本發(fā)明屬于木質(zhì)纖維素酶解領(lǐng)域，具體涉及一種促進(jìn)木質(zhì)纖維素酶解糖化的方法。

背景技術(shù)：

我國是農(nóng)業(yè)大國，木質(zhì)纖維素資源豐富，高效開發(fā)該類可再生資源是緩解能源危機(jī)的有效手段，也對減輕環(huán)境污染具有重要意義。木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素組成，性質(zhì)穩(wěn)定，較難降解，若無有效的預(yù)處理方法破壞其結(jié)構(gòu)則很難直接被利用。另一方面，預(yù)處理后生物質(zhì)的水解糖化又是木質(zhì)纖維素資源利用過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在眾多水解方法中，酶解因其特有優(yōu)勢如徹底、副產(chǎn)物少、條件溫和、環(huán)保、糖損耗低等被廣泛應(yīng)用。但由于纖維素酶壽命短、活性低、穩(wěn)定性差等缺陷，導(dǎo)致木質(zhì)纖維素酶解糖化率低、成本高。為了解決上述問題，國內(nèi)外學(xué)者展開了大量的研究。例如在檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％，固液比為1:20，微波功率600W，處理時間8min，酶水解96h，水稻秸稈的還原糖產(chǎn)率可達(dá)50.6％，提高了28.1％，見木質(zhì)纖維素微波強(qiáng)化預(yù)處理方法的初步研究，黃美子等，現(xiàn)代化工，2016，36，9；通過固液比1:10(g/mL)0.5％的硫酸溶液，在80℃下預(yù)浸20min后，然后以2℃/min的速率升溫至150℃，并保溫1h，對毛竹竹黃木質(zhì)素進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理后用蒸餾水將樣品洗滌至中性，60℃烘干，用粉碎機(jī)磨碎至0.18～0.83mm的粉末，經(jīng)過上述預(yù)處理后，竹黃木質(zhì)素結(jié)構(gòu)得到了顯著改善，見稀硫酸預(yù)處理對毛竹竹黃木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的影響，黃曹興，林業(yè)工程學(xué)報，2016，1，1；此外，Zhang通過白腐菌聯(lián)合堿預(yù)處理強(qiáng)化楊木的酶解糖化作用，效果也較顯著，Zhang Liming,et al.,Industrial Crops and Products,2016,86。綜上所述，這些方法均在一定程度上改善木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，提高了木質(zhì)纖維素的酶解效率，但是操作程序復(fù)雜不易控制、處理成本較高，同時纖維素酶的活性也并沒有顯著提高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種利用伽馬輻照預(yù)處理聯(lián)合毛發(fā)蛋白為酶解助劑促進(jìn)木質(zhì)纖維素酶解糖化的方法，克服現(xiàn)有技術(shù)糖化率低、酶活性差、成本高、不易操作等缺陷。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

包括以下步驟：

1)將毛發(fā)浸泡在85～95℃的醋酸溶液中，然后調(diào)節(jié)pH值為6～7，過濾，濾液干燥得毛發(fā)蛋白粉；

2)將木質(zhì)纖維素生物質(zhì)粉碎過篩，得到木質(zhì)纖維素生物質(zhì)粉；將木質(zhì)纖維素生物質(zhì)粉浸泡于去離子水中，進(jìn)行輻照處理；

3)分離出輻照處理后的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)粉并加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液混合均勻，得到混合溶液，再向混合溶液中加入纖維素酶和毛發(fā)蛋白粉，得到酶解液；其中，纖維素酶的添加量為5～15FPU/g木質(zhì)纖維素生物質(zhì)粉，毛發(fā)蛋白粉和混合溶液的質(zhì)量體積比為(0.5～2)mg：1mL；酶解液在30～45℃進(jìn)行酶解反應(yīng)3～24h，完成促進(jìn)木質(zhì)纖維素的酶解糖化。

進(jìn)一步地，步驟1)中毛發(fā)采用羊毛或羽毛；毛發(fā)先用去離子水清洗除去表面浮雜，烘干后再浸泡于醋酸溶液中；毛發(fā)與醋酸溶液的質(zhì)量體積比為1mg：(1～4)mL。

進(jìn)一步地，步驟1)中醋酸溶液的體積分?jǐn)?shù)為30～50％。

進(jìn)一步地，步驟1)中浸泡30～50min。

進(jìn)一步地，步驟1)中用氨水調(diào)節(jié)pH值；制得的毛發(fā)蛋白粉密封于聚乙烯袋中，4℃貯藏備用。

進(jìn)一步地，步驟1)中濾液于40～60℃干燥2d。

進(jìn)一步地，步驟2)中木質(zhì)纖維素生物質(zhì)采用玉米秸稈；過篩采用的40～80目篩網(wǎng)。

進(jìn)一步地，步驟2)中木質(zhì)纖維素生物質(zhì)粉與去離子水的質(zhì)量體積比為(0.5～2)mg：1mL。

進(jìn)一步地，步驟2)中輻照處理是用輻照劑量1～10kGy的伽馬射線輻照10～50min。

進(jìn)一步地，步驟3)中每0.5g木質(zhì)纖維素生物質(zhì)粉中加入2～5mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液的濃度為0.075mol/L，pH值為4.8。

本發(fā)明相對現(xiàn)有技術(shù)來說，具有以下有益的技術(shù)效果：

1、本發(fā)明通過輻照預(yù)處理改變木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)，使結(jié)晶度指數(shù)(CrI)降低，比表面積(SSA)增加，利于后面的酶解糖化作用，同時簡化了生物質(zhì)的預(yù)處理工序與成本。2、本發(fā)明方法采用毛發(fā)蛋白粉為酶解助劑，毛發(fā)蛋白的加入通過降低木質(zhì)素對纖維素酶的非特異性吸收，節(jié)省了纖維素酶的用量，通過降低酶的熱失活，保證了酶的活性，并通過降低酶與氣液界面的接觸，避免了纖維素酶的損耗。3、在強(qiáng)化木質(zhì)纖維素酶解糖化的同時，實現(xiàn)了廢棄毛發(fā)的資源化利用，減少了環(huán)境污染。與輻照與處理配合使用，可在更短的時間內(nèi)(＜24h)達(dá)到更高的效率，而目前的研究均要在90h甚至100h以上才能達(dá)到相同高度的酶解率，本方法縮短了反應(yīng)時間，有效降低了水解單糖因過度水解而造成的損失。本發(fā)明是一種用輻照預(yù)處理，以毛發(fā)蛋白為酶解助劑，強(qiáng)化木質(zhì)纖維素酶解糖化作用的方法。

【附圖說明】

圖1是本發(fā)明實施例1輻照預(yù)處理時間對CrI和SSA的影響；

圖2是本發(fā)明實施例1酶解時間對還原糖得率的影響；

圖3是本發(fā)明實施例2預(yù)處理對CrI和SSA的影響；

圖4是本發(fā)明實施例2酶解時間對還原糖得率的影響；

圖5是本發(fā)明實施例3預(yù)處理對CrI和SSA的影響；

圖6是本發(fā)明實施例3酶解時間對還原糖得率的影響。

【具體實施方式】

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。

本發(fā)明方法通過如下步驟進(jìn)行的：

1)毛發(fā)選取羊毛，用去離子水清洗羊毛除去表面浮雜，烘干，然后按質(zhì)量體積比為1mg：(1～4)mL，將羊毛浸泡在30～50％(v/v)的醋酸溶液中，在85～95℃處理30～50min。用氨水中和多余的醋酸直至pH值為6～7，過濾，濾液于40～60℃干燥2d得蛋白粉，將制得的毛發(fā)蛋白粉密封于聚乙烯袋中，4℃貯藏，備用。

2)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)選擇玉米秸稈，首先取一定量的玉米秸稈，挑出異物，將選好的秸稈粉碎過篩(40～80目)，將過篩后的秸稈粉浸泡于去離子水中，質(zhì)量體積比為(0.5～2)mg：1mL，然后用輻照劑量1～10kGy的伽馬射線輻照10～50min；輻照結(jié)束后抽濾分離出秸稈粉。

3)將步驟2)分離得到的秸稈粉作為底物，取0.5g置于50mL燒瓶中，向其中加入2～5mL 0.075mol/L(pH 4.8)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液充分混合，得到混合溶液，然后再分別向燒瓶中加入纖維素酶和毛發(fā)蛋白粉，充分混合，其中，纖維素酶添加量為5～15FPU/g底物，毛發(fā)蛋白粉和混合溶液的質(zhì)量體積比為(0.5～2)mg：1mL。酶解反應(yīng)在恒溫震蕩培養(yǎng)箱(160r/min)中進(jìn)行，溫度30～45℃，反應(yīng)時間3～24h。在一定的反應(yīng)時間間隔后，取出樣品進(jìn)行還原糖與酶活性分析。

步驟1)羊毛毛發(fā)可用其他動物或飛禽毛發(fā)代替，如牛毛、豬毛、雞毛或其它羽毛等。

步驟2)玉米秸稈可用任何木質(zhì)纖維素生物質(zhì)代替，如楊木，樹葉，蒿桿等。

本發(fā)明技術(shù)方法中首先對木質(zhì)纖維素進(jìn)行伽馬射線輻照與處理，然后用制得的毛發(fā)蛋白粉與纖維素酶一起作用于預(yù)處理后的樣品，具有新穎、獨(dú)特、效率高、成本低等特點。

本方法應(yīng)用伽馬射線輻照預(yù)處理聯(lián)合毛發(fā)蛋白作為酶解助劑促進(jìn)木質(zhì)纖維素酶解糖化。對于輻照技術(shù)，研究發(fā)現(xiàn)其在改變物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)方面具有顯著效果，且該技術(shù)成本低、效果好、易操作；另一方面，毛發(fā)蛋白，來源于動物及飛禽廢棄毛發(fā)，具有天然蛋白質(zhì)的各種功能特性若將其用作酶解助劑，強(qiáng)化木質(zhì)纖維素的酶解糖化作用，不僅實現(xiàn)了廢棄資源的有效利用，還可降低木質(zhì)纖維素酶解糖化成本，這對解決能源危機(jī)將具有重要意義。

下面通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。

實施例1

1)毛發(fā)選取羊毛，用去離子水清洗羊毛除去表面浮雜，烘干，然后將固液比1:1(mg/mL)的羊毛浸泡在30％(v/v)的醋酸溶液中，在85℃處理30min。用氨水中和多余的醋酸直至pH值為6，過濾，濾液于40℃干燥2d得蛋白粉，將制得的毛發(fā)蛋白粉密封于聚乙烯袋中，4℃貯藏，備用。

2)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)選擇玉米秸稈，首先取一定量的玉米秸稈，挑出異物，將選好的秸稈粉碎過篩(40目)，將過篩后的秸稈粉浸泡于去離子水中，固液比0.5:1(mg/mL)，然后用輻照劑量1kGy的伽馬射線輻照10min。

3)取(2)預(yù)處理后的樣品0.5g置于50mL燒瓶中，向其中加入2mL 0.075mol/L(pH 4.8)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液充分混合,然后再分別向燒瓶中加入5FPU/g的纖維素酶和0.5mg/mL的毛發(fā)蛋白粉，充分混合。酶解反應(yīng)在恒溫震蕩培養(yǎng)箱(160r/min)中進(jìn)行，溫度30℃，反應(yīng)時間24h。在一定的反應(yīng)時間間隔后，取出樣品進(jìn)行還原糖與酶活性分析。

效果分析：

上述實施例中在輻照作用下，玉米秸稈的結(jié)構(gòu)得到了顯著改善，見圖1。

由圖1可知，預(yù)處理后，玉米秸稈的纖維素結(jié)構(gòu)向利于酶解糖化作用的方向發(fā)生明顯改變。

同時，在毛發(fā)蛋白的作用下，纖維素酶活性由8697U提高到了13005U，酶活性得到了顯著提高。

對于酶解糖化效率，見圖2，由圖可知，在酶解24h后，還原糖得率即已達(dá)到489.09mg/g，目前還未見到有達(dá)這樣效果的研究。

實施例2

1)毛發(fā)選取羊毛，用去離子水清洗羊毛除去表面浮雜，烘干，然后將固液比1:2(mg/mL)的羊毛浸泡在35％(v/v)的醋酸溶液中，在88℃處理35min。用氨水中和多余的醋酸直至pH值為6.3，過濾，濾液于45℃干燥2d得蛋白粉，將制得的毛發(fā)蛋白粉密封于聚乙烯袋中，4℃貯藏，備用。

2)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)選擇玉米秸稈，首先取一定量的玉米秸稈，挑出異物，將選好的秸稈粉碎過篩(50目)，將過篩后的秸稈粉浸泡于去離子水中，固液比1:1(mg/mL)，然后用輻照劑量3kGy的伽馬射線輻照20min。

3)取(2)預(yù)處理后的樣品0.5g置于50mL燒瓶中，向其中加入2.5mL 0.075mol/L(pH 4.8)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液充分混合,然后再分別向燒瓶中加入7.5FPU/g的纖維素酶和1mg/mL的毛發(fā)蛋白粉，充分混合。酶解反應(yīng)在恒溫震蕩培養(yǎng)箱(160r/min)中進(jìn)行，溫度35℃，反應(yīng)時間24h。在一定的反應(yīng)時間間隔后，取出樣品進(jìn)行還原糖與酶活性分析。

效果分析：

上述實施例中在輻照作用下，玉米秸稈的結(jié)構(gòu)得到了顯著改善，見圖3。

由圖3可知，預(yù)處理后，玉米秸稈的纖維素結(jié)構(gòu)向利于酶解糖化作用的方向發(fā)生明顯改變。

同時，在毛發(fā)蛋白的作用下，纖維素酶活性由8697U提高到了15443U，酶活性得到了顯著提高。

對于酶解糖化效率，見圖4，由圖可知，在酶解24h后，還原糖得率即已達(dá)到493.44mg/g。

實施例3

1)毛發(fā)選取羊毛，用去離子水清洗羊毛除去表面浮雜，烘干，然后將固液比1:3(mg/mL)的羊毛浸泡在40％(v/v)的醋酸溶液中，在90℃處理40min。用氨水中和多余的醋酸直至pH值為6.6，過濾，濾液于50℃干燥2d得蛋白粉，將制得的毛發(fā)蛋白粉密封于聚乙烯袋中，4℃貯藏，備用。

2)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)選擇玉米秸稈，首先取一定量的玉米秸稈，挑出異物，將選好的秸稈粉碎過篩(60目)，將過篩后的秸稈粉浸泡于去離子水中，固液比1.5:1(mg/mL)，然后用輻照劑量6kGy的伽馬射線輻照30min。

3)取(2)預(yù)處理后的樣品0.5g置于50mL燒瓶中，向其中加入3mL 0.075mol/L(pH 4.8)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液充分混合,然后再分別向燒瓶中加入10FPU/g的纖維素酶和1.5mg/mL的毛發(fā)蛋白粉，充分混合。酶解反應(yīng)在恒溫震蕩培養(yǎng)箱(160r/min)中進(jìn)行，溫度40℃，反應(yīng)時間24h。在一定的反應(yīng)時間間隔后，取出樣品進(jìn)行還原糖與酶活性分析。

效果分析：

上述實施例中在輻照作用下，玉米秸稈的結(jié)構(gòu)得到了顯著改善，見圖5。

由圖5可知，預(yù)處理后，玉米秸稈的纖維素結(jié)構(gòu)向利于酶解糖化作用的方向發(fā)生明顯改變。

同時，在毛發(fā)蛋白的作用下，纖維素酶活性由8697U提高到了15221U，酶活性得到了顯著提高。

對于酶解糖化效率，見圖6，由圖可知，在酶解24h后，還原糖得率即已達(dá)到488.67mg/g。

實施例4

毛發(fā)選取羊毛，用去離子水清洗羊毛除去表面浮雜，烘干，然后將固液比1:3.5(mg/mL)的羊毛浸泡在45％(v/v)的醋酸溶液中，在93℃處理45min。用氨水中和多余的醋酸直至pH值為6.8，過濾，濾液于55℃干燥2d得蛋白粉，將制得的毛發(fā)蛋白粉密封于聚乙烯袋中，4℃貯藏，備用。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)選擇玉米秸稈，首先取一定量的玉米秸稈，挑出異物，將選好的秸稈粉碎過篩(70目)，將過篩后的秸稈粉浸泡于去離子水中，固液比1.7:1(mg/mL)，然后用輻照劑量8kGy的伽馬射線輻照40min。取預(yù)處理后的樣品0.5g置于50mL燒瓶中，向其中加入4mL 0.075mol/L(pH 4.8)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液充分混合,然后再分別向燒瓶中加入12FPU/g的纖維素酶和1.8mg/mL的毛發(fā)蛋白粉，充分混合。酶解反應(yīng)在恒溫震蕩培養(yǎng)箱(160r/min)中進(jìn)行，溫度42℃，反應(yīng)時間24h。在一定的反應(yīng)時間間隔后，取出樣品進(jìn)行還原糖與酶活性分析。

實施例5

毛發(fā)選取羊毛，用去離子水清洗羊毛除去表面浮雜，烘干，然后將固液比1:4(mg/mL)的羊毛浸泡在50％(v/v)的醋酸溶液中，在95℃處理50min。用氨水中和多余的醋酸直至pH值為7，過濾，濾液于60℃干燥2d得蛋白粉，將制得的毛發(fā)蛋白粉密封于聚乙烯袋中，4℃貯藏，備用。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)選擇玉米秸稈，首先取一定量的玉米秸稈，挑出異物，將選好的秸稈粉碎過篩(80目)，將過篩后的秸稈粉浸泡于去離子水中，固液比2:1(mg/mL)，然后用輻照劑量10kGy的伽馬射線輻照50min。取預(yù)處理后的樣品0.5g置于50mL燒瓶中，向其中加入5mL 0.075mol/L(pH 4.8)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液充分混合,然后再分別向燒瓶中加入15FPU/g的纖維素酶和2mg/mL的毛發(fā)蛋白粉，充分混合。酶解反應(yīng)在恒溫震蕩培養(yǎng)箱(160r/min)中進(jìn)行，溫度45℃，反應(yīng)時間24h。在一定的反應(yīng)時間間隔后，取出樣品進(jìn)行還原糖與酶活性分析。

上述方法有效改善了木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)，使酶解作用更容易進(jìn)行，簡化了預(yù)處理工序；增強(qiáng)了酶活性、降低了酶載量、提高了生物質(zhì)還原糖得率、同時又節(jié)省了成本，實現(xiàn)了廢棄物的資源化利用；再者，毛發(fā)蛋白的加入顯著地縮短了酶解時間，降低了還原糖因過度水解而造成的損失。

以上述及內(nèi)容僅為本發(fā)明構(gòu)思下的基本說明，而依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案所作的任何等效變換，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。