本發(fā)明屬于核酸擴(kuò)增
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因的基因芯片試劑盒。
背景技術(shù)：
：細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)具有重要臨床意義。臨床診斷中存在抗生素的用量大、起點(diǎn)高、種類(lèi)較為隨意的缺陷，從而導(dǎo)致耐藥菌種的產(chǎn)生和流行。目前用于耐藥基因檢測(cè)仍較為傳統(tǒng)，大致有生理生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)等后加以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增相應(yīng)基因的方法，而上述檢測(cè)方法需要時(shí)間長(zhǎng)，方法操作煩瑣、報(bào)告結(jié)果慢、通量低，且往往先鑒定出菌種，才能相應(yīng)的進(jìn)行藥敏等后續(xù)試驗(yàn)，因而難以適應(yīng)臨床治療的需要。因此開(kāi)發(fā)快速高通量的分子診斷技術(shù)檢測(cè)，可以協(xié)助快速診斷，指導(dǎo)及時(shí)準(zhǔn)確用藥。生物芯片技術(shù)是近年來(lái)在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展并成熟的一項(xiàng)高新技術(shù)，主要是通過(guò)微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固相芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸以及其他多種生物成份的準(zhǔn)確、快速、大量信息的檢測(cè)。生物芯片的主要特點(diǎn)是高通量、微型化和自動(dòng)化。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因的引物對(duì)組。本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因的引物對(duì)組，由如下3個(gè)引物對(duì)組成：1)如下(a1)或(a2)所示的引物對(duì)，記為引物對(duì)1：(a1)由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)；(a2)由將序列表中序列1和序列2經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(a1)中所述引物對(duì)功能相同的引物對(duì)；2)如下(b1)或(b2)所示的引物對(duì)，記為引物對(duì)2：(b1)由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)；(b2)由將序列表中序列3和序列4經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(b1)中所述引物對(duì)功能相同的引物對(duì)；3)如下(c1)或(c2)所示的引物對(duì)，記為引物對(duì)3：(c1)由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)；(c2)由將序列表中序列5和序列6經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(c1)中所述引物對(duì)功能相同的引物對(duì)。其中，所述引物對(duì)1用于擴(kuò)增mecA基因；所述引物對(duì)2用于擴(kuò)增vanA基因；所述引物對(duì)3用于擴(kuò)增vanB基因。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因的成套單鏈DNA。本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因的成套單鏈DNA，具體由探針組和所述引物對(duì)組組成；所述探針組由如下3個(gè)單鏈DNA探針組成：序列表中序列7所示的單鏈DNA探針1；序列表中序列8所示的單鏈DNA探針2；序列表中序列9所示的單鏈DNA探針3。其中，所述單鏈DNA探針1用于檢測(cè)所述引物對(duì)1的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針2用于檢測(cè)所述引物對(duì)2的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針3用于檢測(cè)所述引物對(duì)3的擴(kuò)增結(jié)果。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因的試劑盒。本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因的試劑盒，含有所述引物對(duì)組，以及雜交芯片；所述雜交芯片是按照包括如下步驟的方法制備獲得的：將通式為“NH2-(T)n-雜交探針序列”的3種單鏈檢測(cè)探針?lè)謩e通過(guò)氨基與醛基的反應(yīng)固定到醛基修飾化的固相載體(如玻片)上，獲得所述雜交芯片；所述通式中的(T)n表示n個(gè)連續(xù)的T，n為大于等于5，且小于等于30的整數(shù)；所述通式中對(duì)應(yīng)于所述3種單鏈檢測(cè)探針的3種雜交探針序列分別如序列表中序列7-9所示。根據(jù)需要，所述試劑盒中還可含有經(jīng)熒光標(biāo)記的隨機(jī)引物；所述隨機(jī)引物的序列為5’-NX-3’，N表示A、G、C和T中的任一種，6≤X≤15，且X為整數(shù)(如X＝9)，NX表示X個(gè)連續(xù)的脫氧核糖核苷酸。以上所述經(jīng)熒光標(biāo)記的隨機(jī)引物是用于對(duì)所述引物對(duì)組中的引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光標(biāo)記的。根據(jù)需要，也可以不采用所述經(jīng)熒光標(biāo)記的隨機(jī)引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光標(biāo)記，而是采用其他方法。如將所述引物對(duì)組中每個(gè)引物對(duì)的一條引物的5’末端進(jìn)行熒光標(biāo)記(如TAMRA)，被熒光標(biāo)記的引物是存在于擴(kuò)增產(chǎn)物中可被相應(yīng)探針雜交的單鏈DNA上的引物。所述試劑盒中還可含有雜交液；所述雜交液中含有經(jīng)熒光標(biāo)記的無(wú)關(guān)單鏈DNA分子；所述無(wú)關(guān)單鏈DNA分子為非源自于所述細(xì)菌耐藥基因的單鏈DNA分子。所述雜交芯片的制備方法還包括將表面化學(xué)質(zhì)控探針QC、和/或雜交質(zhì)控探針PC、和/或陰性對(duì)照探針BC通過(guò)氨基與醛基的反應(yīng)固定到所述醛基修飾化的固相載體 (如玻片)上的步驟；所述表面化學(xué)質(zhì)控探針QC、所述雜交質(zhì)控探針PC和所述陰性對(duì)照探針均為單鏈探針；所述表面化學(xué)質(zhì)控探針QC的一端經(jīng)氨基修飾，另一端具有熒光標(biāo)記(如Hex)；所述雜交質(zhì)控探針PC的一端經(jīng)氨基修飾，且能與所述雜交液中的所述無(wú)關(guān)單鏈DNA分子雜交；所述陰性對(duì)照探針BC的一端經(jīng)氨基修飾，且與源自于所述革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因的任何單鏈DNA分子均不能雜交。進(jìn)一步，在本發(fā)明中，所述表面化學(xué)質(zhì)控探針QC自5’端到3’端的結(jié)構(gòu)組成為“NH2-TCACTTGCTTCCGTTGAGG-Hex”；所述雜交質(zhì)控探針PC自5’端到3’端的結(jié)構(gòu)組成為“NH2-TTTTTTTTTTTTCCTCAACGGAAGCAAGTGAT”；所述陰性對(duì)照探針BC自5’端到3’端的結(jié)構(gòu)組成為“NH2-TTTTTTTTTTTTGTTGCTTCTGGAATGAGTTTGCT”。所述引物對(duì)組或所述成套單鏈DNA或所述試劑盒在如下(a)或(b)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：(a)檢測(cè)或輔助檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因(非診斷目的)，或制備用于檢測(cè)或輔助檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因的產(chǎn)品；(b)檢測(cè)或輔助檢測(cè)含有革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因的細(xì)菌(非診斷目的)，或制備用于檢測(cè)或輔助檢測(cè)含有革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因的細(xì)菌的產(chǎn)品。在本發(fā)明中，所述革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因具體可為如下中的至少一種：mecA基因、vanA基因、vanB基因。所述mecA基因的GenBank登錄號(hào)為AB221119.1(update：2006-5-19)；所述vanA基因的GenBank登錄號(hào)為M97297.1(update：2002-6-20)；所述vanB基因的GenBank登錄號(hào)為AY655711.1(update：2005-11-7)。相應(yīng)的，含有所述mecA基因的細(xì)菌具體可為金黃色葡萄球菌；含有所述vanA基因的細(xì)菌具體可為糞腸球菌或屎腸球菌；含有所述vanB基因的細(xì)菌具體可為糞腸球菌或屎腸球菌。所述引物對(duì)組或所述成套單鏈DNA在制備所述試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明對(duì)極大樣本量的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因進(jìn)行研究。本發(fā)明提供的試劑盒支持高通量，快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)多個(gè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因，對(duì)中國(guó)人群進(jìn)行篩查，能有效地起到準(zhǔn)確診斷、耐藥溯源、耐藥控制等作用，從而抗生素使用量，減少耐藥產(chǎn)生。附圖說(shuō)明圖1為雜交芯片的點(diǎn)陣排布示意圖(即芯片探針布局示意圖)。-表示沒(méi)有固定任 何探針。圖2為用于檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因的試劑盒的特異性分析結(jié)果。該圖對(duì)應(yīng)的芯片探針布局示意圖如圖1所示。其中，A所示芯片檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)的參考品DNA質(zhì)粒為ZL-vanA(對(duì)應(yīng)vanA基因)；B所示芯片檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)的參考品DNA質(zhì)粒為ZL-vanB(對(duì)應(yīng)vanB基因)；C所示芯片檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)的參考品DNA質(zhì)粒為ZL-mecA(對(duì)應(yīng)mecA基因)。圖3為用于檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因的試劑盒的臨床樣本檢測(cè)結(jié)果。該圖對(duì)應(yīng)的芯片探針布局示意圖如圖1所示。其中，A所示芯片檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)1號(hào)臨床樣本；B所示芯片檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)2號(hào)臨床樣本；C所示芯片檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)3號(hào)臨床樣本。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、用于檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因的試劑盒的制備及其使用一、用于檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因的試劑盒的組裝與制備1、針對(duì)3個(gè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因設(shè)計(jì)的引物和雜交探針針對(duì)3個(gè)細(xì)菌耐藥基因設(shè)計(jì)的引物和單鏈雜交探針具體序列如表1和表2所示。表1針對(duì)3個(gè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因設(shè)計(jì)的引物表2針對(duì)3個(gè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因設(shè)計(jì)的單鏈雜交探針編號(hào)檢測(cè)基因GenBank探針名稱(chēng)序列(5’-3’)1mecAAB221119.1mecA-1427GTAGCACTCGAATTAGGCAG(序列7)2vanAM97297.1vanA-379TGTAGGCTGCGATATTCAAA(序列8)3vanBAY655711.1vanB-793GTCGAGGAACGAAATCGGGT(序列9)2、將雜交探針固定于雜交芯片雜交芯片為分別固定有3種單鏈檢測(cè)探針的基片。每種檢測(cè)探針都是一段氨基修飾的寡核苷酸探針，3種單鏈檢測(cè)探針的通式為“NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-雜交探針序列”，其中“雜交探針序列”即為表2中序列7-9所示的3種單鏈雜交探針”。各檢 測(cè)探針?lè)謩e用基因點(diǎn)樣液(博奧生物集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為CP.440010)溶解，終濃度為10μM，重復(fù)三次點(diǎn)制到醛基化修飾的玻片(博奧生物集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為CP.420022)上，從而通過(guò)氨基與醛基的反應(yīng)將3種探針固定到雜交芯片上。另外，同樣通過(guò)氨基與醛基的反應(yīng)將表面化學(xué)質(zhì)控探針QC、雜交質(zhì)控探針PC和陰性對(duì)照探針BC也固定到雜交芯片上。QC是一端帶有Hex標(biāo)記，另一端具有氨基修飾的單鏈寡核苷酸探針，用于觀察芯片點(diǎn)樣和固定的效率，其自5’端到3’端的結(jié)構(gòu)組成為NH2-TCACTTGCTTCCGTTGAGG-Hex。PC是一段氨基修飾的單鏈寡核苷酸探針，可以與雜交液中添加的經(jīng)熒光標(biāo)記的無(wú)關(guān)單鏈DNA分子(C-PC)雜交，用于雜交過(guò)程的質(zhì)控，其自5’端到3’端的結(jié)構(gòu)組成為NH2-TTTTTTTTTTTTCCTCAACGGAAGCAAGTGAT。BC是一段氨基修飾的寡核苷酸探針，與雜交體系中的所有待檢測(cè)序列均不會(huì)雜交，用于觀察有無(wú)非特異雜交，其自5’端到3’端的結(jié)構(gòu)組成為NH2-TTTTTTTTTTTTGTTGCTTCTGGAATGAGTTTGCT。圖1為雜交芯片的點(diǎn)陣排布示意圖。3、用于檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因的試劑盒的組成本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因(即表1和表2中涉及的3種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因)的試劑盒含有：(1)步驟1中表1所示的3個(gè)引物對(duì)；(2)步驟2中固定有3種檢測(cè)探針以及表面化學(xué)質(zhì)控探針QC、雜交質(zhì)控探針PC和陰性對(duì)照探針BC的雜交芯片；(3)經(jīng)熒光標(biāo)記的隨機(jī)引物；所述隨機(jī)引物的序列為5’-N9-3’，N表示A、G、C和T中的任一種，N9表示9個(gè)連續(xù)的脫氧核糖核苷酸。(4)雜交液；所述雜交液中含有經(jīng)熒光標(biāo)記的無(wú)關(guān)單鏈DNA分子(C-PC)，其核苷酸序列為5’-ATCACTTGCTTCCGTTGAGG-3’。二、用于檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因的試劑盒的使用方法1、樣品聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增取1μL待測(cè)的DNA樣品溶液，以其為模板，分別采用表1所示的3個(gè)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。20μLPCR擴(kuò)增體系如下：10×PCRbuffer(含Mg2+)2μL；2.5mMdNTP1.6μL；10μM上游引物0.5μL；10μM下游引物0.5μL；模板1μL；5U/μLrTaq0.2μL；補(bǔ)水至20μL。PCR擴(kuò)增程序如下：94℃5min；(94℃30s；55℃30s；72℃1min)30循環(huán)；72℃10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后共得到3份PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。2、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光標(biāo)記每種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物取5μL，加入到不同樣品管中，每個(gè)樣品管中加入3μL濃度 為100μM的經(jīng)TAMRA熒光標(biāo)記的9N隨機(jī)引物(核苷酸序列為5’-N9-3’，N表示A、G、C和T中的任一種，N9表示9個(gè)連續(xù)的脫氧核糖核苷酸，具體為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品)，補(bǔ)水至19μL，震蕩混勻，瞬時(shí)離心；95℃變性后置于冰上，加入6μL熒光標(biāo)記反應(yīng)體系mix(組成：10×KlenowBuffer2.5μL；5U/μLKlenow酶1μL；2.5mMdNTP2.5μL)。按程序進(jìn)行熒光標(biāo)記，程序如下：37℃90min；70℃10min。共得到3份TAMRA熒光標(biāo)記產(chǎn)物。3、TAMRA熒光標(biāo)記產(chǎn)物的純化使用Macherey-Nagel公司生產(chǎn)的NucleoSpinGelandPCRClean-up試劑盒(產(chǎn)品貨號(hào)：REF740609*250)，對(duì)步驟2獲得的TAMRA熒光標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行純化，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。4、雜交將含有經(jīng)TAMRA熒光標(biāo)記的無(wú)關(guān)單鏈DNA分子(5’-ATCACTTGCTTCCGTTGAGG-3’)的雜交buffer(博奧生物集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為CP.440030)在50℃融化，配制3份雜交混合液(其中步驟3純化后的TAMRA熒光標(biāo)記產(chǎn)物溶液15μL，雜交buffer5μL)，將配制好的3份雜交混合液加入到步驟一2中的雜交芯片上，每份雜交混合液對(duì)應(yīng)一個(gè)完整雜交芯片，95℃變性3min，立即放置冰上，并50℃水浴雜交2h。5、清洗用兩種不同洗液(洗液I：2×SSC，0.2％SDS，預(yù)熱至50℃；洗液II：0.2×SSC，預(yù)熱至50℃)按照先洗液I后洗液II的順序分別清洗4min后，把芯片放在SlideWasher_8芯片清洗儀中，選擇離心程序，離心(或離心機(jī)1000rpm離心2min)，甩干。6、掃描及結(jié)果判定使用博奧晶芯LuxScan10K微陣列芯片掃描儀完成掃描(選擇綠色通道，設(shè)定“Power”的參數(shù)范圍為50-90和“PMT”的參數(shù)范圍為500-900)，并根據(jù)掃描結(jié)果按照如下方法確定待測(cè)DNA樣品中是否含有表1中涉及的3種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因，以及具體含有3種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因中的哪一種或哪幾種：用于檢測(cè)某革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因的探針在芯片上的固定位置處如果檢測(cè)到熒光信號(hào)，則判定對(duì)應(yīng)的待測(cè)DNA樣品中含有對(duì)應(yīng)的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因；否則則不含有對(duì)應(yīng)的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因。另外，掃描過(guò)程中軟件會(huì)根據(jù)檢測(cè)到的熒光信號(hào)強(qiáng)度賦予不同顏色，顏色由藍(lán)色至白色，信號(hào)逐漸增強(qiáng)，進(jìn)而可初步判斷待測(cè)DNA樣品中目標(biāo)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因含量的高低。實(shí)施例2、用于檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因的試劑盒的特異性和靈敏度測(cè)定一、參考品DNA質(zhì)粒的制備1、含有mecA基因靶標(biāo)片段的質(zhì)粒的構(gòu)建將mecA基因(GenBank：AB221119.1，update：2006-5-19)的第1001-1926位所示DNA片段連接至pGEM-TEasyVector載體(promega公司產(chǎn)品)上，得到重組質(zhì)粒ZL-mecA。并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確。2、含有vanA基因靶標(biāo)片段的質(zhì)粒的構(gòu)建將vanA基因(GenBank：M97297.1，update：2002-6-20)的第7000-7988位所示DNA片段連接至pGEM-TEasyVector載體上，得到重組質(zhì)粒ZL-vanA。并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確。3、含有vanB基因靶標(biāo)片段的質(zhì)粒的構(gòu)建將vanB基因(GenBank：AY655711.1，update：2005-11-7)的第14-1029位所示DNA片段連接至pGEM-TEasyVector載體上，得到重組質(zhì)粒ZL-vanB。并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確。二、用于檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因的試劑盒的特異性分析將步驟一構(gòu)建的3種參考品DNA質(zhì)粒均稀釋至濃度為104拷貝/μL，分別以稀釋后的3種參考品DNA質(zhì)粒為待測(cè)DNA樣品，然后按照實(shí)施例1步驟二進(jìn)行操作，檢測(cè)待測(cè)DNA樣品中是否含有目的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因，具體判定方法參見(jiàn)實(shí)施例1步驟二6。結(jié)果如圖2所示，由圖可見(jiàn)對(duì)于每一種參考品DNA質(zhì)粒而言，均僅為固定了相應(yīng)檢測(cè)探針的點(diǎn)能夠檢測(cè)到明顯熒光信號(hào)，其他點(diǎn)均沒(méi)有檢測(cè)到熒光信號(hào)。該結(jié)果表明本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因的試劑盒具有較強(qiáng)的特異性。三、用于檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因的試劑盒的靈敏度分析將上述步驟一構(gòu)建的3種參考品DNA質(zhì)粒分別進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)玫綕舛纫来螢?04拷貝/μL、103拷貝/μL、102拷貝/μL、101拷貝/μL的稀釋液。分別以不同稀釋度的3種參考品DNA質(zhì)粒為待測(cè)DNA樣品，然后按照實(shí)施例1步驟二進(jìn)行操作，檢測(cè)待測(cè)DNA樣品中是否含有目的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因，具體判定方法參見(jiàn)實(shí)施例1步驟二6。結(jié)果顯示：對(duì)于每一種參考品DNA質(zhì)粒而言，濃度為104拷貝/μL、103拷貝/μL、102拷貝/μL時(shí)相應(yīng)檢測(cè)探針的點(diǎn)都能夠檢測(cè)到明顯熒光信號(hào)；僅濃度為101拷貝/μL的參考品DNA質(zhì)粒沒(méi)有檢測(cè)到熒光信號(hào)。該結(jié)果表明本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因的試劑盒具有較高的靈敏度。實(shí)施例3、實(shí)際臨床樣品的檢測(cè)一、臨床樣本類(lèi)型本實(shí)施例所采用臨床樣本來(lái)自于北京大學(xué)人民醫(yī)院采集的人傷口處粘稠膿液(本著本采集者自愿的原則)，共三份。二、臨床樣本中DNA樣品的提取1、取步驟一的臨床樣本1-3mL；2、加入4倍體積4％(4g/100mL)的NaOH，搖勻，室溫放置30min液化；3、取0.5ml液化后膿液與0.5mL4％(4g/100mL)的NaOH，室溫，10min；4、12000rpm離心15min；5、棄上清，加無(wú)菌生理鹽水1mL，混勻，12000rpm離心5min；6、棄上清，沉淀用于DNA提取；7、加入50μL核酸提取液(博奧生物集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為CP.360090)，充分震蕩混勻，使沉淀完全懸浮；8、將懸浮液轉(zhuǎn)移至核酸提取管中，旋緊管蓋，放入核酸提取儀或渦旋震蕩儀上最大轉(zhuǎn)速震蕩5min；9、95℃金屬浴加熱5min；10、5000rpm離心1min，將上清液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?、?shí)際臨床樣品的檢測(cè)將步驟二獲得的三份臨床樣本DNA為待測(cè)DNA樣品，然后按照實(shí)施例1步驟二進(jìn)行操作，檢測(cè)待測(cè)DNA樣品中是否含有目的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌耐藥基因，具體判定方法參見(jiàn)實(shí)施例1步驟二6。結(jié)果如圖3所示，由圖可見(jiàn)三份樣本雜交信號(hào)均清晰且單一。經(jīng)與探針位置比對(duì)，1號(hào)臨床樣本中檢測(cè)得到信號(hào)為耐藥基因mecA，2號(hào)臨床樣本中檢測(cè)得到信號(hào)為耐藥基因mecA和耐藥基因vanA，3號(hào)臨床樣本中檢測(cè)得到信號(hào)為耐藥基因vanB。為了進(jìn)一步確定以上本發(fā)明檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本發(fā)明的發(fā)明人將三份臨床樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了瓊脂糖凝膠電泳及測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)：1號(hào)臨床樣本僅采用引物對(duì)mecA-F/mecA-R的擴(kuò)增產(chǎn)物具有明顯的電泳條帶，而其他引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物均沒(méi)有檢測(cè)到明顯的電泳條帶，進(jìn)一步對(duì)引物對(duì)mecA-F/mecA-R的擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序發(fā)現(xiàn)其序列正為mecA基因(GenBank：AB221119.1，update：2006-5-19)的第1001-1926位；2號(hào)臨床樣本僅采用引物對(duì)mecA-F/mecA-R和vanA-F/vanA-R的擴(kuò)增產(chǎn)物具有明顯的電泳條帶，而其他引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物均沒(méi)有檢測(cè)到明顯的電泳條帶，進(jìn)一步對(duì)引物對(duì)mecA-F/mecA-R和vanA-F/vanA-R的擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序發(fā)現(xiàn)其序列正為mecA基因(GenBank：AB221119.1，update：2006-5-19)的第1001-1926位和vanA基因(GenBank： M97297.1，update：2002-6-20)的第7000-7988位；3號(hào)臨床樣本僅采用引物對(duì)vanB-F/vanB-R的擴(kuò)增產(chǎn)物具有明顯的電泳條帶，而其他引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物均沒(méi)有檢測(cè)到明顯的電泳條帶，進(jìn)一步對(duì)引物對(duì)vanB-F/vanB-R的擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序發(fā)現(xiàn)其序列正為vanB基因(GenBank：AY655711.1，update：2005-11-7)的第14-1029位。該結(jié)果證明利用本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3