本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及識(shí)別癌胚抗原的嵌合抗原受體及其應(yīng)用，還涉及包含識(shí)別癌胚抗原(cea)scfv的嵌合抗原受體的慢病毒載體和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

單克隆抗體抗體的產(chǎn)生技術(shù)經(jīng)歷了三個(gè)階段：經(jīng)典免疫方法產(chǎn)生的異源多克隆抗體；細(xì)胞工程產(chǎn)生的鼠源單克隆抗體及基因工程產(chǎn)生的人源單克隆抗體。以小鼠來源單克隆抗體用于疾病治療，直接使用小鼠抗體進(jìn)行人體治療時(shí)，因?yàn)槭罂沟漠愘|(zhì)性會(huì)引起人抗鼠抗體反應(yīng)(humananti-mouseantibodyreaction，hama)，導(dǎo)致抗體半衰期短，在循環(huán)系統(tǒng)中被很快清除，失去療效。因此，治療用鼠源單抗需要進(jìn)行人源化修飾以提高抗體的人源化程度、減弱hama。

單鏈抗體(single-chainvariablefragment(scfv))是由抗體的可變區(qū)(vh和vl區(qū))通過15-20個(gè)氨基酸的短肽連接而成，scfv能較好地保留其對(duì)抗原的親和活性，并具有分子量小、穿透力強(qiáng)和抗原性弱等特點(diǎn)。

人源化抗體是指抗體的可變區(qū)部分(即vh和vl區(qū))或抗體全部由人類抗體基因所編碼。人源化抗體可以大大減少異源抗體對(duì)人類機(jī)體造成的免疫副反應(yīng)，人源化抗體的形式也從最初的嵌合抗體、改型抗體等逐步發(fā)展為人源化抗體。

將鼠源抗體改造為人源化抗體有以下幾種主要形式：鼠可變區(qū)(viarableregion，vrs)+人恒定區(qū)(constantregion，crs)、鼠互補(bǔ)決定區(qū)(complementaritydeterminingregion，cdrs)+人框架區(qū)(fragmentregions，frs)、鼠cdrs+人frs等，尤其以“鼠cdrs+人fr”模式最為常見，這種人源化抗體形式僅僅保留了cdrs中的鼠源殘基，而將其余部分替換為人抗殘基，能將鼠抗的異源反應(yīng)降到較低水平。但是直接將鼠抗cdrs移入人抗frs通常會(huì)導(dǎo)致抗體失去原有抗原結(jié)合活性，因此需要對(duì)影響抗原抗體結(jié)合的關(guān)鍵殘基進(jìn)行反復(fù)修改，而后通過大量抗原抗體結(jié)合特異性、親和力檢測，從而篩選得到具有活性的抗體序列。

過繼細(xì)胞治療(adoptivecelltherapy，act)是生物治療技術(shù)的一種，對(duì)自體免疫細(xì)胞(主要是t細(xì)胞)進(jìn)行體外擴(kuò)增，然后將其回輸給腫瘤患者以達(dá)到治療目的的方法，被認(rèn)為是繼手術(shù)、放、化療后的第4種治療方式，在臨床治療中受到廣泛應(yīng)用。過繼細(xì)胞治療廣泛應(yīng)用的主要是：淋巴因子活化的殺傷細(xì)胞(lymphokineactivatedkillercell，lak)與il-2聯(lián)合治療晚期惡性腫瘤取得了一定療效；腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumorinfiltratinglymphocytes，til)臨床試驗(yàn)中治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤取得了較好的效果；細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokineinducedkillercell，cik)，目前國內(nèi)開展較多的臨床試驗(yàn)，對(duì)肝癌、肺癌等腫瘤取得了顯著的效果。但是目前上述三種治療方法均需活化t細(xì)胞，t細(xì)胞活化需要兩種活化信號(hào)，即t細(xì)胞表面的tcr-cd3與mhc-ⅰ分子結(jié)合為活化的第一信號(hào)，決定t細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性；t細(xì)胞表面的共刺激分子與相應(yīng)配體結(jié)合為活化的第二信號(hào)，決定t細(xì)胞增殖。但腫瘤細(xì)胞、腫瘤微環(huán)境可下調(diào)mhc、配體分子，從而抑制t細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。因此需要可進(jìn)行基因改造，主要有兩種方式：基因轉(zhuǎn)導(dǎo)tcr(tcellreceptor，tcr)和嵌合抗原受體(chimericantigenreceptor，car)。嵌合抗原受體(chimericantigenreceptor，car)是模擬tcr功能的人工受體，由抗原識(shí)別域、鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)及胞內(nèi)信號(hào)域依次連接組成，胞內(nèi)信號(hào)域通常為cd3ζ鏈或fcrγ，或與一種或多種共刺激分子相連，如4-1bb(cd137)，cd28，icos(cd278)。腫瘤細(xì)胞表面的抗原(受體)與嵌合抗原受體的抗體(配體)結(jié)合時(shí)，通過鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)將信號(hào)傳遞至胞內(nèi)，胞內(nèi)信號(hào)域?qū)⑿盘?hào)轉(zhuǎn)化為活化信號(hào)，激活效應(yīng)細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞增殖、產(chǎn)生細(xì)胞因子從而殺傷腫瘤細(xì)胞。嵌合抗原受體較tcr改造更具優(yōu)勢：(1)特異性：抗體(配體)特異性識(shí)別抗原(受體)；(2)效率高：不會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因tcr與患者內(nèi)源性tcr發(fā)生錯(cuò)配；(3)非mhc-ⅰ限制性：不需要與mhc-ⅰ分子結(jié)合，可克服腫瘤細(xì)胞、腫瘤微環(huán)境下調(diào)mhc-ⅰ分子造成的免疫逃逸；(4)抗原選擇范圍廣：抗原可以是糖類、脂類、蛋白。

近年來，t淋巴細(xì)胞嵌合抗原受體(car-t)治療在腫瘤治療中展現(xiàn)了顯著的治療效果尤其是治療cd19陽性的惡相腫瘤或者白血病方面；利用car-t進(jìn)行實(shí)體瘤的研究也不斷得到重視，但是大多數(shù)car-t治療實(shí)體瘤的效果卻并不令人滿意，car-t對(duì)于治療實(shí)體瘤還需要更多的探索。scfv(單鏈抗體)對(duì)于car的抗原結(jié)合親和力及car的功能均起著決定性作用，最佳的scfv與car的結(jié)合可以使得car-t治療更有效更安全，因此car結(jié)構(gòu)中scfv的優(yōu)化對(duì)于car-t治療的應(yīng)用是十分必要且有意義的。

在car-t的治療中相對(duì)于殺傷腫瘤的能力，安全性和car-t能否有效性的識(shí)別腫瘤細(xì)胞是更重要考慮的因素。對(duì)單克隆抗體進(jìn)行氨基酸突變產(chǎn)生一系列對(duì)同一抗原表位具有不同親和力的抗體，構(gòu)建car-t細(xì)胞，其中scfv展現(xiàn)了更有效的抗腫瘤效果和更好的安全性。針對(duì)不同抗原表位或者源于不同雜交瘤細(xì)胞的scfv構(gòu)建car會(huì)有不同的效果，但是高親和力的scfv-car具有更高的腫瘤殺傷效果。

cea又稱癌胚抗原，作為結(jié)直腸癌檢測的標(biāo)志其在大部分正常組織中均未發(fā)現(xiàn)表達(dá)，cea具有較好的腫瘤特異性可以作為一個(gè)很好的抗原靶標(biāo)應(yīng)用于car-t治療。我們已經(jīng)在利用car-t細(xì)胞進(jìn)行抗cea腫瘤的嘗試，但是并未發(fā)現(xiàn)對(duì)腫瘤有效的緩解，并且在病人細(xì)胞轉(zhuǎn)染car后在培養(yǎng)的過程中發(fā)現(xiàn)有些病人細(xì)胞car陽性率隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長下降顯著。由于一些scfv能夠聚集或進(jìn)行獨(dú)立的抗原信號(hào)傳導(dǎo)，在與car結(jié)合后會(huì)減弱甚至干擾car-t細(xì)胞的功能，我們推測是由于運(yùn)用的scfvbw431/26并非最適的結(jié)合car的scfv，因此我們希望尋找到最適的結(jié)合cea-car的scfv應(yīng)用于表達(dá)cea的腫瘤病人的治療，為實(shí)體瘤的臨床應(yīng)用提供新的思路。

鼠源的scfv在人體內(nèi)會(huì)引起hama(humananti-mouseantibodies)或者h(yuǎn)aca(cellularanti-carimmuneresponses)反應(yīng)，人源化的scfv可以有效地降低car的免疫原性，增強(qiáng)car-t在體內(nèi)的持續(xù)和安全性。因此在選擇scfv時(shí)我們選擇了人源化的抗cea抗體設(shè)計(jì)制備scfv。

我們的抗體設(shè)計(jì)人員在整理cea的人源化抗體資料時(shí)，對(duì)于夾雜在其中的一篇晶體結(jié)構(gòu)解析的文章產(chǎn)生了濃厚的興趣，通過其豐富的抗體設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)敏銳察覺到該晶體結(jié)構(gòu)所對(duì)應(yīng)的scfv可以很完美的和car結(jié)合，依據(jù)該抗體結(jié)構(gòu)我們?cè)O(shè)計(jì)了其scfv并將其插入到三代car結(jié)構(gòu)中進(jìn)行試驗(yàn)。通過與多種scfv對(duì)比，檢測不同scfv-car轉(zhuǎn)染后car陽性率的維持，car-t細(xì)胞表型，car-t細(xì)胞增殖和對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力確定該anti-cea-scfv為最適的與car結(jié)合的scfv，該scfv來源于抗cea單克隆抗體m5a，其不僅可以維持car在病人細(xì)胞培養(yǎng)過程中的陽性率并且能夠加強(qiáng)car-t的增殖和殺傷腫瘤的能力；出于對(duì)臨床治療安全性的考慮，我們的技術(shù)人員對(duì)m5a-scfv進(jìn)一步進(jìn)行了人源化改進(jìn)構(gòu)建了sdr移植抗體，確保了car-t細(xì)胞在人體內(nèi)的安全性并能夠加強(qiáng)其在人體內(nèi)的可持續(xù)存活。

目前針對(duì)表達(dá)cea的實(shí)體瘤還沒有很好地治療方案，抗原嵌合受體在t細(xì)胞上轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定性也沒有很好的解決方案，也沒有報(bào)道顯示m5a-scfv結(jié)合抗原嵌合受體對(duì)嵌合抗原受體細(xì)胞的穩(wěn)定性和對(duì)cea實(shí)體瘤療效的影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種識(shí)別癌胚抗原的嵌合抗原受體及其應(yīng)用，本發(fā)明的識(shí)別癌胚抗原的嵌合抗原受體能夠更穩(wěn)定的表達(dá)于t淋巴細(xì)胞，具有更好的清除腫瘤細(xì)胞的能力。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

抗癌胚抗原的嵌合抗原受體，由識(shí)別癌胚抗原的單鏈抗體(scfv)，鉸鏈區(qū)，跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)域依次連接組成；所述識(shí)別癌胚抗原的單鏈抗體(scfv)的氨基酸序列含有m5a-scfv的氨基酸序列或通過對(duì)m5a-scfv多肽進(jìn)行隨機(jī)點(diǎn)突變得到的氨基酸序列。

m5a-scfv的氨基酸序列如seqidno:12所示。

進(jìn)一步，所述識(shí)別癌胚抗原的單鏈抗體(scfv)的氨基酸序列如seqidno:12或seqidno:13或seqidno:14所示或seqidno:15所示。

所述的嵌合抗原受體需要逾越兩個(gè)技術(shù)障礙，一是尋找更穩(wěn)定有效的識(shí)別癌胚抗原的scfv，二是將最佳的scfv多肽進(jìn)行人源化處理。

為什么要進(jìn)行改造？因?yàn)槲覀兡壳笆褂玫淖R(shí)別癌胚抗原的嵌合抗原受體在應(yīng)用時(shí)不能夠穩(wěn)定表達(dá)于t淋巴細(xì)胞尤其是病人來源的t淋巴細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長t細(xì)胞表面的嵌合抗原受體表達(dá)顯著降低。人源化程度越高的scfv可以有效地降低car的免疫原性，增強(qiáng)car-t在體內(nèi)的持續(xù)和安全性。

影響嵌合抗原受體表達(dá)穩(wěn)定性的因素主要在于scfv以及構(gòu)建scfv時(shí)所使用的hinge序列。在選擇scfv時(shí)我們選擇了已知的抗cea抗體設(shè)計(jì)制備scfv。將鼠源抗體改造為人源化抗體有以下幾種主要形式：1)鼠可變區(qū)(viarableregion，vrs)+人恒定區(qū)(constantregion，crs)；2)鼠互補(bǔ)決定區(qū)(complementaritydeterminingregion，cdrs)+人框架區(qū)(fragmentregions，frs)；3)鼠cdrs+人frs等。如何改造識(shí)別癌胚抗原的抗體，使之能夠較好地保留其對(duì)抗原的親和活性，并且組合為最佳的識(shí)別cea(癌胚抗原)嵌合抗原受體，是一個(gè)難題。發(fā)明人團(tuán)隊(duì)在未有更有效的技術(shù)提示的情況下通過排除法將目前已報(bào)道的4個(gè)抗cea單克隆抗體全部制備scfv通過不同的組合方式構(gòu)建car(嵌合抗原受體)進(jìn)行篩選。

改造多肽的方法，是在cdr區(qū)保留不進(jìn)行突變。方法的結(jié)果存在隨機(jī)性，只有在配置得當(dāng)?shù)那闆r下，其親和力才有可能和原有小鼠抗體的親和力相當(dāng)。而本發(fā)明所保護(hù)的方法，是在知道較好的結(jié)果后，反推的方法，即“事后諸葛亮”式的方法。

在保護(hù)所述的嵌合抗原受體時(shí)，我們還淘汰了三組其他靶點(diǎn)思路下的嵌合抗原受體，但是其它的三組因?yàn)橛H和力測試實(shí)驗(yàn)不合格，慘遭淘汰。而僅僅由本發(fā)明所保護(hù)的這一組，具有預(yù)料不到的技術(shù)效果。

本部分保護(hù)的car的組合方式，經(jīng)過測試之后，可以起到穩(wěn)定表達(dá)于病人來源的t淋巴細(xì)胞，并且具有更好的清除腫瘤細(xì)胞的能力，用于針對(duì)實(shí)體瘤的過繼細(xì)胞治療。

進(jìn)一步，鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如seqidno:17所示。

進(jìn)一步，所述跨膜區(qū)所述跨膜區(qū)的氨基酸序列如seqidno:18或seqidno:19所示。

進(jìn)一步，所述胞內(nèi)信號(hào)域?yàn)閏d3ζ鏈和/或fcrγ和/或cd137和/或cd28和/或cd278。胞內(nèi)信號(hào)域通常為cd3ζ鏈或fcrγ，或與一種或多種共刺激分子相連，如4-1bb(cd137)，cd28，icos(cd278)。cd137的核苷酸序列如seqidno:7所示，cd28的核苷酸序列如seqidno:6所示，cd3ζ的核苷酸序列如seqidno:8所示。

作為一種優(yōu)選，所述胞內(nèi)信號(hào)域依次為cd28、cd137和cd3ζ。

腫瘤細(xì)胞表面的抗原(受體)與所述的嵌合抗原受體的抗體(配體)結(jié)合時(shí)，通過鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)將信號(hào)傳遞至胞內(nèi)，胞內(nèi)信號(hào)域?qū)⑿盘?hào)轉(zhuǎn)化為活化信號(hào)，激活效應(yīng)細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞增殖、產(chǎn)生細(xì)胞因子從而殺傷腫瘤細(xì)胞。嵌合抗原受體較tcr改造更具優(yōu)勢：(1)特異性：抗體(配體)特異性識(shí)別抗原(受體)；(2)效率高：不會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因tcr與患者內(nèi)源性tcr發(fā)生錯(cuò)配；(3)非mhc-ⅰ限制性：不需要與mhc-ⅰ分子結(jié)合，可克服腫瘤細(xì)胞、腫瘤微環(huán)境下調(diào)mhc-ⅰ分子造成的免疫逃逸；(4)抗原選擇范圍廣：抗原可以是糖類、脂類、蛋白。

進(jìn)一步，所述嵌合抗原受體的核苷酸序列如seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4所示。

本發(fā)明的嵌合抗原受體，其可以用于針對(duì)實(shí)體瘤的過繼細(xì)胞治療。

很多報(bào)道提到：過繼細(xì)胞治療在白血病中效果顯著，但對(duì)實(shí)體瘤的car-t臨床治療效果有限。我們通過前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，未經(jīng)改造的單鏈抗體導(dǎo)致現(xiàn)有的抗cea的car陽性率低，在病人細(xì)胞培養(yǎng)過程中很不穩(wěn)定，并且隨著時(shí)間的推移會(huì)導(dǎo)致car陽性率下降，進(jìn)而影響car對(duì)結(jié)直腸癌的臨床治療效果。而我們將單鏈抗體的氨基酸序列進(jìn)行改造后，克服了上述問題。

本發(fā)明的目的之二在于所述的嵌合抗原受體的慢病毒載體的制備方法，具體包括以下步驟：

1)合成含有識(shí)別癌胚抗原的單鏈抗體(scfv)的嵌合抗原受體的基因序列：合成依次含前導(dǎo)肽、抗人cea抗原的不同的單鏈抗體scfv、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)域；所述鉸鏈區(qū)核酸序列如seqidno:5、跨膜區(qū)核酸序列如seqidno:9、胞內(nèi)信號(hào)域核酸序列如seqidno:6、seqidno:7和seqidno:8；

2)構(gòu)建表達(dá)嵌合抗原受體的慢病毒載體：設(shè)計(jì)引物，正向引物的核苷酸序列如seqidno:20所示，反向引物的核苷酸序列如seqidno:21所示，以所述嵌合抗原受體的序列為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得dna片段；

將所述dna片段的基因序列用限制性內(nèi)切酶nhei和sali雙酶切，同時(shí)用限制性內(nèi)切酶nhei和sali酶切慢病毒表達(dá)載體pcdh-ef1，然后將梅切后的目的片段和慢病毒表達(dá)載體片段通過t4連接酶進(jìn)行連接，獲得表達(dá)嵌合抗原受體的慢病毒載體。

進(jìn)一步，在步驟2)之后，包裝并純化所述慢病毒載體。

本發(fā)明的目的之三在于提供一種所述的制備方法所得的慢病毒載體。

在所述的方法下得到所述的慢病毒載體，這樣的慢病毒載體的陽性表達(dá)率高，在病人細(xì)胞培養(yǎng)過程中很穩(wěn)定，并且不會(huì)隨著時(shí)間的推移會(huì)導(dǎo)致car陽性率下降。于是，用所述慢病毒載體感染的t細(xì)胞，這樣的t細(xì)胞具備殺傷靶細(xì)胞的功能。

本發(fā)明的目的還在于提供一種所述的慢病毒載體感染的t細(xì)胞。

本發(fā)明的目的還在于提供一種所述的t細(xì)胞在用于制備治療實(shí)體瘤的藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述的實(shí)體瘤的細(xì)胞能夠表達(dá)cea。cea又稱癌胚抗原，作為結(jié)直腸癌檢測的標(biāo)志其在大部分正常組織中均未發(fā)現(xiàn)表達(dá)，cea具有較好的腫瘤特異性可以作為一個(gè)很好的抗原靶標(biāo)應(yīng)用于car-t治療。

進(jìn)一步，所述實(shí)體瘤為結(jié)直腸癌腫瘤。

另外，回到發(fā)明的起源端，本發(fā)明的目的還在于提供一種所述的識(shí)別癌胚抗原的單鏈抗體(scfv)的氨基酸序列在用于制備治療實(shí)體瘤的藥物中的應(yīng)用。所述識(shí)別癌胚抗原的單鏈抗體(scfv)的氨基酸序列如seqidno:14所示或seqidno:15所示。所述改造的多肽片段，其相對(duì)于被改造前，更具有人源化抗體的特性。

進(jìn)一步，所述的實(shí)體瘤的細(xì)胞能夠表達(dá)cea。

本發(fā)明的目的還在于提供一種所述的識(shí)別癌胚抗原的單鏈抗體(scfv)的氨基酸序列在在用于制備精準(zhǔn)捕獲能夠表達(dá)cea實(shí)體瘤細(xì)胞的載體中的應(yīng)用。除了細(xì)胞治療，也可以用于放射性治療。所述識(shí)別癌胚抗原的單鏈抗體(scfv)的氨基酸序列如seqidno:12或seqidno:13或seqidno:14所示或seqidno:15所示。所述氨為改造的多肽片段，其相對(duì)于被改造前，更具有人源化抗體的特性。

本發(fā)明的目的還在于提供一種如seqidno:12或seqidno:13所示的氨基酸序列在制備car-t骨架中的抗原識(shí)別域的應(yīng)用。

總的來說，本發(fā)明所述的scfv-car嵌合抗原受體在免疫細(xì)胞中表達(dá)后，不僅可以維持靶向cea的嵌合抗原受體(chimericantigenreceptor，car)在病人細(xì)胞培養(yǎng)過程中的陽性率并且能夠加強(qiáng)car-t的增殖和殺傷腫瘤的能力，并且對(duì)抗原陰性的細(xì)胞無毒副作用，能夠用于腫瘤的靶向治療。

本發(fā)明的有益效果在于：

1)本發(fā)明提供的嵌合抗原受體識(shí)別癌胚抗原，能夠更穩(wěn)定的表達(dá)于t淋巴細(xì)胞，具有更好的清除腫瘤細(xì)胞的能力，不僅可以維持靶向cea的嵌合抗原受體在病人細(xì)胞培養(yǎng)過程中的陽性率并且能夠加強(qiáng)car-t的增殖和殺傷腫瘤的能力，對(duì)抗原陰性的細(xì)胞無毒副作用，能夠用于腫瘤的靶向治療。

2)本發(fā)明提供的通過改造的嵌合抗原受體人源化程度高，可以有效地降低car的免疫原性，增強(qiáng)car-t在體內(nèi)的持續(xù)和安全性。

3)本發(fā)明提供的嵌合抗原受體能夠穩(wěn)定表達(dá)于t淋巴細(xì)胞尤其是病人來源的t淋巴細(xì)胞，可以用于制備治療實(shí)體瘤的藥物中針對(duì)實(shí)體瘤的過繼細(xì)胞治療。

附圖說明

圖1為四組不同的scfv-car-t結(jié)構(gòu)圖。

圖2為四組不同scfv對(duì)cea靶點(diǎn)的親和力測定結(jié)果，圖a、b、c和d分別為m5a、hmn-14、bw431/26和c2-45與不同cea濃度梯度的親和力結(jié)果(kd值越低親和力越強(qiáng))。

圖3為四組scfv融合的嵌合抗原受體轉(zhuǎn)染t細(xì)胞后隨著細(xì)胞培養(yǎng)的天數(shù)嵌合抗原受體表達(dá)陽性率的變化，縱坐標(biāo)代表嵌合抗原受體陽性表達(dá)的百分率，橫坐標(biāo)表示培養(yǎng)天數(shù)。

圖4為四組cea-car-t細(xì)胞第8天第14天car陽性率的檢測結(jié)果。

圖5為cea-car-3轉(zhuǎn)染t細(xì)胞第4天、第8天、第14天和第18天car陽性率檢測。

圖6為四組不同的scfv-car-t細(xì)胞體外殺傷活性檢測；圖a表示殺傷24小時(shí)酶聯(lián)免疫法(elisa)檢測各scfv-car-tifn-γ的釋放；圖b表示8小時(shí)car-t細(xì)胞與靶細(xì)胞效靶比6:1是car-t細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷能力；

圖7為四組不同的scfv-car-t細(xì)胞8小時(shí)的效果圖，圖7-a表示8小時(shí)不同效靶比的car-t的殺傷能力；圖7-b表示效靶比3:1不同時(shí)間點(diǎn)各car-t的殺傷能力。

圖8為四組不同的scfv-car-t動(dòng)物體內(nèi)殺傷實(shí)驗(yàn)；每只nod/scid皮下注射lovo-luc細(xì)胞(lovo細(xì)胞高表達(dá)cea，luc為螢火蟲熒光素酶在底物的作用下通過小動(dòng)物成像儀可以實(shí)時(shí)觀測腫瘤在體內(nèi)的生長和分布情況)1*10^66天后隨機(jī)分組每組4只小鼠，每組分別尾靜脈注射cea-car-1、cea-car-2、cea-car-4、utd(對(duì)照t細(xì)胞)，利用小動(dòng)物成像儀觀察第6天、第13天、第20天以及第27天腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生長情況.

圖9為腫瘤熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖。

圖10為人源化改造后不同hscfv組成的car-t細(xì)胞殺傷后ifn-g釋放。

圖11為人源化改造后不同hscfv組成的car-t細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的清除能力對(duì)比。結(jié)果顯示進(jìn)行改造后的cea-car-1-2有更好的清除腫瘤細(xì)胞的能力。

具體實(shí)施方式

以下將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，j.薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。所舉實(shí)施例是為了更好地對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行說明，但并不是本發(fā)明的內(nèi)容僅限于所舉實(shí)施例。所以熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上述發(fā)明內(nèi)容對(duì)實(shí)施方案進(jìn)行非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

第一部分

本部分實(shí)驗(yàn)通過對(duì)四種不同的單克隆抗體(表位肽不同)的單鏈抗體進(jìn)行獲得，并對(duì)單鏈抗體進(jìn)行人源化目的的突變，將突變的單鏈抗體用于制備嵌合抗原受體，并對(duì)錢和抗原受體進(jìn)行功能驗(yàn)證試驗(yàn)。通過本部分的實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論：雖然理論上“單鏈抗體”可以用于制備嵌合抗原受體，但實(shí)際并不是每一單鏈抗體都可以用于制備嵌合抗原受體。這需要發(fā)明人付出創(chuàng)造性的勞動(dòng)，才能在眾多的改造的單鏈抗體中找到具有預(yù)料不到的效果的產(chǎn)品。

實(shí)施例1含有m5a、hmn-14、c2-45和bw431/26的scfv的嵌合抗原受體病毒的構(gòu)建

為了證明我們篩選的抗cea的car比目前使用的抗cea的car和其他抗ceascfv的car更有優(yōu)勢，因此需要同時(shí)構(gòu)建不同抗cea人源化單克隆抗體的scfv-car命名cea-car-1、cea-car-2、cea-car-3和cea-car-4，分別如下：

1合成含有不同scfv的靶向癌胚抗原的嵌合抗原受體的基因序列

合成依次含前導(dǎo)肽(又稱信號(hào)肽)(簡稱lp)、抗人cea抗原的不同的單鏈抗體scfv，igg4鉸鏈區(qū)(簡稱igg4)、cd28跨膜區(qū)或cd8跨膜區(qū)(簡稱為tm)，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。

2構(gòu)建表達(dá)嵌合抗原受體的慢病毒載體

設(shè)計(jì)如下引物，并將其由南京金斯瑞生物科技公司合成，具體引物如下：

引物1：5’-aggctagcatgggatggagctgtatcat-3’，下劃線為nhei限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；

引物2：5’-gattgtcgacttagcgagggggcagggcctgcatgtga-3’，下劃線為sali限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。

然后以上述所示序列為引物，上述合成的各嵌合抗原受體序列為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，反應(yīng)體系按kodfxneodna聚合酶(購自toyobo公司)說明書加樣，pcr反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；95℃變性10s，55℃退火15s，68℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)。將擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，擴(kuò)增獲得約2000bp的dna片段，然后用回收試劑盒(promega公司)進(jìn)行dna片段回收，具體方法見說明書，回收獲得嵌合抗原受體，將dna回收片段送南京金斯瑞生物科技公司測序。

將克隆獲得的編碼嵌合抗原受體的基因序列用限制性內(nèi)切酶nhei和sali(購自thermo公司)雙酶切，同時(shí)用限制性內(nèi)切酶nhei和sali酶切慢病毒表達(dá)載體pcdh-ef1(購至addgeneplasmid#72266)，酶切反應(yīng)按說明書進(jìn)行。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后用瓊脂糖凝膠dna片段回收試劑盒進(jìn)行dna片段回收，然后將的目的片段和載體片段通過t4連接酶(購自promega公司)進(jìn)行連接，獲得表達(dá)嵌合抗原受體的慢病毒載體，命名為lv-scfv(cea)。將慢病毒載體取5μl轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10，30℃培養(yǎng)16h后挑取單克隆，挑取的單克隆在30℃條件下培養(yǎng)12h后用質(zhì)粒抽提試劑盒(invitrogen公司)抽提質(zhì)粒，具體方法見說明書。

按照如上方法分別構(gòu)建四個(gè)慢病毒載體(下劃線指代改造的單鏈抗體)：

“m5a-scfv-igg4hinge-cd28tm-cd28-cd137-cd3z”；

“hmn-14-scfv-igg4hinge-cd28tm-cd28-cd137-cd3z”；

“c2-45-scfv-igg4hinge-cd28tm-cd28-cd137-cd3z”；

“bw431/26-scfv-igg4hinge-cd28tm-cd28-cd137-cd3z”。

3慢病毒的包裝

本實(shí)施例包裝慢病毒采用磷酸鈣法，具體步驟如下：用含10％(wt)fbs的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)293t細(xì)胞，至較佳狀態(tài)；然后將293t細(xì)胞以1×105/cm2的密度傳至1個(gè)75cm2的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)22h，保證轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合度為70-80％；再用預(yù)熱的含2％(wt)fbs的dmem培養(yǎng)基換液，培養(yǎng)2h，備用；將680μlddh2o、20μg慢病毒載體、20μgpmdlg/prre質(zhì)粒、20μgprsv–rev和10μgpmd2.g質(zhì)粒、100μl2.5mmcacl2加入15ml離心管中，混合均勻，混勻后用移液器向混合液中逐滴加入2×hbs，同時(shí)用10ml移液器吹打混勻，混勻后室溫靜置15min，然后將混合液逐滴加入上述制備的細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)12-16h后，用含10％fbs(wt)的dmem培養(yǎng)基更換培液，繼續(xù)培養(yǎng)48h、72h后分別收集細(xì)胞上清并用于病毒純化。

4慢病毒的純化

將病毒上清收集在50ml離心管中，3000r/min離心10min；然后用0.45μm過濾膜過濾，濾液在3000r/min離心10min至新的50ml離心管；然后根據(jù)病毒上清量，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50％的peg6000和4mnacl，再用醫(yī)用鹽水定容至35ml，使peg6000終濃度為8.5％，nacl終濃度為0.3m，定溶后于4℃冰箱靜置90min，30min/次顛倒混勻；然后于4℃、5000r/min條件下離心30min，棄盡上清，用200μl含10％fbs的dmem培養(yǎng)基重懸病毒，1.5mlep管分裝，每管40μl，-80℃保存?zhèn)溆?。制得病毒分別命名為：

cea-car-1、cea-car-2、cea-car-3和cea-car-4，序列分別為seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4。

5慢病毒滴度測定

步驟1:病毒感染293t細(xì)胞

感染前將293t細(xì)胞以鋪24孔板中，取已純化的病毒1μl，用醫(yī)用生理鹽水稀釋10倍，再向每孔細(xì)胞中加入1μl聚凝胺(polybrene)溶液，然后將1μl和9μl稀釋后的病毒液分別加到293t細(xì)胞中，24h后用含10％fbs(wt)的dmem培養(yǎng)基換液，感染72h后于1000r/min條件下離心5min以收集細(xì)胞，抽提基因組。

步驟2:抽提基因組

基因組抽提試劑盒為qiaampdnabloodminikit購于qiagen公司(貨號(hào)511004)，按試劑盒說明書操作，具體如下：將收集的細(xì)胞用pbs重懸，1000r/min離心5min，棄盡上清，重復(fù)1次；再用200μlpbs重懸細(xì)胞，并加入20μl蛋白酶k，200μlal裂解液，吹打混勻，56℃孵育10min；然后加入200μl預(yù)冷的乙醇，上下顛倒混勻，將溶液轉(zhuǎn)移至過濾柱中，室溫靜置1min，8000r/min離心1min，棄盡上清；接著加入700μlaw1溶液，8000r/min離心1min，棄盡上清；再加入500μlaw2溶液，8000r/min離心1min，棄盡上清，將過濾柱轉(zhuǎn)移至新的1.5mlep管中，開蓋靜置1min以揮發(fā)乙醇；加入50μl滅菌ddh2o(60℃預(yù)熱)，靜置2min，12000g/min離心1min。

步驟3:qrt-pcr測定病毒滴度

反應(yīng)體系如下：premixextaqtmii(2×)10μl，上游引物(gagup)1μl，下游引物(gagdn)1μl，抽提的基因組1μl，rnase-freedh2o7μl，每個(gè)樣品、標(biāo)準(zhǔn)品至少3個(gè)重復(fù)孔。然后按如下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，72℃延伸30s，反應(yīng)結(jié)束后，用分析軟件分析數(shù)據(jù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算病毒滴度。計(jì)算結(jié)果顯示，病毒滴度為1×10⁸tu/ml。

實(shí)施例2scfv與靶抗原(cea)親和力測定

前述4個(gè)scfv標(biāo)記有his標(biāo)簽后克隆進(jìn)質(zhì)粒載體并轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)6天并收集所有上清，上清通過0.22um濾膜過濾后通過鎳柱親和層析純化上清中的scfv-his，純化后scfv-his純度達(dá)到95％，scfv-his濃度通過bradford發(fā)測定；不同的scfv與cea的親和力通過fortebiored96相互作用分析儀(pall,ca,u.s.)進(jìn)行檢查，實(shí)驗(yàn)步驟依據(jù)說明書進(jìn)行?？谷薸gg-fc(ahc)的生物傳感器依據(jù)說明書要求購買于pallfortébio,1512121；重組cea-fc的濃度為15ug/ml，購買于sinobiologicalinc貨號(hào)為11077-h03h-50，將cea-fc預(yù)先孵育于生物傳感器，scfv和陰性對(duì)照用pbs稀釋5個(gè)梯度，結(jié)合動(dòng)力學(xué)運(yùn)算利用fortébio數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)不同scfv于cea的親和力進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了三個(gè)獨(dú)立重復(fù)，結(jié)果如圖2所示，m5a-scfv與cea抗原具有較好的親和力。

實(shí)施例3嵌合抗原受體在t細(xì)胞內(nèi)維持的檢測

1人外周血單核細(xì)胞的分離

用加有抗凝劑的采血管采集外周血約60ml，分裝于50ml離心管各30ml，加入7.5ml羥乙基淀粉稀釋；室溫(18～25℃)自然沉降約30min，收集上層血漿，將收集的上層血漿于1400rpm/min條件下離心15min；然后用生理鹽水重懸沉淀，按體積比為1:1加到淋巴細(xì)胞分離液上，梯度離心，400g/min，離心機(jī)降速設(shè)置為1，離心20min；離心后，離心管由上至下分為：第一層：血漿層；第二層：環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層；第三層：透明分離液層；第四層：紅細(xì)胞層；取第二層白色淋巴細(xì)胞層，并用生理鹽水洗滌2次，第一次400g/min，離心10min，第二次1100rpm/min，離心5min，生理鹽水重懸細(xì)胞，加入含有10％fbs的rpmi1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，得人外周血單核細(xì)胞。

2慢病毒載體感染t淋巴細(xì)胞

用含10％胎牛血清的rpmi1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)新制備的單個(gè)核細(xì)胞pbmc，第1天加入抗cd3單克隆抗體活化；前3天進(jìn)行慢病毒感染；加入5moi對(duì)應(yīng)的慢病毒載體，未感染的t淋巴細(xì)胞作為空白對(duì)照；24h后將培養(yǎng)基更換為含有500iu/ml重組人il-2的rpmi1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)10-20天。

在培養(yǎng)過程中分別對(duì)培養(yǎng)至4天、8天、14天以及18天的已感染病毒的t細(xì)胞，300g/min，離心5min，棄盡上清以收集細(xì)胞；用含有體積分?jǐn)?shù)1％胎牛血清的pbs溶液重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞調(diào)整密度為1×106個(gè)/ml；將收集的細(xì)胞分裝為6管，每管100μl，向每管細(xì)胞中加入5μl濃度為0.3μg/ml的his標(biāo)記的重組人ceacam5蛋白(北京義翹神州公司)，4℃孵育30min，pbs溶液洗滌2次，再加入af647標(biāo)記的小鼠抗his抗體(南京金斯瑞公司)，4℃孵育30min，pbs溶液洗滌2次，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，分別檢測培養(yǎng)第4天、第8天、第14天和第18天car表達(dá)陽性率，結(jié)果如圖3，圖4，圖5所示，統(tǒng)計(jì)為如下表所示的統(tǒng)計(jì)圖，cea-car-1在轉(zhuǎn)染t淋巴細(xì)胞后能夠穩(wěn)定的表達(dá)于t細(xì)胞表面，而cea-car-3則不能轉(zhuǎn)染上t細(xì)胞。

表第4天、第8天、第14天和第18天car表達(dá)陽性率

實(shí)施例4病毒感染car-t細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷能力的影響

不同scfv的嵌合抗原受體對(duì)靶細(xì)胞的殺傷能力通過aceaxcelligencertcamp儀器完成，實(shí)驗(yàn)步驟依據(jù)儀器說明書進(jìn)行；第一天將靶細(xì)胞(表達(dá)cea的腫瘤細(xì)胞)以2-5*10^{^4}每孔鋪板于儀器配備的96孔板中，附著于孔底的腫瘤細(xì)胞以電阻指數(shù)為數(shù)據(jù)每15分鐘記錄一次，24小時(shí)后依據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)的效靶比每孔鋪入相應(yīng)的car-t細(xì)胞，記錄car-t細(xì)胞鋪入24小時(shí)的電阻指數(shù)，24小時(shí)后收集各組上清進(jìn)行酶聯(lián)免疫(elisa)檢測并通過儀器分析的各組電阻指數(shù)分析結(jié)果，car-t細(xì)胞殺傷率＝基線電阻指數(shù)-實(shí)時(shí)電阻指數(shù)，elisa檢測通過elisa試劑盒檢測ifn-γ，試劑盒購于bdbiosciences貨號(hào)4316955。殺傷結(jié)果如圖6b和圖7所示，結(jié)果顯示cea-car-1具有更好的清除腫瘤細(xì)胞的能力。

細(xì)胞因子檢測

1細(xì)胞因子檢測采用elisa的方法，使用bd公司試劑盒進(jìn)行。

2標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：準(zhǔn)備小試管6只，依次編好號(hào)碼，先在各小試管中加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液100μl，然后取原濃度標(biāo)準(zhǔn)品100μl加入一只已編好號(hào)的試管中，充分混勻；再在該試管中取100μl加入第二支試管中，充分混勻；再在該試管中取100μl加入第三只試管中，充分混勻；再在該試管中取100μl加入第四只試管中，充分混勻；再在該試管中取100μl加入第五只試管中，充分混勻；然后在該試管中取100μl，棄掉；第六只試管作為0號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品。

3在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔，依次加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μl，每個(gè)濃度做2個(gè)平行孔。

4加樣：分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品、酶標(biāo)試劑及生物素標(biāo)記的抗體，其余各步操作相同)、待測樣品孔；在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品40μl，然后再加生物素標(biāo)記的抗體10μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

5溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

6配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。

7洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干；

8加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外；

9溫育：操作同3；

10洗滌：操作同5；

11終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)；

12測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(od值)，測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

結(jié)果如圖6a顯示cea-car-1和cea-car-2car-t細(xì)胞在殺傷后釋放的ifn-γ要高于cea-car-4。

實(shí)例5感染的car-t細(xì)胞在nod-scidγ-/-(nsg)小鼠體內(nèi)對(duì)小鼠異種移植的結(jié)直腸癌腫瘤的殺傷/清除能力

nod-scidγ-/-(nsg)小鼠購買于中國北京vitalriverlaboratoryanimaltechnologyco.,ltd，6-8周齡的小鼠購買后于spf級(jí)動(dòng)物房喂養(yǎng)一周后每只鼠皮下注射lovo-luc細(xì)胞1*10^6，喂養(yǎng)6天后隨機(jī)分組分別尾靜脈注射cea-car-1、cea-car-2、cea-car-4、utd(對(duì)照t細(xì)胞)1*10^7細(xì)胞，每3-4天測量腫瘤的大小，每周利用小動(dòng)物成像儀觀察腫瘤在小鼠體內(nèi)的分布，結(jié)果見圖8圖9，cea-car-1轉(zhuǎn)染的t細(xì)胞能夠更好的抑制甚至清除小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞。

第二部分

本部分采用了不用于第一部分的另一單鏈抗體作為改造目標(biāo)，獲得了幾條新的改造的多肽，將突變的單鏈抗體用于制備嵌合抗原受體，并對(duì)嵌合抗原受體進(jìn)行功能驗(yàn)證試驗(yàn)。我們將功能驗(yàn)證成功的數(shù)據(jù)通過權(quán)利要求進(jìn)行保護(hù)。本部分參照第一部分實(shí)施例的方法和步驟進(jìn)行，再此就不重復(fù)記錄。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10，圖11，結(jié)果顯示我們改造的多肽scfv-1-2構(gòu)成的car：cea-car-1-1t細(xì)胞具有更好的殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。

綜上所述，我們提供的數(shù)據(jù)表明由于改造后的m5a-scfv的加入cea-car-1在表達(dá)穩(wěn)定性，對(duì)腫瘤細(xì)胞的清除以及相關(guān)細(xì)胞因子分泌上具有更好的效果；我們利用m5a-scfv的鼠源抗體進(jìn)行人源化改造獲得scfv-1-1(seqidno:14)，scfv-1-2(seqidno:15)以及scfv-1-3(seqidno:16)三個(gè)人源化后的scfv序列，進(jìn)一步制備car-t細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其核酸序列如seqidno:11或者seqidno:10發(fā)現(xiàn)scfv-1-2(seqidno:15)構(gòu)成的car轉(zhuǎn)染的t細(xì)胞(seqidno:10)對(duì)腫瘤細(xì)胞的清除效果更優(yōu)于m5a-scfv。

最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。

<110>重慶精準(zhǔn)生物技術(shù)有限公司

<120>識(shí)別癌胚抗原的嵌合抗原受體及其應(yīng)用

<160>21

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>899

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<213>artificial

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<223>cea-car-1

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<223>鉸鏈區(qū)

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serleuglylys

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leuserleuvalilethrleutyrcys

20

<210>20

<211>

<212>dna

<213>artificial

<220>

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<211>

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>反向引物

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