本發(fā)明涉及一種利用微生物酶生物轉(zhuǎn)化法制備杠柳苷元的方法。

(二)

背景技術(shù)：

杠柳苷元(periplogenin)是一種存在于中藥材香加皮(Periplocae Cortex)中的強(qiáng)心苷(CAS號為514-39-6，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1)，有強(qiáng)心、抗炎和抗腫瘤等藥理作用，對體外培養(yǎng)的多種腫瘤細(xì)胞，如對小鼠S180肉瘤細(xì)胞、人胃癌SGC-7901細(xì)胞、人肺癌A549細(xì)胞和人肝癌HepG2細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞株均具有毒性作用[韓宇博，趙愛國.杠柳苷元的抗腫瘤作用研究.中國小兒血液與腫瘤雜志，2008,13(1):1-5]；杠柳苷元對人皮膚異常增殖細(xì)胞的增殖具有抑制作用，而且對心得安誘導(dǎo)的豚鼠銀屑病模型具有較好的治療作用，但對皮下結(jié)締組織細(xì)胞A9則無抑制作用，因而可以治療皮膚增生性疾病[鮑永利，李玉新，張文靜，等.一種杠柳苷元及其衍生物用于防治皮膚增生性疾病的應(yīng)用：中國，201510811907.0，2016-02-24]。杠柳苷元對體外培養(yǎng)的肥大細(xì)胞、致敏大鼠肥大細(xì)胞的組胺釋放有顯著的抑制作用，口服給藥杠柳苷元可使小鼠顯著減少肥大細(xì)胞的組胺釋放，具有顯著的抗炎作用[顧衛(wèi)，趙力建，趙愛國.杠柳苷元對肥大細(xì)胞脫顆粒及釋放組胺影響的研究.中國藥房，2008,19(3):166-168]。由此可見，杠柳苷元作為藥物應(yīng)用于臨床疾病治療的前景廣闊。

杠柳苷元天然存在于香加皮中，但含量極低，幾乎不可能用天然提取法生產(chǎn)杠柳苷元，目前尚未見化學(xué)合成法的研究報(bào)道。在香加皮中，杠柳苷元的糖苷—杠柳毒苷(periplocin，CAS號13137-64-9，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1)的含量卻較高。不同產(chǎn)地的香加皮中，杠柳毒苷的含量差別較大，在0.060～12.15mg/g之間，其中以產(chǎn)自天津薊縣的香加皮中杠柳毒苷含量最高[田俊生，李天祥，劉虹，等.HPLC法測定不同產(chǎn)地香加皮中杠柳毒苷的含量.中藥材，2006,29(8):799-800]。所以，以杠柳毒苷為原料水解制備杠柳苷元是一種較佳的生產(chǎn)方法。

目前已有水解杠柳毒苷制備杠柳苷元專利申請，如專利“一種杠柳苷元的制備方法(申請?zhí)?00610013621.9)”公開的方法是用酸處理香加皮提取物、香加皮藥材等，再經(jīng)萃取和柱層析分離得到杠柳苷元，該方法具有工藝簡單，成本低的優(yōu)點(diǎn)，但大量使用酸和有機(jī)溶劑，不利于環(huán)境保護(hù)；專利“一種酶法水解制備杠柳苷元的方法(申請?zhí)?01110210631.2)”公開的方法是采用蝸牛酶、纖維素酶或苦杏仁酶酶解香加皮甲醇提取物，雖然該方法具有得率高的優(yōu)點(diǎn)，但是酶的成本勢必影響該技術(shù)的應(yīng)用。

為了提高杠柳苷元的生產(chǎn)效率，克服現(xiàn)有杠柳苷元生產(chǎn)方法的不足，本發(fā)明采用生物轉(zhuǎn)化法制備杠柳苷元(反應(yīng)式見圖1)。篩選獲得一株轉(zhuǎn)化能力高的微生物菌株，利用該菌株發(fā)酵制備的粗酶液，直接處理香加皮，在粗酶液中糖苷酶的作用下，其中杠柳毒苷轉(zhuǎn)化為杠柳苷元，再經(jīng)分離獲得產(chǎn)品杠柳苷元。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種利用黑曲霉(Aspergillus niger)HC306菌株發(fā)酵制備粗酶液處理香加皮，轉(zhuǎn)化其中的杠柳毒苷為杠柳苷元的方法，較好地克服現(xiàn)有酸水解法的污染問題，也較好地克服了酶水解法的酶成本較高的問題，本工藝具有流程簡單、轉(zhuǎn)化得率高和副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種生物轉(zhuǎn)化法制備杠柳苷元的方法，所述的方法是以黑曲霉HC306發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液經(jīng)抽濾后的濾液為催化劑，以香加皮為原料構(gòu)成轉(zhuǎn)化體系，在30～35℃、150～250r/min恒溫振蕩條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液過濾，濾餅干燥后經(jīng)分離純化，獲得杠柳苷元。

進(jìn)一步，所述轉(zhuǎn)化體系中，原料香加皮的終濃度為50～100g/L轉(zhuǎn)化體系，所述香加皮質(zhì)量符合中國藥典(2015版)要求，在加入轉(zhuǎn)化體系前先烘干粉碎過60目篩；所述催化劑用量以抽濾前發(fā)酵液中干菌體重量計(jì)為6～8g/L轉(zhuǎn)化體系。

進(jìn)一步，所述的轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間為8～12h。

進(jìn)一步，所述黑曲霉HC306在發(fā)酵培養(yǎng)前，通常需要先經(jīng)平板培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，再經(jīng)過種子培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，然后用孢子或種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)酶培養(yǎng)，所述黑曲霉HC306發(fā)酵培養(yǎng)方法為：

(1)活化培養(yǎng)：將黑曲霉HC306菌種孢子接種于平板培養(yǎng)基，于28～30℃恒溫培養(yǎng)2～3d，獲得平板孢子，所述的平板培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)；PDA培養(yǎng)基組成為：馬鈴薯100～200g/L(馬鈴薯洗凈去皮，切成小塊，加5倍質(zhì)量水煮沸20～30min，4層紗布過濾去渣留汁)，蔗糖10～20g/L，瓊脂15～20g/L，pH自然；優(yōu)選PDA培養(yǎng)基組成：馬鈴薯200g/L，蔗糖20g/L、瓊脂18g/L，溶劑為自來水，pH自然；

(2)種子擴(kuò)大培養(yǎng)：挑取步驟(1)活化培養(yǎng)后黑曲霉HC306孢子接種至種子培養(yǎng)基中，于28～30℃、200～250r/min恒溫振蕩條件下培養(yǎng)2～3d，得種子液；所述種子培養(yǎng)基組成為：蔗糖10～20g/L，(NH₄)₂SO₄ 3～5g/L，酵母浸出粉2～3g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄ 0.5g/L，CaCl₂ 0.1g/L，溶劑為自來水，pH 5～6；優(yōu)選的種子培養(yǎng)基組成為：蔗糖10g/L，(NH₄)₂SO₄3g/L，酵母浸出粉2g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄ 0.5g/L，CaCl₂ 0.1g/L，溶劑為自來水，pH 5～6；

(3)發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟(2)制備的種子液以體積濃度5～10％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28～30℃、200～250r/min恒溫振蕩條件下培養(yǎng)2～3d，獲得發(fā)酵液，將發(fā)酵液用4層紗布過濾，濾液即為催化劑；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成同種子培養(yǎng)基，優(yōu)選的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：蔗糖20g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，酵母浸出粉3g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄ 0.5g/L，CaCl₂0.1g/L，溶劑為自來水，pH 5～6。

本發(fā)明所述分離純化方法為：將干燥后的濾餅加入體積濃度70％甲醇水溶液，于40℃、40KHz、180W條件下超聲提取30min后，布氏漏斗抽濾，獲得濾液和濾餅；濾餅用等體積的體積濃度70％甲醇水溶液重復(fù)提取3次，合并濾液，于45℃減壓蒸干，得膏狀物；將膏狀物用甲醇溶解后進(jìn)行硅膠柱層析，用體積比為10:5的石油醚和乙酸乙酯進(jìn)行等度洗脫，HPLC跟蹤監(jiān)測，收集含杠柳苷元的洗脫液，45℃減壓蒸干，得杠柳苷元；第一次提取用體積濃度70％甲醇水溶液體積用量以干燥后的濾餅質(zhì)量計(jì)為5ml/g。

本發(fā)明所述的黑曲霉HC306菌株，保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號：GDMCC No:60026，保藏日期2016年3月21日，已在專利申請(申請?zhí)朇N201610234720.3)中公開。

微生物有著非常強(qiáng)大的酶系和分解轉(zhuǎn)化物質(zhì)的能力，在黑曲霉HC306發(fā)酵液中，不僅含有糖苷酶，能將杠柳毒苷轉(zhuǎn)化為杠柳苷元，還有一些其他多糖水解酶，對香加皮中纖維素、木聚糖等的水解，有利于結(jié)合態(tài)的杠柳毒苷和杠柳苷元釋放，從而可以獲得較高的杠柳苷元提取收率。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：(1)利用黑曲霉HC306發(fā)酵制備粗酶液處理香加皮制備杠柳苷元的方法，發(fā)酵培養(yǎng)基成分簡單，發(fā)酵成本低；(3)黑曲霉HC306生長迅速、抗雜菌污染能力強(qiáng)、容易培養(yǎng)，批次穩(wěn)定；(4)以香加皮干粉為原料，投入黑曲霉HC306粗酶體系轉(zhuǎn)化，既免去杠柳毒苷分離提取操作，也免去了酶的分離純化步驟，工藝簡單，易于工業(yè)化應(yīng)用；(5)香加皮經(jīng)生物轉(zhuǎn)化處理后，杠柳苷元含量最高可達(dá)7mg/g以上，是提取杠柳苷元的較佳原料。

(四)附圖說明

圖1杠柳毒苷轉(zhuǎn)化為杠柳苷元的化學(xué)反應(yīng)式；

圖2HPLC法分析杠柳苷元濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖3香加皮樣品的HPLC分析圖譜，A為標(biāo)準(zhǔn)品杠柳毒苷和杠柳苷元的HPLC圖譜；B為未經(jīng)轉(zhuǎn)化處理的香加皮甲醇提取物HPLC圖譜；C為經(jīng)轉(zhuǎn)化處理的香加皮甲醇提取物HPLC圖譜(實(shí)施例3樣品)。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1轉(zhuǎn)化菌種的篩選

對實(shí)驗(yàn)室保存的6個黑曲霉菌株(編號為HC304～HC309，分離過程已在CN 201610234720.3中公開)轉(zhuǎn)化杠柳毒苷為杠柳苷元的能力進(jìn)行篩選。先從4℃冰箱保存的上述黑曲霉平板菌種挑取1滿環(huán)孢子，接種于新鮮PDA平板培養(yǎng)基，平板于28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，得活化的黑曲霉平板。用棉簽從活化的菌種平板中蘸取孢子，接種到50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)3d后(不同菌株培養(yǎng)液的干菌體濃度在4.23g/L～6.45g/L之間不等)，50mL發(fā)酵液用4層紗布過濾，收集的濾液即為粗酶液。取其中的40mL粗酶液于150mL三角瓶中，再加入2g香加皮(終濃度為50g/L)于粗酶液中構(gòu)成反應(yīng)體系(總體積按40mL計(jì))，于30℃、150r/min恒溫振蕩水浴中轉(zhuǎn)化12h。轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化體系用布氏漏斗抽濾，濾餅連同濾紙一起與85℃烘干10h，HPLC法分析經(jīng)處理的香加皮中杠柳苷元含量。

HPLC分析來自不同菌株發(fā)酵制備的粗酶液處理香加皮中杠柳苷元含量，結(jié)果見表1，由此比較不同菌株產(chǎn)酶轉(zhuǎn)化杠柳毒苷為杠柳苷元的能力高低。

表1不同黑曲霉菌株來源的粗酶液處理香加皮中杠柳苷元含量

由表1可以看出：經(jīng)黑曲霉HC306發(fā)酵制備的粗酶液處理后的香加皮，其中的杠柳苷元含量最高，為3.43mg/g，而未轉(zhuǎn)化的香加皮中杠柳苷元含量僅為0.13mg/g。黑曲霉HC306菌株，已保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號：GDMCC No:60026，保藏日期2016年3月21日。

所述的平板培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，按以下組成和方法配制：馬鈴薯洗凈去皮切成小塊，稱取200g，加自來水1000mL，煮沸30min，4層紗布過濾去渣，濾液補(bǔ)足到1000mL，再加入蔗糖20g、瓊脂18g，pH自然(實(shí)測6.5)，經(jīng)高壓蒸汽121℃滅菌15min后倒入無菌培養(yǎng)皿，每皿25mL。

所述的發(fā)酵培養(yǎng)基按如下組成和方法配制：蔗糖10g/L，(NH₄)₂SO₄ 3g/L，酵母浸出粉2g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄ 0.5g/L，CaCl₂ 0.1g/L，溶劑為水，pH 6，250mL的三角瓶裝50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，8層紗布扎口，高壓蒸汽121℃滅菌15min。

所述的香加皮原料質(zhì)量符合中國藥典(2015版)要求，需經(jīng)過85℃烘干10h，粉碎后過60目篩。

所述HPLC分析方法為：0.5g香加皮粉于三角瓶中，加入體積濃度70％甲醇水溶液10mL，40℃、40KHz、180W條件下超聲提取30min，上層清液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾備用。HPLC條件為：LC-20AD高效液相色譜儀(日本島津儀器有限公司)，色譜柱為Phenomenex Luna C18鍵合硅膠柱(5μm，250mm×4.6mm)，柱溫25℃；流動相為體積比1:3的乙腈和水混合物，流速1.0mL/min，檢測波長220nm，進(jìn)樣量20μL。由相同分析條件下，標(biāo)準(zhǔn)品杠柳苷元濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)計(jì)算出甲醇提取液中杠柳苷元濃度，再計(jì)算出香加皮樣品中的杠柳苷元含量。

實(shí)施例2：黑曲霉HC306轉(zhuǎn)化穩(wěn)定性驗(yàn)證

以黑曲霉HC306為產(chǎn)酶菌種，在50mL搖瓶發(fā)酵規(guī)模下，增加了種子擴(kuò)大培養(yǎng)步驟，發(fā)酵制備粗酶液處理香加皮，驗(yàn)證菌種的轉(zhuǎn)化穩(wěn)定性，具體工藝步驟如下：

(1)將4℃冰箱中保藏的黑曲霉HC306平板菌種接種于新鮮PDA平板培養(yǎng)基，平板于30℃恒溫培養(yǎng)2d，所述的PDA平板培養(yǎng)基組成和制備方法同實(shí)施例1；

(2)用棉簽蘸取步驟(1)活化培養(yǎng)后黑曲霉HC306孢子2次至50mL種子培養(yǎng)基中，于30℃、200r/min恒溫振蕩條件下培養(yǎng)3d，得干菌體濃度為5.87g/L的種子液。所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為：蔗糖10g/L，(NH₄)₂SO₄ 3g/L，酵母浸出粉2g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄ 0.5g/L，CaCl₂ 0.1g/L，溶劑為水，pH 6，250mL的三角瓶裝50mL種子培養(yǎng)基，8層紗布扎口，高壓蒸汽121℃滅菌15min。

(3)步驟(2)種子液以體積濃度5％(即2.5mL)的接種量接種至50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、200r/min恒溫振蕩條件下培養(yǎng)3d，得干菌體濃度為6.33g/L的發(fā)酵液。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成和配制方法同步驟(2)中的種子培養(yǎng)基。

(4)發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，將步驟(3)獲得發(fā)酵液50mL用4層紗布過濾，收集的濾液即為粗酶液。取其中的40mL粗酶液于150mL三角瓶中，再加入2g香加皮(終濃度為50g/L)于粗酶液中構(gòu)成反應(yīng)體系(總體積按40mL計(jì))，于30℃、150r/min恒溫振蕩水浴中轉(zhuǎn)化12h。轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化體系用布氏漏斗抽濾，濾餅連同濾紙一起于85℃烘干10h，用HPLC分析經(jīng)處理的香加皮中杠柳苷元的含量。

HPLC分析表明，按本實(shí)施例方法，黑曲霉HC306制備的粗酶液轉(zhuǎn)化處理香加皮，樣品中杠柳苷元含量為3.93mg/g。實(shí)施例2轉(zhuǎn)化方法重復(fù)實(shí)驗(yàn)3批次，3批次實(shí)驗(yàn)結(jié)果無顯著性差異，表明黑曲霉HC306制備的粗酶液轉(zhuǎn)化杠柳毒苷為杠柳苷元的性能穩(wěn)定。

實(shí)施例3：優(yōu)選轉(zhuǎn)化工藝

在實(shí)施例2的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基成分濃度、培養(yǎng)條件、香加皮濃度、轉(zhuǎn)化時(shí)間等，黑曲霉HC306發(fā)酵制備粗酶液轉(zhuǎn)化處理香加皮，其中的杠柳苷元含量顯著提高。優(yōu)選的生物轉(zhuǎn)化法制備杠柳苷元的工藝步驟如下：

(1)將4℃冰箱中保藏的黑曲霉HC306平板菌種接種于新鮮PDA平板培養(yǎng)基，平板于30℃恒溫培養(yǎng)2d，所述的PDA平板培養(yǎng)基組成和制備方法同實(shí)施例1；

(2)用棉簽蘸取步驟(1)活化培養(yǎng)后黑曲霉HC306孢子2次至50mL種子培養(yǎng)基中，于30℃、250r/min恒溫振蕩條件下培養(yǎng)2d，得干菌體濃度為5.63g/L的種子液。所述種子培養(yǎng)基組成和配制方法同實(shí)施例2。

(3)步驟(2)種子液以體積濃度10％(即5mL)的接種量接種至50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、250r/min恒溫振蕩條件下培養(yǎng)2d，得干菌體濃度為8.04g/L的發(fā)酵液。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如下：蔗糖20g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，酵母浸出粉3g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄0.5g/L，CaCl₂ 0.1g/L，溶劑為水，pH 6，250mL的三角瓶裝50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，8層紗布扎口，高壓蒸汽121℃滅菌15min。

(4)發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，將步驟(3)獲得發(fā)酵液50mL經(jīng)4層紗布過濾，收集的濾液即為粗酶液。取其中的40mL粗酶液于150mL三角瓶中，再加入4g香加皮(終濃度為100g/L)于粗酶液中構(gòu)成反應(yīng)體系(總體積按40mL計(jì))，于35℃、200r/min恒溫振蕩水浴中轉(zhuǎn)化8h。轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化體系用布氏漏斗抽濾，濾餅連同濾紙一起與105℃烘干5h，用HPLC分析經(jīng)處理的香加皮中杠柳苷元含量。

HPLC分析表明，按本實(shí)施例方法，黑曲霉HC306制備的粗酶液轉(zhuǎn)化處理香加皮，轉(zhuǎn)化樣品中杠柳苷元含量為7.36mg/g，較實(shí)施例3提高了87.3％。

實(shí)施例4：轉(zhuǎn)化工藝放大

以黑曲霉HC306為產(chǎn)酶菌種，在實(shí)施例3的基礎(chǔ)上，將產(chǎn)酶培養(yǎng)放大到300mL搖瓶發(fā)酵，轉(zhuǎn)化體系放大到250mL，具體工藝步驟如下：

(1)將4℃冰箱中保藏的黑曲霉HC306平板菌種接種于新鮮PDA平板培養(yǎng)基，平板于30℃恒溫培養(yǎng)2d，所述的PDA平板培養(yǎng)基組成和制備方法同實(shí)施例1；

(2)用棉簽蘸取步驟(1)活化培養(yǎng)后黑曲霉HC306孢子2次至50mL種子培養(yǎng)基中，于30℃、250r/min恒溫振蕩條件下培養(yǎng)2d，得干菌體濃度為5.78g/L的種子液。所述種子培養(yǎng)基組成和配制方法同實(shí)施例2。

(3)步驟(2)種子液以體積濃度10％(即30mL)的接種量接種至300mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、250r/min恒溫振蕩條件下培養(yǎng)2d，得干菌體濃度為7.92g/L的發(fā)酵液。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成同實(shí)施例3，1L的三角瓶裝300mL發(fā)酵培養(yǎng)基，8層紗布扎口，高壓蒸汽121℃滅菌20min。

(4)發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，將步驟(3)獲得發(fā)酵液300mL經(jīng)4層紗布過濾，收集的濾液即為粗酶液。取其中的250mL粗酶液于1L三角瓶中，再加入25g香加皮(終濃度為100g/L)于粗酶液中構(gòu)成反應(yīng)體系(總體積按250mL計(jì))，于30℃、200r/min恒溫振蕩水浴中轉(zhuǎn)化8h。轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，轉(zhuǎn)化體系用布氏漏斗抽濾，濾餅連同濾紙一起與105℃烘干5h，用HPLC分析經(jīng)處理的香加皮中杠柳苷元的含量。

HPLC分析表明，按本實(shí)施例方法，黑曲霉HC306制備的粗酶液轉(zhuǎn)化處理香加皮，樣品中杠柳苷元含量為7.23mg/g。

實(shí)施例5：杠柳苷元的分離純化

按實(shí)施例4方法，步驟(4)濾餅100g(即轉(zhuǎn)化處理后的香加皮粉)加入500mL的體積濃度70％甲醇水溶液，于40℃、40KHz、180W條件下超聲提取30min后，布氏漏斗抽濾，收集濾液，濾餅(即香加皮)再次加入500mL的體積濃度70％甲醇水溶液，重復(fù)上述方法提取3次。合并提取液約1400mL，于45℃減壓蒸干，得膏狀物4.62g，加10mL甲醇溶解膏狀物，進(jìn)行柱層析分離。柱填料為硅膠，層析柱直徑為4cm，硅膠填裝高度為30cm，用體積比為10:5的石油醚和乙酸乙酯進(jìn)行等度洗脫，洗脫液50mL收集一份，HPLC分析各份洗脫液中的杠柳苷元濃度，將含有杠柳苷元的洗脫液合并，45℃減壓蒸干燥得杠柳苷元。

按本實(shí)施例方法，100g經(jīng)轉(zhuǎn)化處理后的香加皮，從中提取得到杠柳苷元0.705g，提取得率為0.705％，純度為92.6％。