本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)組學研究方向復雜生物樣品預處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：，具體涉及酰肼化學法用于選擇性富集N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段的方法及其應用。
背景技術(shù)：
：：“鳥槍法”是目前蛋白質(zhì)組學研究的主流技術(shù)，在這種技術(shù)中，復雜蛋白質(zhì)組樣品首先用酶(主要是胰蛋白酶)酶解成肽的混合物，然后用一維或者多維分離技術(shù)對該酶解物進行分離，并用二級質(zhì)譜進行檢測；利用所獲得的串聯(lián)質(zhì)譜譜圖，通過數(shù)據(jù)庫檢索來鑒定蛋白(文獻1.Yates,J.R.,TheRevolutionandEvolutionofShotgunProteomicsforLarge-ScaleProteomeAnalysis.JAmChemSoc,2013,135(5)，1629-1640.)。但是這種技術(shù)也存在一些問題，一個蛋白經(jīng)過酶解以后平均可以產(chǎn)生幾十種肽段，因此一個復雜的蛋白質(zhì)組樣品經(jīng)過酶解后所產(chǎn)生的肽的混合物是及其復雜的，可能含有幾十萬種不同的肽(文獻2.Zhang,H.；Li,X.J.；Martin,D.B.；Aebersold,R.,IdentificationandquantificationofN-linkedglycoproteinsusinghydrazidechemistry,stableisotopelabelingandmassspectrometry.Naturebiotechnology,2003,21(6),660-666.)。這樣來自高豐度蛋白的大量冗余肽段就會干擾低豐度蛋白的檢測和鑒定。為了解決這個問題，一個比較好的策略是通過對蛋白質(zhì)的特征肽段進行富集來對蛋白質(zhì)的酶解液進行簡化，去掉冗余的肽段，從而降低分離分析的強度。在國際上，目前已經(jīng)發(fā)展了多種樣品預處理方法來簡化蛋白質(zhì)組樣品酶解液的復雜度，其中把含有特定稀有氨基酸殘基如半胱氨酸(文獻3.Giron,P.；Dayon,L.；David,F.；Sanchez,J.C.；Rose,K.,EnrichmentofN-terminalcysteinyl-peptidesbycovalentcapture.JProteomics,2009,71(6),647-61.)，組氨酸(文獻4.Mesmin,C.；Domon,B.,ImprovementofthePerformanceofTargetedLC-MSAssaysthroughEnrichmentofHistidine-ContainingPeptides.JProteomeRes,2014,13(12),6160-6168.)，色氨酸(文獻5.Yu,Y.；Liu,M.；Yan,G.；He,Y.；Xu,C.；Shen,H.；Yang,P.,Hydrazide-functionalizedmagneticmicrospheresfortheselectiveenrichmentofdigestedtryptophan-containingpeptidesinserum.Talanta,2011,85(2),1001-1006.)等的肽段富集出來是比較常用的方法。并且這些特定的氨基酸殘基的存在還能提高蛋白鑒定的可靠性。除了上述的氨基酸殘基，N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段也比較特殊，其N-端的絲氨酸或者蘇氨酸的1,2-氨基醇結(jié)構(gòu)與糖肽中的順式二醇結(jié)構(gòu)類似，也可以被高碘酸鈉氧化為醛基，從而被酰肼材料捕獲。因此用于富集糖肽的酰肼化學法(文獻6.Nilsson,J.；Ruetschi,U.；Halim,A.；Hesse,C.；Carlsohn,E.；Brinkmalm,G.；Larson,G.,Enrichmentofglycopeptidesforglycanstructureandattachmentsiteidentification.Naturemethods,2009,6(11),809-U26.)也可以用于N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段的富集。本發(fā)明正是利用酰肼化學法開發(fā)了一種基于固相捕獲-釋放的富集蛋白質(zhì)組樣品酶解液中N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段的方法。通過高碘酸鈉氧化，酰肼材料捕獲，鹽酸羥胺釋放(文獻7.Dirksen,A.；Yegneswaran,S.；Dawson,P.E.,Bisarylhydrazonesasexchangeablebiocompatiblelinkers.AngewandteChemie,2010,49(11),2023-7.)，最終只有N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段進行LC-MS/MS分析。這樣去除了大量的冗余肽段，從而大大降低了樣品的復雜度以利于低豐度蛋白的鑒定和分析。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種可以簡便、高效、高特異性的富集復雜蛋白樣品蛋白酶解液中N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段的方法。本發(fā)明提供的方法是利用酰肼材料可以與高碘酸鈉氧化后的N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段上的醛基發(fā)生反應，從而將N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段從復雜樣品蛋白酶解液中富集分離出來，然后通過質(zhì)譜分析得到樣品的肽段和蛋白鑒定結(jié)果。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：取生物樣品，使用胰蛋白酶Trypsin酶解，并用PNGaseF酶去除糖鏈，然后用高碘酸鈉將蛋白酶解液中的N-端為絲氨酸/蘇氨酸的肽段選擇性氧化為N-端為醛基結(jié)構(gòu)的肽段，之后利用酰肼材料富集氧化后的肽段并使用鹽酸羥胺處理，最后對釋放的肽段進行LC-MS/MS分析來獲得肽段和蛋白的鑒定結(jié)果。所述的肽段選擇性富集方法具體步驟如下：(1)取生物樣品，溶解在含6-8MUrea和50-100mMTEAB的緩沖溶液中，加入終濃度為10-20mMDTT，37-60℃水浴中1-3h，然后加入終濃度為20-40mMIAA，20-25℃避光反應40-60min，生物樣品在緩沖溶液的濃度為1-10mg/mL；(2)步驟(1)結(jié)束后得到的樣品，用含50-100mMTEAB的水溶液按將Urea濃度稀釋至0.5-1M的比例稀釋，然后加入與蛋白質(zhì)量比為1/50-1/25的胰蛋白酶Trypsin，37℃水浴中酶解12-16h，得到肽段溶液；(3)步驟(2)結(jié)束后得到的樣品，用截留分子量為3-30K的超濾管在離心力為2000-20000g下進行超濾離心，得到濾出液；(4)向步驟(3)得到的溶液中加入與肽段質(zhì)量比為500Unites/mg-1000Unites/mg的PNGaseF，然后置于37℃水浴中酶切1-10h；(5)向步驟(4)得到的肽段溶液中加入三氟乙酸調(diào)pH至2-3，然后用C18固相萃取柱除去溶液中的小分子，將得到的肽段洗脫液冷凍干燥；(6)將100-1000μg步驟(5)得到的蛋白質(zhì)組樣品酶解肽段復溶于100-1000μL的氧化緩沖溶液中；(7)向上述步驟(6)的溶液中加入高碘酸鈉，使其終濃度為0.2-20mM，在4-37℃溫度下避光反應10-100min；(8)向上述步驟(7)的溶液中加入硫代硫酸鈉，使其終濃度為0.4-40mM，在4-37℃溫度下反應10-30min；(9)將上述步驟(8)的溶液加入10-200μL酰肼材料中，在振蕩器上渦旋震蕩12-36h后通過離心分離的方法去除上清液，上清液為非N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段的混合溶液；(10)將洗滌溶液加入上述步驟(9)得到的酰肼材料中，在振蕩器上渦旋震蕩1-10min后通過離心分離的方法去除上清液，上清液為酰肼材料上非特異性吸附的肽段的混合溶液；(11)向上述步驟(10)得到的酰肼材料中加入100-1000μL鹽酸羥胺溶液中，在25-40℃水浴中孵育12-36h，然后通過離心分離，收集上層清液，加入三氟乙酸調(diào)pH至2-3，然后用C18固相萃取柱除去溶液中的小分子，將得到的肽段洗脫液冷凍干燥即得到富集后的N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段。步驟(6)氧化緩沖溶液組成為10-200mM乙酸鈉和10-200mM氯化鈉，其余為水，pH值為3.0-6.5。步驟(9)中渦旋振蕩時溫度控制在10-40℃；步驟(9)、步驟(10)和步驟(11)中離心機的離心力為500g-3000g。步驟(10)中的洗滌溶液依次為10-300mM氯化鈉水溶液，50％-100％乙腈水溶液以及0.1％-3％氯化鈉水溶液，每種洗滌溶液分別連續(xù)洗滌1-6次。步驟(11)中的鹽酸羥胺溶液的組成為10-200mM乙酸鈉和50-300mM鹽酸羥胺，其余為水，pH值為2.5-6.5。將上述步驟(11)中得到的N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段復溶在0.1％體積濃度的甲酸中進行RPLC-MS/MS分析。該方法特異性高，能降低酶解液的復雜度，促進低豐度蛋白的鑒定，可用于復雜生物樣品的蛋白質(zhì)組分析。所述的肽段選擇性富集方法，所用的肽段富集材料為商品化的酰肼修飾的瓊脂糖凝膠(75-300μm)(Hercules,CA,U.S.A.)。所述的肽段選擇性富集方法，蛋白酶解液中只有N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段才可以被選擇性氧化，從而被酰肼材料富集。本發(fā)明的優(yōu)點：該富集方法簡單，易于操作，特異性高，樣品富集前后鑒定結(jié)果有很高的互補性，是一種序列特異性富集方法。本發(fā)明是首次將酰肼材料用于N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段的富集，結(jié)合高分辨率的RPLC-MS/MS分析，降低了樣品的復雜度，有利于低豐度蛋白的鑒定和分析。其序列特異性富集的特性在分析蛋白質(zhì)的細胞成分，蛋白質(zhì)的分子作用等方面有很大的應用前景。附圖說明圖1為所述復雜蛋白質(zhì)組樣品酶解液中N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段富集方法的流程圖。酶解后得到的肽段混合物用高碘酸鈉進行氧化，得到的混合物與酰肼材料進行渦旋振蕩，在洗去非特異性吸附的冗余肽段后，使用鹽酸羥胺將與微球結(jié)合的肽段釋放下來進行LC-MS/MS分析。圖2為所述復雜蛋白質(zhì)組樣品酶解液中N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段富集方法， 用于鼠肝蛋白質(zhì)組學分析的肽段鑒定數(shù)據(jù)，實驗組(富集后的樣品)和對照組(富集前的樣品)都分別進行了三次技術(shù)重復實驗。(a)富集前后肽段的鑒定結(jié)果。(b)富集前后鑒定到肽段的Weblogo圖。圖3為所述復雜蛋白質(zhì)組樣品酶解液中N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段富集方法，用于鼠肝蛋白質(zhì)組學分析的蛋白質(zhì)鑒定數(shù)據(jù)。(a)富集前三次技術(shù)重復的蛋白質(zhì)鑒定數(shù)目，(b)富集后三次技術(shù)重復的蛋白質(zhì)鑒定數(shù)目，(c)富集前后蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果的overlap。圖4為所述復雜蛋白質(zhì)組樣品酶解液中N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段富集方法，用于人血清蛋白質(zhì)組學分析的蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果。實驗組(富集后的樣品)和對照組(富集前的樣品)都分別進行了三次技術(shù)重復實驗，圖中的結(jié)果為三次技術(shù)重復實驗的平均值。具體實施方式下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。實施例1N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段富集方法用于鼠肝蛋白質(zhì)組學分析：(1)取1mg鼠肝蛋白質(zhì)樣品，溶解在含8MUrea和100mMTEAB(四乙基溴化銨)的緩沖溶液中(pH8.0)，加入終濃度為20mMDTT，60℃水浴中1h，然后加入終濃度為40mMIAA，25℃避光反應40min以封閉巰基；(2)用100mMTEAB(pH8.0)稀釋Urea濃度至1M，然后加入25μg胰蛋白酶，37℃水浴中酶解16h；(3)用截留分子量為10K的超濾管在14000g離心力下對上述得到的溶液進行超濾離心，得到濾出液；(4)加入500Unites的PNGaseF酶，然后置于37℃水浴中酶切6h；(5)用三氟乙酸調(diào)pH至2.5，然后C18固相萃取柱除去溶液中的小分子，將得到的肽段洗脫液冷凍干燥；(6)將200μg得到的酶解肽段復溶于400μL氧化緩沖溶液中,加入終濃度為2mM的高碘酸鈉，25℃溫度下避光反應60min；然后加入4mM硫代硫酸鈉，25℃下反應15min以猝滅氧化反應；(7)將上述溶液加入40μL酰肼材料中，在25℃振蕩器上渦旋震蕩24h，之后在1400g離心力作用下離心去除上清液；(8)用150mMNaCl水溶液、80％(v/v)乙腈、0.9％NaCl水溶液各連續(xù)洗滌上述酰肼材料3次，以洗去非特異性吸附的肽段，并將酰肼材料分散在200μL鹽酸羥胺水溶液中，于37℃水浴中孵育16h；(9)收集上層清液，用三氟乙酸調(diào)pH至2.5，然后用C18固相萃取柱除去溶液中的小分子，將得到的肽段洗脫液冷凍干燥即得到富集的N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段混合物；(10)將上述得到的肽段混合物用0.1％(v/v)甲酸復溶進行RPLC- MS/MS分析。圖2為肽段的鑒定結(jié)果，對比富集前后總的肽段鑒定數(shù)目以及N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段所占的比例，可以看出富集以后肽段的總數(shù)減少但是N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段的比例卻由富集之前的15.0％增加到93.5％，說明這種固相捕獲-釋放方法將N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段從復雜蛋白質(zhì)組樣品酶解液中富集出來可以有效降低樣品的復雜程度，并且具有很高的富集特異性。由Weblogo圖可以更直觀地看出該方法的特異性很高，而且還是一種序列特異性富集方法。圖3為蛋白質(zhì)的鑒定結(jié)果，從圖中可以看出富集前和富集后三次技術(shù)重復鑒定結(jié)果的overlap都很高，有60％～70％，但是分別合并富集前和富集后三次技術(shù)重復的結(jié)果，再對比發(fā)現(xiàn)兩者的overlap只有37％，這么低的overlap說明富集后和富集前的鑒定結(jié)果有很高的互補性。并且，從圖中還可以發(fā)現(xiàn)，有500多個蛋白是富集之后新鑒定到的，由于這些蛋白的豐度較低，直接分析不容易鑒定的到。而該富集方法選擇性的將N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段富集出來，去掉了高豐度蛋白冗余肽段，從而有利于低豐度蛋白的鑒定。實施例2N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段富集方法用于人血清蛋白質(zhì)組學分析：本實驗所用的人血清由大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院(大連，中國)提供。樣品的取得和使用完全合法，并符合該院倫理委員會的相關(guān)規(guī)定。人血清蛋白樣品中N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段的富集實驗操作同實施例1鼠肝蛋白實驗流程。圖4為N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段富集前后鑒定到的蛋白譜圖數(shù)目分布圖，從圖中可以看出富集前后鑒定到蛋白的譜圖數(shù)目發(fā)生了很大的變化，富集后的蛋白集中在低譜圖鑒定數(shù)目區(qū)(小于8)，并且高譜圖鑒定數(shù)目(大于32)的蛋白總數(shù)也大大減少，例如血清中豐度最高的蛋白，血清白蛋白，其譜圖數(shù)目從富集前的1583降低至富集后的244，這就說明通過N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段的富集可以有效降低血清蛋白樣品酶解液的復雜程度，從而有利于血清中一些低豐度蛋白的鑒定?？傊?，本發(fā)明為一種基于酰肼化學法來選擇性富集復雜蛋白質(zhì)組樣品酶解液中N-端絲氨酸/蘇氨酸肽段來降低樣品的復雜度，從而促進低豐度蛋白鑒定的方法。該方法原理簡單，容易操作，富集特異性高，能有效降低蛋白質(zhì)組樣品酶解液的復雜度，促進低豐度蛋白的鑒定。當前第1頁1 2 3 當前第1頁1 2 3