本發(fā)明涉及一種高活性花生殼多糖及其制備方法，屬于天然產(chǎn)物制備的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
多糖類物質(zhì)一般是存在生物活體內(nèi)的一種天然物質(zhì)，直接參與生物體的基本代謝過程，對生物體的代謝過程產(chǎn)生積極影響。具有預(yù)防心血管疾病、預(yù)防糖尿病、清除人體有害物質(zhì)、提高人體免疫力等顯著的生理功能?？梢宰鳛轭A(yù)防、減輕癥狀、輔助治療心血管等疾病的功能性食品，也可以作為食品添加劑或營養(yǎng)強(qiáng)化劑廣泛應(yīng)用于食品、保健品以及醫(yī)藥制品中，以補(bǔ)充人體所需的膳食纖維量，增加產(chǎn)品保健功能，改進(jìn)產(chǎn)品風(fēng)味，提高產(chǎn)品品質(zhì)和附加值等?；钚远嗵堑奶崛》椒òɑ瘜W(xué)法、酶法、化學(xué)-酶結(jié)合法、發(fā)酵法、超聲輔助法、微波輔助法等多種方法。
黃酮類化合物是泛指具有15個(gè)碳原子的多元酚化合物，廣泛存在于自然界，具有多種生物活性，在體內(nèi)具有改善微循環(huán)、改變體內(nèi)酶活性、降血脂、降膽固醇、抗自由基、抗氧化、增強(qiáng)免疫功能、抑菌、抗病毒和抗炎癥等多種功能活性。正是因其所具備的多種調(diào)節(jié)人體生理功能和治療人類疾病的作用而使黃酮類物質(zhì)成為目前高端功能性營養(yǎng)化學(xué)品的代表，產(chǎn)品利潤、市場空間遠(yuǎn)高于一般的食品或健康食品。目前，通常采用化學(xué)法合成、植物提取以及運(yùn)用微生物生物合成等方式獲取黃酮類物質(zhì)。
我國是世界上最大的花生生產(chǎn)國和消費(fèi)國，在花生加工利用過程中，每年產(chǎn)生幾百萬噸的花生殼廢棄物，除少部分加工成為粗飼料和可食用菌的培養(yǎng)基外，多數(shù)花生殼作為燃料或成為垃圾，而花生殼約占花生重量的三分之一，含有有65 %-80%的粗纖維素、10%的半纖維素以及其他一些活性成分并未得到有效的開發(fā)利用，資源浪費(fèi)嚴(yán)重。本發(fā)明運(yùn)用生物學(xué)手段結(jié)合農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)將花生殼中的纖維素進(jìn)行改性處理，獲得富含黃酮類化合物的高活性花生殼多糖，所得產(chǎn)品綠色安全，可應(yīng)用于功能食品中，不僅為花生殼資源的高值化利用提供生產(chǎn)依據(jù)，延長花生加工產(chǎn)業(yè)鏈，而且契合人們的消費(fèi)需求，具有重要的應(yīng)用與經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
纖維素酶在分解纖維素時(shí)起生物催化作用，可以將纖維素分解成寡糖或單糖。纖維素酶根據(jù)其催化反應(yīng)功能的不同可分為內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶。內(nèi)切葡聚糖酶隨機(jī)切割纖維素多糖鏈內(nèi)部的無定型區(qū)，產(chǎn)生不同長度的寡糖和新鏈的末端。外切葡聚糖酶作用于這些還原性和非還原性的纖維素多糖鏈的末端，釋放葡萄糖或纖維二糖。研究認(rèn)為纖維素的水解是兩種的酶協(xié)同作用，才能將纖維素徹底的水解。我們發(fā)現(xiàn)商業(yè)化纖維素酶可以使花生殼中纖維素水解獲得活性多糖，但是目前商業(yè)化纖維素酶酶解最適溫度為50-60℃而多糖的最佳提取溫度為60-80℃，為了防止纖維素酶的失效，必須將酶解與提取分為兩步進(jìn)行。因此提取效率低，提取時(shí)間長，耗能低。
本發(fā)明通過對來源于里氏木霉的內(nèi)切葡聚糖酶1EGI和外切纖維素酶1CEL內(nèi)部氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得了耐高溫的纖維素酶復(fù)合酶，將兩種酶的最適溫度提高了10度以上。使用本發(fā)明的纖維素酶復(fù)合酶可以有效解決當(dāng)前多糖制備過程中酶解與提取不能同步進(jìn)行的問題，酶制劑用量少，提取時(shí)間短，提取效率高，多糖活性好，黃酮含量高。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種耐高溫且能高效降解花生殼的復(fù)合酶，其降解產(chǎn)物為富含黃酮的花生多糖。該復(fù)合酶由內(nèi)切葡聚糖酶突變體和外切纖維素酶突變體組成，所述突變是對氨基酸序列分別如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示的來源于里氏木霉的內(nèi)切葡聚糖酶1EGI和外切纖維素酶1CEL內(nèi)部氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，從而提高了兩種突變體所組成的復(fù)合酶的酶解溫度。
所述突變是將內(nèi)切葡聚糖酶1EGI第99位的絲氨酸突變?yōu)楸奖彼幔?41位的天冬氨酸突變?yōu)榱涟彼?，得到突變體1EGIS99FD241L；將外切纖維素酶1CEL第210位的半胱氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔玫酵蛔凅w1CELQ210K。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述內(nèi)切葡聚糖酶突變體1EGIS99FD241L、外切纖維素酶突變體1CELQ210K的氨基酸序列分別如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4所示。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種提高內(nèi)切葡聚糖酶1EGI和外切纖維素酶1CEL高溫下水解花生殼活性的方法，是將氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的內(nèi)切葡聚糖酶蛋白質(zhì)分子內(nèi)部第99位的絲氨酸突變?yōu)楸奖彼?，?41位的天冬氨酸突變?yōu)榱涟彼?，將氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的外切纖維素酶蛋白質(zhì)分子內(nèi)部第210位的半胱氨酸突變?yōu)橘嚢彼帷?/p>
關(guān)于突變體命名：
以“酶分子 親本氨基酸 位點(diǎn) 取代后氨基酸”表示突變體，比如1CELC210K，是指在外切纖維素酶親本氨基酸序列的基礎(chǔ)上將第104位的氨基酸S（絲氨酸，Ser）突變?yōu)榘被酇（丙氨酸，Ala）第210位的半胱氨酸C突變?yōu)橘嚢彼酜。本發(fā)明中，以SEQ ID NO.1所示的序列為內(nèi)切葡聚糖酶親本序列，以SEQ ID NO.2所示的序列為外切纖維素酶親本序列。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種富含黃酮類化合物的活性多糖的制備方法，包括如下制備步驟：
（1）花生殼經(jīng)清洗、烘干、超微粉碎后與水混合，添加由內(nèi)切葡聚糖酶突變體和外切纖維素酶突變體組成的復(fù)合酶，超聲波輔助酶解和提取花生殼中的水溶性多糖和黃酮類化合物；
（2）真空抽濾步驟（1）所得混合物，保留抽濾液，并經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到濃縮液，濃縮液冷卻后，加入預(yù)冷的乙醇，并于4℃條件下放置12 h，離心收集沉淀，同時(shí)保留上清液；
（3）步驟（2）所得沉淀加水復(fù)溶，離心收集上清液，加入預(yù)冷的乙醇，并于4℃條件下放置12 h，離心收集沉淀，經(jīng)真空干燥得到活性多糖；
（4）步驟（2）所得上清液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，選擇截留分子量為20 kDa的超濾膜進(jìn)行超濾，保留透過液，所得透過液溶解步驟（3）所得活性多糖，該混合物經(jīng)冷凍干燥獲得富含黃酮類化合物的活性多糖。
所述內(nèi)切葡聚糖酶突變體與外切纖維素酶突變體復(fù)配的比例為5:4~3:1。
所述超聲波輔助酶解的條件為：按料液比1:10~1:30混合粉碎的花生殼與水，每50g花生殼添加0.5~2.2 g復(fù)合酶，60-80℃下超聲波輔助酶解和提取3-15 min。
本發(fā)明還要求保護(hù)所述富含黃酮類化合物的活性多糖，或者利用生產(chǎn)富含黃酮類化合物的活性多糖的方法生產(chǎn)得到的富含黃酮類化合物的活性多糖在食品、農(nóng)業(yè)或制備藥物方面的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明通過定點(diǎn)突變的方式，分別將內(nèi)切葡糖酶和外切纖維素酶底物結(jié)合位點(diǎn)和酶反應(yīng)中心活性位點(diǎn)中的氨基酸進(jìn)行突變，提高了二者的最適反應(yīng)溫度和高溫環(huán)境的酶活穩(wěn)定性，同時(shí)提高了對花生殼的水解活性；并通過復(fù)配兩種酶蛋白的突變體實(shí)現(xiàn)高效制備花生殼活性多糖，活性多糖得率達(dá)到90%，在同等條件下，比野生型酶蛋白酶解花生殼后的多糖得率提高了70%，比商業(yè)纖維素酶制劑酶解后的多糖得率提高了38.8%。運(yùn)用該復(fù)合酶加工處理花生殼實(shí)現(xiàn)了多糖酶解和提取的同步進(jìn)行，比傳統(tǒng)提取方法減少一個(gè)操作步驟，節(jié)省提取時(shí)間50%以上適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。
本發(fā)明的另一個(gè)有益效果是采用超聲波輔助復(fù)合酶酶解及提取的工藝方法，實(shí)現(xiàn)了高效同步制備活性多糖和黃酮類化合物的目的，并采用乙醇沉淀結(jié)合超濾分離的方法獲得了富含黃酮類化合物的活性多糖，其中黃酮含量高達(dá)18.1mg/g，普通花生多糖中黃酮含量低于4mg/g。所得富含黃酮類化合物的活性多糖具有顯著的抗氧化活性和抑菌活性，陽離子交換能力高、，具有增強(qiáng)免疫功能、抑菌、抗病毒和抗炎癥等多種功能活性，能夠食品、醫(yī)藥、化學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
清洗干燥后的花生殼經(jīng)超微粉碎儀粉碎，得花生殼粉末，與水以1:20的比例混合，每50g花生殼添加0.9 g由內(nèi)切葡聚糖酶突變體與外切纖維素酶突變體組成的復(fù)合酶，內(nèi)切葡聚糖酶突變體與外切纖維素酶突變體的復(fù)配比例為5:2，65℃的條件下超聲波輔助酶解提取10min。所得混合物進(jìn)行真空抽濾，保留抽濾液。抽濾液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到濃縮液；濃縮液冷卻后，加入預(yù)冷的乙醇，并于4℃條件下放置12h，離心收集沉淀，同時(shí)保留上清液。
所得沉淀加水復(fù)溶，離心收集上清液，加入預(yù)冷的乙醇，并于4℃條件下放置12 h，離心收集沉淀，經(jīng)真空干燥得到活性多糖；所得上清液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，選擇截留分子量為20kDa的超濾膜進(jìn)行超濾，保留透過液，所得透過液溶解真空干燥后的活性多糖，該混合物經(jīng)冷凍干燥獲得富含黃酮類化合物的活性多糖。
所得富含黃酮類化合物的活性多糖對NaOH溶液具有明顯的緩沖能力，表明具有陽離子交換能力；經(jīng)液相色譜檢測，活性多糖中木犀草素（黃酮）含量為15.2mg/g；對DPPH自由基和羥自由基清除能力的IC50分別為4.7%和1.1%（g/mL，W/V），即當(dāng)清除50%的DPPH自由基和羥自由基時(shí)，所需活性多糖的濃度分別為4.7%和1.1%；濃度為100 mg/mL的活性多糖溶液與濃度為5 μg/mL的VC溶液的鐵還原力相當(dāng)；對大腸桿菌、尖孢鐮刀菌、金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用。
實(shí)施例2
清洗干燥后的花生殼經(jīng)超微粉碎儀粉碎，得花生殼粉末，與水以1:15的比例混合，每50g花生殼添加0.65 g由內(nèi)切葡聚糖酶突變體與外切纖維素酶突變體組成的復(fù)合酶，內(nèi)切葡聚糖酶突變體與外切纖維素酶突變體的復(fù)配比例為2:1，于溫度為70℃的條件下微波輔助酶解和提取12min。所得混合物進(jìn)行真空抽濾，保留抽濾液。抽濾液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到濃縮液；濃縮液冷卻后，加入預(yù)冷的乙醇，并于4℃條件下放置12 h，離心收集沉淀，同時(shí)保留上清液。
所得沉淀加水復(fù)溶，離心收集上清液，加入預(yù)冷的乙醇，并于4℃條件下放置12 h，離心收集沉淀，經(jīng)真空干燥得到活性多糖；所得上清液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，選擇截留分子量為20kDa的超濾膜進(jìn)行超濾，保留透過液，所得透過液溶解真空干燥后的活性多糖，該混合物經(jīng)冷凍干燥獲得富含黃酮類化合物的活性多糖。
所得富含黃酮類化合物的活性多糖對NaOH溶液具有明顯的緩沖能力，表明具有陽離子交換能力；經(jīng)液相色譜檢測，活性多糖中木犀草素（黃酮）含量為13.8mg/g；對DPPH自由基和羥自由基清除能力的IC50分別為5.2%和2.7%（g/mL，W/V），即當(dāng)清除50%的DPPH自由基和羥自由基時(shí)，所需活性多糖的濃度分別為5.2%和2.7%；濃度為120 mg/mL的活性多糖溶液與濃度為5μg/mL的VC溶液的鐵還原力相當(dāng)；對大腸桿菌、黃曲霉、尖孢鐮刀菌、厚垣孢鐮刀菌具有抑制作用。
實(shí)施例3
清洗干燥后的花生殼經(jīng)超微粉碎儀粉碎，得花生殼粉末，與水以1:30的比例混合，每50g花生殼添加1.5 g由內(nèi)切葡聚糖酶突變體與外切纖維素酶突變體組成的復(fù)合酶，內(nèi)切葡聚糖酶突變體與外切纖維素酶突變體的復(fù)配比例為3:2，于溫度為79℃的條件下微波輔助酶解和提取8min。所得混合物進(jìn)行真空抽濾，保留抽濾液。抽濾液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到濃縮液；濃縮液冷卻后，加入預(yù)冷的乙醇，并于4℃條件下放置12 h，離心收集沉淀，同時(shí)保留上清液。
所得沉淀加水復(fù)溶，離心收集上清液，加入預(yù)冷的乙醇，并于4℃條件下放置12 h，離心收集沉淀，經(jīng)真空干燥得到活性多糖；所得上清液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，選擇截留分子量為20kDa的超濾膜進(jìn)行超濾，保留透過液，所得透過液溶解真空干燥后的活性多糖，該混合物經(jīng)冷凍干燥獲得富含黃酮類化合物的活性多糖。
所得富含黃酮類化合物的活性多糖對NaOH溶液具有明顯的緩沖能力，表明具有陽離子交換能力；經(jīng)液相色譜檢測，活性多糖中木犀草素（黃酮）含量為18.1mg/g；對DPPH自由基和羥自由基清除能力的IC50分別為4.5%和1.8%（g/mL，W/V），即當(dāng)清除50%的DPPH自由基和羥自由基時(shí)，所需活性多糖的濃度分別為4.5%和0.91.8%；濃度為110 mg/mL的活性多糖溶液與濃度為5μg/mL的VC溶液的鐵還原力相當(dāng)；對大腸桿菌、尖孢鐮刀菌、厚垣孢鐮刀菌具有抑制作用。
實(shí)施例4
清洗干燥后的花生殼經(jīng)超微粉碎儀粉碎，得花生殼粉末，與水以1:40的比例混合，每50g花生殼添加2.1 g由內(nèi)切葡聚糖酶突變體與外切纖維素酶突變體組成的復(fù)合酶，內(nèi)切葡聚糖酶突變體與外切纖維素酶突變體的復(fù)配比例為3:2，于溫度為75℃的條件下微波輔助酶解和提取11min。所得混合物進(jìn)行真空抽濾，保留抽濾液。抽濾液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到濃縮液；濃縮液冷卻后，加入預(yù)冷的乙醇，并于4℃條件下放置12 h，離心收集沉淀，同時(shí)保留上清液。
所得沉淀加水復(fù)溶，離心收集上清液，加入預(yù)冷的乙醇，并于4℃條件下放置12 h，離心收集沉淀，經(jīng)真空干燥得到活性多糖；所得上清液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，選擇截留分子量為20kDa的超濾膜進(jìn)行超濾，保留透過液，所得透過液溶解真空干燥后的活性多糖，該混合物經(jīng)冷凍干燥獲得富含黃酮類化合物的活性多糖。
所得富含黃酮類化合物的活性多糖對NaOH溶液具有明顯的緩沖能力，表明具有陽離子交換能力；經(jīng)液相色譜檢測，活性多糖中木犀草素（黃酮）含量為18.8mg/g；對DPPH自由基和羥自由基清除能力的IC50分別為5.5%和2.8%（g/mL，W/V），即當(dāng)清除50%的DPPH自由基和羥自由基時(shí)，所需活性多糖的濃度分別為5.5%和2.8%；濃度為95mg/mL的活性多糖溶液與濃度為5μg/mL的VC溶液的鐵還原力相當(dāng)；對大腸桿菌、尖孢鐮刀菌、厚垣孢鐮刀菌具有抑制作用。
以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到變化或替換，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
SEQUENCE LISTING
<110> 山東省花生研究所
<120> 一種高活性花生殼多糖及其制備方法
<130> 2014
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 371
<212> PRT
<213> 里氏木霉
<400> 1
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275 280 285
Thr Val Val Thr Gln Phe Glu Thr Ser Gly Ala Ile Asn Arg Tyr Tyr
290 295 300
Val Gln Asn Gly Val Thr Phe Gln Gln Pro Asn Ala Glu Leu Gly Ser
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Tyr Ser Gly Asn Glu Leu Asn Asp Asp Tyr Cys Thr Ala Glu Glu Ala
325 330 335
Glu Phe Gly Gly Ser Ser Phe Ser Asp Lys Gly Gly Leu Thr Gln Phe
340 345 350
Lys Lys Ala Thr Ser Gly Gly Met Val Leu Val Met Ser Leu Trp Asp
355 360 365
Asp Tyr Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp Ser Thr Tyr Pro Thr Asn
370 375 380
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Ser Gly Val Pro Ala Gln Val Glu Ser Gln Ser Pro Asn Ala Lys Val
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Ser Gly
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<211> 434
<212> PRT
<213> 里氏木霉
<400> 4
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