本發(fā)明屬于核酸擴(kuò)增技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因的基因芯片試劑盒。

背景技術(shù)：

細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)具有重要臨床意義。臨床診斷中存在抗生素的用量大、起點(diǎn)高、種類(lèi)較為隨意的缺陷，從而導(dǎo)致耐藥菌種的產(chǎn)生和流行。目前用于耐藥基因檢測(cè)仍較為傳統(tǒng)，大致有生理生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)等后加以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增相應(yīng)基因的方法，而上述檢測(cè)方法需要時(shí)間長(zhǎng)，方法操作煩瑣、報(bào)告結(jié)果慢、通量低，且往往先鑒定出菌種，才能相應(yīng)的進(jìn)行藥敏等后續(xù)試驗(yàn)，因而難以適應(yīng)臨床治療的需要。因此開(kāi)發(fā)快速高通量的分子診斷技術(shù)檢測(cè)，可以協(xié)助快速診斷，指導(dǎo)及時(shí)準(zhǔn)確用藥。

生物芯片技術(shù)是近年來(lái)在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展并成熟的一項(xiàng)高新技術(shù)，主要是通過(guò)微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固相芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸以及其他多種生物成份的準(zhǔn)確、快速、大量信息的檢測(cè)。生物芯片的主要特點(diǎn)是高通量、微型化和自動(dòng)化。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因的引物對(duì)組。

本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因的引物對(duì)組，由如下13個(gè)引物對(duì)組成：

1)如下(a1)或(a2)所示的引物對(duì)，記為引物對(duì)1：

(a1)由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)；

(a2)由將序列表中序列1和序列2經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(a1)中所述引物對(duì)功能相同的引物對(duì)；

2)如下(b1)或(b2)所示的引物對(duì)，記為引物對(duì)2：

(b1)由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)；

(b2)由將序列表中序列3和序列4經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(b1)中所述引物對(duì)功能相同的引物對(duì)；

3)如下(c1)或(c2)所示的引物對(duì)，記為引物對(duì)3：

(c1)由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)；

(c2)由將序列表中序列5和序列6經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(c1)中所述引物對(duì)功能 相同的引物對(duì)；

4)如下(d1)或(d2)所示的引物對(duì)，記為引物對(duì)4：

(d1)由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)；

(d2)由將序列表中序列7和序列8經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(d1)中所述引物對(duì)功能相同的引物對(duì)；

5)如下(e1)或(e2)所示的引物對(duì)，記為引物對(duì)5：

(e1)由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)；

(e2)由將序列表中序列9和序列10經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(e1)中所述引物對(duì)功能相同的引物對(duì)；

6)如下(f1)或(f2)所示的引物對(duì)，記為引物對(duì)6：

(f1)由序列表中序列11和序列12所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)；

(f2)由將序列表中序列11和序列12經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(f1)中所述引物對(duì)功能相同的引物對(duì)；

7)如下(g1)或(g2)所示的引物對(duì)，記為引物對(duì)7：

(g1)由序列表中序列13和序列14所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)；

(g2)由將序列表中序列13和序列14經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(g1)中所述引物對(duì)功能相同的引物對(duì)；

8)如下(h1)或(h2)所示的引物對(duì)，記為引物對(duì)8：

(h1)由序列表中序列15和序列16所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)；

(h2)由將序列表中序列15和序列16經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(h1)中所述引物對(duì)功能相同的引物對(duì)；

9)如下(i1)或(i2)所示的引物對(duì)，記為引物對(duì)9：

(i1)由序列表中序列17和序列18所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)；

(i2)由將序列表中序列17和序列18經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(i1)中所述引物對(duì)功能相同的引物對(duì)；

10)如下(j1)或(j2)所示的引物對(duì)，記為引物對(duì)10：

(j1)由序列表中序列19和序列20所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)；

(j2)由將序列表中序列19和序列20經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(j1)中所述引物對(duì)功能相同的引物對(duì)；

11)如下(k1)或(k2)所示的引物對(duì)，記為引物對(duì)11：

(k1)由序列表中序列21和序列22所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)；

(k2)由將序列表中序列21和序列22經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(k1)中所述引物對(duì)功能相同的引物對(duì)；

12)如下(l1)或(l2)所示的引物對(duì)，記為引物對(duì)12：

(l1)由序列表中序列23和序列24所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)；

(l2)由將序列表中序列23和序列24經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(l1)中所述引物對(duì)功能相同的引物對(duì)；

13)如下(m1)或(m2)所示的引物對(duì)，記為引物對(duì)13：

(m1)由序列表中序列25和序列26所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)；

(m2)由將序列表中序列25和序列26經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的兩條單鏈DNA分子組成的，且與(m1)中所述引物對(duì)功能相同的引物對(duì)。

其中，所述引物對(duì)1用于擴(kuò)增mecA基因；所述引物對(duì)2用于擴(kuò)增vanA基因；所述引物對(duì)3用于擴(kuò)增vanB基因；所述引物對(duì)4用于擴(kuò)增bla_DHA-1基因；所述引物對(duì)5用于擴(kuò)增bla_OXA-23基因；所述引物對(duì)6用于擴(kuò)增bla_OXA-24基因；所述引物對(duì)7用于擴(kuò)增bla_OXA-58基因；所述引物對(duì)8用于擴(kuò)增bla_KPC-1基因；所述引物對(duì)9用于擴(kuò)增bla_IMP-4基因；所述引物對(duì)10用于擴(kuò)增bla_VIM-8基因；所述引物對(duì)11用于擴(kuò)增bla_NDM-1基因；所述引物對(duì)12用于擴(kuò)增bla_CTX-M-1基因；所述引物對(duì)13用于擴(kuò)增bla_CTX-M-9基因。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因的成套單鏈DNA。

本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因的成套單鏈DNA，具體由探針組和所述引物對(duì)組組成；所述探針組由如下13個(gè)單鏈DNA探針組成：序列表中序列27所示的單鏈DNA探針1；序列表中序列28所示的單鏈DNA探針2；序列表中序列29所示的單鏈DNA探針3；序列表中序列30所示的單鏈DNA探針4；序列表中序列31所示的單鏈DNA探針5；序列表中序列32所示的單鏈DNA探針6；序列表中序列33所示的單鏈DNA探針7；序列表中序列34所示的單鏈DNA探針8；序列表中序列35所示的單鏈DNA探針9；序列表中序列36所示的單鏈DNA探針10；序列表中序列37所示的單鏈DNA探針11；序列表中序列38所示的單鏈DNA探針12；序列表 中序列39所示的單鏈DNA探針13。

其中，所述單鏈DNA探針1用于檢測(cè)所述引物對(duì)1的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針2用于檢測(cè)所述引物對(duì)2的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針3用于檢測(cè)所述引物對(duì)3的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針4用于檢測(cè)所述引物對(duì)4的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針5用于檢測(cè)所述引物對(duì)5的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針6用于檢測(cè)所述引物對(duì)6的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針7用于檢測(cè)所述引物對(duì)7的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針8用于檢測(cè)所述引物對(duì)8的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針9用于檢測(cè)所述引物對(duì)9的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針10用于檢測(cè)所述引物對(duì)10的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針11用于檢測(cè)所述引物對(duì)11的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針12用于檢測(cè)所述引物對(duì)12的擴(kuò)增結(jié)果；所述單鏈DNA探針13用于檢測(cè)所述引物對(duì)13的擴(kuò)增結(jié)果。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因的試劑盒。

本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因的試劑盒，含有所述引物對(duì)組，以及雜交芯片；所述雜交芯片是按照包括如下步驟的方法制備獲得的：將通式為“NH₂-(T)_n-雜交探針序列”的13種單鏈檢測(cè)探針?lè)謩e通過(guò)氨基與醛基的反應(yīng)固定到醛基修飾化的固相載體(如玻片)上，獲得所述雜交芯片；所述通式中的(T)_n表示n個(gè)連續(xù)的T，n為大于等于5，且小于等于30的整數(shù)；所述通式中對(duì)應(yīng)于所述13種單鏈檢測(cè)探針的13種雜交探針序列分別如序列表中序列27-39所示。

根據(jù)需要，所述試劑盒中還可含有經(jīng)熒光標(biāo)記的隨機(jī)引物；所述隨機(jī)引物的序列為5’-N_X-3’，N表示A、G、C和T中的任一種，6≤X≤15，且X為整數(shù)(如X＝9)，N_X表示X個(gè)連續(xù)的脫氧核糖核苷酸。

以上所述經(jīng)熒光標(biāo)記的隨機(jī)引物是用于對(duì)所述引物對(duì)組中的引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光標(biāo)記的。根據(jù)需要，也可以不采用所述經(jīng)熒光標(biāo)記的隨機(jī)引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光標(biāo)記，而是采用其他方法。如將所述引物對(duì)組中每個(gè)引物對(duì)的一條引物的5’末端進(jìn)行熒光標(biāo)記(如TAMRA)，被熒光標(biāo)記的引物是存在于擴(kuò)增產(chǎn)物中可被相應(yīng)探針雜交的單鏈DNA上的引物。

所述試劑盒中還可含有雜交液；所述雜交液中含有經(jīng)熒光標(biāo)記的無(wú)關(guān)單鏈DNA分子；所述無(wú)關(guān)單鏈DNA分子為非源自于所述細(xì)菌耐藥基因的單鏈DNA分子。

所述雜交芯片的制備方法還包括將表面化學(xué)質(zhì)控探針QC、和/或雜交質(zhì)控探針PC、和/或陰性對(duì)照探針BC通過(guò)氨基與醛基的反應(yīng)固定到所述醛基修飾化的固相載體(如玻片)上的步驟；

所述表面化學(xué)質(zhì)控探針QC、所述雜交質(zhì)控探針PC和所述陰性對(duì)照探針均為單鏈探針；所述表面化學(xué)質(zhì)控探針QC的一端經(jīng)氨基修飾，另一端具有熒光標(biāo)記(如Hex)； 所述雜交質(zhì)控探針PC的一端經(jīng)氨基修飾，且能與所述雜交液中的所述無(wú)關(guān)單鏈DNA分子雜交；所述陰性對(duì)照探針BC的一端經(jīng)氨基修飾，且與源自于所述細(xì)菌耐藥基因的任何單鏈DNA分子均不能雜交。

進(jìn)一步，在本發(fā)明中，所述表面化學(xué)質(zhì)控探針QC自5’端到3’端的結(jié)構(gòu)組成為“NH₂-TCACTTGCTTCCGTTGAGG-Hex”；所述雜交質(zhì)控探針PC自5’端到3’端的結(jié)構(gòu)組成為“NH₂-TTTTTTTTTTTTCCTCAACGGAAGCAAGTGAT”；所述陰性對(duì)照探針BC自5’端到3’端的結(jié)構(gòu)組成為“NH₂-TTTTTTTTTTTTGTTGCTTCTGGAATGAGTTTGCT”。

所述引物對(duì)組或所述成套單鏈DNA或所述試劑盒在如下(a)或(b)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：

(a)檢測(cè)或輔助檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因(非診斷目的)，或制備用于檢測(cè)或輔助檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因的產(chǎn)品；

(b)檢測(cè)或輔助檢測(cè)含有細(xì)菌耐藥基因的細(xì)菌(非診斷目的)，或制備用于檢測(cè)或輔助檢測(cè)含有細(xì)菌耐藥基因的細(xì)菌的產(chǎn)品。

在本發(fā)明中，所述細(xì)菌耐藥基因具體可為如下中的至少一種：mecA基因、vanA基因、vanB基因、bla_DHA-1基因、bla_OXA-23基因、bla_OXA-24基因、bla_OXA-58基因、bla_KPC-1基因、bla_IMP-4基因、bla_VIM-8基因、bla_NDM-1基因、bla_CTX-M-1基因和bla_CTX-M-9基因。

所述mecA基因的GenBank登錄號(hào)為AB221119.1(update：2006-5-19)；所述vanA基因的GenBank登錄號(hào)為M97297.1(update：2002-6-20)；所述vanB基因的GenBank登錄號(hào)為AY655711.1(update：2005-11-7)；所述bla_DHA-1基因的GenBank登錄號(hào)為EF406115.1(update：2007-8-17)；所述bla_OXA-23基因的GenBank登錄號(hào)為JN665073.1(update：2011-11-7)；所述bla_OXA-24基因的GenBank登錄號(hào)為JN207494.1(update：2011-11-27)；所述bla_OXA-58基因的GenBank登錄號(hào)為EU107372.1(update：2007-9-11)；所述bla_KPC-1基因的GenBank登錄號(hào)為AF297554.1(update：2001-3-26)；所述bla_IMP-4基因的GenBank登錄號(hào)為AF244145.1(update：2001-2-27)；所述bla_VIM-8基因的GenBank登錄號(hào)為AY524987.1(update：2004-11-5)；所述bla_NDM-1基因的GenBank登錄號(hào)為JF503991.1(update：2012-12-11)；所述bla_CTX-M-1基因的GenBank登錄號(hào)為AJ416342.1(update：2008-10-23)；所述bla_CTX-M-9基因的GenBank登錄號(hào)為AJ416345.1(update：2005-4-15)。

相應(yīng)的，含有所述mecA基因的細(xì)菌具體可為金黃色葡萄球菌；含有所述vanA基因的細(xì)菌具體可為糞腸球菌或屎腸球菌；含有所述vanB基因的細(xì)菌具體可為糞腸球菌或屎腸球菌；含有所述bla_DHA-1基因的細(xì)菌具體可為肺炎克雷伯菌；含有所述bla_OXA-23基因的細(xì)菌具體可為鮑曼不動(dòng)桿菌；含有所述bla_OXA-24基因的細(xì)菌具體可為鮑曼不動(dòng) 桿菌；含有所述bla_OXA-58基因的細(xì)菌具體可為鮑曼不動(dòng)桿菌；含有所述bla_KPC-1基因的細(xì)菌具體可為肺炎克雷伯菌或銅綠假單胞菌；含有所述bla_IMP-4基因的細(xì)菌具體可為鮑曼不動(dòng)桿菌；含有所述bla_VIM-8基因的細(xì)菌具體可為肺炎克雷伯菌或鮑曼不動(dòng)桿菌；含有所述bla_NDM-1基因的細(xì)菌具體可為大腸埃希氏菌；含有所述bla_CTX-M-1基因的細(xì)菌具體可為奇異變形桿菌；含有所述bla_CTX-M-9基因的細(xì)菌具體可為大腸埃希氏菌。

所述引物對(duì)組或所述成套單鏈DNA在制備所述試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明對(duì)極大樣本量的細(xì)菌耐藥基因進(jìn)行研究。本發(fā)明提供的試劑盒支持高通量，快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)多個(gè)耐藥基因，對(duì)中國(guó)人群進(jìn)行篩查，能有效地起到準(zhǔn)確診斷、耐藥溯源、耐藥控制等作用，從而抗生素使用量，減少耐藥產(chǎn)生。

附圖說(shuō)明

圖1為雜交芯片的點(diǎn)陣排布示意圖(即芯片探針布局示意圖)。

圖2為用于檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因的試劑盒的特異性分析結(jié)果。該圖對(duì)應(yīng)的芯片探針布局示意圖如圖1所示。其中，A所示芯片檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)的參考品DNA質(zhì)粒為ZL-CTX-M-1(對(duì)應(yīng)bla_CTX-M-1基因)；B所示芯片檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)的參考品DNA質(zhì)粒為ZL-CTX-M-9(對(duì)應(yīng)bla_CTX-M-9基因)；C所示芯片檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)的參考品DNA質(zhì)粒為ZL-DHA-1(對(duì)應(yīng)bla_DHA-1基因)；D所示芯片檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)的參考品DNA質(zhì)粒為ZL-IMP-4(對(duì)應(yīng)bla_IMP-4基因)；E所示芯片檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)的參考品DNA質(zhì)粒為ZL-KPC-1(對(duì)應(yīng)bla_KPC-1基因)；F所示芯片檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)的參考品DNA質(zhì)粒為ZL-NDM-1(對(duì)應(yīng)bla_NDM-1基因)；G所示芯片檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)的參考品DNA質(zhì)粒為ZL-OXA-23(對(duì)應(yīng)bla_OXA-23基因)；H所示芯片檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)的參考品DNA質(zhì)粒為ZL-OXA-24(對(duì)應(yīng)bla_OXA-24基因)；I所示芯片檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)的參考品DNA質(zhì)粒為ZL-OXA-58(對(duì)應(yīng)bla_OXA-58基因)；J所示芯片檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)的參考品DNA質(zhì)粒為ZL-vanA(對(duì)應(yīng)vanA基因)；K所示芯片檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)的參考品DNA質(zhì)粒為ZL-vanB(對(duì)應(yīng)vanB基因)；L所示芯片檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)的參考品DNA質(zhì)粒為ZL-VIM-8(對(duì)應(yīng)bla_VIM-8基因)；M所示芯片檢測(cè)結(jié)果對(duì)應(yīng)的參考品DNA質(zhì)粒為ZL-mecA(對(duì)應(yīng)mecA基因)。

圖3為三份臨床樣品的芯片檢測(cè)結(jié)果圖。其中，A為1號(hào)臨床樣本；B為2號(hào)臨床樣本；C為3號(hào)臨床樣本。該圖對(duì)應(yīng)的芯片探針布局示意圖如圖1所示。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1、用于檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因的試劑盒的制備及其使用

一、用于檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因的試劑盒的組裝與制備

1、針對(duì)13個(gè)細(xì)菌耐藥基因設(shè)計(jì)的引物和雜交探針

針對(duì)13個(gè)細(xì)菌耐藥基因設(shè)計(jì)的引物和單鏈雜交探針具體序列如表1和表2所示。

表1 針對(duì)13個(gè)細(xì)菌耐藥基因設(shè)計(jì)的引物

表2 針對(duì)13個(gè)細(xì)菌耐藥基因設(shè)計(jì)的單鏈雜交探針

2、將雜交探針固定于雜交芯片

雜交芯片為分別固定有13種單鏈檢測(cè)探針的基片。每種檢測(cè)探針都是一段氨基修飾的寡核苷酸探針，13種單鏈檢測(cè)探針的通式為“NH₂-TTTTTTTTTTTTTTT-雜交探針序列”，其中“雜交探針序列”即為表2中序列27-39所示的13種單鏈雜交探針”。各檢測(cè)探針?lè)謩e用基因點(diǎn)樣液(博奧生物集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為CP.440010)溶解，終濃度為10μM，重復(fù)三次點(diǎn)制到醛基化修飾的玻片(博奧生物集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為CP.420022)上，從而通過(guò)氨基與醛基的反應(yīng)將13種探針固定到雜交芯片上。另外，同樣通過(guò)氨基與醛基的反應(yīng)將表面化學(xué)質(zhì)控探針QC、雜交質(zhì)控探針PC和陰性對(duì)照探針BC也固定到雜交芯片上。QC是一端帶有Hex標(biāo)記，另一端具有氨基修飾的單鏈寡核苷酸探針，用于觀察芯片點(diǎn)樣和固定的效率，其自5’端到3’端的結(jié)構(gòu)組成為NH₂-TCACTTGCTTCCGTTGAGG-Hex。PC是一段氨基修飾的單鏈寡核苷酸探針，可以與雜交液中添加的經(jīng)熒光標(biāo)記的無(wú)關(guān)單鏈DNA分子(C-PC)雜交，用于雜交過(guò)程的質(zhì)控，其自5’端到3’端的結(jié)構(gòu)組成為NH₂-TTTTTTTTTTTTCCTCAACGGAAGCAAGTGAT。BC是一段氨基修飾的寡核苷酸探針，與雜交體系中的所有待檢測(cè)序列均不會(huì)雜交，用于觀察有無(wú)非特異雜交，其自5’端到3’端的結(jié)構(gòu)組成為NH₂-TTTTTTTTTTTTGTTGCTTCTGGAATGAGTTTGCT。圖1為雜交芯片的點(diǎn)陣排布示意圖。

3、用于檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因的試劑盒的組成

本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因(即表1和表2中涉及的13種細(xì)菌耐藥基因)的試劑盒含有：

(1)步驟1中表1所示的13個(gè)引物對(duì)；

(2)步驟2中固定有13種檢測(cè)探針以及表面化學(xué)質(zhì)控探針QC、雜交質(zhì)控探針PC和陰性對(duì)照探針BC的雜交芯片；

(3)經(jīng)熒光標(biāo)記的隨機(jī)引物；所述隨機(jī)引物的序列為5’-N₉-3’，N表示A、G、C和T中的任一種，N₉表示9個(gè)連續(xù)的脫氧核糖核苷酸。

(4)雜交液；所述雜交液中含有經(jīng)熒光標(biāo)記的無(wú)關(guān)單鏈DNA分子(C-PC)，其核苷酸序列為5’-ATCACTTGCTTCCGTTGAGG-3’。

二、用于檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因的試劑盒的使用方法

1、樣品聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增

取1μL待測(cè)的DNA樣品溶液，以其為模板，分別采用表1所示的13個(gè)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。20μL PCR擴(kuò)增體系如下：10×PCR buffer(含Mg²⁺)2μL；2.5mM dNTP 1.6μL；10μM上游引物0.5μL；10μM下游引物0.5μL；模板1μL；5U/μL rTaq0.2μL；補(bǔ)水至20μL。PCR擴(kuò)增程序如下：94℃5min；(94℃30s；55℃30s；72℃1min)30循環(huán)；72℃10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后共得到13份PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

2、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光標(biāo)記

每種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物取5μL，加入到不同樣品管中，每個(gè)樣品管中加入3μL濃度為100μM的經(jīng)TAMRA熒光標(biāo)記的9N隨機(jī)引物(核苷酸序列為5’-N9-3’，N表示A、G、C和T中的任一種，N9表示9個(gè)連續(xù)的脫氧核糖核苷酸，具體為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品)，補(bǔ)水至19μL，震蕩混勻，瞬時(shí)離心；95℃變性后置于冰上，加入6μL熒光標(biāo)記反應(yīng)體系mix(組成：10×Klenow Buffer 2.5μL；5U/μL Klenow酶1μL；2.5mM dNTP 2.5μL)。按程序進(jìn)行熒光標(biāo)記，程序如下：37℃90min；70℃10min。共得到13份TAMRA熒光標(biāo)記產(chǎn)物。

3、TAMRA熒光標(biāo)記產(chǎn)物的純化

使用Macherey-Nagel公司生產(chǎn)的Nucleo Spin Gel and PCR Clean-up試劑盒(產(chǎn)品貨號(hào)：REF740609*250)，對(duì)步驟2獲得的TAMRA熒光標(biāo)記產(chǎn)物進(jìn)行純化，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

4、雜交

將含有經(jīng)TAMRA熒光標(biāo)記的無(wú)關(guān)單鏈DNA分子(5’-ATCACTTGCTTCCGTTGAGG-3’)的雜交buffer(博奧生物集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為CP.440030)在50℃融化，配制13份雜交混合液(其中步驟3純化后的TAMRA熒光標(biāo)記產(chǎn)物溶液15μL，雜交buffer 5μL)，將配制好的13份雜交混合液加入到步驟一2中的雜交芯片上，每份雜交混合液對(duì)應(yīng)一個(gè)完整雜交芯片，95℃變性3min，立即放置冰上，并50℃水浴雜交2h。

5、清洗

用兩種不同洗液(洗液I：2×SSC，0.2％SDS，預(yù)熱至50℃；洗液II：0.2×SSC，預(yù)熱至50℃)按照先洗液I后洗液II的順序分別清洗4min后，把芯片放在SlideWasher_8芯片清洗儀中，選擇離心程序，離心(或離心機(jī)1000rpm離心2min)，甩干。

6、掃描及結(jié)果判定

使用博奧晶芯LuxScan 10K微陣列芯片掃描儀完成掃描(選擇綠色通道，設(shè)定“Power”的參數(shù)范圍為50-90和“PMT”的參數(shù)范圍為500-900)，并根據(jù)掃描結(jié)果按照如下方法確定待測(cè)DNA樣品中是否含有表1中涉及的13種細(xì)菌耐藥基因，以及具體含有13種細(xì)菌耐藥基因的哪一種或哪幾種：用于檢測(cè)某細(xì)菌耐藥基因的探針在芯片上的固定位置處如果檢測(cè)到熒光信號(hào)，則判定對(duì)應(yīng)的待測(cè)DNA樣品中含有對(duì)應(yīng)的細(xì)菌耐藥基因；否則則不含有對(duì)應(yīng)的細(xì)菌耐藥基因。另外，掃描過(guò)程中軟件會(huì)根據(jù)檢測(cè)到的熒光信號(hào)強(qiáng)度賦予不同顏色，顏色由藍(lán)色至白色，信號(hào)逐漸增強(qiáng)，進(jìn)而可初步判斷待測(cè)DNA樣品中目標(biāo)細(xì)菌耐藥基因含量的高低。

實(shí)施例2、用于檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因的試劑盒的特異性和靈敏度測(cè)定

一、參考品DNA質(zhì)粒的制備

1、含有mecA基因靶標(biāo)片段的質(zhì)粒的構(gòu)建

將mecA基因(GenBank：AB221119.1，update：2006-5-19)的第1001-1926位所示DNA片段連接至pGEM-T Easy Vector載體(promega公司產(chǎn)品)上，得到重組質(zhì)粒ZL-mecA。并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確。

2、含有vanA基因靶標(biāo)片段的質(zhì)粒的構(gòu)建

將vanA基因(GenBank：M97297.1，update：2002-6-20)的第7000-7988位所示DNA片段連接至pGEM-T Easy Vector載體上，得到重組質(zhì)粒ZL-vanA。并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確。

3、含有vanB基因靶標(biāo)片段的質(zhì)粒的構(gòu)建

將vanB基因(GenBank：AY655711.1，update：2005-11-7)的第14-1029位所示DNA片段連接至pGEM-T Easy Vector載體上，得到重組質(zhì)粒ZL-vanB。并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確。

4、含有bla_DHA-1基因靶標(biāo)片段的質(zhì)粒的構(gòu)建

將bla_DHA-1基因(GenBank：EF406115.1，update：2007-8-17)的第1-1113位所示DNA片段連接至pGEM-T Easy Vector載體上，得到重組質(zhì)粒ZL-DHA-1。并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確。

5、含有bla_OXA-23基因靶標(biāo)片段的質(zhì)粒的構(gòu)建

將bla_OXA-23基因(GenBank：JN665073.1，update：2011-11-7)的第97-899位所示DNA片段連接至pGEM-T Easy Vector載體上，得到重組質(zhì)粒ZL-OXA-23。并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確。

6、含有bla_OXA-24基因靶標(biāo)片段的質(zhì)粒的構(gòu)建

將bla_OXA-24基因(GenBank：JN207494.1，update：2011-11-27)的第4168-4882位所示DNA片段連接至pGEM-T Easy Vector載體上，得到重組質(zhì)粒ZL-OXA-24。并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確。

7、含有bla_OXA-58基因靶標(biāo)片段的質(zhì)粒的構(gòu)建

將bla_OXA-58基因(GenBank：EU107372.1，update：2007-9-11)的第42-835位所示DNA片段連接至pGEM-T Easy Vector載體上，得到重組質(zhì)粒ZL-OXA-58。并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確。

8、含有bla_KPC-1基因靶標(biāo)片段的質(zhì)粒的構(gòu)建

將bla_KPC-1基因(GenBank：AF297554.1，update：2001-3-26)的第154-1003位所示DNA片段連接至pGEM-T Easy Vector載體上，得到重組質(zhì)粒ZL-KPC-1。并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確。

9、含有bla_IMP-4基因靶標(biāo)片段的質(zhì)粒的構(gòu)建

將bla_IMP-4基因(GenBank：AF244145.1，update：2001-2-27)的第1-470位所示DNA片段連接至pGEM-T Easy Vector載體上，得到重組質(zhì)粒ZL-IMP-4。并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確。

10、含有bla_VIM-8基因靶標(biāo)片段的質(zhì)粒的構(gòu)建

將bla_VIM-8基因(GenBank：AY524987.1，update：2004-11-5)的第89-798位所示DNA片段連接至pGEM-T Easy Vector載體上，得到重組質(zhì)粒ZL-VIM-8。并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確。

11、含有bla_NDM-1基因靶標(biāo)片段的質(zhì)粒的構(gòu)建

將bla_NDM-1基因(GenBank：JF503991.1，update：2012-12-11)的第118437-119168位所示DNA片段連接至pGEM-T Easy Vector載體上，得到重組質(zhì)粒ZL-NDM-1。并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確。

12、含有bla_CTX-M-1基因靶標(biāo)片段的質(zhì)粒的構(gòu)建

將bla_CTX-M-1基因(GenBank：AJ416342.1，update：2008-10-23)的第567-1373位所示DNA片段連接至pGEM-T Easy Vector載體上，得到重組質(zhì)粒ZL-CTX-M-1。并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確。

13、含有bla_CTX-M-9基因靶標(biāo)片段的質(zhì)粒的構(gòu)建

將bla_CTX-M-9基因(GenBank：AJ416345.1，update：2005-4-15)的第218-958位所示DNA片段連接至pGEM-T Easy Vector載體上，得到重組質(zhì)粒ZL-CTX-M-9。并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確。

二、用于檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因的試劑盒的特異性分析

將步驟一構(gòu)建的13種參考品DNA質(zhì)粒均稀釋至濃度為10⁴拷貝/μL，分別以稀釋 后的13種參考品DNA質(zhì)粒為待測(cè)DNA樣品，然后按照實(shí)施例1步驟二進(jìn)行操作，檢測(cè)待測(cè)DNA樣品中是否含有目的細(xì)菌耐藥基因，具體判定方法參見(jiàn)實(shí)施例1步驟二6。

結(jié)果如圖2所示，由圖可見(jiàn)對(duì)于每一種參考品DNA質(zhì)粒而言，均僅為固定了相應(yīng)檢測(cè)探針的點(diǎn)能夠檢測(cè)到明顯熒光信號(hào)，其他點(diǎn)均沒(méi)有檢測(cè)到熒光信號(hào)。該結(jié)果表明本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因的試劑盒具有較強(qiáng)的特異性。

三、用于檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因的試劑盒的靈敏度分析

將上述步驟一構(gòu)建的13種參考品DNA質(zhì)粒分別進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)玫綕舛纫来螢?0⁴拷貝/μL、10³拷貝/μL、10²拷貝/μL、10¹拷貝/μL的稀釋液。分別以不同稀釋度的13種參考品DNA質(zhì)粒為待測(cè)DNA樣品，然后按照實(shí)施例1步驟二進(jìn)行操作，檢測(cè)待測(cè)DNA樣品中是否含有目的細(xì)菌耐藥基因，具體判定方法參見(jiàn)實(shí)施例1步驟二6。

結(jié)果顯示：對(duì)于每一種參考品DNA質(zhì)粒而言，濃度為10⁴拷貝/μL、10³拷貝/μL、10²拷貝/μL時(shí)相應(yīng)檢測(cè)探針的點(diǎn)都能夠檢測(cè)到明顯熒光信號(hào)；僅濃度為10¹拷貝/μL的參考品DNA質(zhì)粒沒(méi)有檢測(cè)到熒光信號(hào)。該結(jié)果表明本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因的試劑盒具有較高的靈敏度。

實(shí)施例3、實(shí)際臨床樣品的檢測(cè)

一、臨床樣本類(lèi)型

本實(shí)施例所采用臨床樣本來(lái)自于北京大學(xué)人民醫(yī)院采集的人傷口處粘稠膿液(本著本采集者自愿的原則)，共三份。

二、臨床樣本中DNA樣品的提取

1、取步驟一的臨床樣本1-3mL；

2、加入4倍體積4％(4g/100mL)的NaOH，搖勻，室溫放置30min液化；

3、取0.5mL液化后膿液與0.5mL 4％(4g/100mL)的NaOH，室溫，10min；

4、12 000rpm離心15min；

5、棄上清，加無(wú)菌生理鹽水1mL，混勻，12 000rpm離心5min；

6、棄上清，沉淀用于DNA提取；

7、加入50μL核酸提取液(博奧生物集團(tuán)有限公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為CP.360090)，充分震蕩混勻，使沉淀完全懸??；

8、將懸浮液轉(zhuǎn)移至核酸提取管中，旋緊管蓋，放入核酸提取儀或渦旋震蕩儀上最大轉(zhuǎn)速震蕩5min；

9、95℃金屬浴加熱5min；

10、5000rpm離心1min，將上清液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

三、實(shí)際臨床樣品的檢測(cè)

將步驟二獲得的三份臨床樣本DNA為待測(cè)DNA樣品，然后按照實(shí)施例1步驟二進(jìn)行操作，檢測(cè)待測(cè)DNA樣品中是否含有目的細(xì)菌耐藥基因，具體判定方法參見(jiàn)實(shí)施例1步驟二6。

結(jié)果如圖3所示，由圖可見(jiàn)三份樣本雜交信號(hào)均清晰且單一。經(jīng)與探針位置比對(duì)，1號(hào)臨床樣本中檢測(cè)得到信號(hào)為耐藥基因bla_CTX-M-9和bla_KPC-1，2號(hào)臨床樣本中檢測(cè)得到信號(hào)為耐藥基因bla_OXA-23、bla_OXA-58和bla_VIM-8，3號(hào)臨床樣本中檢測(cè)得到信號(hào)為耐藥基因bla_CTX-M-1和bla_DHA-1。

為了進(jìn)一步確定以上本發(fā)明檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本發(fā)明的發(fā)明人將三份臨床樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了瓊脂糖凝膠電泳及測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)：1號(hào)臨床樣本僅采用引物對(duì)CTX-M9-F/CTX-M9-R和KPC-F/KPC-R的擴(kuò)增產(chǎn)物具有明顯的電泳條帶，而其他引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物均沒(méi)有檢測(cè)到明顯的電泳條帶，進(jìn)一步對(duì)引物對(duì)CTX-M9-F/CTX-M9-R和KPC-F/KPC-R的擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序發(fā)現(xiàn)其序列正依次分別為bla_CTX-M-9基因(GenBank：AJ416345.1，update：2005-4-15)的第218-958位和bla_KPC-1基因(GenBank：AF297554.1，update：2001-3-26)的第154-1003位；2號(hào)臨床樣本僅采用引物對(duì)OXA23-F/OXA23-R、OXA58-F/OXA58-R和VIM-F/VIM-R的擴(kuò)增產(chǎn)物具有明顯的電泳條帶，而其他引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物均沒(méi)有檢測(cè)到明顯的電泳條帶，進(jìn)一步對(duì)引物對(duì)OXA23-F/OXA23-R、OXA58-F/OXA58-R和VIM-F/VIM-R的擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序發(fā)現(xiàn)其序列正依次分別為bla_OXA-23基因(GenBank：JN665073.1，update：2011-11-7)的第97-899位、bla_OXA-58基因(GenBank：EU107372.1，update：2007-9-11)的第42-835位和bla_VIM-8基因(GenBank：AY524987.1，update：2004-11-5)的第89-798位；3號(hào)臨床樣本僅采用引物對(duì)CTX-M1-F/CTX-M1-R和DHA-F/DHA-R的擴(kuò)增產(chǎn)物具有明顯的電泳條帶，而其他引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物均沒(méi)有檢測(cè)到明顯的電泳條帶，進(jìn)一步對(duì)引物對(duì)CTX-M1-F/CTX-M1-R和DHA-F/DHA-R的擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序發(fā)現(xiàn)其序列正依次分別為bla_CTX-M-1基因(GenBank：AJ416342.1，update：2008-10-23)的第567-1373位和bla_DHA-1基因(GenBank：EF406115.1，update：2007-8-17)的第1-1113位。該結(jié)果證明利用本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。