實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)ca6病毒的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬核酸檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CA6病毒的方法；該方法基于CA6VP1序列設(shè)計(jì)了特異性的引物和Taqman探針，用于快速、特異和高靈敏度地檢測(cè)CA6病毒，本發(fā)明方法能穩(wěn)定和有效地?cái)U(kuò)增CA6基因片段，最高檢測(cè)靈敏度能達(dá)到10copies/μl；且該方法的特異性高，未觀察到假陽性的結(jié)果；本發(fā)明方法檢測(cè)CA6快速，靈敏，可靠?？蛇M(jìn)一步用于大規(guī)模標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，及用于CA6的流行病學(xué)的監(jiān)測(cè)工作，有助于臨床實(shí)踐中的早期快速診斷。
【專利說明】實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CA6病毒的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬檢測(cè)領(lǐng)域，涉及核酸檢測(cè)方法，具體涉及一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CA6 病毒的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)有技術(shù)公開了手足口?。╤and, foot and mouth disease, HFMD)是由人腸道病 毒（human enterovirus, HEV)引起的常見傳染??；有統(tǒng)計(jì)顯示，該病一年四季均可發(fā)病， 5?7月為高發(fā)期，5歲以下兒童多見，其中的大多數(shù)臨床癥狀輕微，以發(fā)熱和手、足、口腔等 部位的皮疹或皰疹為主，少數(shù)患者可出現(xiàn)無菌性腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹（AFP)、神經(jīng) 源性肺水腫和心肌炎等，個(gè)別重癥患兒病情進(jìn)展快，可導(dǎo)致死亡。自1997年至今，在馬來西 亞，新加坡，澳大利亞，中國等多個(gè)國家已經(jīng)有數(shù)次HFMD暴發(fā)流行；HFMD已經(jīng)成為亞太地區(qū) 嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題并引起多個(gè)國家的關(guān)注。盡管引起HFMD的主要病原是EV71和CA16， 但是近年來多個(gè)國家報(bào)道了以CA6為主要病原導(dǎo)致的HFMD暴發(fā)流行；2008年秋冬季，芬蘭 報(bào)道了以脫甲病為主要臨床表現(xiàn)的HFMD的暴發(fā)，主要病原是CA6 ;同樣，從2009至2011年 在臺(tái)灣，日本和新加坡等地區(qū)相繼暴發(fā)了以CA6為主要病原的HFMD。在2012年冬季中國上 海地區(qū)對(duì)腸道病毒監(jiān)測(cè)中，發(fā)現(xiàn)了 CA6取代了 EV71為導(dǎo)致HFMD的主要腸道病毒。上述統(tǒng) 計(jì)結(jié)果表明，CA6有可能成為新發(fā)的HFMD暴發(fā)流行的主要病原，因此，在HFMD的防控工作 中，對(duì)于CA6的日常監(jiān)測(cè)顯得非常必要。
[0003] 傳統(tǒng)的HEV鑒定分型主要基于病毒分離和抗血清中和實(shí)驗(yàn)；但該方法鑒定周期長 且抗血清容易和其他HEV產(chǎn)生交叉反應(yīng)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于病毒核苷酸序列分 析的分型方法越來越多地被應(yīng)用。Nix等人研究的snPCR方法，結(jié)合sanger測(cè)序的方法可 快速靈敏用于HEV分型鑒定。上述分子分型方法雖可對(duì)HEV分型鑒定，但通常需要測(cè)序和序 列比對(duì)來確定病原，尤其在HEV暴發(fā)流行時(shí)，所述方法往往不適用于臨床大規(guī)模標(biāo)本中病 原檢測(cè)。迄今為止，世界范圍內(nèi)已經(jīng)有數(shù)次CA6導(dǎo)致的HFMD暴發(fā)，但用于CA6特異性檢測(cè) 快速靈敏的方法尚鮮見有報(bào)道，尤其是未見有關(guān)特異性實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR) 檢測(cè)CA6病毒的方法的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供用于CA6特異性檢測(cè)快速靈敏 的方法，具體涉及一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CA6病毒的方法。
[0005] 本發(fā)明方法基于CA6 VP1序列設(shè)計(jì)了特異性的引物和Taqman探針，可用于快速、 特異和高靈敏度地檢測(cè)疑似患者標(biāo)本，進(jìn)一步為HFMD的臨床診斷和治療及疫情防控提供 參考依據(jù)。
[0006] 具體的，本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CA6病毒的方法，其特征在于，其包括步 驟： (1)臨床采集標(biāo)本 收集手足口病患者的咽拭子、糞便標(biāo)本； (2) 設(shè)計(jì)引物 根據(jù)Genbank庫中收錄的CA6的衣殼蛋白（VP1)編碼序列并結(jié)合CA6流行地區(qū)的VP1 序列，本發(fā)明的實(shí)施例中采用上海地區(qū)CA6流行的VP1序列，采用Primer Express 3. 0設(shè)計(jì) 合成CA6特異性real-time PCR的引物和探針；采用NCBI網(wǎng)站上的BLAST工具盒BioEdit 軟件（version 7. 0. 9)分析所設(shè)計(jì)的引物和探針的保守性； 所述引物和探針由上海Invitrogen公司合成； (3) 提取核酸，Real-time PCR和T-A克隆 采用High Pure Viral Nucleic Acid Kit(Roche 11858874001)提取病毒基因組RNA; 將樣本加入含poly (A)的Binding Buffer中，再加入蛋白酶K混勻，72 ?裂解10 min,用 柱子吸附RNA，加入Inhibitor Removal Buffer洗1次；再用Wash Buffer洗2次，最后用 50 μ? Elution Buffer 洗脫 RNA ; PCR采用試劑盒（Takara DRR064A)進(jìn)行，反應(yīng)液中包含 2X Buffer Mix III 12. 5μ1, TaKaRa Ex Taq HS (5 U/ μ 1)0. 5μ 1，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0· 5μ 1，上游引 物 CA6F lOpmol,下游引物 CA6R lOpmol，探針 3pmol, RNA 模板 2· 5 μ 1 ; 其中，PCR反應(yīng)條件：42°C反轉(zhuǎn)錄，10min ;95°C 10s，60°C 40s，運(yùn)行45個(gè)循環(huán)，在60°C 進(jìn)行熒光采集；反應(yīng)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，ViiA 7系統(tǒng)）上進(jìn)行， 本發(fā)明所涉及的引物和探針序列如表1所示， 表1引物和探針序列

【權(quán)利要求】
1. 一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CA6病毒的方法，其特征在于，其包括步驟： (1) 采集標(biāo)本 收集手足口病患者的咽拭子、糞便標(biāo)本； (2) 設(shè)計(jì)引物 根據(jù)Genbank庫中收錄的CA6的衣殼蛋白VP1編碼序列并結(jié)合CA6流行地區(qū)的VP1序 列，設(shè)計(jì)合成CA6特異性real-time PCR的引物和探針，然后分析上述述引物和探針的保守 性； (3) 提取核酸，Real-time PCR和T-A克隆 提取病毒基因組RNA;將樣本加入含poly(A)的Binding Buffer中，再加入蛋白酶K混 勻，72 °C裂解，用柱子吸附RNA，加入 Inhibitor Removal Buffer洗 1 次；再用 Wash Buffer 洗2次，最后用Elution Buffer洗脫RNA ; PCR采用試劑盒（Takara DRR064A)進(jìn)行，25μ1反應(yīng)液中包含2X Buffer Mix ill 12. 5 μ 1, TaKaRa Ex Taq HS(5 U/ μ 1)0. 5 μ 1, PrimeScript RT Enzyme Mix II 0. 5 μ 1, 上游引物 CA6F lOpmol,下游引物 CA6R lOpmol，探針 3pmol, RNA 模板 2. 5 μ 1 ; 其中，PCR反應(yīng)條件：42°C反轉(zhuǎn)錄，lOmin ;95°C 10s，60°C 40s，運(yùn)行45個(gè)循環(huán)，在60°C 進(jìn)行熒光采集；反應(yīng)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，引物和探針序列為，
* 參考的 CA6 病毒株為 TW/399/10 (Genbank No. JQ946054); 取Real-time RT-PCR陽性產(chǎn)物進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳；采用割膠純化試劑盒回收 107bp大小的PCR產(chǎn)物，通過T-A克隆試劑盒將PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)pMD18-T載體；通過測(cè)序獲 得克隆片段序列，然后用BLAST工具對(duì)克隆片段進(jìn)行比對(duì)分析； (4) 評(píng)估Real-time RT-PCR的靈敏度和特異性 采用T-A克隆質(zhì)粒制作標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行Standard curve實(shí)驗(yàn)的方法：首先微量紫外分光光 度計(jì)對(duì)克隆質(zhì)粒進(jìn)行核酸定量，然后進(jìn)行10倍模板稀釋，制作1〇7?l〇2copieS/μ 1的標(biāo)準(zhǔn) 品；以所述標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行Real-time RT-PCR,獲得Standard curve ; 選取 18 種 HEV 血清型，包括 EV71，EV68, CVA2, CVA4, CVA5, CVA10, CVA12, CVA21，CVB1， CVB2，CVB4，CVB5，Echo 3，Echo 9，Echo 19，Echo 25，Echo 30 驗(yàn)證該 PCR 方法的特異 性：首先采用High Pure Viral Nucleic Acid Kit提取上述病毒株的基因組RNA，再以上述 基因組RNA為模板并選擇克隆質(zhì)粒為陽性對(duì)照品進(jìn)行real-time RT-PCR，觀察擴(kuò)增曲線； (5) Real-time RT-PCR檢測(cè)臨床標(biāo)本 對(duì)采集的標(biāo)本，進(jìn)行核酸提?。蝗缓蟛捎肦T-PCR進(jìn)行腸道病毒屬特異性篩選；篩選 出的腸道病毒陽性標(biāo)本再采用RT-PCR的方法進(jìn)行EV71和CA16的篩選；腸道病毒屬檢測(cè) 陽性而EV71和CA16檢測(cè)陰性的標(biāo)本，采用Real-time RT-PCR方法檢測(cè)CA6,同時(shí)，采用 RT-snPCR方法對(duì)上述標(biāo)本進(jìn)行平行檢測(cè)分型，驗(yàn)證新熒光定量PCR方法的準(zhǔn)確性。
2. 按權(quán)利要求1所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CA6病毒的方法，其特征在于，所述步驟 (2) 中，采用Primer Express 3. 0設(shè)計(jì)合成CA6特異性real-time PCR的引物和探針；采 用NCBI網(wǎng)站上的BLAST工具盒BioEdit軟件分析上述引物和探針的保守性。
3. 按權(quán)利要求1所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CA6病毒的方法，其特征在于，所述步 驟（3)中，采用High Pure Viral Nucleic Acid Kit Roche 11858874001 提取病毒基因組 RNA。
4. 按權(quán)利要求1所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CA6病毒的方法，其特征在于，所述 步驟（3)中，PCR采用試劑盒Takara DRR064A進(jìn)行；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為Applied Biosystems, ViiA 7 系統(tǒng)。
5. 按權(quán)利要求1所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CA6病毒的方法，其特征在于，所述步驟 (3) 中，采用割膠純化試劑盒Invitrogen，K2100-12回收PCR產(chǎn)物，通過T-A克隆試劑盒 Takara，D101A將PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)pMD18-T載體。
6. 按權(quán)利要求1所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CA6病毒的方法，其特征在于，所述步驟 (4) 中，微量紫外分光光度計(jì)為Thermo，NanoDrop ND-2000C。
7. 按權(quán)利要求1所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CA6病毒的方法，其特征在于，所述步驟 (4)中，High Pure Viral Nucleic Acid Kit 為 Roche 11858874001。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK104099427SQ201310127090
【公開日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2013年4月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月14日
【發(fā)明者】胡蕓文, 管文彩, 張曉玲, 宋志剛 申請(qǐng)人:上海市公共衛(wèi)生臨床中心