動物源細菌的酰胺醇類藥物耐藥基因四重pcr檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種動物源細菌的酰胺醇類藥物耐藥基因四重PCR檢測試劑盒。本發(fā)明提供了檢測細菌對酰胺醇類藥物耐藥性的引物組，由引物對1、引物對2、引物對3和引物對4組成；本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明根據(jù)細菌中主要的4個酰胺醇類藥物耐藥基因（cfr、fexA、fexB、floR）的核苷酸序列設(shè)計合成4對相應(yīng)的特異性PCR引物，利用四重PCR對待檢測細菌中酰胺醇類藥物耐藥基因進行擴增，具有高效、快速、成本低、實用性強等特點。
【專利說明】動物源細菌的酰胺醇類藥物耐藥基因四重PCR檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及動物源細菌的酰胺醇類藥物耐藥基因四重 PCR檢測試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 抗生素藥物在控制人類和動物傳染性疫病以及降低傳染病發(fā)病率和死亡率方面 起到了關(guān)鍵性作用。但隨著動物飼養(yǎng)的集約化程度的逐漸提高，用藥量不斷增大，使得細菌 耐藥性產(chǎn)生和傳播更加迅速，從而為細菌性疾病的治療帶來了極大的挑戰(zhàn)。目前細菌耐藥 性問題已成為全球范圍內(nèi)臨床用藥、新型藥物研究開發(fā)等領(lǐng)域最為熱點的問題之一。
[0003] 酰胺醇類藥物包括氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，此類藥物因其抗菌譜廣、吸收 快、體內(nèi)分布廣泛在獸醫(yī)臨床上發(fā)揮著舉足輕重的作用。酰胺醇類藥物作用機制主要是通 過與50S亞基結(jié)合，阻斷肽酰轉(zhuǎn)移酶的作用，干擾帶有氨基酸的氨基酰-tRNA終端與50S亞 基結(jié)合，從而使新肽鏈形成受阻，抑制蛋白質(zhì)合成。
[0004] 隨著對氯霉素和甲砜霉素的潛在毒性、殘留和耐藥性的研究的深入，包括中國在 內(nèi)的許多國家已陸續(xù)禁止其在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用。20世紀(jì)90年代，美國先靈-葆雅公司 研制的新合成酰胺醇類廣譜抗生素投入市場，結(jié)構(gòu)的改造與修飾使得氟苯尼考在安全性和 有效性方面比氯霉素和甲砜霉素有著明顯的優(yōu)勢，主要用于治療牛、豬、禽及魚類的細菌性 疾?。ù竽c埃希氏菌、克雷伯氏桿菌、溶血性巴氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、奇異變形桿菌、金 黃色葡萄球菌、胸膜肺炎放線桿菌及傷寒沙門氏菌等)。1999年4月氟苯尼考在我國批準(zhǔn)上 市，廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，逐漸成為應(yīng)用最廣泛的獸用抗生素之一。但隨著用藥的增多， 臨床上對氟苯尼考耐藥的菌株也不斷出現(xiàn)，這勢必給臨床治療帶來嚴(yán)重威脅。
[0005] 細菌耐藥性檢測對于指導(dǎo)臨床精確用藥，及時診斷治療具有重要的意義。傳統(tǒng)的 耐藥檢測是用紙片擴散法（K-B法)、MIC稀釋法和E試驗來檢測細菌耐藥的表型，雖然該方 法能夠直觀的觀察到細菌對某種藥物的敏感和耐藥，但首先需要對細菌進行分離培養(yǎng)和純 化，并且操作繁瑣、經(jīng)驗依賴性強、耗時較長，遠遠不能夠滿足臨床快速診斷和治療的需要。 同時，由于傳統(tǒng)的方法是在體外人為條件下對基因型的表達型進行檢測，因此對其產(chǎn)生影 響的不確定因素較多，且僅能檢測細菌的表型耐藥特性，不能檢測其隱型耐藥性。
[0006] 隨著越來越多的分子生物學(xué)技術(shù)被應(yīng)用于耐藥性的檢測，不僅為臨床耐藥性檢測 提供了快速敏感且更加可靠的方法，同時也在解釋耐藥機制方面起著關(guān)鍵作用，為開展動 物源病原菌耐藥性監(jiān)測與流行病學(xué)研究以及新型抗生素的開發(fā)研制提供了重要的科學(xué)依 據(jù)。起初，常規(guī)的PCR技術(shù)結(jié)合探針鑒定或電泳分析對單個耐藥基因的檢測上發(fā)揮了重要 的作用。但在臨床上，即使是同一類抗生素的耐藥也可能是由于不同的機制，即使是同一種 機制也可能是由不同的耐藥基因引起的，并且由于一些耐藥基因的可轉(zhuǎn)移性，臨床菌株顯 示出越來越多的多重耐藥，而傳統(tǒng)的單重PCR由于檢測指標(biāo)單一，遠不能滿足臨床檢測的 要求，因此，多重PCR應(yīng)運而生，實現(xiàn)了多目標(biāo)的檢測。
[0007] 多重PCR技術(shù)是在反應(yīng)體系中加入多對引物進行PCR反應(yīng)，同時擴增一份樣本中 的不同DNA序列區(qū)域，一次反應(yīng)能夠富集多個目的基因片段，并根據(jù)電泳結(jié)果中不同長度 片段是否存在來判定是否含有目的基因。多重PCR因其高特異性、高效率、低成本的優(yōu)勢， 已被應(yīng)用于生命科學(xué)的各個領(lǐng)域。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測或輔助檢測細菌中耐藥基因的引物組。
[0009] 本發(fā)明提供的檢測或輔助檢測細菌中耐藥基因的引物組，由引物對1、引物對2、 引物對3和引物對4組成；
[0010] 所述引物對1由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單 鏈DNA分子組成；
[0011] 所述引物對2由序列表中序列3所示的單鏈DNA分子和序列表中序列4所示的單 鏈DNA分子組成；
[0012] 所述引物對3由序列表中序列5所示的單鏈DNA分子和序列表中序列6所示的單 鏈DNA分子組成；
[0013] 所述引物對4由序列表中序列7所示的單鏈DNA分子和序列表中序列8所示的單 鏈DNA分子組成。
[0014] 上述引物組中，所述引物組中各條引物均為等摩爾比；
[0015] 所述耐藥為耐酰胺醇類藥物；所述酰胺醇類藥物具體為氟苯尼考或氯霉素；
[0016] 所述耐藥基因為floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因中至少一種。
[0017] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測或輔助檢測細菌中耐藥基因的PCR試劑。
[0018] 本發(fā)明提供的PCR試劑，由上述的引物組、PCR擴增緩沖液和水組成；
[0019] 所述引物組中的4種引物對中的各條引物在所述PCR試劑中的終濃度均為 0.2 μ mol/L ；
[0020] 所述耐藥為耐酰胺醇類藥物；所述酰胺醇類藥物具體為氟苯尼考或氯霉素；
[0021] 所述耐藥基因具體為floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因中至少一種。
[0022] 上述PCR擴增緩沖液為Premix Ex Taq溶液，購自Takara公司Code:D335A，其各 組分及濃度為1. 25U/25 μ 1的Taq聚合酶、濃度均為0. 4mmol/L的dNTP、濃度為4mmol/L的 Mg2.。
[0023] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種檢測或輔助檢測細菌中耐藥基因的PCR試劑盒。
[0024] 本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述的引物組或上述PCR試劑；所述耐藥為耐酰胺醇 類藥物；所述酰胺醇類藥物具體為氟苯尼考或氯霉素；
[0025] 所述耐藥基因具體為floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因中至少一種。
[0026] 上述的引物組或上述PCR試劑或上述試劑盒在檢測和/或輔助檢測待測細菌是否 含有耐藥基因中的應(yīng)用；
[0027] 或上述的引物組或上述PCR試劑在制備檢測和/或輔助檢測待測細菌是否含有耐 藥基因產(chǎn)品中的應(yīng)用；
[0028] 或上述的引物組或上述PCR試劑在制備檢測和/或輔助檢測待測細菌是否耐酰胺 醇類藥物產(chǎn)品中的應(yīng)用；
[0029] 所述耐藥為耐酰胺醇類藥物；所述酰胺醇類藥物具體為氟苯尼考或氯霉素；上述 產(chǎn)品為試劑盒；
[0030] 所述耐藥基因具體為floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因中至少一種。
[0031] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種檢測和/或輔助檢測待測細菌是否含有耐藥基 因的方法。
[0032] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：用上述的引物組或上述PCR試劑對所述待測 樣品進行四重PCR擴增，檢測PCR產(chǎn)物；
[0033] 若得到的PCR產(chǎn)物具有200bp、348bp、534bp和683bp大小，則待測細菌含有或候 選含有4種耐藥基因：floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因；若得到的PCR產(chǎn)物不具 有200bp、348bp、534bp和683bp任一種大小，則待測細菌不含有或候選不含有4種耐藥基 因中任一種：floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因；
[0034] 若得到的PCR產(chǎn)物具有200bp大小，則待測細菌含有或候選含有floR基因；若得 到的PCR產(chǎn)物不具有200bp大小，則待測細菌不含有或候選不含有floR基因；
[0035] 若得到的PCR產(chǎn)物具有348bp大小，則待測細菌含有或候選含有fexB基因；若得 到的PCR產(chǎn)物不具有348bp大小，則待測細菌不含有或候選不含有fexB基因；
[0036] 若得到的PCR產(chǎn)物具有534bp大小，則待測細菌含有或候選含有cfr基因；若得到 的PCR產(chǎn)物不具有534bp大小，則待測細菌不含有或候選不含有cfr基因；
[0037] 若得到的PCR產(chǎn)物具有683bp大小，則待測細菌含有或候選含有fexA基因；若得 到的PCR產(chǎn)物不具有683bp大小，則待測細菌不含有或候選不含有fexA基因；
[0038] 若得到的PCR產(chǎn)物具有200bp和348bp大小，則待測細菌含有或候選含有floR基 因和fexB基因；若得到的PCR產(chǎn)物不具有200bp和348bp大小，則待測細菌不含有或候選 不含有floR基因和fexB基因；
[0039] 若得到的PCR產(chǎn)物具有200bp和534bp大小，則待測細菌含有或候選含有floR基 因和cfr基因；若得到的PCR產(chǎn)物不具有200bp和534bp大小，則待測細菌不含有或候選不 含有floR基因和cfr基因；
[0040] 若得到的PCR產(chǎn)物具有200bp和683bp大小，則待測細菌含有或候選含有floR基 因和fexA基因；若得到的PCR產(chǎn)物不具有200bp和683bp大小，則待測細菌不含有或候選 不含有floR基因和fexA基因；
[0041] 若得到的PCR產(chǎn)物具有348bp和534bp大小，則待測細菌含有或候選含有fexB基 因和cfr基因；若得到的PCR產(chǎn)物不具有348bp和534bp大小，則待測細菌不含有或候選不 含有fexB基因和cfr基因；
[0042] 若得到的PCR產(chǎn)物具有348bp和683bp大小，則待測細菌含有或候選含有fexB 基因和fexA基因；若得到的PCR產(chǎn)物不具有348bp大小，則待測細菌不含有或候選不含有 fexB基因和fexA基因；
[0043] 若得到的PCR產(chǎn)物具有534bp和683bp大小，則待測細菌含有或候選含有cfr基 因和fexA基因；若得到的PCR產(chǎn)物不具有534bp大小和683bp大小，則待測細菌不含有或 候選不含有cfr基因和fexA基因。
[0044] 上述方法中，所述四重PCR擴增的退火溫度為55°C ;所述檢測PCR產(chǎn)物的方法為 電泳檢測或測序。
[0045] 本發(fā)明的第五個目的是提供一種引物對。
[0046] 本發(fā)明提供的引物對，為如下4種中的任一種：引物對1、引物對2、引物對3和引 物對4 ;
[0047] 所述引物對1由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單 鏈DNA分子組成；
[0048] 所述引物對2由序列表中序列3所示的單鏈DNA分子和序列表中序列4所示的單 鏈DNA分子組成；
[0049] 所述引物對3由序列表中序列5所示的單鏈DNA分子和序列表中序列6所示的單 鏈DNA分子組成；
[0050] 所述引物對4由序列表中序列7所示的單鏈DNA分子和序列表中序列8所示的單 鏈DNA分子組成。
[0051] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明根據(jù)細菌中主要的4個酰胺醇類藥物耐藥基因（cfr、 fexA、fexB、floR)的核苷酸序列設(shè)計合成4對相應(yīng)的特異性PCR引物，利用四重PCR對待 檢測細菌中酰胺醇類藥物耐藥基因進行擴增，可以一次性篩選出待測細菌是否含4個酰胺 醇類藥物耐藥基因中任一種或者多種，也可以用來鑒定待測細菌是否耐酰胺醇類藥物；本 發(fā)明的引物及方法具有高效、快速、成本低、實用性強等特點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0052] 圖1為四重PCR的擴增結(jié)果
[0053] 圖2為菌株W9-2的擴增結(jié)果
[0054] 圖3為菌株EF-01的擴增結(jié)果

【具體實施方式】
[0055] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0056] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0057] 下述實施例中所用的部分菌株及記載該菌株的文獻來源及含有的耐藥基因如表1 所示：
[0058] 表1為6株耐酰胺醇類藥物菌株文獻來源及含有的耐藥基因
[0059]

【權(quán)利要求】
1. 檢測或輔助檢測細菌中耐藥基因的引物組，由引物對1、引物對2、引物對3和引物對 4組成； 所述引物對1由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈 DNA分子組成； 所述引物對2由序列表中序列3所示的單鏈DNA分子和序列表中序列4所示的單鏈 DNA分子組成； 所述引物對3由序列表中序列5所示的單鏈DNA分子和序列表中序列6所示的單鏈 DNA分子組成； 所述引物對4由序列表中序列7所示的單鏈DNA分子和序列表中序列8所示的單鏈 DNA分子組成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組，其特征在于： 所述引物組中各條引物均為等摩爾比； 所述耐藥為耐酰胺醇類藥物； 所述耐藥基因為floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因中至少一種。
3. 檢測或輔助檢測細菌中耐藥基因的PCR試劑，由權(quán)利要求1或2所述的引物組、PCR 擴增緩沖液和水組成； 所述引物組中的4種引物對中的各條引物在所述PCR試劑中的終濃度均為0. 2 μ mol/ L ； 所述耐藥為耐酰胺醇類藥物； 所述耐藥基因具體為floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因中至少一種。
4. 檢測或輔助檢測細菌中耐藥基因的PCR試劑盒，包括權(quán)利要求1或2所述的引物組 或權(quán)利要求3所述PCR試劑；所述耐藥為耐酰胺醇類藥物； 所述耐藥基因具體為floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因中至少一種。
5. 權(quán)利要求1或2所述的引物組或權(quán)利要求3所述PCR試劑或權(quán)利要求4所述的試劑 盒在檢測和/或輔助檢測待測細菌是否含有耐藥基因中的應(yīng)用； 或權(quán)利要求1或2所述的引物組或權(quán)利要求3所述PCR試劑在制備檢測和/或輔助檢 測待測細菌是否含有耐藥基因產(chǎn)品中的應(yīng)用； 或權(quán)利要求1或2所述的引物組或權(quán)利要求3所述PCR試劑在制備檢測和/或輔助檢 測待測細菌是否耐酰胺醇類藥物產(chǎn)品中的應(yīng)用； 所述耐藥為耐酰胺醇類藥物； 所述耐藥基因具體為floR基因、fexB基因、cfr基因和fexA基因中至少一種。
6. -種檢測和/或輔助檢測待測細菌是否含有耐藥基因的方法，包括如下步驟：用權(quán) 利要求1或2所述的引物組或權(quán)利要求3所述PCR試劑對所述待測樣品進行四重PCR擴增， 檢測PCR產(chǎn)物； 若得到的PCR產(chǎn)物具有200bp大小，則待測細菌含有或候選含有floR基因；若得到的 PCR產(chǎn)物不具有200bp大小，則待測細菌不含有或候選不含有floR基因； 若得到的PCR產(chǎn)物具有348bp大小，則待測細菌含有或候選含有fexB基因；若得到的 PCR產(chǎn)物不具有348bp大小，則待測細菌不含有或候選不含有fexB基因； 若得到的PCR產(chǎn)物具有534bp大小，則待測細菌含有或候選含有cfr基因；若得到的 PCR產(chǎn)物不具有534bp大小，則待測細菌不含有或候選不含有cfr基因； 若得到的PCR產(chǎn)物具有683bp大小，則待測細菌含有或候選含有fexA基因；若得到的 PCR產(chǎn)物不具有683bp大小，則待測細菌不含有或候選不含有fexA基因。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征在于： 所述四重PCR擴增的退火溫度為55°C ; 所述檢測PCR產(chǎn)物的方法為電泳檢測或測序。
8. -種引物對,為如下4種中的任一種：引物對1、引物對2、引物對3和引物對4 ; 所述引物對1由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈 DNA分子組成； 所述引物對2由序列表中序列3所示的單鏈DNA分子和序列表中序列4所示的單鏈 DNA分子組成； 所述引物對3由序列表中序列5所示的單鏈DNA分子和序列表中序列6所示的單鏈 DNA分子組成； 所述引物對4由序列表中序列7所示的單鏈DNA分子和序列表中序列8所示的單鏈 DNA分子組成。
【文檔編號】C12N15/11GK104099407SQ201310127290
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月12日
【發(fā)明者】沈建忠, 吳聰明, 汪洋, 李君
申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)