本發(fā)明涉及天然產(chǎn)物有效成分提取技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種小分子量鐵皮石斛多糖的制備方法。

背景技術(shù)：

鐵皮石斛（Dendrobium candidum Wall.ex Lindl）為蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生附生型草本植物，富含石斛多糖、石斛堿、氨基酸、菲類化合物及多種微量元素，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材。鐵皮石斛中多用于保健品行業(yè)，最主要的活性成分為石斛多糖，口服具有增強機體免疫力、抗腫瘤、抗氧化及延緩衰老等功效。目前化妝品產(chǎn)業(yè)也開始應(yīng)用鐵皮石斛多糖作為化妝品原料，但大多是發(fā)揮鐵皮石斛多糖具備大分子量（>1000kDa）的持久保濕功效，而對于小分子量石斛多糖（平均分子量小于300kDa）在增強皮膚免疫力方面的功效研究則基本未見文獻(xiàn)報道。

皮膚作為生態(tài)系統(tǒng)，是微生物菌群賴以生存的棲身之地，每平方厘米約有十億細(xì)菌在皮膚表面互利共生，形成微生態(tài)的防護(hù)盾。在人體皮膚的表面，存在著益生菌、有害菌，益生菌主要有雙歧桿菌，嗜酸乳桿菌等乳酸菌屬，有害菌則包括鏈球菌和金黃色葡球菌等。在皮膚衛(wèi)生情況良好、正常菌群平衡，益生菌占種群優(yōu)勢，皮膚上的代謝產(chǎn)物（皮脂、汗液）大多被有益菌群利用，促使pH下降和皮膚屏障形成，能夠抑制有害菌，皮膚狀態(tài)正常；但當(dāng)皮膚菌群紊亂，有害菌處于優(yōu)勢地位時，皮膚pH上升，皮膚屏障功能消失，會導(dǎo)致有害微生物侵蝕皮膚，發(fā)生炎癥。

朗格漢斯細(xì)胞(Langerhans cell，LC)是免疫反應(yīng)中重要的抗原呈遞細(xì)胞和單核吞噬細(xì)胞，能捕獲和處理侵入皮膚的抗原，形成抗原肽-MHC分子復(fù)合物，并傳遞給T細(xì)胞，可使特異性T細(xì)胞增殖和激活，引發(fā)免疫應(yīng)答。

因此，只要能證明本發(fā)明制備的小分子量石斛多糖能促進(jìn)皮膚表面益生菌的生長，及提高皮膚中朗格漢斯細(xì)胞的密度，就能夠表征其在提高皮膚免疫力方面的作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題，是提供一種平均分子量小于300kDa的小分子量鐵皮石斛多糖的制備方法，該方法制備的小分子量鐵皮石斛多糖可以促進(jìn)皮膚益生菌增殖，提高皮膚免疫力。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種小分子量鐵皮石斛多糖的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

A、菌株活化與擴培：無菌條件下，取適量液體培養(yǎng)基配制菌種濃度為1×10⁵-1×10⁶CFU/mL的菌懸液，所述菌種為燕麥鐮刀菌，菌種保藏號CICC 14038 ，然后取0.2-0.5mL菌懸液在PDA固體培養(yǎng)基表面劃線，20-30℃溫度下培養(yǎng)24-48h；挑取分散較好的單菌落接種至含有液體培養(yǎng)基成分的發(fā)酵搖瓶中進(jìn)行擴培，培養(yǎng)溫度20-30℃，搖瓶轉(zhuǎn)速200r/min，供氧培養(yǎng)24-72h，氧濃度0.010-0.030mol/L，得燕麥鐮刀菌發(fā)酵種子液，該發(fā)酵種子液中的燕麥鐮刀菌濃度達(dá)1×10⁴-1×10⁵ CFU/mL；所述液體培養(yǎng)基為含15.0-30.0g/L蔗糖、5.0-10.0g/L酵母粉的MS液體培養(yǎng)基；

B、鐵皮石斛破壁處理：50-52℃條件下，按質(zhì)量比1:20將鐵皮石斛粉末與蒸餾水預(yù)先混合后倒入不銹鋼容器中，以刮邊攪拌15rpm的速度，攪拌6-8h，然后利用高壓微射流均質(zhì)機反復(fù)高壓均質(zhì)5-10次，均質(zhì)壓力設(shè)90-130MPa，均質(zhì)溫度50-52℃，得鐵皮石斛破壁勻漿；

C、 發(fā)酵培養(yǎng)：在發(fā)酵罐中注入適量液體培養(yǎng)基，稱取步驟B所得鐵皮石斛破壁勻漿投入發(fā)酵罐中，量取鐵皮石斛破壁勻漿體積5.0-10.0%的燕麥鐮刀菌種子液加入發(fā)酵罐中，然后加入KH₂PO₄和Na₂HPO₄緩沖溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵罐中的料液pH至5.5-7.0，在25-35℃溫度下供氧發(fā)酵3-5d，氧濃度控制在0.020-0.040mol/L，發(fā)酵完成得發(fā)酵液；

D、多糖純化：發(fā)酵完成后降至室溫，向發(fā)酵罐中加入發(fā)酵液質(zhì)量0.5-1.0%的硅藻土助濾劑及發(fā)酵液質(zhì)量5.0-8.0%的脫色活性炭，靜置吸附1h，再以板框壓濾機過濾去渣，得濾液，然后將濾液與Sevage試劑按照體積比4.0-6.0:1.0進(jìn)行混合，充分振蕩30min，3000r/min轉(zhuǎn)速離心10min，取上清液；再將上清液與質(zhì)量濃度為95%的乙醇按質(zhì)量比1.0:1.0-3.0進(jìn)行混合，靜置12-36h，真空抽濾得沉淀，用質(zhì)量濃度為80%的乙醇洗滌3次，60℃下真空干燥24h，得小分子量鐵皮石斛多糖。

本發(fā)明制備的小分子量鐵皮石斛多糖含量的測定：參照苯酚-硫酸法；小分子量鐵皮石斛多糖的分子量測定：利用Sephadex G-200凝膠排阻層析法；小分子量鐵皮石斛多糖結(jié)構(gòu)表征需利用高效液相色譜儀對酸解后多糖進(jìn)行測定。結(jié)果表明：本發(fā)明制備的小分子量鐵皮石斛多糖得率高于32.50%，平均分子量小于300KDa，其主鏈均由D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖及D-甘露糖組成。

本發(fā)明所用燕麥鐮刀菌（Fusarium avenaceum）購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種編號：CICC 14038；所用PDA培養(yǎng)基購于杭州百思生物技術(shù)有限公司；所用蔗糖（CAS 57-50-1）購于阿拉丁試劑（上海）有限公司，純度≥99.5%；所用酵母粉（CAS 119-44-8）購于北京鴻潤寶順科技有限公司，純度≥99.0%；所用MS液體培養(yǎng)基為SIGMA公司生產(chǎn)，牌號M5519；所用鐵皮石斛粉末為收購自浙江溫州樂清市的2年生鐵皮石斛鮮枝，自行清洗、晾干、粉碎至50目-100目；所用高壓微射流均質(zhì)機購于上海鯉躍精密機械貿(mào)易有限公司，型號M-110EH；所用發(fā)酵罐購于南京潤澤生物工程設(shè)備有限公司，型號RZY-XGX；所用硅藻土購于嵊州市華力硅藻土制品有限公司，牌號為CD06，SiO₂(%)≥85%；所用脫色活性炭購于湖州森盛活性炭有限公司，牌號為ZL-786，亞甲基蘭吸附力12mL/0.1g；所用板框壓濾機購于昆山市昆工環(huán)保機械有限公司，型號為XAMGZ/30U；所用氣浴恒溫振蕩器購于江蘇杰瑞爾電器有限公司，型號SHZ-82；所用離心機購于張家港市宇佼機械有限公司，型號為PSF-1000；所用真空抽濾機購于上?？粕齼x器有限公司，型號為ZF-30L；真空干燥機購于常州日翔干燥設(shè)備有限公司，型號SZG-350。

本發(fā)明中制備的小分子量鐵皮石斛多糖對青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌及嗜酸乳桿菌的生長增殖有促進(jìn)作用，以實施例1中制備的產(chǎn)品為例，實驗如下：

將活化好的4種菌株分別以1.0%的接種量（濃度為10⁶ CFU/mL）接種于分別添加小分子量鐵皮石斛多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的MRS培養(yǎng)基中，每組3個平行實驗，38℃條件下培養(yǎng)24h，利用紫外可見分光光度計測定波長600nm處各培養(yǎng)液的吸光度值（OD600_nm）。所用青春雙歧桿菌 (Bifidobacterium adolesentis) 菌種編號CICC 6070，嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium infantis）菌種編號CICC 6069，兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum）菌種編號CICC 6071，嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）菌種編號CICC 6096均購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；所用MRS培養(yǎng)基購于青島海博生物技術(shù)有限公司；所用紫外可見分光光度計購于尤尼柯（上海）儀器有限公司，型號UV-2100PC。

雙歧桿菌與嗜酸乳桿菌在不同濃度小分子量鐵皮石斛多糖培養(yǎng)液中OD_600nm值列于表1，不同添加量小分子量鐵皮石斛多糖對雙歧桿菌及嗜酸乳桿菌生長的影響見圖1。

表1 雙歧桿菌與嗜酸乳桿菌在不同濃度小分子量鐵皮石斛多糖培養(yǎng)液中OD_600nm值

由表1、圖1可知，隨著小分子量鐵皮石斛多糖添加量的增加，典型皮膚益生菌青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌及嗜酸乳桿菌的生長均表現(xiàn)為增長的趨勢，在添加量為2.0%（質(zhì)量百分比）時OD_600nm值達(dá)到最大，當(dāng)小分子量鐵皮石斛多糖添加量達(dá)到2.5%（質(zhì)量百分比）時，促生長作用有所減弱，這可能是由于多糖濃度較高，引起培養(yǎng)液的滲透壓、pH值發(fā)生改變及代謝產(chǎn)物的積累限制了益生菌的增殖導(dǎo)致的。實驗結(jié)果可以表明，在小于2%（質(zhì)量百分比）的濃度時，小分子量鐵皮石斛多糖對益生菌的生長增殖起到很好的促進(jìn)作用，是一種有效的益生元。

本發(fā)明還通過小分子量鐵皮石斛多糖對最接近于人類SLE的動物模型—自發(fā)性SLE模型雌性小鼠NZBWF1/J表皮朗格漢斯細(xì)胞密度的影響來表征其在提高皮膚免疫力方面的作用，以實施例2中制備的產(chǎn)品為例，實驗如下：

將12只2月齡NZBWF1/J雌性小鼠分為地塞米松（Dexamethasone）組6只，地塞米松1.0mg/kg每日腹腔內(nèi)注射；小分子量鐵皮石斛多糖組6只，小分子量鐵皮石斛多糖50mg/kg每日腹腔內(nèi)注射，從小鼠2月齡開始連續(xù)用藥6個月至小鼠8月齡；SPF級C57BL/6純系雌性小鼠6只，8月齡。

小鼠乙醚全麻下剪取同一部位小鼠耳部，利用解剖顯微鏡將耳兩側(cè)皮膚分開，刮除兩側(cè)軟骨，放入pH7.2的生物EDTA分離液中，38℃恒溫下浸泡2h，顯微鏡下分離真表皮，表皮固定于4℃丙酮中20min，用PBS磷酸緩沖液沖洗3次，每次3min。分別加入濃度為1:50的抗小鼠Ia抗原OX3、1:200的抗小鼠Ia抗原OX4及小鼠表皮于eppendorf 微型管中，4℃過夜，PBS沖洗，加入生物素化的羊抗鼠IgG血清，38℃孵育2h，PBS沖洗，加ABC（卵白素/生物素/酶）復(fù)合物，孵育1h后PBS沖洗。解剖顯微鏡下，將表皮平鋪于玻片，加底物3-氨基-9-乙基卡巴唑（AEC）室溫顯色干燥后，甘油明膠封片。

在顯微鏡下觀察，出現(xiàn)橘紅色星形細(xì)胞即為陽性。表皮朗格漢斯細(xì)胞密度（LC/mm²）=每視野平均LC數(shù)/表皮面積，表皮面積通過測微尺標(biāo)定的目鏡方格測定。各實驗組小鼠表皮LC密度數(shù)據(jù)列于表2。所用自發(fā)性SLE模型雌性小鼠NZBWF1/J購于南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院；所用SPF級C57BL/6純系小鼠，雌性，8月齡，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心；解剖顯微鏡購于深圳市博視達(dá)光學(xué)儀器有限公司，型號BD-60T。

表2 各實驗組小鼠表皮LC密度均值表（LC/mm²）

由表2可知，與地塞米松組SLE型小鼠NZBWF1/J相比，小分子量鐵皮石斛多糖組SLE型小鼠NZBWF1/J表皮LC密度明顯增高，可能是由于小分子量鐵皮石斛多糖促進(jìn)GM-CSF的生成，同時刺激未成熟的粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分化成熟，提高機體的免疫功能，地塞米松作為免疫抑制劑廣泛應(yīng)用于人類及動物自身免疫性疾病的治療與研究；與C57BL/6純系小鼠相比，小分子量鐵皮石斛多糖組SLE型小鼠NZBWF1/J表皮LC密度也有顯著增長。

實驗證明，小分子量鐵皮石斛多糖可促進(jìn)皮膚朗格漢斯細(xì)胞密度的提高，從而可提升肌膚免疫力，提升肌膚體質(zhì)。

對照試驗：

按照以下步驟制得大分子量鐵皮石斛多糖：將鐵皮石斛粉末與蒸餾水按質(zhì)量比1:20投入反應(yīng)容器中，加熱至85℃，浸提3h，完成后抽濾，重復(fù)浸提3次，收集濾液，真空干燥濃縮至原有體積的1/5，然后按照濾液：Sevage試劑=6.0:1.0（體積比）混合，充分振蕩30min，3000r/min離心10min，取上清液，再按照上清液：95%乙醇=1.0:2.0 (質(zhì)量比) 加入乙醇，靜置24h，真空抽濾機過濾得沉淀，用80%乙醇洗滌3次，60℃真空干燥24h，得大分子量鐵皮石斛多糖產(chǎn)品。

所得大分子量鐵皮石斛多糖分子量介于730-1180kDa，其主鏈由D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖及D-甘露糖組成。

研究大分子量鐵皮石斛多糖對青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌及嗜酸乳桿菌的生長增殖作用，實驗方法同上，實驗結(jié)果見表3。

表3雙歧桿菌與嗜酸乳桿菌在不同濃度大分子量鐵皮石斛多糖培養(yǎng)液中OD_600nm值

由表3、圖2可知，隨著大分子量鐵皮石斛多糖添加量的增加，典型皮膚益生菌青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌及嗜酸乳桿菌的生長并沒有表現(xiàn)出明顯的增長趨勢，實驗結(jié)果表明，大分子量石斛多糖(730-1180kDa)對益生菌的生長增殖沒有起到明顯的促進(jìn)作用。

通過大分子量鐵皮石斛多糖對自發(fā)性SLE模型雌性小鼠NZBWF1/J表皮朗格漢斯細(xì)胞密度的影響來表征其在皮膚免疫力方面的作用，實驗方法同上，實驗結(jié)果見表4。

表4 各實驗組小鼠表皮LC密度均值表（LC/mm²）

由表4可知，與C57BL/6純系小鼠相比，大分子量鐵皮石斛多糖組SLE型小鼠NZBWF1/J表皮LC密度沒有明顯增長，實驗表明，大分子量石斛多糖(730-1180kDa)不能明顯促進(jìn)皮膚朗格漢斯細(xì)胞密度的提高，對提升肌膚免疫力幾乎不起作用。

綜上，經(jīng)對比試驗表明，大分子量石斛多糖在益生菌的生長增殖及皮膚朗格漢斯細(xì)胞密度的提高方面均沒有明顯的促進(jìn)作用，不能夠有效提升肌膚免疫力。

本發(fā)明首先利用高壓微射流均質(zhì)法對鐵皮石斛粉末進(jìn)行破壁處理，再利用選自鐵皮石斛內(nèi)生真菌的燕麥鐮刀菌來發(fā)酵制備小分子量鐵皮石斛多糖，其平均分子量小于300KDa。通過對小分子量鐵皮石斛多糖在益生菌的生長及小鼠朗格漢斯細(xì)胞（(Langerhans cell，LC)）的密度方面的影響進(jìn)行研究，結(jié)果表明小分子量鐵皮石斛多糖可有效促進(jìn)皮膚益生菌的增殖，并可提高皮膚表面朗格漢斯細(xì)胞密度，從而提升肌膚免疫力及防御力，維持皮膚健康狀態(tài)。

本發(fā)明提供的小分子量鐵皮石斛多糖制備方法，主要利用采用燕麥鐮刀菌來發(fā)酵，制備小分子鐵皮石斛多糖，平均得率高于32.50%。

綜上所述，本發(fā)明制備的小分子量鐵皮石斛多糖平均分子量小于300kDa，可以有效促進(jìn)皮膚益生菌的增殖，并可提高皮膚表面朗格漢斯細(xì)胞密度，從而提升肌膚免疫力及防御力，維持皮膚健康狀態(tài)。

附圖說明

圖1 不同添加量小分子量鐵皮石斛多糖對雙歧桿菌及嗜酸乳桿菌生長的影響；

圖2 不同添加量大分子量鐵皮石斛多糖對雙歧桿菌及嗜酸乳桿菌生長的影響。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅限于這些實施例。

實施例1：

A、菌株活化與擴培：無菌條件下，用無菌滴管吸取適量液體培養(yǎng)基滴入裝有鐵皮石斛內(nèi)生真菌燕麥鐮刀菌凍干粉的菌種管內(nèi)配制成菌種濃度為1×10⁶ CFU/mL的菌懸液，然后取0.2mL菌懸液在PDA固體培養(yǎng)基表面劃線，25℃條件下培養(yǎng)48h，挑取分散較好的單菌落接種至含有液體培養(yǎng)基成分的發(fā)酵搖瓶中進(jìn)行擴培，25℃，200r/min條件下供氧培養(yǎng)48h，氧濃度0.030mol/L，制得發(fā)酵種子液，其中燕麥鐮刀菌濃度為1×10⁵ CFU/mL，所用液體培養(yǎng)基為含蔗糖30.0g/L，酵母粉8.0g/L的MS液體培養(yǎng)基；

B、鐵皮石斛破壁處理：50℃條件下，將3kg鐵皮石斛粉末與60L蒸餾水預(yù)先混合后倒入不銹鋼容器中，以刮邊攪拌15rpm的速度，攪拌6h，然后利用高壓微射流均質(zhì)機，壓力設(shè)為90MPa，溫度為50℃，反復(fù)高壓均質(zhì)8次，獲得鐵皮石斛破壁勻漿；

C、 發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟B中所得鐵皮石斛破壁勻漿投入發(fā)酵罐中，按勻漿體積7.0%的接種量接種入燕麥鐮刀菌種子液，發(fā)酵罐中液體培養(yǎng)基成分同步驟A，并加入KH₂PO₄和Na₂HPO₄緩沖溶液調(diào)節(jié)料液pH=7.0，在溫度35℃下供氧發(fā)酵3d，氧濃度0.040mol/L；

D、多糖純化：發(fā)酵完成后降至室溫，向發(fā)酵罐中加入發(fā)酵液質(zhì)量0.5%的硅藻土助濾劑及發(fā)酵液質(zhì)量7.0%的脫色活性炭，靜置吸附1h，再以板框壓濾機過濾去渣，得濾液；然后按照濾液：Sevage試劑=4.0:1.0（體積比）混合，充分振蕩30min，3000r/min離心10min，取上清液，再按照上清液：95%乙醇=1.0: 2.0 (質(zhì)量比) 加入乙醇，靜置24h，真空抽濾機過濾得沉淀，用80%乙醇洗滌3次，60℃真空干燥24h，得小分子量鐵皮石斛多糖產(chǎn)物1005.6g。

本實施例制備的小分子量鐵皮石斛多糖得率為33.52%，平均分子量221.60kDa，其主鏈由D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖及D-甘露糖組成，摩爾比為3.112 : 2.013 : 1.561: 1.034 : 2.487。

實施例2：

A、菌株活化與擴培：無菌條件下，用無菌滴管吸取適量液體培養(yǎng)基滴入裝有鐵皮石斛內(nèi)生真菌燕麥鐮刀菌凍干粉的菌種管內(nèi)配制成菌種濃度為8.5×10⁵CFU/mL的菌懸液，然后取0.4mL菌懸液在PDA固體培養(yǎng)基表面劃線，20℃條件下培養(yǎng)36h，挑取分散較好的單菌落接種至含有液體培養(yǎng)基成分的發(fā)酵搖瓶中進(jìn)行擴培，20℃，200r/min條件下供氧培養(yǎng)72h，氧濃度0.010mol/L，制得發(fā)酵種子液，其中燕麥鐮刀菌濃度為6.5×10⁴CFU/mL，所用液體培養(yǎng)基為含蔗糖18.0g/L，酵母粉10.0g/L的MS液體培養(yǎng)基；

B、鐵皮石斛破壁處理： 52℃條件下，將3kg鐵皮石斛粉末與60L蒸餾水預(yù)先混合后倒入不銹鋼容器中，以刮邊攪拌15rpm的速度，攪拌8h，然后利用高壓微射流均質(zhì)機，壓力設(shè)為130MPa，溫度為52℃，反復(fù)高壓均質(zhì)10次，獲得鐵皮石斛破壁勻漿；

C、 發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟B中所得鐵皮石斛破壁勻漿投入發(fā)酵罐中，按勻漿體積10.0%的接種量接種入燕麥鐮刀菌種子液，發(fā)酵罐中液體培養(yǎng)基成分同步驟A，并加入KH₂PO₄和Na₂HPO₄緩沖溶液調(diào)節(jié)料液pH=5.5，在溫度25℃下供氧發(fā)酵5d，氧濃度0.030mol/L；

D、多糖純化：發(fā)酵完成后降至室溫，向發(fā)酵罐中加入發(fā)酵液質(zhì)量0.8%的硅藻土助濾劑及發(fā)酵液質(zhì)量8.0%脫色活性炭，靜置吸附1h，再以板框壓濾機過濾去渣，得濾液；然后按照濾液：Sevage試劑=5.0:1.0（體積比）混合，充分振蕩30min，3000r/min離心10min，取上清液，再按照上清液：95%乙醇=1.0: 3.0 (質(zhì)量比) 加入乙醇，靜置36h，真空抽濾機過濾得沉淀，用80%乙醇洗滌3次，60℃真空干燥24h，得小分子量鐵皮石斛多糖產(chǎn)物1035.6g。

本實施例制備的小分子量鐵皮石斛多糖得率為34.52%，平均分子量1.5kDa，其主鏈由D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖及D-甘露糖組成，摩爾比為2.452 : 1.025 : 2.231: 3.154 : 1.562。

實施例3：

A、菌株活化與擴培：無菌條件下，用無菌滴管吸取適量液體培養(yǎng)基滴入裝有鐵皮石斛內(nèi)生真菌燕麥鐮刀菌凍干粉的菌種管內(nèi)配制成菌種濃度為1×10⁵CFU/mL的菌懸液，然后取0.5mL菌懸液在PDA固體培養(yǎng)基表面劃線，30℃條件下培養(yǎng)24h，挑取分散較好的單菌落接種至含有液體培養(yǎng)基成分的發(fā)酵搖瓶中進(jìn)行擴培，30℃，200r/min條件下供氧培養(yǎng)24h，氧濃度0.020mol/L，制得發(fā)酵種子液，其中燕麥鐮刀菌濃度為1×10⁴CFU/mL，所用液體培養(yǎng)基為含蔗糖15.0g/L，酵母粉10.0g/L的MS液體培養(yǎng)基；

B、鐵皮石斛破壁處理：51℃條件下，將3kg鐵皮石斛粉末與60L蒸餾水預(yù)先混合后倒入不銹鋼容器中，以刮邊攪拌15rpm的速度，攪拌6.5h，然后利用高壓微射流均質(zhì)機，壓力設(shè)為100MPa，溫度為51℃，反復(fù)高壓均質(zhì)5次，獲得鐵皮石斛破壁勻漿；

C、 發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟B中所得鐵皮石斛破壁勻漿投入發(fā)酵罐中，按勻漿體積5.0%的接種量接種入燕麥鐮刀菌種子液，發(fā)酵罐中液體培養(yǎng)基成分同步驟A，并加入KH₂PO₄和Na₂HPO₄緩沖溶液調(diào)節(jié)料液pH=6.0，在溫度30℃下供氧發(fā)酵4d，氧濃度0.020mol/L；

D、多糖純化：發(fā)酵完成后降至室溫，向發(fā)酵罐中加入發(fā)酵液質(zhì)量0.7%的硅藻土助濾劑及發(fā)酵液質(zhì)量5.0%脫色活性炭，靜置吸附1h，再以板框壓濾機過濾去渣，得濾液；然后按照濾液：Sevage試劑=6.0:1.0（體積比）混合，充分振蕩30min，3000r/min離心10min，取上清液，再按照上清液：95%乙醇=1.0:1.0 (質(zhì)量比) 加入乙醇，靜置24h，真空抽濾機過濾得沉淀，用80%乙醇洗滌3次，60℃真空干燥24h，得小分子量鐵皮石斛多糖產(chǎn)物975.0g。

本實施例制備的小分子量鐵皮石斛多糖得率為32.50%，平均分子量110.50kDa，其主鏈由D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖及D-甘露糖組成，摩爾比為1.547: 1.751: 2.323: 2.872: 1.310。

實施例4：

A、菌株活化與擴培：無菌條件下，用無菌滴管吸取適量液體培養(yǎng)基滴入裝有鐵皮石斛內(nèi)生真菌燕麥鐮刀菌凍干粉的菌種管內(nèi)配制成菌種濃度為4.2×10⁵CFU/mL的菌懸液，然后取0.3mL菌懸液在PDA固體培養(yǎng)基表面劃線，28℃條件下培養(yǎng)24h，挑取分散較好的單菌落接種至含有液體培養(yǎng)基成分的發(fā)酵搖瓶中進(jìn)行擴培，28℃，200r/min條件下供氧培養(yǎng)30h，氧濃度0.020mol/L，制得發(fā)酵種子液，其中燕麥鐮刀菌濃度為3×10⁴CFU/mL，所用液體培養(yǎng)基為含蔗糖18.0g/L，酵母粉5.0g/L的MS液體培養(yǎng)基；

B、鐵皮石斛破壁處理：50℃條件下，將3kg鐵皮石斛粉末與60L蒸餾水預(yù)先混合后倒入不銹鋼容器中，以刮邊攪拌15rpm的速度，攪拌6.5h，然后利用高壓微射流均質(zhì)機，壓力設(shè)為110MPa，溫度為50℃，反復(fù)高壓均質(zhì)7次，獲得鐵皮石斛破壁勻漿；

C、 發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟B中所得鐵皮石斛破壁勻漿投入發(fā)酵罐中，按勻漿體積8.5 %的接種量接種入燕麥鐮刀菌種子液，發(fā)酵罐中液體培養(yǎng)基成分同步驟A，并加入KH₂PO₄和Na₂HPO₄緩沖溶液調(diào)節(jié)料液pH=6.8，在溫度28℃下供氧發(fā)酵4d，氧濃度0.030mol/L；

D、多糖純化：發(fā)酵完成后降至室溫，向發(fā)酵罐中加入發(fā)酵液質(zhì)量0.6%的硅藻土助濾劑及發(fā)酵液質(zhì)量6.5%脫色活性炭，靜置吸附1h，再以板框壓濾機過濾去渣，得濾液；然后按照濾液：Sevage試劑=4.5:1.0（體積比）混合，充分振蕩30min，3000r/min離心10min，取上清液，再按照上清液：95%乙醇=1.0:2.0 (質(zhì)量比) 加入乙醇，靜置12h，真空抽濾機過濾得沉淀，用80%乙醇洗滌3次，60℃真空干燥24h，得小分子量鐵皮石斛多糖產(chǎn)物988.5g。

本實施例制備的小分子量鐵皮石斛多糖得率為32.95%，平均分子量300kDa，其主鏈由D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖及D-甘露糖組成，摩爾比為3.005 : 2.645 : 1.006: 2.336 : 1.496。

實施例5：

A、菌株活化與擴培：無菌條件下，用無菌滴管吸取適量液體培養(yǎng)基滴入裝有鐵皮石斛內(nèi)生真菌燕麥鐮刀菌凍干粉的菌種管內(nèi)配制成菌種濃度為7.8×10⁵CFU/mL的菌懸液，然后取0.25mL菌懸液在PDA固體培養(yǎng)基表面劃線，23℃條件下培養(yǎng)30h，挑取分散較好的單菌落接種至含有液體培養(yǎng)基成分的發(fā)酵搖瓶中進(jìn)行擴培，23℃，200r/min條件下供氧培養(yǎng)72h，氧濃度0.030mol/L，制得發(fā)酵種子液，其中燕麥鐮刀菌濃度為5.3×10⁴CFU/mL，所用液體培養(yǎng)基為含蔗糖28.0g/L，酵母粉6.0g/L的MS液體培養(yǎng)基；

B、鐵皮石斛破壁處理：52℃條件下，將3kg鐵皮石斛粉末與60L蒸餾水預(yù)先混合后倒入不銹鋼容器中，以刮邊攪拌15rpm的速度，攪拌6-8h，然后利用高壓微射流均質(zhì)機，壓力設(shè)為120MPa，溫度為52℃，反復(fù)高壓均質(zhì)8次，獲得鐵皮石斛破壁勻漿；

C、 發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟B中所得鐵皮石斛破壁勻漿投入發(fā)酵罐中，按勻漿體積9.0%的接種量接種入燕麥鐮刀菌種子液，發(fā)酵罐中液體培養(yǎng)基成分同步驟A，并加入KH₂PO₄和Na₂HPO₄緩沖溶液調(diào)節(jié)料液pH=6.0，在溫度28℃下供氧發(fā)酵4d，氧濃度0.035mol/L；

D、多糖純化：發(fā)酵完成后降至室溫，向發(fā)酵罐中加入發(fā)酵液質(zhì)量1.0%的硅藻土助濾劑及發(fā)酵液質(zhì)量7.5%脫色活性炭，靜置吸附1h，再以板框壓濾機過濾去渣，得濾液；然后按照濾液：Sevage試劑=5.5:1.0（體積比）混合，充分振蕩30min，3000r/min離心10min，取上清液，再按照上清液：95%乙醇=1.0:2.5 (質(zhì)量比) 加入乙醇，靜置30h，真空抽濾機過濾得沉淀，用80%乙醇洗滌3次，60℃真空干燥24h，得小分子量鐵皮石斛多糖產(chǎn)物1026.0g。

本實施例制備的小分子量鐵皮石斛多糖得率為34.20%，重均分子量98.74kDa，其主鏈由D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖及D-甘露糖組成，摩爾比為1.894 : 2.620 : 3.128: 1.772: 2.315。