技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有肝癌HepG2細(xì)胞抑制活性的根皮苷三乙酯的制備方法，本發(fā)明的制備工藝簡單，所得產(chǎn)物具有肝癌HepG2細(xì)胞抑制活性，其在功能性食品領(lǐng)域具有應(yīng)用前景。
背景技術(shù)：
：研究表明，約有35%的腫瘤與膳食因素有關(guān)。從膳食因素與腫瘤的發(fā)生關(guān)系來看，改變膳食營養(yǎng)和生活習(xí)慣可以降低腫瘤的發(fā)生率，尤其在癌前病變階段，改變不良生活方式或食用一些具有抗腫瘤作用的功能食品，對(duì)抗癌前病變具有重要作用。目前開發(fā)的功能食品，要求其具有抗氧化作用、誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡、提高機(jī)體免疫力、誘導(dǎo)細(xì)胞間隙連接通訊、抗突變、抗畸變。要實(shí)現(xiàn)這些作用需要充分合理地應(yīng)用各種生理活性物質(zhì)，也需要合理地搭配各種基本營養(yǎng)素，以充分發(fā)揮抗腫瘤食品的保健作用和最大限度地調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫功能。根皮苷是根皮素的葡萄糖苷，屬于二氫查爾酮類物質(zhì)，其主要存在于蘋果樹的根皮、莖、嫩葉以及蘋果果實(shí)中,近年來在多穗柯甜茶中也發(fā)現(xiàn)了含量比較豐富的根皮苷。但根皮苷脂溶性均不佳，導(dǎo)致其降低其生物利用度不高,限制了其的應(yīng)用范圍。酯化是提高天然產(chǎn)物生物活性的常用策略。目前酯化衍生主要采用酸酐或酰氯，進(jìn)行化學(xué)酰化，但根皮苷上羥基眾多、環(huán)境相近，為合成帶來了較大困難。該法存在著反應(yīng)區(qū)域選擇性差，目的產(chǎn)物產(chǎn)率低、分離困難等缺點(diǎn)。若采用基團(tuán)保護(hù)及脫保護(hù)等措施，又存在步驟繁多，耗時(shí)長，且引入溶劑多、環(huán)境不友好等缺點(diǎn)。而傳統(tǒng)的非水相酶催化雖具有有高效、高選擇性的特點(diǎn)，但其大多使用有機(jī)溶劑、離子液體為反應(yīng)介質(zhì)，獲得的產(chǎn)物主要為單酯化衍生物。而本發(fā)明則采用無溶劑體系的非水相酶促法，將乙酸乙烯酯作為酰基供體和反應(yīng)介質(zhì)，以脂肪酶為催化劑合成了根皮苷三乙酯，其對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞具有很好的抑制效果，在功能性食品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，對(duì)我國蘋果資源的綜合開發(fā)和產(chǎn)業(yè)鏈延伸也具有重要意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的主要目的是提供一種具有肝癌HepG2細(xì)胞抑制活性的根皮苷三乙酯的制備方法，本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種具有肝癌HepG2細(xì)胞抑制活性的根皮苷三乙酯的制備方法，包括以下步驟：(1)用乙酸乙烯酯將根皮苷(純度≥98％)溶解完全，而后加入脂肪酶，反應(yīng)體系中根皮苷的濃度0.5-2mg/mL，脂肪酶的濃度2-12mg/mL。將所得混合物在30-60℃下密閉，振蕩反應(yīng)24-72h后終止反應(yīng)。(2)將步驟(1)所得反應(yīng)混合物中的脂肪酶濾除，并將溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至油狀物加入適量丙酮溶解，使用配有C18預(yù)裝柱的快速制備色譜進(jìn)行分離，流動(dòng)相由甲醇和純水構(gòu)成，采用梯度洗脫，洗脫程序如表1，檢測波長為280nm。(3)將步驟(2)所得洗脫液真空濃縮，冷凍干燥(溫度為-60~-40℃,真空度低于0.08Pa)，得產(chǎn)品。表1洗脫程序時(shí)間（min）甲醇（%）純水（%）0208052080107030本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與效果：（1）根皮苷為蘋果深加工副產(chǎn)物，來源廣泛，以其為原料制備的根皮苷三乙酯具有很強(qiáng)的肝癌HepG2細(xì)胞抑制活性，因而本發(fā)明具有很強(qiáng)的實(shí)用性，對(duì)我國蘋果資源的綜合開發(fā)和產(chǎn)業(yè)鏈延伸具有重要意義。（2）本發(fā)明的生產(chǎn)工藝簡單，并且提取和純化步驟中所用的有機(jī)溶劑均能有效回收，節(jié)約了生產(chǎn)成本，因此本發(fā)明具有廣闊的市場前景。附圖說明圖1為本發(fā)明所述的根皮苷三乙酯紫外光譜；圖2為本發(fā)明所述的根皮苷三乙酯的紅外光譜；圖3為本發(fā)明所述的根皮苷三乙酯的質(zhì)譜（正離子模式）；圖4為本發(fā)明所述的根皮苷三乙酯的1H-NMR圖譜；圖5為本發(fā)明所述的根皮苷三乙酯13C-NMR圖譜；圖6為本發(fā)明所述的根皮苷三乙酯抑制肝癌HepG2細(xì)胞效果。具體實(shí)施方式為詳細(xì)介紹本發(fā)明的實(shí)施，列舉如下實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受下列實(shí)施例的限制。實(shí)施例1用35mL乙酸乙烯酯將60mg根皮苷(純度≥98％)溶解完全，而后加入脂肪酶(LipozymeIMRM)250mg。將所得混合物在50℃下密閉，振蕩反應(yīng)60h后終止反應(yīng)。濾除反應(yīng)液中的脂肪酶，并將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至油狀物加入15mL丙酮溶解，使用配有C18預(yù)裝柱的快速制備色譜進(jìn)行分離純化，流動(dòng)相由甲醇和純水構(gòu)成，采用梯度洗脫，洗脫程序如表1，檢測波長為280nm。所得洗脫液真空濃縮，冷凍干燥(溫度為-50℃,真空度0.05Pa)，得根皮苷三乙酯26.1mg。實(shí)施例2用40mL乙酸乙烯酯將45mg根皮苷(純度≥98％)溶解完全，而后加入脂肪酶(LipozymeIMTL)100mg。將所得混合物在40℃下密閉，振蕩反應(yīng)72h后終止反應(yīng)。濾除反應(yīng)液中的脂肪酶，并將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至油狀物加入10mL丙酮溶解，使用配有C18預(yù)裝柱的快速制備色譜進(jìn)行分離純化，流動(dòng)相由甲醇和純水構(gòu)成，采用梯度洗脫，洗脫程序如表1，檢測波長為280nm。所得洗脫液真空濃縮，冷凍干燥(溫度為-40℃,真空度0.04Pa)，得根皮苷三乙酯18.16mg。實(shí)施例3用30mL乙酸乙烯酯將50mg根皮苷(純度≥98％)溶解完全，而后加入脂肪酶(Novozym435)150mg。將所得混合物在45℃下密閉，振蕩反應(yīng)48后終止反應(yīng)。濾除反應(yīng)液中的脂肪酶，并將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至油狀物加入適量10mL丙酮溶解，使用配有C18預(yù)裝柱的快速制備色譜進(jìn)行分離純化，流動(dòng)相由甲醇和純水構(gòu)成，采用梯度洗脫，洗脫程序如表1，檢測波長為280nm。所得洗脫液真空濃縮，冷凍干燥(溫度為-50℃,真空度0.06Pa)，得根皮苷三乙酯29.07mg。當(dāng)前第1頁1 2 3