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本申請要求2014年2月5日提交的AU 2014900347標題為“適配子構(gòu)建體”的優(yōu)先權(quán)。

技術(shù)領(lǐng)域

本公開涉及適配子及其用途，尤其涉及能特異性結(jié)合CD133并且在癌癥的診斷和/或治療中特別有用的適配子。

背景技術(shù)：

CD133，也稱為Prominin-1，是高度糖基化的五次跨膜(pentaspan)膜糖蛋白，其與質(zhì)膜中的膽固醇結(jié)合。盡管已知該蛋白能夠確定大量的細胞群體，包括成體干細胞和祖細胞，并且在多種發(fā)育的上皮細胞和分化細胞中表達，但其具體功能仍有待闡述。然而，其與Notch-信號通路有關(guān)聯(lián)，該通路對二元細胞命運、腸上皮細胞的分化和淋巴組織生成至關(guān)重要(Ulasov等人.2011.Mol Med 17:103-12)。由于認為該分子是許多癌癥中的癌癥干細胞(CSC)的標記物，近年對其表現(xiàn)出了更多的興趣。確實，越來越多的證據(jù)表明CD133在許多癌癥中的CSC上表達，并且在免疫缺陷小鼠中，相對于陰性對照物，CD133+細胞存在增加的腫瘤發(fā)生可能性(Dittfeld等人.2009.Radiother Oncol 92:353-61)。

近年，免疫療法對癌癥治療具有很大的影響。然而，抗體，甚至是人源化抗體的使用，可引起可能致命的不良副作用(Hansel等人.2010.Nat Rev Drug Discov 9:325-38)。這引起了對“更大和更好的”選擇的探索。已進行了數(shù)次使用核酸作為治療劑的嘗試，但這些嘗試取得了令人失望的結(jié)果，這尤其是因為這些核酸不能進入細胞(Shigdar等人.2011.Br J Haematol 155:3-13)。

化學抗體，稱為適配子，在過去20年中被越來越多地用于臨床應用。確實，一種適配子哌加他尼(pegaptanib)(抗VEGF適配子)已得到FDA批準，并且?guī)追N其它的適配子在進行臨床試驗。將適配子用于治療的興趣增加是由于幾個原因，包括如下事實：它們沒有表現(xiàn)出免疫原性、由于是化學合成的而產(chǎn)生的批次間差異很小，以及相比常規(guī)抗體更為穩(wěn)定。由于其尺寸較小，它們還顯示優(yōu)良的腫瘤穿透。然而，它們最重要的特征是能夠?qū)⑦@些適配子附著至納米粒子、藥物、成像劑或其它核酸治療劑，而無功能喪失(Meng等人.2012.PLoS One 7:e33434)。該功能化引起新的和更多的靶向治療，其相比當前的治療方式具有更少的副作用(Meng等人.2012同上)。當相比主要為被動過程的常規(guī)治療時，靶向遞送系統(tǒng)要有效得多。適配子要想成為有效的藥物遞送劑，該適配子必須能結(jié)合其細胞表面上的靶標，并在短時間內(nèi)被內(nèi)化。因此，本領(lǐng)域需要具有改進的結(jié)合特性和腫瘤穿透的適配子。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

最近已了解到癌癥干細胞是引起贅生組織形成和生長的原因，并且其天然耐受化學治療，這解釋了為何傳統(tǒng)化療起初能夠縮小腫瘤但不能完全根除腫瘤，導致最后的復發(fā)。根據(jù)癌癥干細胞假說，CD133陽性細胞(CD133⁺)決定長期的腫瘤生長，并因此被懷疑能影響臨床結(jié)果。最近發(fā)現(xiàn)CD133陽性細胞的比例以及它們的成簇的拓撲組織均為不良的無進展生存和總體生存的重要預后因素，而與腫瘤階段、切除程度或患者年齡無關(guān)。

當前用于靶向CD133陽性癌癥干細胞的技術(shù)利用常規(guī)的基于抗體的系統(tǒng)，但由于可用的抗CD133抗體的尺寸以及它們相對不能穿透組織而缺少靈敏性。

因此，針對CD133+細胞的適配子的產(chǎn)生將有利于根除癌癥。本發(fā)明人制備了CD133特異性的適配子，其能被快速內(nèi)化并顯示優(yōu)良的腫瘤穿透，從而解決了這一問題。尤其是本公開的適配子是特別有效的治療診斷劑。

本公開提供了一種特異性結(jié)合CD133的適配子。在一個實例中，所述適配子是寡核苷酸。在一個實例中，所述寡核苷酸可以是RNA、DNA或雜交RNA/DNA適配子，和/或可以包含除腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶以外的核苷酸。

本公開還提供了一種適配子，其包含序列5’–X-ACGUAUACUAU-Y-3’(SEQ ID NO:1)，其中X和Y的序列是互補的，從而能夠堿基配對，并且其中X和Y單獨地包含一段CG配對的核苷酸，所述CG配對的核苷酸足以允許至少一種半簇附著至其上。

根據(jù)本公開的適配子，X和Y可以單獨地包含至少4個CG配對的核苷酸(4個CG對)。在另一個實例中，X和Y可以單獨地包含至少5個CG配對的核苷酸、或者至少6個CG配對的核苷酸、或者至少7個CG配對的核苷酸、或者至少8個CG配對的核苷酸、或者至少9個CG配對的核苷酸、或者至少10個CG配對的核苷酸、或者至少11個CG配對的核苷酸、或者至少12個CG配對的核苷酸、或者至少13個CG配對的核苷酸、或者至少14個CG配對的核苷酸、或者至少15個CG配對的核苷酸。

在另一個實例中，所述適配子可包含4至15個CG配對的核苷酸(4至15個CG對)。在另一個實例中，所述適配子可包含2至12個CG配對的核苷酸。在另一個實例中，所述適配子可以包含2至10個配對的核苷酸、2至8個配對的核苷酸、或2至6個配對的核苷酸。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應理解CG配對的核苷酸構(gòu)成適配子的莖區(qū)。

在一個實例中，所述適配子顯示對CD133約24nM或更低的平衡解離常數(shù)(K_D)。在另一個實例中，所述適配子顯示對CD133約24nM的解離常數(shù)(K_D)。在另一個實例中，所述適配子對CD133顯示24nM的解離常數(shù)(K_D)。在另一個實例中，所述解離常數(shù)通過測量適配子與表達在HT29細胞上的CD133的結(jié)合來確定。

在一個實例中，所述適配子是雜交RNA/DNA適配子。在另一個實例中，所述適配子是分離的適配子。在另一個實例中，所述適配子是根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法(例如SELEX)合成的。

在一個實例中，根據(jù)本公開的適配子特異性地結(jié)合CD133。在另一個實例中，根據(jù)本公開的適配子選擇性地結(jié)合CD133。

在一個實例中，所述適配子包含序列5’–CGCGCGCCGCACGUAUACUAUGCGGCGCGCG-3′(SEQ ID NO:2)。在一個實例中，所述適配子包含根據(jù)SEQ ID NO:2所示的序列，其中所述序列包含10個GC配對的核苷酸，所述核苷酸是DNA。在另一個實例中，所述適配子包含RNA序列5′-ACGUAUACUAU-3’(SEQ ID NO：3)。在另一個實例中，所述適配子包含根據(jù)SEQ ID NO:2所示的序列，其含有根據(jù)SEQ ID NO:3所示的序列，其中SEQ ID NO:3是RNA，剩余的序列是DNA。在一個實例中，預測的適配子二維結(jié)構(gòu)的莖區(qū)在圖1中顯示。

在一個實例中，適配子基本上由根據(jù)SEQ ID NO:2所示的序列組成?？蛇x地，所述適配子可以由根據(jù)SEQ ID NO:2所示的序列組成。根據(jù)本公開的或根據(jù)SEQID NO:2所示的適配子包括額外的序列。根據(jù)本公開的適配子可以包含與SEQ IDNO:2具有至少95％同一性的序列，或者至少90％同一性、至少92％同一性、至少85％同一性、至少80％同一性、至少75％同一性、或至少70％同一性的序列。

在一個實例中，通過插入(intercalation)進行半簇的附著。在另一個實例中，通過綴合進行附著。在另一個實例中，通過靜電結(jié)合進行附著。在另一個實例中，通過接頭(linker)進行附著。

根據(jù)本公開的半簇可以是DNA染色劑或用于化療治療的分子，或者是能夠進行兩種功能的分子。能夠插入至根據(jù)本公開的適配子的合適的分子的實例可以選自：阿霉素(doxorubicin)、亞德里亞霉素(adriamycine)、黃連素、原黃素(provflavine)、米托蒽醌、柔毛霉素、沙利度胺、更生霉素、達諾霉素、放線菌素D、9-氨基吖啶、氨柔比星、安吖啶、蒽環(huán)霉素(anthramycine)、小檗因、博來霉素、elliplicine、表柔比星、伊達比星、methpyrillo、光神霉素、絲裂霉素、絲裂霉素C、米托蒽醌、米托蒽醌、吡柔比星、匹克生瓊(pixantrone)、普卡霉素、普羅黃素(proflavine)、靈菌紅素、沙利度胺、voreloxin、戊柔比星、佐柔比星、撲爾敏、prodisiosin、methapyrillino、絲裂霉素、偏端霉素、dantinomycin、偏端霉素、卡波鉑、順鉑和其它鉑衍生物、Hoechst 33258、berenil、DAPI、或致癌劑(包括黃曲霉素B1的exo 8,9環(huán)氧化物、吖啶比如普羅黃素或奎納克林或溴化乙錠)。其它GC插入劑是本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且意圖被納入本公開的范圍。在優(yōu)選的實例中，所述分子是阿霉素(DOX)。

X和Y的序列能夠形成堿基配對，因此提供了適配子的莖區(qū)。不希望受到理論的束縛，優(yōu)選地，半簇能夠通過插入堿基配對的X和Y的DNA序列中的CpG位點之間而附著至本公開的適配子。對于DOX，每CpG位點平均有約2.5個DOX分子，或者換言之，約2.5個DOX分子能夠插入根據(jù)SEQ ID NO:2所示的序列。

所述適配子的總長度可以是19至101個核苷酸、21至85個核苷酸、25至75個核苷酸、31至65個核苷酸、41至55個核苷酸、或者31至41個核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應理解，雖然本公開描述了包含至少15個CG配對的核苷酸的適配子，剩余的莖序列除了交替的CG配對的核苷酸以外，可以包含RNA或DNA序列。

本公開的適配子在序列中可以進一步包含一個或多個核苷酸取代，保持適配子的結(jié)合環(huán)。在一個實例中，在本文公開的適配子、或者根據(jù)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的適配子序列的莖區(qū)中，序列包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個取代。應理解取代的數(shù)量取決于適配子的長度，并且將耐受至適配子仍能夠允許分子比如阿霉素進行附著的程度。

在一個實例中，所述適配子進一步包含一種或多種改進適配子(在體外和/或在體內(nèi))穩(wěn)定性的修飾。在一個實例中，在環(huán)區(qū)的嘧啶核苷酸堿基(C和/或U)是經(jīng)2’-氟代(2’-F)修飾的。為避免疑義，環(huán)區(qū)是序列5’-ACGUAUACUAU-3’(SEQ ID NO:3)。在另一個實例中，在適配子莖區(qū)的C堿基(脫氧胞苷，dC)被修飾為5-甲基脫氧胞苷(5-甲基dC)。當dC被取代為5-甲基dC時，適配子的Tm可以提高多達0.5℃每插入。不希望受到理論的束縛，在CpG基序中存在的5-甲基dC能夠阻止或限制無端的(unwarranted)免疫反應，否則在體內(nèi)施用寡核苷酸時發(fā)生無端的免疫反應，這對于體內(nèi)診斷和治療尤其重要。在另一個實例中，適配子的3’端可以被修飾以保護其免受核酸酶消化。在另一個實例中，使用磷酸基團、磷酸酯或者反向的dT(invdT-3’)修飾3’端來修飾適配子。在另一個實例中，5’端可以偶聯(lián)染料，比如生物素、異硫氰酸熒光素(FITC)、青藍(Cy3或Cy5)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知額外的修飾，并且認為是包括在本公開之內(nèi)的。

在一個實例中，本公開提供了雜交RNA/DNA適配子，其包含序列5’-X-A(2’fC)G(2’-fU)A(2’fU)A(2’fC)(2’fU)A(2’fU)-Y-(inv dT)-3’(SEQ ID NO:4)，其中，X和Y是互補的，從而能夠堿基配對，并且其中X和Y單獨包含一段CG配對的核苷酸，f＝2’-氟代，以及inv dT＝反向的dT(反向連接)，并且其中X和Y的長度足以允許至少一種半簇附著至其上。在一個具體的實例中，X和Y是DNA。

在一個實例中，本公開提供了一種雜交RNA/DNA適配子，其包含序列5’–mCGmCGmCGmCmCGmCA(2’fC)G(2’-fU)A(2’fU)A(2’fC)(2’fU)A(2’fU)GmCGGmCGmCGmCG-(inv dT)-3’(SEQ ID NO:5)，其中，C＝5-甲基dC，f＝2’-氟代，以及inv dT＝反轉(zhuǎn)dT(反向連接)。根據(jù)這個實例，所述適配子包含反向的3’端G。

在另一個實例中，所述雜交RNA/DNA適配子基本上由根據(jù)SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的序列組成。在另一個實例中，雜交RNA/DNA適配子由根據(jù)SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的序列組成。

根據(jù)本公開的適配子可以包含與SEQ ID NO:4或5具有至少95％同一性的序列，或者與SEQ ID NO:4或5所示的序列具有至少90％同一性、至少92％同一性、至少85％同一性、至少80％同一性、至少75％同一性、或至少70％同一性的序列。

所述適配子可以進一步包含3’或5’染料，比如Cy3或Cy5。

本領(lǐng)域已知制備2’-氟代修飾的RNA堿基的方法。在一個實例中，在合成RNA轉(zhuǎn)錄本期間直接并入2’-氟代修飾的堿基。

本公開還提供了一種適配子，其實質(zhì)上具有與包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示序列的適配子相同的結(jié)合CD133的能力。

在一個實例中，根據(jù)本公開的適配子特異性地結(jié)合CD133⁺細胞。在另一個實例中，根據(jù)本公開的適配子選擇性地結(jié)合CD133⁺細胞。CD133⁺細胞可以是干細胞。所述干細胞可以是經(jīng)純化的或分離的干細胞，在一個實例中可以是癌癥干細胞。在一個實例中，癌癥干細胞的特征是(i)表達CD133、(ii)致瘤、(iii)能夠自我更新、(iv)能夠分化以及(v)通過常規(guī)治療抵抗凋亡。

可選地，癌癥干細胞可以描述為從來源比如生物樣品分離的、富集的或純化的。在另一個實例中，癌癥干細胞代表基于CD133⁺表達富集的細胞群。在另一個實例中，細胞群包含至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的癌癥干細胞。

在一個實例中，表達CD133的細胞和/或癌癥干細胞在體內(nèi)。在另一個實例中，表達CD133的細胞和/或癌癥干細胞在體外。在另一個實例中，表達C133的細胞和/或癌癥干細胞存在于從受試者獲得的生物樣品中?？梢砸匀魏纬Ｒ?guī)方式檢測適配子的結(jié)合，例如，通過檢測與適配子連接的標記、通過適配子成像、或通過確定結(jié)合適配子的量。合適的方法例如在WO 2004/081574中描述。

在另一個實例中，本公開的表達CD133的細胞和/或癌癥干細胞單獨地或共同地表達一種或多種標記物，所述標記物選自CD44、ABCG2、β-連環(huán)蛋白、CD117、ALDH、VLA-2、CD166、CD201、IGFR、EpCAM和EGF1R。

“單獨地”意思是本公開分別包括所述的標記物或標記物組，盡管在本文沒有分別列舉單獨的標記物或標記物組，所附權(quán)利要求可以分別地彼此區(qū)分地限定這種標記物或標記物組。

“共同地”意思是本公開包括任何數(shù)量或組合的所述的標記物或肽的組，盡管本文沒有被具體列舉這種數(shù)量或組合的標記物或標記物組，所附權(quán)利要求可以分別限定這種組合或子組合，并區(qū)別于任何其它標記物的組合或標記物組。

在另一個實例中，根據(jù)本公開的腫瘤干細胞是腦癌干細胞、轉(zhuǎn)移性腦癌細胞、乳癌干細胞、前列腺癌干細胞、胰腺癌干細胞、結(jié)腸癌干細胞、肝癌干細胞、肺癌干細胞、卵巢癌干細胞、皮膚癌干細胞或黑色素瘤干細胞。

本公開的適配子可以用于治療或診斷。此外因為DOX是天然熒光的，其同時能夠被用于治療和診斷(即治療診斷)。

本公開還提供了一種包含根據(jù)本公開的適配子的診斷劑或治療診斷劑。在一個實例中，所述適配子是根據(jù)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的適配子。在另一個實例中，所述診斷劑包含偶聯(lián)可檢測的標記的本公開的適配子。在一個實例中，所述診斷劑用于在體內(nèi)或在體外檢測表達CD133的癌癥干細胞。在一個實例中，所述治療診斷劑是適配子-Dox綴合物。

本公開還提供了一種用于在受試者中、或在從受試者獲得的生物樣品中鑒定或檢測表達CD133的細胞和/或癌癥干細胞，所述受試者患有、或疑似患有癌癥，所述方法包括使細胞和本文所描述的診斷劑或治療診斷劑接觸。

在一個實例中，本公開的診斷劑或治療診斷劑能夠用于在受試者中、或者在從受試者獲得的生物樣品中檢測表達CD133的細胞和/或癌癥干細胞的存在，所述受試者患有腫瘤或疑似患有腫瘤。如果需要，檢測可以通過將適配子與可檢測的標記相偶聯(lián)而促進?？蓹z測的標記的實例包括多種酶、輔基(prosthetic group)、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)、電子致密標記、MRI標記和放射性物質(zhì)。

本公開還提供了一種如本文中描述的適配子或者如本文中描述的診斷劑用于生物樣品的組織學檢查。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知制備組織學樣品的方法。

本公開的適配子可以進一步偶聯(lián)至半簇，所述半簇是活性半簇。所述半簇可以是配體，比如另外的適配子或可選的配體。所述半簇可以是免疫球蛋白、或免疫球蛋白的片段或部分、治療劑、另一種藥物或生物活性劑、毒素、或放射性核素?？蛇x地，所述半簇可以包括siRNA、DNA酶或核酶。前述半簇的任何組合也包括在本公開中。

本公開還提供了一種編碼如本文所描述的適配子的表達載體。還提供了與SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:5中任一項互補的核苷酸序列，尤其與SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:5中任一項互補。

本公開還提供了一種用于在有需要的受試者中治療癌癥的方法，所述方法包括向受試者提供本文所描述的適配子或治療診斷劑。被治療的受試者通常是受益于使用本公開的適配子或治療診斷劑的治療的受試者。在一個實例中，所述受試者被診斷為患有癌癥?？蛇x地，所述受試者是疑似患有癌癥的受試者，在該情況中適合向受試者施用治療診斷劑。如本文所描述的偶聯(lián)至半簇的本公開的適配子、或者本文所描述的治療診斷劑可以被施用于受試者持續(xù)數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年時間，以監(jiān)測和/或治療受試者。

根據(jù)本公開的受試者可以是患有或疑似患有癌癥的受試者，所述癌癥選自腦癌、乳癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、皮膚癌、黑色素瘤或存在CD133+細胞的任何其它癌癥。在一個實例中，所述癌癥是任何存在或疑似存在表達CD133的細胞和/或癌癥干細胞的癌癥。

本公開還提供了本文所描述的適配子在制備用于檢測或診斷癌癥的診斷劑中的用途。

本公開還提供了根據(jù)本公開的適配子或根據(jù)本公開的治療診斷劑在制備用于在受試者中治療癌癥的藥物的用途。

本公開還提供了根據(jù)本公開的適配子或根據(jù)本公開的治療診斷劑在醫(yī)學中的用途。

本公開還提供了根據(jù)本公開的適配子或根據(jù)本公開的治療診斷劑用于在受試者中治療癌癥的用途。

本公開還提供一種組合物，其包含治療有效量的根據(jù)本公開的適配子或治療診斷劑，以及藥學上可接受的載體和/或賦形劑。在一個實例中，所述組合物是藥物組合物。

本文所描述適配子、治療診斷劑或組合物可以被單獨使用，或與其它治療方式組合使用。例如，所述適配子或藥物組合物可以與放射治療或其它化療劑組合使用。不希望受到理論的束縛，假定放射治療和/或化療劑主要通過靶向快速分裂的細胞而被用于減小腫瘤，所述快速分裂的細胞通常是癌癥干細胞的子代細胞。本文所描述的所述適配子、治療診斷劑或組合物可以被施用至腫瘤的位點，以特異性去除癌癥干細胞。因此，本文所描述的適配子、治療診斷劑或組合物可以與放射治療或化療一起使用，或者化療或放射治療的治療之后使用。此外，如本文所描述的適配子、治療診斷劑或組合物可以在腫瘤的手術(shù)切除后使用，以消除任何手術(shù)后保留的剩余癌癥細胞。

在另一個實例中，所述適配子在脂質(zhì)體的表面被提供。所述脂質(zhì)體可以含有藥物。合適的藥物的實例包括化療劑、免疫檢查點抑制劑(例如PD-1)、抗生素、免疫球蛋白或抗體、類固醇、或者止痛藥。

適配子或包含適配子的組合物可以通過本領(lǐng)域已知的方法向受試者施用。在一個實例中，所述適配子或組合物是腸胃外施用的，例如通過靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下或局部注射。

還預期本文所描述的所述適配子、治療診斷劑或組合物可以與一種或多種靶向存在于癌癥干細胞的抗原的額外適配子聯(lián)合。

應理解，本公開的每個實例加上必要的變更適用于治療、預防或改善受試者中的癌癥的方法。

附圖說明

圖1：預測DOX插入修飾的CD133適配子的示意圖。(A)通過VIENNA軟件確定的適配子的二級結(jié)構(gòu)(左側(cè))，以及阿霉素的分子結(jié)構(gòu)(右側(cè))。(B)代表由于藥物對雙鏈G-C配對的高親和性，適配子和DOX間可能的插入。

圖2：預測的DOX插入至CD133RNA-DNA雜交適配子的示意圖。(A)通過VIENNA軟件確定的適配子的二級結(jié)構(gòu)(左側(cè))，以及阿霉素的分子結(jié)構(gòu)(右側(cè))。(B)代表由于藥物對雙鏈G-C配對的高親和性，適配子和DOX間可能的插入。

圖3：確定熒光強度和DOX濃度之間的關(guān)系。使用多種濃度的DOX以測量熒光強度。數(shù)據(jù)顯示平均值±SE，n＝3。

圖4：在將DOX插入CD133適配子之后的熒光淬滅曲線。在綴合之后，純化適配子-Dox綴合物。通過在495nm波長處UV的吸收，確定DOX的熒光。數(shù)據(jù)顯示平均值±SE，n＝3。

圖5：在PBS中DOX從綴合物釋放持續(xù)3天。在透析盒中，吸光度(Y軸)與DOX熒光強度相關(guān)。強度越高，越多DOX從綴合物釋放。數(shù)據(jù)顯示平均值±SE，n＝3。

圖6：在CD133陰性HEK2932和CD133陽性的HT29細胞中確定CD133適配子-Dox綴合物的解離常數(shù)。使用濃度范圍0-200nM的熒光標記的CD133適配子和CD133適配子-Dox綴合物研究結(jié)合。(A)使用陽性CD133適配子-Dox綴合物處理的HEK293T細胞系，(B)使用陰性對照適配子-Dox綴合物處理的HEK2932，(C)使用陽性CD133適配子(未綴合)處理的HT29，以及(D)使用陽性CD133適配子-Dox綴合物處理的HT29細胞。數(shù)據(jù)顯示平均值±SE，n＝3。

圖7：使用CD133適配子確定CD133適配子-Dox綴合物的解離常數(shù)。(A)陽性CD133適配子-Dox綴合物，(B)陰性對照CD133適配子-Dox綴合物具有與陽性適配子相同的核酸序列，除了2’-O-甲基修飾替換了2’-氟代化學修飾，導致3-D結(jié)構(gòu)的改變，破壞了對CD133的結(jié)合，以及(C)未綴合的陽性的CD133適配子。

圖8：內(nèi)化的DOX和適配子的共聚焦顯微術(shù)。(A-C)陽性CD133HT29細胞系。(A)CD133適配子。(B)CD133適配子-Dox綴合物。(C)陰性對照適配子-Dox綴合物。(D)陰性對照細胞系HEK293T與CD133適配子-Dox綴合物孵育。(E)HT29細胞系與游離的DOX孵育。標尺＝20μm。

圖9：共聚焦顯微術(shù)評估DOX和適配子的內(nèi)化的處理：(a)CD133適配子，(b)CD133適配子-Dox綴合物，以及(c)使用游離的DOX孵育的陰性對照。

圖10：腫瘤球尺寸。對來自96孔板中的500個細胞的球進行測量。細胞在球?qū)φ战橘|(zhì)、游離的DOX和適配體-Dox綴合物的條件下?？梢娤啾葘φ?，綴合物在全部三個濃度中降低球尺寸(P<0.0)，數(shù)據(jù)顯示平均值±SE，n＝3。

圖11：通過在不同的條件下，以不同的細胞濃度形成的球的數(shù)量測量球的形成。50個細胞1μM顯示無變化，但是10個細胞的對照和綴合物的形成差異明顯(P<0.01)。增加常規(guī)和新的藥物的濃度，導致相比對照，綴合物更高的球形成的抑制(P<0.001)。當濃度增加至2μM時，該作用可以在50個細胞觀察到(P<0.001)。在所有這些CD133適配子-Dox綴合物中，與游離的DOX相比，腫瘤球抑制具有顯著差異(P<0.01)。

圖12：使用6孔超低附著(ultralow attachment)板進行腫瘤球的可視化。

序列表要點

SEQ ID NO:1：是CD133適配子環(huán)區(qū)的核心核苷酸序列，其5’和3’端側(cè)翼是一段交替的CG配對的核苷酸。

SEQ ID NO:2：是能夠綴合DOX的CD133適配子的序列。

SEQ ID NO:3：是CD133適配子的環(huán)區(qū)核心核苷酸序列。

SEQ ID NO:4：是雜交RNA/DNA CD133適配子的序列，其5’和3’端側(cè)翼是一段交替的CG核苷酸，并含有3’反向的dT。

SEQ ID NO:5：是雜交RNA/DNA CD133適配子的序列。

具體實施方式

通用技術(shù)和所選定義

術(shù)語“和/或”，例如“X和/或Y”，應理解為是指“X和Y”或者“X或Y”，并且應當理解為提供了對兩種含義或其中的一種含義的明確支持。

本說明書中包括的任何文獻、行為、材料、裝置、物品等的論述不應理解為承認這些事物中的任一種或所有這些事物形成了現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的一部分，或者由于其出現(xiàn)于本申請的每項權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日期之前而成為本公開相關(guān)的領(lǐng)域中的公共常識。

在整個本說明書中，除非明確地另有所述，或者上下文另有要求，提及單個步驟、物質(zhì)組合物、步驟組合或者物質(zhì)組合物的組合應當理解為包括這些步驟、物質(zhì)組合物、步驟組合或者物質(zhì)組合物的組合中的一項和多項(即，一項或更多項)。

除非明確另有所述，本文中描述的每個實例加以必要的修改適用于本公開中的各個和每個其它實例。

本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本公開易于進行除明確描述的那些以外的改變和修改。應理解，本公開包括所有這樣的改變和修改。本公開還包括本說明書中單獨或共同提及或指出的步驟、特征、組合物和化合物的全部，以及所述步驟或特征的任何和全部組合或者任何兩項或更多項。

本公開并不限于本文中描述的具體實例的范圍，這些具體實例僅旨在示例的目的。功能等同的產(chǎn)品、組合物和方法顯然位于本公開的范圍中。

不需要過多的實驗，除非另有所示，使用分子生物學、重組DNA技術(shù)、細胞生物學和免疫學的常規(guī)技術(shù)即可實施本公開。此類方案描述于，例如，Sambrook,Fritsch&Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories,紐約,第二版(1989),第I、II和III卷全卷；DNA Cloning:A Practical Approach,第I和II卷(D.N.Glover,ed.,1985),IRL Press,牛津,整篇文檔；Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach(M.J.Gait,ed,1984)IRL Press,Oxford,整篇文檔,且尤其是其中的Gait的文章,ppl-22；Atkinson等人,pp35-81；Sproat等人,pp 83-115；以及Wu等人,pp 135-151；4.Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach(B.D.Hames&S.J.Higgins,eds.,1985)IRL Press,牛津,整篇文檔；Immobilized Cells and Enzymes:A Practical Approach(1986)IRL Press,牛津,整篇文檔；Perbal,B.,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan,eds.,Academic Press,Inc.),整系列,Sakakibara,D.,Teichman,J.,Lien,E.Land Fenichel,R.L.(1976).Biochem.Biophys.Res.Commun.73 336-342；Merrifield,R.B.(1963).J.Am.Chem.Soc.85,2149-2154；Barany,G.和Merrifield,R.B.(1979)in The Peptides(Gross,E.和Meienhofer,J.eds.),vol.2,pp.1-284,Academic Press,紐約.12.Wünsch,E.,ed.(1974)Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie(Müler,E.,ed.),vol.15,第4版，第1和2部分,Thieme,Stuttgart；Bodanszky,M.(1984)Principles of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,海德爾堡；Bodanszky,M.&Bodanszky,A.(1984)The Practice of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,海德爾堡；Bodanszky,M.(1985)Int.J.Peptide Protein Res.25,449-474；Handbook of Experimental Immunology,I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell,eds.,1986,Blackwell Scientific Publications)；以及Animal Cell Culture:Practical Approach,第三版(John R.W.Masters,ed.,2000),ISBN 0199637970,整篇文檔。

在整個本說明書中，除非上下文另有要求，詞語“包含”或者變型如“包括”或“含有”應理解為意指包括所述的步驟或元件或整數(shù)，或者步驟或元件或整數(shù)的組，但不排除任何其它的步驟或元件或整數(shù)，或者元件或整數(shù)的組。

術(shù)語“由…組成”應理解為意指方法、過程或物質(zhì)的組合物(例如適配子序列)具有所述的步驟和/或組分，并且沒有其它的步驟或組分。

在本文中用于核酸序列的情況中，術(shù)語“基本上由…組成”是非窮盡地解釋，并且理解為意指核苷酸序列中存在額外的核苷酸堿基，其中所述額外的堿基構(gòu)成不超過總核苷酸序列的約10％。

如本文所用，術(shù)語“約”在涉及可測量的值如重量、時間、劑量等的量時，是指包括與指定量的±20％或±10％，更優(yōu)選±5％，甚至更優(yōu)選±1％，并且甚至更優(yōu)選±0.1％的差異。

如本文所用的術(shù)語“適配子”或“寡核苷酸適配子”一般是指單個定義的序列的寡核苷酸，或者所述寡核苷酸的混合物，其中所述混合物保留了對CD133的特異性結(jié)合。如本文所用，“適配子”是指單鏈核酸。在結(jié)構(gòu)上，本公開的適配子為特異性結(jié)合性寡核苷酸。適配子可包含RNA、DNA或RNA和DNA二者。適配子可以是使用領(lǐng)域公知的方法合成生產(chǎn)的?？蛇x地，適配子可以是重組生產(chǎn)的。

如本文所用的術(shù)語“寡核苷酸”通用于多脫氧核糖核苷酸(含有2’-脫氧-D-核糖或其經(jīng)修飾的形式)，即DNA；多核糖核苷酸(含有D核糖或其經(jīng)修飾的形式)，即RNA；以及任何其它類型的多核苷酸，其為嘌呤或嘧啶堿基的N-糖苷或C-糖苷，或者經(jīng)修飾的嘌呤或嘧啶堿基或無堿基核苷酸。根據(jù)本公開的內(nèi)容，術(shù)語“寡核苷酸”不僅包括具有常規(guī)堿基、糖殘基和核苷酸間連接的那些，還包括包含這3種半簇中任何一種或所有的修飾的那些。

如本文所用的術(shù)語“CG配對的核苷酸”理解為指當存在于雙鏈結(jié)構(gòu)時，互補的C和G核苷酸堿基配對。例如，單個CG配對的核苷酸對應于在一條鏈上的C與互補鏈上的G堿基配對。4個CG配對的核苷酸指這樣一種結(jié)構(gòu)，其中在一條鏈的線性序列中存在CGCG或GCGC，并且與互補鏈上的互補序列GCGC或CGCG堿基配對。

如本文所用的“術(shù)語CpG位點”理解為指在堿基線性序列中，沿其長度胞嘧啶核苷酸出現(xiàn)在鳥嘌呤核苷酸旁邊的DNA區(qū)。術(shù)語CpG是C-磷酸-G的簡稱，即，胞嘧啶和鳥嘌呤僅被一個磷酸分開。符號CpG用于區(qū)分線性序列與CG堿基配對的胞嘧啶和鳥嘌呤。

如本文所用的術(shù)語“RNA-DNA雜交適配子”是一種包含核糖核苷單元和脫氧核糖核苷單元或堿基的適配子。

如本文所用的術(shù)語“嘧啶”指胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)堿基。胸腺嘧啶(T)通常在DNA中發(fā)現(xiàn)，但不出現(xiàn)在RNA中。胞嘧啶在RNA和DNA中發(fā)現(xiàn)，并且尿嘧啶通常在RNA中發(fā)現(xiàn)，但不出現(xiàn)在DNA中。

如本文所用，術(shù)語“結(jié)合親和性”意指適配子結(jié)合或不結(jié)合靶標的傾向，并且描述了適配子結(jié)合靶標的結(jié)合強度或親和性的測量。所述相互作用的能量學在“結(jié)合親和性”上是有意義的，因為其確定了相互作用伴侶的必要濃度、這些伴侶能夠結(jié)合的速率，以及溶液中結(jié)合和游離分子的相對濃度。所述能量學在本文中尤其是通過確定解離常數(shù)K_d來表征的。如本領(lǐng)域所已知的，低的解離常數(shù)指示分子彼此間的較強的結(jié)合和親和性。

如本文中所用，術(shù)語“生物樣品”是指來自受試者的細胞或細胞群或一定量的組織或流體。最經(jīng)常情況下，所述樣品已被從受試者移除，但術(shù)語“生物樣品”也可指體內(nèi)分析的細胞或組織，即未從受試者移除的細胞或組織。通常，“生物樣品”包含來自受試者的細胞。在本公開中“生物樣品”將包括表達CD133的細胞。生物樣品包括但不限于組織活檢、穿刺活檢、刮擦物(例如，口腔刮擦物)、全血、血漿、血清、淋巴、骨髓、尿液、唾液、痰、細胞培養(yǎng)物、胸膜液、心包液、腹水或腦脊液。生物樣品還包括組織活檢和細胞培養(yǎng)物。生物樣品或組織樣品可指分離自個體的組織或流體樣品，包括但不限于，例如，血液、血漿、血清、腫瘤活檢、尿液、糞便、痰、脊髓液、胸膜液、乳頭吸液、淋巴液、皮膚的外部部分、呼吸道、腸道和泌尿生殖道、淚液、唾液、奶、細胞(包括但不限于血細胞)、腫瘤、器官，以及體外細胞培養(yǎng)物組分樣品。在一些實施方案中，樣品來自原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤的切除術(shù)、支氣管鏡活檢或芯針活檢，或者來自胸膜液的單元塊(cellblock)。另外，可使用細針吸入樣品。樣品可為石蠟包埋的或冷凍的組織?？赏ㄟ^從受試者去除細胞樣品獲得樣品。

給予術(shù)語“足以允許將至少一種半簇附著至其上”廣義的解釋。該術(shù)語包括直接的附著或連接、或者非直接的附著或連接(例如共價鍵或靜電相互作用)、或者可逆的內(nèi)含或嵌入(insertion)(比如插入)。在另一個實例中，所述附著是通過綴合或通過使用接頭進行的。

如本文所用的術(shù)語“偶聯(lián)至”旨在包括適配子借以與本文所描述的3’或5’端試劑(例如invdT)或與本文所描述的半簇連接、附著或結(jié)合的任何結(jié)構(gòu)。

術(shù)語“具有實質(zhì)上相同能力”理解為指適配子能夠競爭性地抑制本公開的適配子與CD133上表位的結(jié)合。用于確定是否適配子能夠競爭性地抑制本公開的適配子與CD133的結(jié)合的方法可包括本領(lǐng)域已知的競爭性結(jié)合測定。

如本文所用的術(shù)語“分離的”意指可從其它組分或化學品純化的適配子，所述組分或化學品可以存在于產(chǎn)生和純化適配子的過程中(例如使用SELEX方法)。在細胞的情況中，該術(shù)語還指從細胞可能天然存在的環(huán)境中的其它組分中可分離的或純化細胞。分離的細胞可被純化至相對于其可天然獲取的狀態(tài)的任何程度。

術(shù)語“免疫球蛋白片段”可以與“抗原結(jié)合片段”交換使用，并且理解為指完整抗體的一種或多種可變區(qū)?？贵w片段的實例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、雙體、線性抗體、單鏈抗體分子和由抗體片段形成的多特異性抗體。

如本文所用，術(shù)語“治療有效量”應理解為指足夠量的用于減少表達CD133的癌癥干細胞的數(shù)目和/或癌癥的一種或多種癥狀的根據(jù)本公開的適配子或藥物組合物。技術(shù)人員理解這樣的量將根據(jù)例如具體受試者和/或疾病的類型或嚴重性或水平而改變。該術(shù)語不應理解為將本公開限定于特定量的適配子。

如本文所用，術(shù)語“治療”應理解為指施用治療有效量的如本文所公開的適配子或藥物組合物，并減輕與癌癥相關(guān)的或由癌癥引起的臨床病況的至少一種癥狀。

如本文所用，術(shù)語“特異性結(jié)合”應理解為指，相較于適配子與替代細胞或物質(zhì)的反應或結(jié)合，適配子與特定細胞或物質(zhì)反應或結(jié)合得更為頻繁、更為快速、持續(xù)時間更長和/或親和性更大。例如，相比適配子結(jié)合不相關(guān)的蛋白和/或表位或其免疫原性片段，特異性結(jié)合靶標蛋白的適配子以更大的親和性、親合力(avidity)、更快速地和/或以更長的持續(xù)時間結(jié)合該蛋白或表位或其免疫原性片段。通過閱讀本定義，還應理解，例如，特異性結(jié)合第一靶標的適配子可以或可以不特異性結(jié)合第二靶標。由此，“特異性結(jié)合”未必需要排斥結(jié)合或不可檢測地結(jié)合另一靶標，這包括在術(shù)語“選擇性結(jié)合”中。通常，但非必然地，提及結(jié)合時，是指特異性結(jié)合。根據(jù)相比適配子和環(huán)境中的其它物質(zhì)或總體上的非相關(guān)分子的解離常數(shù)，適配子對靶標的比較解離常數(shù)(Kd)來定義結(jié)合的特異性。通常適配子對于靶標的Kd比靶標和不相關(guān)物質(zhì)或環(huán)境中的伴隨物質(zhì)的Kd小2倍、5倍或10倍。甚至更優(yōu)選地，Kd為小50倍、100倍或200倍。

術(shù)語“選擇性結(jié)合”應理解為指適配子與標記物或在細胞上表達的抗原排斥結(jié)合或不可檢測地結(jié)合，其中所述標記物或抗原不是CD133。

如本文所用的術(shù)語“CD133⁺”或“表達CD133的細胞”可互換使用。該術(shù)語包括可通過任何合適的方式檢測的細胞表面表達的CD133抗原。在一個實例中，提及細胞對于給定標記物為陽性是指其可為該標記物的低(lo或暗)或高(亮，bri)表達者，這取決于該標記物在細胞表面上存在的程度，其中所述術(shù)語涉及熒光強度。

如本文所使用的，術(shù)語“治療診斷”或“治療診斷劑”理解為指并有診斷和治療功能的適配子。這種實體可以同時用于靶向藥物遞送和釋放以及診斷，所述診斷包括監(jiān)測疾病進程和對治療的反應。更具體地，根據(jù)本公開的治療診斷劑是一種化療分子，例如阿霉素被綴合至適配子從而形成的適配子-Dox綴合物。術(shù)語“適配子-Dox綴合物”理解為指如圖1中所示的一個或多個阿霉素分子被插入在適配子莖序列的本公開的CD133適配子。

如本文所用，術(shù)語“受試者”應理解為指任何受試者，包括人或非人受試者。非人受試者可包括非人的靈長、有蹄(牛、豬、綿羊、山羊、馬、水牛和美洲野牛)、犬、貓科動物、兔(家兔、野兔和鼠兔)、嚙齒(小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠和沙鼠)、鳥和魚。在一個實例中，受試者為人。

適配子

適配子的幾種獨特的特性使得它們成為用于大量的分子生物學應用和用作潛在的藥劑的有吸引力的工具。首先，大多數(shù)適配子以高親和性結(jié)合靶標，顯示皮摩爾至納摩爾范圍內(nèi)的典型的解離常數(shù)。適配子的結(jié)合位點包括靶標分子的裂縫和凹槽，引起與許多當前可用的藥劑非常類似的拮抗活性。第二，適配子的結(jié)構(gòu)在廣泛的溫度和儲存條件范圍內(nèi)是穩(wěn)定的，保持了形成其獨特的三級結(jié)構(gòu)的能力。第三，適配子可被化學合成，這與制備單克隆抗體所需的昂貴的和勞動密集的生物系統(tǒng)形成對比。

不希望受到理論的束縛，由于RNA適配子對其靶標蛋白的理論上較高的親和性以及修飾的RNA比未修飾的RNA更大的血漿穩(wěn)定性，RNA適配子通常是許多研究小組優(yōu)選的。

本文公開了能特異性結(jié)合CD133抗原的適配子分子，其可用于在細胞內(nèi)有效遞送試劑，比如治療癌癥的化療分子。本公開的這種適配子分子特別用作治療劑、診斷劑和治療診斷劑。

適配子為單鏈的寡核苷酸或寡核苷酸類似物，其結(jié)合特定的靶標分子如蛋白或小分子。因此，適配子是抗體的寡核苷酸類似物。通常，適配子包含約15至約100個核苷酸，優(yōu)選約15至約40個核苷酸，并且更優(yōu)選約20至約40個核苷酸，其中長度落入這些范圍中的寡核苷酸可通過常規(guī)技術(shù)進行制備。

適配子結(jié)合高度依賴于適配子寡核苷酸形成的二級結(jié)構(gòu)。RNA和單鏈DNA(或類似物)適配子是已知的。參見，例如Burke等人(1996).J.Mol.Biol.264:650-666；Ellington和Szostak(1990).Nature 346:818-22；Hirao等人(1998).Mol Divers.4:75-89；Jaeger等人(1998).EMBO Journal 17:4535；Kensch等人(2000).J.Biol.Chem 275:18271-8；Schneider等人(1995).Biochemistry 34:9599-9610；以及US 5773598、US6028186、US 6110900、US6127119和US 6171795。

本公開的適配子包括雜交RNA/DNA適配子，其中適配子的結(jié)合(即，環(huán))區(qū)是RNA，莖區(qū)是DNA。不希望受到理論的束縛，認為DNA莖區(qū)提供了分子比如阿霉素插入的位點，因為分子對雙鏈DNA CG配對的高親和性。

適配子的產(chǎn)生

本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知用于制備根據(jù)本公開的適配子的多種方法。指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化“SELEX^TM”是一種用于針對任何期望的靶標制備核酸配體的方法，如，例如在U.S.5,475,096和5,270,163、以及PCT/US91/04078中描述的，其每一個通過參考特別并入本文。

SELEX^TM技術(shù)基于這樣的事實，即核酸具有足夠的形成多種二維和三維結(jié)構(gòu)的能力，以及在其單體中適用的充當幾乎任何化合物(不管是大還是小尺寸)的配體(即，形成特異性結(jié)合對)的足夠的化學多樣性。

該方法包括使用相同的通用選擇方案，從候選物的混合物選擇，并逐步迭代結(jié)構(gòu)改進，以達到幾乎任何所期望的結(jié)合親和性和選擇性的標準。從核酸的混合物開始，優(yōu)選包含隨機化序列片段，SELEX^TM方法包括在有利于結(jié)合的條件下將混合物與靶標接觸、將未結(jié)合的核酸與那些結(jié)合靶標分子的核酸分離、使核酸-靶標對解離、擴增從核酸-靶標對解離的核酸以獲得配體富集的核酸混合物的步驟，然后通過所需的多個循環(huán)中重復結(jié)合、分離、解離和擴增的步驟。

在含有大量的可能的序列和結(jié)構(gòu)的核酸混合物中，存在對于給定的靶標的大范圍的結(jié)合親和性。例如，核酸混合物包含20個核苷酸的隨機化片段，其具有4²⁰個候選的可能性。對靶標具有更高的親和性常數(shù)的那些最有可能結(jié)合到靶標。在分離、解離和擴增之后，產(chǎn)生第二核酸混合物，對更高結(jié)合親和性候選物富集。額外輪的偏向最佳配體的漸進選擇，直至得到的核酸混合物主要由僅一個或一些序列組成。然后將這些進行克隆、測序并單獨測試對純配體的結(jié)合親和性。

重復選擇和擴增的循環(huán)，直至獲得期望的目標。在最通常的情況中，持續(xù)選擇/擴增直至在重復循環(huán)中不再獲得結(jié)合強度的顯著提高。該方法可以被用于多達約10¹⁸種不同的核酸種類的樣品。測試混合物的核酸優(yōu)選包括隨機化序列部分以及用于有效擴增必要的保守序列。核酸序列變體可以以多種方式生產(chǎn)，包括隨機化核酸序列的合成，以及從隨機化裂解的細胞核酸中進行尺寸選擇?？勺冃蛄胁糠滞耆谢虿糠趾须S機序列；它還可以含有與隨機化序列合并的保守序列的子部分。在選擇/擴增迭代之前或期間，通過突變可以引入或增加在測試核酸中的序列變異性。

如在Shigdar S等人(2013)Cancer Letters 330:84-95中描述的，在選擇期間適配子候選物的富集可以使用限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)和流式細胞術(shù)監(jiān)測。

適配子的結(jié)合親和性

結(jié)合親和性描述了分子彼此的結(jié)合強度或親和性的測量。本文中的適配子對于靶標和其它分子的結(jié)合親和性根據(jù)Kd進行定義?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法確定解離常數(shù)，并且甚至對于復雜的混合物，可通過諸如Caceci,M.,等人,Byte(1984)9:340-362中描述的那些方法計算解離常數(shù)。測量解離常數(shù)的實例描述于例如US7602495，其描述了表面等離子體共振分析，以及在US 6562627和US 2012/00445849中。在另一個實例中，使用諸如Wong和Lohman,(1993).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,5428-5432公開的雙過濾硝酸纖維素過濾器結(jié)合測定確認Kd。確定適配子的結(jié)合親和性的方法還在例如Stoltenburg R等人(2005)Anal Bioanal Chem 383:83-91、Tran DT等人(2010)Molecules 15,1127-1140和Cho M等人(2013)PNAS 110(46):18460-18465中描述。

然而，觀察到對于一些小寡核苷酸，難以直接確定Kd，并且可能造成高的誤導性結(jié)果。在這些情況下，用已知能結(jié)合靶標或候選物的物質(zhì)進行針對靶標分子或其它候選物質(zhì)的競爭性結(jié)合測定。在理想情況下，發(fā)生50％抑制時的濃度值(Ki)等于Kd。然而，在任何情況Ki都不會小于Kd。因此，替代性地，Ki的測定為Kd的值設(shè)定了最大值。在技術(shù)困難阻礙Kd的精確測量的那些情況下，可方便地替換Ki測量來提供Kd的上限。Ki值也可用于確認本公開的適配子結(jié)合CD133。

改進適配子穩(wěn)定性

在使用核酸作為治療劑中遇到的一個潛在的問題在于，在顯示期望的效果前，寡核苷酸以其磷酸二酯形式在體液中可被諸如內(nèi)切酶和外切酶的細胞內(nèi)酶和細胞外酶快速降解。本公開還包括如本文所述的類似物和/或經(jīng)設(shè)計用于改進適配子的一種或多種特性比如保護免被核酶消化的額外修飾。

本公開中預期的寡核苷酸適配子修飾包括但不限于，提供了其它化學基團的那些，所述其它化學基團向核酸配體堿基或核酸配體整體并入額外的電荷、極性、疏水性、氫鍵、靜電相互作用和流變性。

用于產(chǎn)生耐受核酶的寡核苷酸適配子的修飾還可包括一種或多種取代的核苷酸間連接、改變的糖、改變的堿基或其組合。此類修飾包括2’-位置的糖修飾、5-位置的嘧啶修飾、8-位置的嘌呤修飾、環(huán)外胺的修飾、4-硫代尿苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代、骨架修飾、硫代磷酸酯或烷基磷酸酯修飾、甲基化和不常見的堿基配對組合如異堿基異胞苷和異鳥苷；3’和5’修飾如加帽；綴合至高分子量、非免疫原性化合物；綴合至親脂性化合物；以及磷酸酯骨架修飾。

在一個實例中，與本公開的適配子綴合的非免疫原性的高分子量化合物為聚烷二醇，優(yōu)選聚乙二醇。在一個實例中，骨架修飾包括并入一個或多個硫代磷酸酯至磷酸骨架中。在另一個實例中，本公開的適配子包含并入少于10個、少于6個或少于3個硫代磷酸酯至磷酸骨架中。

在適當情況下，額外的修飾可以包括以下的至少一種：2’-脫氧、2’-鹵代(包括2’-氟代)、2’-氨基(優(yōu)選非取代的或單取代或二取代)、2’-單-、二-或三-鹵代甲基、2’-O-烷基、2’-O-鹵代-取代烷基、2’-烷基、疊氮基、硫代磷酸酯、硫氫基、甲基膦酸酯、熒光素、羅丹明、芘、生物素、黃嘌呤、次黃嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-羥基-6-巰嘌呤、以及在6-位置硫取代的嘧啶堿基、或在5位置鹵代或C15烷基基團取代的嘧啶堿基、非堿基接頭、3’-脫氧腺苷以及其它可用的“鏈終止子”或“不可延伸”類似物(在RNA的3’端)、或者比如32P、33P等標記。前述的所有可以使用本文公開的標準合成技術(shù)并入到適配子。

適配子的利用

本公開的適配子分子可用作分離和純化靶標分子(例如，攜帶CD133的癌癥干細胞)的親和配體；追蹤、監(jiān)測、檢測和定量靶標分子(例如，攜帶CD133的癌癥干細胞)的探針，或者封閉、允許、激活或催化在生理上與實現(xiàn)治療效果有關(guān)的反應的探針。它們可用作藥劑，結(jié)合特定靶標以及將特定分子導向期望位點。

本公開的適配子分子可用于體外過程，例如用于純化靶標分子(例如，攜帶CD133的癌癥干細胞)的親和純化混合物。適配子對于從污染物中色譜分離靶標分子(例如，攜帶CD133的癌癥干細胞)和從細胞培養(yǎng)物或細胞提取物中純化靶標分子是理想的。

在一個實例中，本公開的適配子分子可用作將靶標(例如，攜帶CD133的癌癥干細胞)結(jié)合或固定至固相支持物的捕獲試劑。固相支持物可由具有通常與過濾器、晶圓、晶圓芯片、膜和薄膜有關(guān)的結(jié)構(gòu)和組合物的基底組成。然而，預期固相支持物可由這樣的基底組成，其包括但不限于樹脂、親和樹脂、磁珠或聚合物珠子或用于捕獲或固定用于診斷、檢測或定量研究的試劑的任何診斷性檢測劑。

固相支持物可基于期望的用途包含任何材料，包括但不限于：玻璃、金屬表面，以及諸如鋼材、陶瓷材料或聚合物材料如聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺和聚偏二氟乙烯等的材料，或以上的組合。

CD133抗原

CD133最初稱為AC133，是一種糖蛋白(也稱為Prominin 1)。其為特異性定位至細胞突起的5次跨膜的跨膜糖蛋白的一個成員。CD133表達于造血干細胞、內(nèi)皮祖細胞、惡性膠質(zhì)瘤、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)干細胞、齲源性兒科腦瘤，以及成人腎臟、乳腺、氣管、唾液腺、胎盤、消化道、睪丸和其它細胞類型中。

結(jié)合表達CD133的癌癥干細胞

通過干細胞分化更新成體細胞的最熟知的實例是造血系統(tǒng)。發(fā)育上未成熟的前體細胞如造血干細胞和祖細胞響應分子信號，以逐漸形成不同的血液和淋巴細胞類型。干細胞也存在于其它組織中，包括上皮組織和間質(zhì)組織。癌癥干細胞可起源于這些細胞類型中的任何一種，例如，由于正常干細胞中的遺傳損傷或通過干細胞和/或分化細胞的異常調(diào)節(jié)的增殖而產(chǎn)生。

癌癥干細胞可來源于包含致瘤干細胞的任何癌癥，所述致瘤干細胞即具有廣泛或無限增殖能力的細胞，并且產(chǎn)生了大多數(shù)的癌細胞。在確立的腫瘤中，大多數(shù)細胞已丟失了廣泛增殖和形成新的腫瘤的能力，并且小部分的癌癥干細胞增殖從而再生癌癥干細胞，以及產(chǎn)生缺少致瘤潛力的腫瘤細胞。癌癥干細胞可不對稱地和對稱地分裂，并且可顯示變化的增殖速率。癌癥干細胞可包括已重新獲得了干細胞性能的瞬時性擴增的細胞或祖細胞。

可從中分離干細胞的代表性癌癥包括特征為實體瘤的癌癥，包括例如纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、間皮瘤、尤因氏腫瘤(Ewing’s tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞癌、胚胎性癌、威爾姆氏腫瘤(Wilm’s tumor)、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突膠質(zhì)細胞瘤、腦膜瘤、黑素瘤、成神經(jīng)細胞瘤和成視網(wǎng)膜細胞瘤。

可根據(jù)本公開從中分離或富集干細胞的額外的代表性癌癥包括造血性惡性腫瘤，如B細胞淋巴瘤和白血病，包括低級/濾泡非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴細胞(SL)NHL、中級/濾泡NHL、中級擴散性NHL、高級成免疫細胞性NHL、高級小非切割的細胞NHL、巨大腫塊性疾病(bulky disease)NHL和華氏巨球蛋白血癥(Waldenstrom’s Macroglobulinemia)、慢性白細胞性白血病、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、成淋巴細胞性白血病(lymphoblastic leukemia)、淋巴細胞性白血病、單核細胞性白血病、髓系白血病和前髓系白血病。

可使用本文所述的適配子分子選擇攜帶CD133的癌癥干細胞。例如，與熒光染料偶聯(lián)的適配子可用于主動選擇癌癥干細胞。還已知CD133在一些正常細胞中表達。然而，認為在癌癥干細胞中，CD133表達上調(diào)。癌癥干細胞標記物通常以這樣的水平表達，即比相同來源的分化細胞或非致瘤細胞高至少約5倍，例如，高至少約10倍，或高至少約15倍，或高至少約20倍，或高至少約50倍，或高至少約100倍。選擇過程還可包括陰性選擇標記物，用于排除非癌癥干細胞群中的那些癌細胞。

應理解在實施本公開時，可通過多種不同的方法分離攜帶CD133的細胞。例如，可將本公開的適配子附著于固相支持物以允許粗分離?？筛鶕?jù)分離效率、相關(guān)的細胞毒性、實施的容易程度和速率以及所需的高級設(shè)備和/或?qū)I(yè)技能，采用具有不同效率的不同技術(shù)。用于分離或純化的方法可包括但不限于，使用包被適配子的磁珠的磁力分離、親和色譜和用附著至固體基質(zhì)的適配子進行的“淘選(panning)”。提供精確分離或純化的技術(shù)包括但不限于FACS。準備FACS的方法對技術(shù)人員是顯而易見的。

表達CD133的癌癥干細胞的富集

本公開的適配子可用于從獲自受試者的生物樣品富集癌癥干細胞。通常，所述受試者為患有腫瘤或疑似患有腫瘤的受試者，所述腫瘤含有癌癥干細胞。本文中所用的術(shù)語“富集的”或“富集”或其變型描述這樣的細胞群，即其中當相比未處理的細胞群(例如，樣品中的細胞)時，一種特定細胞類型(即，癌癥干細胞)的比例增加。

在一個實例中，針對癌癥干細胞富集的群包含至少約0.1％或0.5％或1％或2％或5％或10％或15％或20％或25％或30％或50％或75％、80％、或85％、或90％、或95％的攜帶CD133(陽性)的癌癥干細胞。就此而言，術(shù)語“包含癌癥干細胞的富集的細胞群”應理解為給術(shù)語“包含X％的癌癥干細胞的細胞群”提供了明確的支持，其中X％為本文所述的百分比。

在一個實例中，從可選擇形式的包含CD133+細胞的細胞制劑中富集細胞群。就此而言，術(shù)語“可選擇形式”應理解為是指細胞表達允許選擇攜帶CD133的細胞的標記物(例如，細胞表面標記物)。

使用適配子分子對癌癥的診斷/檢測

本公開的適配子可用于體外診斷和/或檢測目的，以確定惡性組織中的癌癥干細胞的存在。所述方法包括檢測生物樣品中CD133+癌癥干細胞的存在。例如，可將生物樣品與本公開的標記的適配子或本公開的適配子-Dox接觸，并測定適配子特異性結(jié)合樣品中的細胞的能力。結(jié)合指示攜帶CD133的癌癥干細胞的存在。本公開的適配子也可用于通過向受試者施用本公開的適配子(其標記有能產(chǎn)生可檢測信號的報告基團)來體內(nèi)定位腫瘤?？蛇x地，或額外地，由于阿霉素具有固有的熒光活性(尤其在遠紅外波長)，該特征可被開發(fā)用于診斷。然后，可使用流式細胞術(shù)、顯微術(shù)、外部閃爍掃描術(shù)、發(fā)射斷層掃描、光學成像或放射核掃描(radionuclear scanning)檢測結(jié)合的適配子。所述方法可用于在受試者中根據(jù)疾病的程度給癌癥分級和監(jiān)測對治療響應的變化。

可通過將適配子與可檢測標記偶聯(lián)來促進癌癥干細胞的檢測?？蓹z測標記的實例包括多種酶、輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)、電子致密標記、MRI標記和放射性物質(zhì)。合適的酶的實例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶。合適的輔基復合物的實例包括鏈霉親和素/生物素和親和素/生物素。合適的熒光物質(zhì)的實例包括傘形酮(umbellifone)、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯代三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白。發(fā)光物質(zhì)的實例包括魯米諾。生物發(fā)光物質(zhì)的實例包括熒光素酶、熒光素和水母素，并且合適的放射性物質(zhì)的實例包括125I、131I、35S、18F、64Cu、94mTc、124I、11C、13N、15O、68Ga、86Y、82Rb或3H。

可通過例如使用Klenow聚合酶的模板延伸，通過T4連接酶介導的連接和末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶來實現(xiàn)適配子的3’端標記?？赏ㄟ^以過量的GTP-β-S補充體外轉(zhuǎn)錄混合物來實現(xiàn)5’端標記，然后可將其硫醇用于附著生物素。另外，將合適的基團直接化學綴合至5’端或3’端可用于標記適配子。

適配子在癌癥治療和治療診斷中的用途

可將本公開的適配子偶聯(lián)至半簇，并用于將所述半簇導向CD133+細胞，優(yōu)選癌癥干細胞。半簇的實例包括可用于殺死癌癥干細胞的毒素、放射性核素或化療劑。

可通過化學合成的半簇和適配子、或通過綴合方式例如用于連接分別制備的適配子和所述半簇的非肽共價鍵(例如非酰胺鍵)，將適配子融合至半簇，例如毒素?？蛇x地，可通過合適的接頭肽連接所述適配子和半簇。

可用的毒素分子包括肽毒素，當存在于細胞中時具有顯著的細胞毒性。毒素的實例包括細胞毒素、破壞酶活性并從而殺死癌癥干細胞的代謝干擾物(抑制劑和活化劑)，以及能殺死具有確定半徑的效應子部分的所有細胞的放射性分子。代謝干擾物是能改變細胞代謝而使得正常功能被改變的分子，例如，酶或細胞因子。在廣義上，術(shù)語毒素包括任何造成腫瘤細胞死亡的效應子。

許多肽毒素具有廣泛性的真核受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域；在這些情況下，必須對毒素進行修飾以防止殺死不攜帶CD133的細胞(例如，防止殺死不攜帶CD133但具有未修飾的毒素的受體的細胞)。必須以保存所述分子的細胞毒性功能的方式進行這樣的修飾。可能有用的毒素包括但不限于：白喉毒素、霍亂毒素、蓖麻毒素、0-志賀樣毒素(SLT-I、SLT-II、SLT-IIV)、LT毒素、C3毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、假單胞菌外毒素、alorin、皂素、莫迪素(modeccin)和白樹毒素(gelanin)。其它毒素包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)和淋巴毒素(LT)。具有抗腫瘤活性的另一種毒素為卡里奇霉素γ1，其為包含具有針對腫瘤的相當大的效力的抗腫瘤抗生素的二炔-烯(Zein N等人(1988).Science 240:1198-201)。

例如，可將白喉毒素(其序列是已知的)綴合至本公開的適配子。由白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diptheriae)分泌的天然的白喉毒素分子由幾個功能域組成，以分子的氨基末端起始，所述功能域可表征為具有酶促活性的片段A(AA 1-193)和片段B(AA 194-535)，所述片段B包括異位結(jié)構(gòu)域和廣義的細胞結(jié)合域(AA 475-535)。

可以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的幾種方式中的任一種連接適配子和毒素半簇。例如，將適配子綴合至毒素(白樹毒素)的方法描述于Chu TC等人.(2006)Cancer Res 6(12)5989-5992中。

所述半簇也可以是在局部水平激活或抑制身體的免疫系統(tǒng)的免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)物。例如，遞送至腫瘤的細胞因子，例如淋巴因子如IL-2，可引起細胞毒性T-淋巴細胞或自然殺傷細胞在腫瘤附近增殖。

半簇或報告基團也可為放射性分子，例如，放射性核素或所謂的敏化劑，例如，在特定條件下變得具有放射性的前體分子，例如，在所謂的“硼中子俘獲治療”(BNCT)中，暴露于低能中子束的硼，所述治療在Barth等人(1990).Scientific American Oct 1990:100-107中有描述?？墒褂镁哂写祟惙派湫孕硬糠值幕衔飦硪种颇[瘤中的癌癥干細胞增殖和標記癌癥干細胞用于成像目的。

放射性核素為可發(fā)射α、β或γ粒子的單原子放射性分子。α粒子發(fā)射體優(yōu)于β或γ粒子發(fā)射體，因為它們在較短的距離釋放高得多的能量輻射，并因此是有效的，而不會顯著地穿透和損傷正常組織。發(fā)射放射性核素的合適的α粒子包括211At、212Pb和212Bi。

放射性分子可以直接或通過雙官能螯合劑與適配子緊密連接。該螯合劑不允許洗脫，并因此過早在體內(nèi)釋放放射性分子。Waldmann,Science,252:1657-62(1991)。例如，為了使BNCT適用于本發(fā)明，可將硼的穩(wěn)定同位素，例如硼10，選為化合物的抗腫瘤半簇或效應子部分。通過適配子與癌癥干細胞的特異性結(jié)合，硼將會被遞送和濃縮至腫瘤細胞中或腫瘤細胞上。在允許積累足夠量的硼的時間后，可以具有約0.025eV的能量的低能中子束對腫瘤進行成像和輻照。雖然該中子輻照自身對腫瘤周圍的健康組織或腫瘤自身造成很少的損傷，硼10(例如，在腫瘤細胞的表面上)會捕獲中子，從而形成不穩(wěn)定同位素硼11。硼11立即裂變產(chǎn)生鋰7核子和高能α粒子，約279萬Ev。這些重粒子是高度致命的，但在很小范圍內(nèi)形成輻射，因為粒子具有僅約一個細胞直徑(10微米)的光程長。

可以附著至本公開的適配子的合適的化療劑可以選自：阿霉素、紫杉醇、細胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根堿、絲裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、長春新堿、長春花堿、秋水仙堿、阿霉素、柔毛霉素、二羥基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素D、1去氫睪酮(1de-hydrotestosterone)、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、和嘌呤霉素、抗代謝物(比如氨甲葉酸、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、氟達拉賓、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪(decarbazine)、羥基脲、門冬酰胺酶、吉西他濱、克拉屈濱)、烷化劑(比如氮芥、嗥替哌(thioepa)、苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)、洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲霉素、達卡巴嗪(DTIC)、甲基芐肼、絲裂霉素C、順鉑和其它鉑衍生物，比如卡波鉑)、抗生素(比如更生霉素(以前的放線菌素)、博來霉素、柔毛霉素(以前的道諾霉素)、伊達比星、光神霉素、絲裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素、氨茴霉素(AMC))。

可選地，所述半簇是能夠插入適配子莖區(qū)序列的化療分子或其它分子。例如，所述化療分子是阿霉素，該分子能夠插入適配子莖的DNA中的CpG位點?；焺┍热绨⒚顾厥枪逃袩晒獾?，這使得使用多種成像技術(shù)便于探查和可視化它們的位置。治療和成像能力相結(jié)合于DOX分子中，這使得它適合用作治療診斷劑。因此，本公開的適配子可以用作治療診斷劑，以遞送阿霉素至癌癥干細胞。為了增加水性溶解度，在阿霉素中的糖的氨基基團可以通過形成DOX氫氯化物而質(zhì)子化。

能夠插入至本公開的適配子的半簇包括：阿霉素、亞德里亞霉素、黃連素、原黃素、米托蒽醌、柔毛霉素、沙利度胺、更生霉素、達諾霉素、放線菌素D、9-氨基吖啶、氨柔比星、安吖啶、蒽環(huán)霉素、小檗因、博來霉素、elliplicine、表柔比星、伊達比星、methpyrillo、光神霉素、絲裂霉素、絲裂霉素C、米托蒽醌、米托蒽醌、吡柔比星、匹克生瓊、普卡霉素、普羅黃素、靈菌紅素、沙利度胺、voreloxin、戊柔比星、佐柔比星、撲爾敏、prodisiosin、methapyrillino、絲裂霉素、偏端霉素、dantinomycin、偏端霉素、卡波鉑、順鉑和其它鉑衍生物、Hoechst 33258、berenil、DAPI、或致癌劑(包括黃曲霉素B1的exo 8,9環(huán)氧化物、吖啶比如普羅黃素或奎納克林或溴化乙錠)。其它GC插入劑是本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且被納入本公開的范圍。

本公開的適配子也可用于將siRNA、核酶或DNA酶遞送至細胞中。

合適的siRNA、核酶或治療劑的實例取決于環(huán)境。適合根據(jù)本公開使用的siRNA或核酶的實例包括靶向ATP結(jié)合盒式膜轉(zhuǎn)運蛋白、多能性基因(Bmi-1、Notch 1、Sox 2、Oct-4、Nanog、β-連環(huán)蛋白、Smo、巣蛋白、ABCG2、Wnt2和SCF等)、GAPDH(甘油醛3-磷酸脫氫酶)和生存素的那些。

例如，這已在現(xiàn)有技術(shù)中使用抗PSMA適配子進行了證明?；趯SMA通過網(wǎng)格蛋白有被小窩內(nèi)化至核內(nèi)體的了解，假定抗PSMA適配子將運載所附著的siRNA至表達PSMA的細胞，并且與PSMA蛋白結(jié)合的適配子-siRNA將通過內(nèi)化進入細胞。接著，siRNA部分將接受Dicer復合物的處理，并送入至RNA誘導沉默復合物(RISC)介導的基因沉默通路。3個研究小組已使用不同的策略來完成這一過程。Chu等人(2006)Nucleic Acids Res 34,e73描述了用于組裝抗PSMA適配子和siRNA的生物素-鏈霉親和素橋聯(lián)介導的綴合方法。McNamara等人.(2006)Nat Biotechnol 24,1005-1015使用“僅RNA”的適配子-siRNA嵌合方法來連接適配子和siRNA。在隨后的Wullner等人(2008).Curr.Cancer Drug Targets 8:554-565的研究中，作者使用抗PSMA適配子來遞送真核延長因子2(EEF2)siRNA至PSMA陽性的前列腺癌細胞，二價的PSMA適配子被用于該目的。作者證明，相比單價的抗PSMA-siRNA嵌合體，二價適配子構(gòu)建物的基因敲低效力較優(yōu)。

本公開的適配子也可用于遞送貨運物至多種實體瘤中的CD133⁺癌癥干細胞。白樹毒素是能抑制蛋白合成過程并且具有細胞毒性的核糖體毒素。然而，其不能透膜，并且需要引導物用于其進入細胞。因此，可使用本公開的適配子來遞送不能透膜的毒素荷載至癌癥干細胞。在另一個實施方案中，本發(fā)明的適配子能夠用于遞送阿霉素(DOX)，所述阿霉素是一種DNA插入化療劑，其本身不能靶向癌癥干細胞、靶向CD133⁺癌癥干細胞。

耐細胞毒性化療劑的腫瘤，部分是由于至癌細胞的遞送不足和癌細胞攝取不足，并且更重要的是癌細胞的流出。來源于聚(D,L-乳酸-乙醇酸共聚物)PLGA的可生物降解的納米粒子(NP)被用于解決這一問題，如Dhar等人(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:17356-17361中所述。簡而言之，通過引入兩個烷基鏈將順鉑轉(zhuǎn)化為其前藥Pt(IV)化合物。這增加了化合物的疏水性，且簡化了將其包裝在NP的疏水核中的過程。聚乙二醇(PEG)被用作合成PLGA-PEG納米粒子的納米沉淀步驟中的共聚物。以PSMA(前列腺特異性膜抗原)適配子修飾PLGA-PEG-NP表面。當以LNCaP細胞孵育時，NP經(jīng)歷內(nèi)吞作用，且烷基化的前藥通過細胞質(zhì)還原過程被轉(zhuǎn)化為順鉑。

本公開還延伸至使用適配子分子同時作為藥物遞送劑和成像劑(治療診斷)。這可通過將適配子綴合至熒光量子點(QD)的表面來實現(xiàn)。接著，用Dox孵育QD-適配子綴合物以形成QD-適配子-Dox納米粒子。Dox和QD均為熒光分子。然而，由于它們在QD-適配子-Dox納米粒子中相互靠近，它們通過雙熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)機制淬滅彼此的熒光。因此，QD-適配子-Dox納米粒子是非熒光的。然而，通過前列腺癌細胞中PSMA介導的內(nèi)吞作用而進行的QD-適配子-Dox納米粒子的內(nèi)化造成Dox從QD-適配子-Dox納米粒子釋放，其引起Dox和QD的熒光的恢復。

藥物組合物

在本公開還提供了一種藥物組合物，其包含本文所描述的適配子、診斷劑或治療診斷劑。本公開的藥物組合物包括制備用于存儲或施用的組合物，包括在藥學上可接受的載體和/或賦形劑中的藥學上有效量的適配子。根據(jù)用于施用的途徑和裝置進行組合物的賦形劑或其它成分的選擇。

術(shù)語“載體”和“賦形劑”是指本領(lǐng)域中常規(guī)使用的用于促進活性化合物的儲存、施用和/或生物活性的物質(zhì)組合物(參見，例如Remington's Pharmaceutical Sciences,16版.,Mac Publishing Company(1980)。載體也可降低活性化合物的任何不需要的副作用。合適的載體為，例如穩(wěn)定的，例如，不能與載體中的其它成分反應。在一個實例中，載體在用于治療的劑量和濃度下不在受體中產(chǎn)生顯著的局部或系統(tǒng)不利影響。

用于本公開的合適載體包括常規(guī)使用的那些，例如，水、鹽水、水性葡萄糖、乳糖、林格氏溶液(Ringer's solution)(一種緩沖溶液)、透明質(zhì)酸和乙二醇，其為示例性的液體載體，特別是(在等滲時)用于溶液。合適的藥物載體和賦形劑包括淀粉、纖維素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、氯化鈉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。

可添加其它的一般添加劑如抗氧化劑、緩沖溶液、抑菌劑等。為了制備可注射的溶液、丸劑、膠囊劑、顆粒劑或片劑，可額外添加稀釋劑、分散劑、表面活性劑、粘合劑和潤滑劑。

如本領(lǐng)域通常已知的，本公開的適配子和其制劑可以直接地或局部地(例如局部給藥)施用給患者或靶標組織或器官。例如，組合物可以包含遞送載體，包括脂質(zhì)體，用于向受試者施用。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法可以將核酸分子施用至細胞，包括但不限于封裝在脂質(zhì)體中通過離子導入(iontophoresis)，或者通過其它載體并入，比如可生物降解聚合物、水凝膠、環(huán)糊精、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)和PLCA微球、可生物降解納米膠囊、和生物黏附微球、或通過蛋白質(zhì)載體。

可用于本公開的適配子的遞送系統(tǒng)包括，例如水性或非水性凝膠、霜、多重乳劑、微乳劑、脂質(zhì)體、膏劑、水性或非水性溶劑、洗劑、噴霧劑、碳氫化合物基質(zhì)和粉劑，并且含有賦形劑，比如增溶劑、滲透促進劑(例如脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)，以及親水性聚合物(例如聚卡波非和聚乙烯基吡咯烷酮)。在一個實施方案中，藥學上可接受的載體是脂質(zhì)體或透皮促進劑。

本公開的藥物組合物是以適于施用例如系統(tǒng)性或局部施用至細胞或受試者(包括例如人)的形式。合適的形式部分取決于用途或進入途徑，例如口服、透皮或通過注射。本領(lǐng)域已知其它因素，以及包括注意事項比如毒性和阻礙組合物發(fā)揮其作用的形式。

可經(jīng)腸胃外(例如，靜脈內(nèi)、皮下、局部或腹膜注射)施用包含本公開的適配子的適配子或組合物?？筛鶕?jù)體重、年齡、性別、健康狀況、飲食、施用頻率、施用方法、排泄物和疾病的嚴重性來確定有效劑量的適配子。在一個實例中，如本文所描述的適配子或治療診斷劑含重量有10-95％的適配子。在另一個實例中，適配子或治療診斷劑含有重量25-75％的適配子。

通常，施用0.1mg/kg至100mg/kg體重/天的活性成分的量。

用于口服使用的制劑也可以作為硬明膠膠囊存在，其中活性成分與惰性固體稀釋劑混合，例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土，或者作為軟明膠膠囊存在，其中活性成分與水或油介質(zhì)混合，例如花生油、液體石蠟或橄欖油。

水性懸浮液含有與適于制備水性懸浮液的賦形劑相混合的適配子。這種賦形劑是懸浮劑，例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、氫丙基-甲基纖維素(hydropropyl-methylcellulose)、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍膠和阿拉伯樹膠；分散或潤濕劑可以是天然產(chǎn)生的磷脂，例如卵磷脂，或者烯化氧與脂肪酸的縮合產(chǎn)物例如聚氧乙烯硬脂酸，或者環(huán)氧乙烷與長鏈脂肪醇的縮合產(chǎn)物例如十七碳亞乙基氧基鯨蠟醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或者環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的縮合產(chǎn)物比如聚氧乙烯山梨醇單油酸酯(polyoxyethylene sorbitol monooleate)，或者環(huán)氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產(chǎn)物例如聚乙烯脫水山梨醇單油酸酯(polyethylene sorbitan monooleate)。水性懸浮液還含有一種或多種防腐劑例如乙烷基或正丙基對羥基苯甲酸、一種或多種著色劑、一種或多種調(diào)味劑、和一種或多種甜味劑比如蔗糖或糖精。

油性懸浮液可以通過將適配子懸浮在植物油中而制劑，例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油，或者在礦物油中制劑，比如液體石蠟。油性懸浮液可以含有增稠劑，例如蜂蠟、硬石蠟或鯨蠟醇?？梢蕴砑犹鹞秳┖驼{(diào)味劑以提供可口的口服制劑。這些組合物可以通過添加抗氧化劑比如抗壞血酸而保存。

分散性粉劑和顆粒劑適于通過添加水制備水性懸浮液，以提供和分散劑或潤濕劑、懸浮劑和一種或多種防腐劑混合的適配子。合適的分散劑或潤濕劑或懸浮劑通過以上提及的那些所示例。也存在額外的賦形劑，例如甜味、調(diào)味和著色劑。

本發(fā)明的藥物組合物還可是水包油的乳劑形式。油相可以是植物油或礦物油或這些的混合物。合適的乳化劑可以是天然產(chǎn)生的膠例如阿拉伯樹膠或黃蓍膠，天然產(chǎn)生的磷脂例如大豆、卵磷脂，以及衍生自脂肪酸和己糖醇、酐的酯或偏酯例如脫水山梨醇單油酸酯，以及所述偏酯和環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物例如聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯。所述乳劑還含有甜味和調(diào)味劑。

無菌注射制劑還可以是在非毒性腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌注射溶液或懸浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。在可接受載體和溶劑中可以被利用的是水、林格氏溶液、等滲氯化鈉溶液以及含有氯化鈉和氯化鉀的等滲鹽溶液。此外，無菌的不揮發(fā)性油常規(guī)用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為此，可以利用任何溫和的不揮發(fā)性油，包括合成的單或二甘油酯。此外，脂肪酸比如油酸應用于注射劑的制備。

應理解，對于任何具體的受試者的具體劑量水平取決于多個因素，包括利用的具體化合物的活性、年齡、體重、一般健康、性別、飲食、施用時間、施用途徑、以及排泄率、藥物組合和接受治療的具體疾病的嚴重性。施用頻率可以是每天、每周或每月一至數(shù)次。

適配子的組合

可根據(jù)本文公開的任何方法，單獨或結(jié)合一種或多種額外的適配子來使用本公開的適配子分子。在一個實例中，可將本公開的適配子分子與可促進癌癥干細胞的檢測、純化或富集的適配子組合。在一個實例中，所述額外的適配子包含Shigdar S等人(2011).Cancer Sci 102(5):991-998中描述的序列EpDT3 5′-GCGACUGGUUACCCGGUCG-3′。在另一個實例中，所述額外的適配子結(jié)合不同的靶標，例如EpCAM。

本公開還包括在5’和/或3’端通過接頭連接有另一個適配子的適配子。本領(lǐng)域已知合適的接頭，并可以包括聚合物比如PEG。

試劑盒

本公開還提供了用于實施本文公開的方法的診斷試劑盒。在一個實例中，所述診斷試劑盒包含用于檢測表達CD133的細胞(例如，癌癥干細胞)的如本文所述的適配子或診斷劑。

所述試劑盒還可包含助劑如緩沖劑和穩(wěn)定劑。所述診斷試劑盒還可包含用于降低背景干擾的試劑、對照試劑和用于進行測試的裝置。通常還包含關(guān)于如何使用所述診斷試劑盒的指導。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應理解可對上述實施方案進行多種變型和/或修改，而不脫離本公開的廣義總體范圍。因此，本實施方案在所有方面應理解為示例性和非限制性的。

實施例

方法

細胞系和細胞培養(yǎng)

購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC，馬納薩斯，VA，美國)的HT-29(人結(jié)腸直腸癌細胞)和HEK293T(人胚胎腎細胞)維持在杜氏改良的伊戈爾介質(zhì)(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM，Invitrogen，維多利亞，澳大利亞)中，其添加了10％胎牛血清(FCS，Hyclone，美國)。將細胞于37℃下孵育在5％CO 2水飽和的氣氛中。

CD133適配子的產(chǎn)生

如在Shigdar S等人(2013)Cancer Letters 330:84-95中描述的產(chǎn)生起始CD133適配子。如圖1中所示，將適配子的莖區(qū)序列替換為DNA莖。

開發(fā)適配子-Dox綴合物

使用VIENNA軟件(http://rna.tbi.univie.ac.at/)預測CD133-適配子的2D結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)指導更準確和更有效的制備適配子-藥物綴合物的特性。設(shè)計用于與化療劑阿霉素(DOX)(SIGMA-ALDRICH)綴合的CD133-適配子由IBA(德國)合成，并儲存在-80℃。綴合之前，通過在85℃加熱5分鐘折疊(folded)適配子，在超過10分鐘緩慢地冷卻至室溫，接著在37℃孵育15分鐘。然后在含有50mM NaCl和2.5mM MgCl2的綴合緩沖液中將DOX與適配子充分混合，并且在37℃，在Orbital混合器/孵育器(RATEK)中以75r.p.m孵育2小時。然后將綴合物經(jīng)過G-50柱(SIGMA-ALDRICH)以將適配子-Dox綴合物與游離的DOX分離。因此適配子-DOX綴合物含有一個或多個DOX分子，所述DOX分子被插入適配子莖區(qū)的DNA序列。

確定DOX和適配子的摩爾比

通過紫外光譜(UV-Spec)，DOX的天然熒光和其插入CD133適配子之后淬滅可以被用于測量DOX綴合的程度以及穩(wěn)定性。使用不同的適配子-Dox摩爾比(0、0.01、0.04、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6)研究綴合過程，并基于游離的DOX的標準曲線使用UV-Spec或熒光讀板機(fluorescence plate reader)分析。

通過HPLC評價DOX負載效率

通過使用乙腈提取綴合物中的DOX，接著使用HPLC定量DOX，確定在不同的適配子/DOX摩爾比時DOX負載效率。簡要地，使用90μl的乙腈稀釋從SephadexG-50柱洗脫的30微升的適配子-Dox綴合物，并旋渦1分鐘。然后將該溶液在21000×g離心5分鐘，將50μl的上清液稀釋于150μL的PBS，充分混合后在21000×g進行另一次離心5分鐘。取100微升的上清液，使用HPLC通過C-18柱經(jīng)反相色譜確定DOX濃度。在HPLC中使用即時UV檢測器定量DOX。在相同的條件下，使用標準的DOX溶液制備校準標準曲線。藥物負載效率(DLE)通過以下公式計算：

分析適配子藥物釋放

使用透析方法，采用Slide-A-Lyzer透析盒(截斷分子量3.5kDa，Thermo SCIENTIFIC，Cat No:66333)確定在體外從適配子-DOX綴合物釋放的DOX。將適配子-Dox綴合物(400μL，1μg/ml DOX)添加至盒中。在黑暗中輕微攪動，在37℃針對PBS和具有10％FCS的PBS在pH 8、7.4或5.0透析所述透析盒。在不同的時間點(10分鐘、0.5小時、1小時、4小時、8小時、24小時和48小時)，從外部緩沖液中取一份30微升的介質(zhì)用于釋放動力學分析，并替換為30μL新鮮的介質(zhì)。使用熒光讀板機(PerkinElmer Life and Analytical Sciences)，根據(jù)DOX濃度對比其熒光強度的標準曲線，將熒光強度轉(zhuǎn)換為DOX的質(zhì)量，來確定DOX的濃度。適配子-Dox的DOX累計釋放以釋放的DOX百分比表示，以時間函數(shù)制圖。

確定適配子-Dox綴合物和其靶標細胞的平衡解離

為最小化非特異性結(jié)合，首先將1×105HT29或HEK293T細胞與封閉緩沖液(含10％FCS、1％BSA和1％tRNA的PBS)孵育20分鐘。然后使用洗滌緩沖液(含有5％FBS和2.5mM MgCl2)洗滌細胞兩次，與CD133適配子、陰性對照適配子、CD133適配子-Dox綴合物或陰性對照適配子-Dox綴合物在冰上孵育1小時，全部使用Cy5在綴合緩沖液中標記(50mM NaCl和2.5mM MgCl2)。

在流式細胞術(shù)分析之前，使用洗滌緩沖液再洗滌細胞兩次，然后懸浮于150μl洗滌緩沖液。然后使用流式細胞儀(FACS CANTOII,Becton Dickerson)收集數(shù)據(jù)，以測量適配子的熒光強度，以陰性對照適配子的熒光背景歸一化熒光強度來確定結(jié)合親和性，然后使用Graph Pad Prism軟件導出。

適配子-DOX綴合物的內(nèi)化

在8室玻片(8-chamber slide)中，以8×10⁵個細胞每孔接種HT29和HEK293T持續(xù)24小時，為共聚焦顯微術(shù)準備。使用封閉緩沖液(含10％FCS、1mg/mL BSA、0.1mg/mL tRNA的PBS)孵育細胞20分鐘，接著使用洗滌緩沖液(含有5％FBS、2.5mM MgCl2和5mM NaCl的PBS)洗滌兩次，之后與200nM適配子、陰性對照適配子、適配子-Dox綴合物或陰性對照適配子-Dox綴合物，在綴合緩沖液中在37℃孵育30分鐘。在孵育的最后15分鐘期間，向細胞添加Bisbenzimide Hoechst 33342(3mg/ml)(Sigma)。移除適配子溶液，在PBS中洗滌細胞3次，每次5分鐘，之后使用FluoView FV10i激光掃描共焦顯微鏡(Olympus)進行可視化。

在體外CSC頻率分析

在80％匯合時，使用胰蛋白酶消化收集細胞，在DMEM/F12無血清介質(zhì)中以單細胞重懸，接著離心(1000×g 5分鐘)。以每孔5、10、50、100、500和1000個細胞的密度，將細胞接種到96孔超低附著板中，或者在6孔超低附著板中4000個細胞/孔，用于腫瘤球形成。使用三個實驗組：腫瘤球介質(zhì)對照、游離DOX處理(1、1.5和2μM)以及適配子-Dox處理(1、1.5和2μM，相當于相同濃度的游離DOX)。在37℃孵育24小時之后，移除上清液，替換為等體積的新鮮的CSC介質(zhì)。腫瘤球定義為具有超過50μm的直徑、邊界輪廓分明的細胞團塊。在接種后3天記錄腫瘤球形成頻率和尺寸。使用ELDA網(wǎng)站(http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html)計算CSC的頻率。根據(jù)公式F＝形成的腫瘤球的數(shù)量/接種的單個細胞的數(shù)量(F是腫瘤球形成頻率)計算在6-孔孵育的腫瘤球形成頻率。

數(shù)據(jù)分析

除非另有說明，數(shù)據(jù)和結(jié)果以平均值和標準差(平均值±S.D.)報告。不同組間平均值的差異使用SPSS 13.0程序的單因素方差分析(ANOVA)進行分析。P值小于0.05被認為是統(tǒng)計上顯著的。

實施例1：DOX與CD133適配子的綴合

目前癌癥治療的主要問題是不能靶向癌癥干細胞(CSC)。為開發(fā)新的靶向CSC的試劑，將本身不能靶向CSC的常用的化療藥物DOX綴合至針對細胞表面標記物CD133的適配子。通過評估適配子結(jié)合親和性和特異性以及藥物的細胞毒性來測試綴合的適配子維持功能的能力。

使用VIENNA軟件(http://rna.tbi.univie.ac.at/)預測CD133適配子的二級結(jié)構(gòu)(圖1)。本發(fā)明人以前確認了CD133和適配子之間的相互作用通過適配子的環(huán)發(fā)生(Shigdar S等人(2013)Cancer Letters 330:84-95)。此外，已知阿霉素(DOX)插入DNA中配對的G-C堿基(圖1B)。因此，在CD133適配子中的RNA莖被替換為10-bp DNA莖以提供DOX負載的平臺。為增加適配子靶標結(jié)合部分和DOX-DNA綴合物的穩(wěn)定性，在DNA莖中使用5’甲基-dC，相比天然的對應物提供了更強的堿基配對。

通過連續(xù)增加的適配子比DOX摩爾比的綴合測定，確定在適配子中DOX負載的最佳摩爾比。為進行該半定量分析，使用UV-Spec和HPLC首先確定在不同濃度的DOX熒光定量評估(圖2)。這提供了測量的熒光強度和游離的DOX的真實濃度之間的關(guān)聯(lián)。通過UV-Spec和高效液相色譜(HPLC)監(jiān)測DOX插入至CD133適配子。圖3顯示DOX的天然熒光，以及之后以CD133適配子比DOX摩爾比0.4:1插入的最大淬滅。適配子負載的DOX隨使用的適配子的濃度增加而增加，且在0.4時達到平臺。該數(shù)據(jù)連同在標準曲線中游離的DOX的基線，允許以淬滅的百分比監(jiān)測DOX與適配子的綴合(圖3)。

實施例2：DOX-適配子綴合物的體外穩(wěn)定性

藥物的控制和持續(xù)釋放對于藥物遞送系統(tǒng)是重要的。本發(fā)明人以前顯示適配子通過內(nèi)吞作用而被內(nèi)化，可能進入核內(nèi)體和溶酶體隔室(compartments)，其具有6.0至5.0的pH，9Shigdar S等人(2011)Cancer science 102:991-998。因此，在PBS和含有胎牛血清(FCS)的PBS中研究在pH范圍中來自適配子-DOX綴合物的DOX體外釋放譜。如在圖4和5中所顯示，在體外DOX從適配子-Dox釋放是依賴pH的，并顯示出少許初始突釋的穩(wěn)定持續(xù)釋放模式。在pH7.4(循環(huán)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的生理pH)，在PBS中48小時后檢測到適配子上插入的DOX的最小釋放。相似地，在pH 8.0，從適配子-Dox釋放的DOX更低。然而在pH 5.0，在PBS中DOX的釋放急劇增加。為模擬在循環(huán)中的條件，在添加有FCS的PBS中測量DOX釋放(圖5)，關(guān)于隨著不同的pH DOX的釋放，發(fā)現(xiàn)與圖4相一致。這種依賴pH的釋放行為是令人滿意的，因為在體內(nèi)系統(tǒng)循環(huán)的中性環(huán)境中DOX應保持與適配子的綴合，并且在內(nèi)化至腫瘤細胞之后在晚期核內(nèi)體/溶酶體的酸性環(huán)境中被釋放。

實施例3：確定適配子綴合物的平衡解離常數(shù)

為確定DOX的綴合是否阻礙結(jié)合親和性和適配子對CD133的特異性，將熒光標記的Cy5適配子-Dox綴合物與HT29結(jié)腸直腸癌細胞孵育，通過流式細胞術(shù)分析確定平衡解離常數(shù)(K_D)(圖6)。在本研究使用的CD133適配子的解離常數(shù)在圖7中顯示。

選擇兩種細胞系HT29和HEK293T用于研究。HT29表達高水平的CD133，然而HEK293細胞系不表達CD133，用作CD133結(jié)合特異性的陰性對照。如在圖6A中所顯示的，適配子-Dox綴合物對陰性對照細胞(HEK293T)具有微不足道的親和性，因為其顯示大于1000nM的K_D。為確定CD133適配子通過特異性分子相互作用結(jié)合CD133，而不是核酸與CD133間非特異性結(jié)合，使用陰性對照適配子-Dox綴合物重復實驗(圖6B)。該陰性對照適配子具有如陽性適配子相同的核酸序列，除了2’-O-甲基修飾替換了2’-氟代化學修飾。

因此，其具有改變的3-D結(jié)構(gòu)，破壞了其對CD133的結(jié)合。陰性對照適配子-Dox還顯示對HT29細胞系不結(jié)合，平衡解離K_D>1000nM。相反，CD133適配子和(圖6C)和CD133適配子-Dox綴合物(圖6D)以高親和性結(jié)合HT29細胞，分別為84.81nM和23.89nM，表明保留親和性，并且使用DOX插入莖提高了親和性。

實施例4：適配子-Dox綴合物的細胞內(nèi)化

質(zhì)膜上存在ABC轉(zhuǎn)運蛋白的提高的表達，將被動擴散到細胞的游離的藥物外排，這是CSC化學抗性的關(guān)鍵機制之一。一種克服這種防御的方式是通過內(nèi)吞作用遞送細胞毒性藥物，因此繞過基于質(zhì)膜的藥物外排泵。為評估CD133適配子-Dox綴合物有效細胞內(nèi)遞送藥物的能力，通過共聚焦顯微術(shù)定性分析綴合物的內(nèi)化(圖8)。使用適配子和DOX處理用于評估內(nèi)化在圖9中顯示。

DOX的激發(fā)和發(fā)射波長分別是480和580nm，同時使用Cy5標記適配子，Cy5具有645/664nm的發(fā)射和激發(fā)波長。即，通過共聚焦流式細胞術(shù)分析的不同的熒光通道，能夠明確鑒定在綴合物中的DOX和適配子。HT29細胞首先與標記有Cy5的CD133適配子孵育，在孵育1小時之后顯示被成功的內(nèi)化(圖8A)。接著，為確定DOX的插入是否能夠影響內(nèi)化，使用適配子-Dox綴合物重復實驗(圖8B)。如在圖8A和B所顯示，綴合物顯示與其僅有CD133適配子的對應物相似的內(nèi)化水平。陰性對照適配子和細胞系(293T)也確認了與親和性結(jié)果相似的綴合物的特異性(圖8C-D)。此外，在圖8E中顯示，使用TRITC通道測量DOX細胞內(nèi)熒光的水平相比游離的DOX更高。

實施例5：適配子-Dox綴合物在體外清除自我更新細胞的能力的確立

功能能力是分析CSC的關(guān)鍵，而非表型表達。這是因為，雖然CSC的特性可以依賴癌癥類型、腫瘤生長的階段和在群中的異質(zhì)性而變化，但保留了自我更新和產(chǎn)生完整子代細胞的能力(Kreso A和O’Brien CA in Current Protocols in Stem Cell Biology(John Wiley和Sons,Inc.,2007)。通過在促進自我更新的條件下的調(diào)節(jié)細胞(CSC的關(guān)鍵性質(zhì))，并且消除終末分化細胞，在體外形成的腫瘤球是自我更新潛能的良好指標(Kreso等人，上文)。以前的研究確認了DOX對殺死CSC是無效的(Zeppernick F等人(2008)Clin Cancer Res 14:123-129，Zhuang X等人(2012)BMC Cancer 12:1-16)。為評價CD133適配子綴合物是否能夠提高DOX針對CSC的細胞毒性能力，進行了上述的腫瘤球形成測定。為分析常規(guī)藥物DOX和新開發(fā)的適配子-Dox綴合物間的CSC靶向差異，使用基于公開的IC50值的DOX的濃度(Poljakova J等人(2008)Interdisciplinary toxicology 1:186-189；Shen F等人(2008)The Journal of pharmacology and experimental therapeutics 324:95-102；Oudard S等人(1991)Cancer chemotherapy and pharmacology 28:259-265)。為了這個目的，在超低附著板中接種不同濃度的HT29細胞。對于96孔超低附著板，以500/孔、200/孔、100/孔、50/孔、10/孔和5/孔的一系列稀釋密度接種細胞。對于6孔超低附著板，以2000/孔或4000/孔的密度接種細胞。細胞與1、1.5、或2μM的游離的DOX或者相同濃度的適配子-DOX孵育。三天以后，評估腫瘤球的尺寸(圖10)以及形成腫瘤球的孔的數(shù)量(圖11)。盡管在更高細胞接種劑量時沒有明顯的球形成抑制(圖11)，但使用適配子-DOX處理的細胞與對照以及游離的DOX相比，腫瘤球尺寸顯著下降(圖10)。

為了在體外獲得適配子-Dox綴合物的真實作用，使用更低接種劑量的細胞(10或5個細胞/孔)(圖11)。使用游離的DOX處理細胞顯示腫瘤球形成的頻率無顯著降低，除了使用5個細胞/孔或更低細胞接種劑量的那些。相反，使用適配子-Dox綴合物處理的細胞，相比PBS對照和游離的DOX顯示腫瘤球形成頻率的顯著降低。為進一步確認使用96孔超低附著板獲得的結(jié)果，使用第二(6孔)版本的腫瘤球測定，以確定獲得的結(jié)果是可重復的(圖12)。在96孔和6孔測定實驗之間的差異是相比在96孔中的單腫瘤球，6孔允許很多腫瘤球的形成。與96孔板情況相似，在6孔板中相比使用游離的DOX或?qū)φ仗幚?，使用適配子-Dox處理腫瘤球的形成急劇降低。