本發(fā)明屬于醫(yī)藥化學領域，具體涉及一種紫皮石斛多糖及其制備方法，尤其涉及所述紫皮石斛多糖在免疫調節(jié)和降血糖活性方面的應用。

背景技術：

紫皮石斛為雙子葉植物藥蘭科植物齒瓣石斛dendrobiumdevonianumpaxt.的干燥莖，具有益胃生津，滋陰清熱等功效。紫皮石斛莖具節(jié)，稍肉質，葉革質，互生，因其莖在秋冬收獲季節(jié)除去葉鞘膜后，表面多為紫色，生長在陽光較強的地方者，紫色更加明顯，因此俗稱紫皮石斛或紫皮蘭。新鮮紫皮石斛的莖稈經修剪、烘干定型后加工成的螺旋團狀顆粒稱為紫皮楓斗。石斛的化學成分主要為多糖、生物堿、菲類、聯(lián)芐類、酚酸類和黃酮類，另外還含有少量的微量元素以及氨基酸，可用于治療白內障、糖尿病、關節(jié)炎、慢性咽炎、腫瘤等疾病。2015年版《中國藥典》收載有鐵皮石斛dendrobiumofficinale和石斛(金釵石斛dendrobiumnobile、鼓槌石斛dendrobiumchrysotoxum、流蘇石斛dendrobiumfimbriatum等)，其中鐵皮石斛功效冠蓋石斛之首，然其生長條件苛刻、自然繁殖能力低，生長緩慢，價格昂貴。紫皮石斛價格僅為鐵皮石斛1/5-1/4，可謂物美價廉。但目前對于紫皮石斛多糖的研究還較少。

國內外提取石斛多糖有水提醇沉方法、溶劑萃取法、酶解提取、超聲波提取等多種提取技術，例專利申請?zhí)枮?01510931074.1的專利公開了“一種提高紫皮石斛中多糖成分浸出率的方法”，將新鮮紫皮石斛洗凈，干燥，切段，粉碎，料液比1:4-8水提，溫度80-100℃，時間1-3h，提取3-4次，提取物濃縮、干燥得到目標產物。但其并未明確所得的紫皮石斛多糖的具體活性成分及結構特征，使得其應用進一步受到限制。再如專利申請?zhí)枮?01610611421.7的專利公開了“一種石斛多糖的提取方法”，將原料粉碎后加水經過高壓浸泡，過濾濃縮提取液，將濃縮液加乙醇沉淀，真空干燥得到石斛多糖。然而，其采用的原料為鐵皮石斛，其原材料成本高，并且該申請中同樣并未明確所得的石斛多糖的具體活性成分及結構特征，使得其應用進一步受到限制。又如專利申請?zhí)枮?01610490394.2的專利公開了“鐵皮石斛多糖在制備防治代謝綜合征藥物及保健品中的應用”，通過水提醇沉法提取，將鐵皮石斛加水進行煎煮，合并多次煎煮所得的鐵皮石斛藥液，減壓濃縮獲得浸膏；再用乙醇沉淀并真空干燥即得鐵皮石斛多糖。然而，其采用的原料為鐵皮石斛，其原材料成本高，并且該申請中同樣并未明確所得的石斛多糖的具體活性成分及結構特征，使得其應用進一步受到限制。雖然上述公開的文獻中，均制備得到石斛多糖，但多數(shù)是針對原料成本較高的鐵皮石斛進行的，并且均未進行結構特征分析與活性之間關系的研究，因而存在無法進一步研究或應用于市場的問題，嚴重影響了石斛多糖作為潛在的活性劑在藥品、食品或保健品領域中的應用。鑒于此，研究一種原材料成本低、并且結構特征與活性明確的石斛多糖的制備方法與應用，是本發(fā)明亟待解決的問題。

技術實現(xiàn)要素：

因此，本發(fā)明所要解決的技術問題在于，為了充分利用自然界中的資源，特別是原料價格低、生產成本低的資源，本發(fā)明對紫皮石斛進行研究，并進一步優(yōu)化對其中含有的紫皮石斛多糖的提取方法，進一步明確提取的多糖的結構特征，并且進行活性的研究與探討。進而，本發(fā)明提供了一種紫皮石斛多糖及其制備方法，以及其在免疫調節(jié)和降血糖活性的方面的應用。

本發(fā)明是通過如下方法實現(xiàn)的：以粉碎的紫皮石斛莖為原料，經過脫脂后，熱水微波提取，3-4倍體積乙醇沉淀多糖，加水溶解沉淀物，冷凍干燥得到粗多糖，通過濾膜過濾分離，冷凍干燥，得到高純度的紫皮石斛多糖。

本發(fā)明反復多次制備出的紫皮石斛多糖經過氣相色譜法分析可知，其單糖組成為甘露糖、乙?；事短呛推咸烟?，甘露糖和葡萄糖摩爾質量比為20～29:1。

本發(fā)明制備出的紫皮石斛多糖經甲基化、氣相色譜-質譜法及核磁共振分析可知，其糖苷鍵為β-1,4-manp和β-1,4-glcp，比例為20～27:1。

本發(fā)明制備出的紫皮石斛多糖采用高效凝膠排阻色譜結合動態(tài)光散射分析可知，其分子量為1×10⁵-10×10⁵da，主要分子量范圍3×10⁵-5×10⁵da。

因此，本發(fā)明提供一種紫皮石斛多糖，碘-碘化鉀試劑顯色陰性，分子量為1×10⁵-10×10⁵da，主要分子量范圍3×10⁵-5×10⁵da；組成單糖主要為甘露糖、乙酰化甘露糖acetyl-man及少量葡萄糖glc，且甘露糖和葡萄糖組成比大于20:1，糖苷鍵主要為β-1,4-manp和β-1,4-glcp。

本發(fā)明還提供了一種紫皮石斛多糖的制備方法，包括以下步驟：

1)將適當粉碎的新鮮或干燥紫皮石斛以75-85％乙醇回流脫脂；

2)將步驟1)脫脂后殘渣加入水提??；

3)水提液加入3-4倍量乙醇醇沉；

4)沉淀物為紫皮石斛粗多糖；

5)紫皮石斛粗多糖配成水提液，采用截留分子量大于3000da的超濾膜作超濾處理；棄濾液后反復超濾，直至濾液中基本無糖檢出；

6)截留液冷凍干燥，得紫皮石斛多糖。

本發(fā)明還提供了一種紫皮石斛多糖的制備方法，包括以下步驟：

1)將適當粉碎的新鮮或干燥紫皮石斛加入水提?。?/p>

2)水提液采用截留分子量大于3000da的超濾膜作超濾處理；棄濾液后反復超濾，直至濾液中基本無糖檢出；

3)截留液冷凍干燥，得紫皮石斛多糖。

優(yōu)選的，所述紫皮石斛多糖碘-碘化鉀試劑顯色陰性，分子量為1×10⁵-10×10⁵da，主要分子量范圍3×10⁵-5×10⁵da；組成單糖主要為甘露糖、乙?；事短?acetyl-man)及少量葡萄糖(glc)，且甘露糖和葡萄糖組成比大于20:1，糖苷鍵主要為β-1,4-manp和β-1,4-glcp。

優(yōu)選的，所述步驟4)中冷凍干燥條件為：溫度-50～-70℃，絕對壓強約為4～7帕。

優(yōu)選的，所述步驟1)乙醇濃度80％。

優(yōu)選的，所述步驟2)殘渣與加入水的比例為1:25-1:35，優(yōu)選1:30。

優(yōu)選的，所述步驟3)乙醇濃度95％。

優(yōu)選的，所述步驟5)中采用截留分子量為10000da的超濾膜作超濾處理。

本發(fā)明還提供一種如上所述的紫皮石斛多糖在制備免疫調節(jié)藥物中的應用。

本發(fā)明還提供一種如上所述的紫皮石斛多糖在制備提高機體免疫功能的食品和保健品方面的應用。

本發(fā)明還提供一種如上所述的紫皮石斛多糖在制備降血糖藥物中的應用。

本發(fā)明還提供一種如上所述的紫皮石斛多糖在制備預防和治療糖尿病的食品和保健品方面的應用。

本申請人經過長期研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明制備出的紫皮石斛多糖具有促進鼠巨噬細胞raw264.7釋放no的作用，同時能增強細胞的吞噬作用，并具有劑量依賴性。本發(fā)明制備出的紫皮石斛多糖具有降低血糖作用，并具有劑量依賴性。

本發(fā)明的上述技術方案相比現(xiàn)有技術具有以下優(yōu)點：

本發(fā)明以紫皮石斛莖為原料，其原料來源豐富，成本低，但具有豐富的藥理價值。

通常采用水提醇沉得到的石斛多糖多含有大量淀粉，采用碘試驗顯色，本發(fā)明制備的紫皮石斛多糖經碘試驗測試后不顯色。

本發(fā)明制備的紫皮石斛多糖結構特征明確，應用氣相色譜-質譜和核磁共振檢測其單糖組成和糖苷鍵類型，高效凝膠排阻色譜-多角度激光聯(lián)用檢測其分子量及在溶液中的構象，并經藥理研究證明此紫皮石斛多糖具有免疫調節(jié)和降血糖活性，為進一步研究開發(fā)多糖類藥物或功能性食品提供了基礎。

附圖說明

圖1是紫皮石斛多糖的單糖組成gc-ms圖。

圖2是紫皮石斛多糖的糖苷鍵類型gc-ms圖。

圖3是紫皮石斛多糖nmr圖。

圖4是紫皮石斛多糖的分子參數(shù)及構象分析hpsec-malls-ri圖譜。

圖5是不同濃度紫皮石斛多糖的細胞活性(a)及對小鼠巨噬細胞no分泌量(b)的影響柱狀圖。

圖6是不同濃度紫皮石斛多糖對小鼠巨噬細胞吞噬能力影響柱狀圖(a)及流式細胞儀圖譜(b)。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明，但是本發(fā)明并不僅僅局限于這些實施例，這些實施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本領域的技術人員在權利要求的范圍內所做出的某些改變和調整也應該認為屬于本發(fā)明范圍。

若無特殊說明，所用實驗方法為常規(guī)實驗方法；所使用的試劑和材料等均可通過商業(yè)途徑獲得。

實施例1

紫皮石斛多糖的制備：

(1)紫皮石斛莖干燥、打粉，用80％乙醇回流脫脂，加入水使得料液比1:30，微波反應提取，微波功率800w，反應時間9min。

(2)水提液濃縮至一定體積，加入4倍體積95％乙醇沉淀，靜置30min，4000g離心10min，保留沉淀，加水復溶，冷凍干燥得到粗多糖，提取率為28.3％。其中，冷凍干燥條件為：溫度-50～-70℃，絕對壓強約為4～7帕。

(3)將上述粗多糖加去離子水配成濃度為5-10mg/ml的溶液，超濾(截留分子量:>3kda,millipore,billerica,ma,usa)，棄超濾液，反復多次補水、超濾，采用苯酚-硫酸法跟蹤檢測濾液中糖含量，直至濾液中基本無糖檢出，截留液冷凍干燥，得到純化后的紫皮石斛多糖(ddp)。采用苯酚-硫酸法測定ddp糖含量為93.6％，采用碘-碘化鉀無淀粉檢出，采用間羥基聯(lián)苯比色法無糖醛酸檢出。其中，冷凍干燥條件為：溫度-50～-70℃，絕對壓強約為4～7帕。

實施例2

紫皮石斛多糖的制備：

將適當粉碎的新鮮或干燥紫皮石斛加入水提取，水提液采用截留分子量10000da的超濾膜作超濾處理；棄濾液后反復多次補水、超濾，采用苯酚-硫酸法跟蹤檢測濾液中糖含量，直至濾液中基本無糖檢出，截留液冷凍干燥，得到純化后的紫皮石斛多糖(ddp)，采用碘-碘化鉀無淀粉檢出，采用間羥基聯(lián)苯比色法無糖醛酸檢出。

實施例3

紫皮石斛多糖的鑒定：

(1)紫皮石斛多糖的單糖組成分析

采用氣相色譜-質譜聯(lián)用測定紫皮石斛多糖的單糖組成，取5mg紫皮石斛多糖樣品加入1ml2mtfa，于微波下水解，微波條件為：功率500w，微波時間4min，待冷卻后，水解液于氮吹吹干，加入0.5ml吡啶(含20mg鹽酸羥胺)90℃反應30min，后再加入0.5ml乙酸酐加熱90℃30min，氮氣吹干，1ml甲醇溶解后gc-ms測定。

gc-ms分析條件為：色譜柱agilent19091s-433，hp-5ms毛細管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；進樣口溫度250℃；載氣為he氣，柱流量1.0ml/min。進樣方式：分流進樣，分流比25:1，進樣量1μl；柱溫：程序升溫：初始溫度165℃，保持7min,以5℃/min的速率程序升溫至185℃，保持5min，以4℃/min的速率程序升溫至200℃，以20℃/min升至280℃。

其結果見圖1，由圖1紫皮石斛多糖的單糖組成gc-ms圖中可知，該紫皮石斛多糖由甘露糖和葡萄糖兩種單糖組成，其摩爾比為甘露糖：葡萄糖＝20-29:1。

(2)紫皮石斛多糖的糖苷鍵類型分析

采用氣相色譜-質譜聯(lián)用和核磁共振測定紫皮石斛多糖的糖苷鍵類型，稱取3mg紫皮石斛多糖，加入1ml無水dmso，充分溶解。加入約20mgnaoh，置于常溫超聲溶解10min。再加入100μlch3i，利用微波輔助甲基化，微波功率為200w，及微波下反應4min，冷卻后利用透析管透析(分子截留量3500da)，再利用超濾離心管超濾濃縮(分子截留量3500da)樣品。加入tfa至終濃度2m，封管，微波輔助水解(500w,4min)，反應結束后，氮吹干燥。加入1ml2mnh4oh(1mnabh4)還原，置于常溫攪拌1h。加入50μlch3cooh終止反應，氮吹干燥，加入200μl甲醇，和5μlch3cooh干燥兩次，最后加入200μl甲醇干燥。利用0.5ml吡啶和0.5ml乙酸酐進行乙?；磻?0℃反應30min。反應后利用1ml水和1mlch2cl2萃取兩次，收集ch2cl2層，樣品氮吹干燥，加入1ml甲醇復溶。

gc-ms分析條件為：色譜柱agilent19091s-433，hp-5ms毛細管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；進樣口溫度250℃；載氣為he氣，柱流量1.0ml/min。進樣方式：分流進樣，分流比25:1，進樣量1μl；柱溫：程序升溫：初始溫度120℃，以5℃/min的速率程序升溫至200℃，以8℃/min的速率程序升溫至250℃，以20℃/min升至280℃。

其結果見圖2，由圖2紫皮石斛多糖的糖苷鍵類型gc-ms圖中的甲基化結果可知，紫皮石斛多糖中主要糖苷鍵為1,4-manp和1,4-glcp，其比例為20-27:1，以及含有少量的t-glcp。

稱取20mg紫皮石斛多糖，反復利用0.5mld2o充分溶解并凍干三次，最后利用0.5mld2o充分溶解，于¹hnmr和¹³cnmr分析。

其結果見圖3，由圖3紫皮石斛多糖的糖苷鍵類型nmr圖中可知，具體見圖3a/b，紫皮石斛多糖中主要糖苷鍵類型為β-d-manp，乙酰化比例約為15-25％。

(3)紫皮石斛多糖的分子參數(shù)及構象分析

采用高效凝膠排阻色譜-多角度激光光散射法測定紫皮石斛多糖的分子參數(shù)以及在溶液中的鏈構象，稱取約3mg紫皮石斛多糖，溶解于1.0ml0.9％(w/v)的氯化鈉水溶液中，hplc-malls-rid-dad檢測條件：流動相為0.9％(w/v)的氯化鈉水溶液；色譜柱柱溫35℃；流速0.5ml/min；色譜柱tskgelg5000pwxl串聯(lián)tskgelg3000pwxl；進樣量100μl，并聯(lián)用dad檢測樣品uv吸收。

其結果參見圖4，由圖4的紫皮石斛多糖的分子參數(shù)及構象分析hpsec-malls-ri圖譜可知，紫皮石斛重均分子量mw范圍為1.0～10.0×10⁵da，主要為3.0-4.0×10⁵da，無紫外吸收，說明該多糖組分相對均一(圖4a/b/c)。由構象分析公式<s²>z^1/2＝kmw^v計算，v值為0.38，可知該紫皮石斛多糖在0.9％nacl溶液中呈球形(圖4d)。

實施例4

紫皮石斛多糖的免疫活性測定

(1)細胞培養(yǎng)

raw264.7細胞購自美國標準菌庫(atcc)，采用培養(yǎng)基dmem，加10％胎牛血清，1％鏈/青霉素，37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(2)細胞活力檢測

收集對數(shù)期細胞，調整細胞懸液濃度，96孔細胞培養(yǎng)板每孔加入100μl，鋪板使待測細胞調密度至5000/孔。5％co2，37℃孵育培養(yǎng)過夜，加入濃度梯度的藥物，設3個復孔，同時設置空白對照組、lps(0.4μg/ml)陽性藥對照組。5％co2，37℃孵育24h。每孔加入20μlmtt溶液(至終濃度1mg/ml)，繼續(xù)避光培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，吸去孔內培養(yǎng)液。每孔加入100μl二甲基亞砜，避光低速振蕩5-10分鐘，使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀od490nm處測量各孔的吸光值。

其結果參見圖5，由圖5不同濃度紫皮石斛多糖的細胞活性(a)的影響柱狀圖可知，紫皮石斛多糖在100-400μg/ml濃度下對raw264.7細胞無毒性(圖5a)。

(3)no釋放測定

收集對數(shù)期細胞，調整細胞懸液濃度，96孔細胞培養(yǎng)板每孔加入100μl，鋪板使待測細胞調密度至5×10⁴/孔。5％co2，37℃孵育培養(yǎng)過夜，加入濃度梯度的藥物，設3個復孔，同時設置空白對照組、lps(0.4μg/ml)陽性藥對照組。5％co2，37℃孵育24小時。離心細胞板300g，5分鐘，收集細胞上清75μl，加入75μlgriess試劑室溫反應15分鐘。在酶聯(lián)免疫檢測儀od540nm處測量各孔的吸光值。

其結果參見圖5，由圖5不同濃度紫皮石斛多糖對小鼠巨噬細胞no分泌量(b)的影響柱狀圖可知，紫皮石斛多糖ddp在100-800μg/ml濃度下具有促進巨噬細胞釋放no的作用，并且具有濃度依賴性(圖5b)。

(4)細胞吞噬功能檢測

取對數(shù)生長期細胞(40×10⁴/孔)于12孔板中，37℃孵育培養(yǎng)過夜，加入濃度梯度的紫皮石斛多糖ddp和lps(0.4μg/ml)。5％co2，37℃孵育18h。棄去原培養(yǎng)基藥物，加入含fitc-dextran染液(終濃度0.1mg/ml)的培養(yǎng)基避光，繼續(xù)培養(yǎng)1h。棄去培養(yǎng)基，然后用冷的pbs(含2％fbs)清洗4次去除未進入細胞的fitc-dextran。流式細胞儀檢測fitc平均熒光強度。

其結果參見圖6，由圖6不同濃度紫皮石斛多糖對小鼠巨噬細胞吞噬能力影響柱狀圖(a)及流式細胞儀圖譜(b)可知，紫皮石斛多糖ddp在100-800μg/ml濃度下具有促進巨噬細胞吞噬能力的作用，并且具有濃度依賴性(圖6)。

實施例5

紫皮石斛多糖的降血糖活性測定：取腹腔注射四氧嘧啶80mg/kg造模成功的60只小鼠隨機分為糖尿病模型組、陽性對照組(消渴丸)、紫皮石斛多糖高、中、低劑量組，每組12只，編號。另隨機抽取12只沒有注射四氧嘧啶的小鼠作為空白對照組。陽性對照組(消渴丸1g/kg)、紫皮石斛多糖低(25mg/kg)、中(50mg/kg)、高劑量組(100mg/kg)按體質量灌胃給藥，糖尿病模型組和空白對照組灌胃給予生理鹽水0.1ml/10g。每天灌胃給藥1次，連續(xù)15d。用血糖儀測定第5、10、15天禁食3h、灌胃5h后的血糖值。

結果見表1，表明：紫皮石斛多糖具有降低糖尿病小鼠高血糖作用，在給藥15d后明顯低于給藥前水平(p＜0.01)；在給藥15d后，紫皮石斛多糖高、中、低劑量組、陽性對照組與糖尿病模型組比較差異極顯著(p＜0.01)。

表1紫皮石斛多糖對糖尿病小鼠血糖影響(x±s)

注：—.不給藥；

與糖尿病模型組比，*p＜0.01；**p＜0.01；

與給藥前比，▲p＜0.05；▲▲p＜0.01。

顯然，上述實施例中所示具體提取方法及參數(shù)僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍之中。