本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及發(fā)酵硫酸多粘菌素B用培養(yǎng)基及發(fā)酵生產(chǎn)硫酸多粘菌素B的方法。
背景技術(shù)：
：硫酸多粘菌素B(PolymyxinBsulfate)，又稱硫酸粘桿菌素B，是一種由多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)產(chǎn)生的氨基酸和脂肪組成的堿性瑣環(huán)狀多肽抗生素，幾乎對所有革蘭氏陰性菌均有較強(qiáng)的抑制或殺菌作用,如大腸桿菌、綠膿桿菌、副大腸桿菌、肺炎克雷白桿菌、嗜酸桿菌、百日咳桿菌及痢疾桿菌等,尤其對綠膿桿菌有顯著作用。世界上許多國家己批準(zhǔn)該藥作為飼料添加劑使用。硫酸多粘菌素B還作為藥品使用，臨床上主要用于敏感菌引起的感染及綠膿桿菌引起的泌尿系統(tǒng)感染、腦膜炎、敗血癥、燒傷感染以及皮膚粘膜感染等。硫酸多粘菌素B是一種多組份物質(zhì)，其中B1、B2、B3及B1-1是其主要成份，最新的EP標(biāo)準(zhǔn)及CP標(biāo)準(zhǔn)中均對成品的含量及有關(guān)物質(zhì)作了如下的要求：多年來，我國硫酸多粘菌素B一直依賴進(jìn)口，為了改變現(xiàn)狀，很多學(xué)者不斷對硫酸多粘菌素B的生產(chǎn)方法進(jìn)行摸索，其中包括對培養(yǎng)基的配方和對發(fā)酵條件中控制參數(shù)的優(yōu)化，例如，田東等人在2010年在硫酸多粘菌素B菌種選育與發(fā)酵工藝的研究中報(bào)道了硫酸多粘菌素B的產(chǎn)量顯著提高的方法，該方法解決了硫酸多粘菌素B產(chǎn)量低的問題。而目前，工業(yè)上采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸多粘菌素B，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有關(guān)物質(zhì)(雜質(zhì))也較多，很多雜質(zhì)是主要成份的結(jié)構(gòu)類似物，這些雜質(zhì)在后續(xù)的提取操作過程中很難去除。例如在采用如下發(fā)酵培養(yǎng)基(糊精6g/100ml、葡萄糖2g/100ml、酵母粉0.8g/100ml、磷酸氫二鉀0.015g/100ml、硫酸銨0.3g/100ml、碳酸鈣0.3g/100ml、消泡劑0.04ml/100ml)發(fā)酵生產(chǎn)硫酸多粘菌素B時(shí)，經(jīng)常會出現(xiàn)成品單雜超標(biāo)的情況，該單雜在進(jìn)行高壓液相檢測過程中出峰緊跟在B2的后面，命名為B2P。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，若發(fā)酵液高壓液相檢測過程中B2P的峰面積比例超過1.5％，那么發(fā)酵液經(jīng)提取精制后制得的成品B2P含量就很可能超過3％。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供發(fā)酵硫酸多粘菌素B用培養(yǎng)基及發(fā)酵生產(chǎn)硫酸多粘菌素B的方法，將發(fā)酵液中可能影響成品質(zhì)量的單雜B2P控制到低于1.5％的水平，從而使經(jīng)該發(fā)酵液提取獲得的成品質(zhì)量符合EP8.0及CP2015的標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了發(fā)酵硫酸多粘菌素B用培養(yǎng)基，每100ml培養(yǎng)基含有以下組份：面粉6～12g、高溫淀粉酶0.03～0.06g、棉籽餅粉0.4～2g、玉米漿0.3～1g、磷酸氫二鉀0.01～0.05g、硫酸銨0.2～0.6g、碳酸鈣0.2～0.6g和消泡劑0.02～0.08ml，余量的水；所述玉米漿的質(zhì)量百分含量為40～50％；所述培養(yǎng)基的pH值為6.7～7.4。優(yōu)選的，每100ml培養(yǎng)基含有以下組份：面粉8～11g、高溫淀粉酶0.035～0.5g、棉籽餅粉0.8～1.5g、玉米漿0.4～0.8g、磷酸氫二鉀0.012～0.03g、硫酸銨0.3～0.5g、碳酸鈣0.25～0.5g和消泡劑0.04～0.06ml，余量的水。優(yōu)選的，每100ml培養(yǎng)基含有以下組份：面粉10g、高溫淀粉酶0.04g、棉籽餅粉1g、玉米漿0.5g、磷酸氫二鉀0.015g、硫酸銨0.4g、碳酸鈣0.3g和消泡劑0.05ml，余量的水。本發(fā)明提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)硫酸多粘菌素B的方法，包括以下步驟：1)將產(chǎn)硫酸多粘菌素B菌種種子液接種到所述培養(yǎng)基中，得到接種有產(chǎn)硫酸多粘菌素B菌種的發(fā)酵液；2)將所述步驟1)中得到的發(fā)酵液在26～32℃條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)的條件包括：發(fā)酵液初始pH6.7～7.4，發(fā)酵過程中pH值自然，發(fā)酵液的溶氧量體積濃度為10％～30％。優(yōu)選的，所述步驟2)中發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為28～30℃。優(yōu)選的，所述步驟2)中發(fā)酵液的溶氧量體積濃度為15～25％。優(yōu)選的，所述步驟2)中發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為40～48h。優(yōu)選的，所述步驟1)中硫酸多粘菌素B菌種為多粘類芽孢桿菌Paenibacilluspolymyxa。優(yōu)選的，所述步驟1)中硫酸多粘菌素B菌種種子液的菌體OD600達(dá)到40～70。優(yōu)選的，所述步驟1)中接種量為5～15％。本發(fā)明提供了發(fā)酵硫酸多粘菌素B用培養(yǎng)基，每100ml培養(yǎng)基含有以下組份含量：面粉6～12g、高溫淀粉酶0.03～0.06g、棉籽餅粉0.4～2g、玉米漿0.3～1g、磷酸氫二鉀0.01～0.05g、硫酸銨0.2～0.6g、碳酸鈣0.2～0.6g和消泡劑0.02～0.08ml，余量的水。本發(fā)明提供的發(fā)酵硫酸多粘菌素B用培養(yǎng)基，面粉在高溫淀粉酶的酶解作用下得到酶解產(chǎn)物為微生物發(fā)酵提供碳源；棉籽餅粉為微生物發(fā)酵提供氮源；玉米漿中營養(yǎng)豐富，為微生物同時(shí)提供碳源和氮源；磷酸氫二鉀、硫酸銨和碳酸鈣為微生物發(fā)酵提供無機(jī)鹽。同時(shí)本發(fā)明提供的所述培養(yǎng)基，通過嚴(yán)格控制各組分用量，各組分協(xié)同配合作用，使微生物發(fā)酵得到的目的產(chǎn)物純度高，雜質(zhì)率低，特別是單雜B2P控制到低于1.5％的水平，從而使成品質(zhì)量符合EP8.0及CP2015的標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)硫酸多粘菌素B的方法，包括以下步驟：1)將產(chǎn)硫酸多粘菌素B菌種種子液接種到所述培養(yǎng)基中；2)將所述步驟1)中接種有產(chǎn)硫酸多粘菌素B菌種的培養(yǎng)基在26～32℃，初始pH值6.7～7.4，發(fā)酵過程中pH值自然條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；所述發(fā)酵培養(yǎng)過程培養(yǎng)基的溶氧量的體積濃度為10％～30％。本發(fā)明通過嚴(yán)格控制發(fā)酵過程中發(fā)酵培養(yǎng)的溫度、pH值和發(fā)酵過程的溶氧量來同時(shí)配合發(fā)酵培養(yǎng)基，從而確保硫酸多粘菌素B的生物代謝途徑順利進(jìn)行，有效調(diào)節(jié)雜質(zhì)特別是單雜B2P的產(chǎn)生，有效降低硫酸多粘菌素B產(chǎn)品中雜質(zhì)率。本發(fā)明從發(fā)酵源頭上有效地解決了成品單雜超標(biāo)的問題。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供了發(fā)酵硫酸多粘菌素B用培養(yǎng)基，每100ml培養(yǎng)基含有以下組份：面粉6～12g、高溫淀粉酶0.03～0.06g、棉籽餅粉0.4～2g、玉米漿0.3～1g、磷酸氫二鉀0.01～0.05g、硫酸銨0.2～0.6g、碳酸鈣0.2～0.6g和消泡劑0.02～0.08ml，余量的水；所述玉米漿的質(zhì)量百分含量為40～50％；所述培養(yǎng)基的pH值為6.7～7.4。本發(fā)明提供的發(fā)酵硫酸多粘菌素B用培養(yǎng)基的組分包括面粉。以100ml培養(yǎng)基計(jì)，所述面粉的質(zhì)量為6～12g，優(yōu)選為8～11g，更優(yōu)選為10g。所述面粉的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的面粉來源即可。本發(fā)明提供的發(fā)酵硫酸多粘菌素B用培養(yǎng)基的組分包括高溫淀粉酶。以100ml培養(yǎng)基計(jì)，所述高溫淀粉酶的質(zhì)量為0.03～0.06g，優(yōu)選為0.035～0.05g，更優(yōu)選為0.04g。所述高溫淀粉酶的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的高溫淀粉酶來源即可。本發(fā)明實(shí)施例中，所述高溫淀粉酶購自山東隆科特酶制劑有限公司。本發(fā)明提供的發(fā)酵硫酸多粘菌素B用培養(yǎng)基的組分包括棉籽餅粉。以100ml培養(yǎng)基計(jì)，所述棉籽餅粉的質(zhì)量為0.4～2g，優(yōu)選為0.8～1.5g，更優(yōu)選為1g。所述棉籽餅粉的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的棉籽餅粉來源即可。所述棉籽餅粉的粒度優(yōu)選為60～100目，更優(yōu)選為80目。本發(fā)明提供的發(fā)酵硫酸多粘菌素B用培養(yǎng)基的組分包括玉米漿。以100ml培養(yǎng)基計(jì)，所述玉米漿的質(zhì)量為0.3～1g，優(yōu)選為0.4～0.8g，更優(yōu)選為0.5g。所述玉米漿的質(zhì)量百分含量為40～50％，優(yōu)選為45％。所述玉米漿的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的玉米漿來源即可。本發(fā)明提供的發(fā)酵硫酸多粘菌素B用培養(yǎng)基的組分包括磷酸氫二鉀。以100ml培養(yǎng)基計(jì)，所述磷酸氫二鉀的質(zhì)量為0.01～0.05g，優(yōu)選為0.012～0.03g，更優(yōu)選為0.015g。所述磷酸氫二鉀的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的磷酸氫二鉀來源即可。本發(fā)明提供的發(fā)酵硫酸多粘菌素B用培養(yǎng)基的組分包括硫酸銨。以100ml培養(yǎng)基計(jì)，所述硫酸銨的質(zhì)量為0.2～0.6g，優(yōu)選為0.3～0.5g，更優(yōu)選為0.4g。所述硫酸銨的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的硫酸銨來源即可。本發(fā)明提供的發(fā)酵硫酸多粘菌素B用培養(yǎng)基的組分包括碳酸鈣。以100ml培養(yǎng)基計(jì)，所述碳酸鈣的質(zhì)量為0.2～0.6g，優(yōu)選為0.25～0.5g，更優(yōu)選為0.3g。所述碳酸鈣的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的碳酸鈣來源即可。本發(fā)明提供的發(fā)酵硫酸多粘菌素B用培養(yǎng)基的組分包括消泡劑。以100ml培養(yǎng)基計(jì)，所述消泡劑的體積為0.02～0.08ml，優(yōu)選為0.04～0.06ml，更優(yōu)選為0.05ml。所述消泡劑的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的消泡劑來源即可。本發(fā)明實(shí)施例中，所述消泡劑的種類為聚醚類消泡劑。本發(fā)明提供的發(fā)酵硫酸多粘菌素B用培養(yǎng)基的組分包括余量的水。所述水優(yōu)選為蒸餾水、雙蒸水、純凈水或超純水。所述水的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的水來源即可。本發(fā)明中，所述發(fā)酵硫酸多粘菌素B用培養(yǎng)基的pH值優(yōu)選為初始pH6.7～7.4，發(fā)酵過程中pH值自然，更優(yōu)選初始pH7.0。本發(fā)明中，所述發(fā)酵硫酸多粘菌素B用培養(yǎng)基的制備方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的組合物混料的技術(shù)方案即可。所述培養(yǎng)基制備后，優(yōu)選進(jìn)行滅菌。所述滅菌的方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的滅菌方法即可。本發(fā)明提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)硫酸多粘菌素B的方法，包括以下步驟：1)將產(chǎn)硫酸多粘菌素B菌種種子液接種到上述技術(shù)方案所述培養(yǎng)基中，得到接種有產(chǎn)硫酸多粘菌素B菌種的發(fā)酵液；2)將所述步驟1)中得到的發(fā)酵液在26～32℃條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵期間控制發(fā)酵液的pH值為初始pH值6.7～7.4，發(fā)酵過程中pH值自然，發(fā)酵液的溶氧量體積濃度為10％～30％。本發(fā)明將產(chǎn)硫酸多粘菌素B菌種種子液接種到上述方案的培養(yǎng)基中，得到接種有產(chǎn)硫酸多粘菌素B菌種的發(fā)酵液。本發(fā)明中，所述產(chǎn)硫酸多粘菌素B菌種優(yōu)選為多粘類芽孢桿菌Paenibacilluspolymyxa。所述多粘類芽孢桿菌Paenibacilluspolymyxa的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的Paenibacilluspolymyxa菌株即可。本發(fā)明實(shí)施例中，所述多粘類芽孢桿菌Paenibacilluspolymyxa的來源為本公司自保藏菌株。本發(fā)明中，所述產(chǎn)硫酸多粘菌素B菌種種子液的制備方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的制備方法即可。所述產(chǎn)硫酸多粘菌素B菌種種子液的培養(yǎng)階段為對數(shù)期末期。所述硫酸多粘菌素B菌種種子液的活菌濃度優(yōu)選為選取處于對數(shù)生長期末期的菌體移種，此時(shí)的OD600達(dá)到40～70。所述接種量優(yōu)選為5～15％，更優(yōu)選為10％。本發(fā)明中，所述接種的方法沒有特殊限制采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的接種方案即可。得到接種有產(chǎn)硫酸多粘菌素B菌種的發(fā)酵液，本發(fā)明將所述發(fā)酵液在26～32℃條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵期間控制發(fā)酵液的pH值為初始pH值6.7～7.4，發(fā)酵過程中pH值自然，發(fā)酵液的溶氧量體積濃度為10％～30％。本發(fā)明中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為28～30℃，更優(yōu)選為29℃。本發(fā)明中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為40～48h，更優(yōu)選為45h。本發(fā)明中，所述發(fā)酵液的溶氧量體積濃度優(yōu)選為15～25％，更優(yōu)選為20％。本發(fā)明中，所述接種后發(fā)酵培養(yǎng)控制溶氧量的方法優(yōu)選采用攪拌、通氣、壓力參數(shù)進(jìn)行控制。所述攪拌的速度優(yōu)選為50～200rpm，更優(yōu)選為100rpm。所述通氣量優(yōu)選為1：0.2-1：0.5VVM，更優(yōu)選為1：0.3VVM。所述壓力優(yōu)選為0.04～0.06MPa，更優(yōu)選為0.05MPa。本發(fā)明中，所述發(fā)酵培養(yǎng)過程中溶氧會逐步下降，調(diào)整攪拌、通氣、壓力參數(shù)控制溶氧量。發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行8～12小時(shí)后，溶氧量會逐步下降至30％左右。本發(fā)明中，控制方法優(yōu)選先調(diào)攪拌后調(diào)通氣量最后調(diào)整罐壓的順序?qū)?shù)進(jìn)行調(diào)整。本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，從發(fā)酵液提取硫酸多粘菌素B成品進(jìn)行檢測。所述硫酸多粘菌素B成品的提取方法沒有特殊要求采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的硫酸多粘菌素B成品的提取方案即可。本發(fā)明中，所述檢測方法優(yōu)選采用外標(biāo)法分別進(jìn)行高壓液相檢測。所述高壓液相檢測的方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的檢測方案即可。下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明提供的發(fā)酵硫酸多粘菌素B用培養(yǎng)基及發(fā)酵生產(chǎn)硫酸多粘菌素B的方法進(jìn)行詳細(xì)的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。實(shí)施例1種子液培養(yǎng)方法：將硫酸多粘菌素B斜面培養(yǎng)物用接種鏟挖取約1cm2大小，接入搖瓶種子培養(yǎng)基中，其中搖瓶采用500ml三角瓶，內(nèi)裝70～80ml種子培養(yǎng)基，搖床轉(zhuǎn)速220rpm、29℃條件下培養(yǎng)14～18小時(shí)。種子培養(yǎng)基組成為：面粉8g/100ml、酵母浸出粉0.3g/100ml、磷酸氫二鉀0.015g/100ml、碳酸鈣0.3g/100ml、硫酸銨0.45g/100ml。將硫酸多粘菌素B產(chǎn)生菌Paenibacilluspolymyxa的種子培養(yǎng)物接入含有如下成份的發(fā)酵培養(yǎng)基中：面粉10g/100ml、高溫淀粉酶4g/100ml、棉籽餅粉1g/100ml、玉米漿0.5ml/100ml、磷酸氫二鉀0.015g/100ml、硫酸銨0.4g/100ml、碳酸鈣0.3g/100ml、消泡劑0.05ml/100ml，接種量7％，溫度29℃，溶氧控制20％，培養(yǎng)44小時(shí)后結(jié)束發(fā)酵。多黏菌素B組分高效液相色譜法：色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以硫酸鈉溶液(取4.46g無水硫酸鈉溶解在900ml水中，用稀磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.3后用水稀釋至1000ml)-乙腈(80：20)為流動(dòng)相；柱溫為30℃；檢測波長為215nm。多黏菌素B1峰的保留時(shí)間約為35分鐘，多黏菌素B2峰和多黏菌素B3峰的分離度應(yīng)不小于3.0。測定法取本品50mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加水-乙腈(80：20)溶解并定量稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另精密稱取多黏菌素B標(biāo)準(zhǔn)品50mg，置100ml量瓶中，加水-乙腈(80：20)溶解并定量稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液(a)；精密量取對照溶液(a)1ml，置100ml量瓶中，用水-乙腈(80：20)稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液(b)。精密量取上述三種溶液各2μl分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至最大組分多黏菌素B1峰保留時(shí)間的1.4倍。色譜圖中多黏菌素B2、多黏菌素B3、多黏菌素B1-Ⅰ、多黏菌素B1的相對保留時(shí)間分別約為0.5、0.55.、0.8、1.0。按外標(biāo)法以相應(yīng)峰面積計(jì)算，按干燥品計(jì)，多黏菌素B3的含量不得過6.0％，多黏菌素B1-Ⅰ的含量不得過15.0％，多黏菌素B1，B2，B3和B1-Ⅰ的總含量不得少于80％。發(fā)酵液用稀硫酸溶液調(diào)pH2～5后，離心取上清液，按上述方法進(jìn)行檢測。將發(fā)酵液及提取后的成品用外標(biāo)法分別進(jìn)行高壓液相檢測，結(jié)果各組份及雜質(zhì)的峰面積比例如下表1所示。表1實(shí)施例1中發(fā)酵產(chǎn)物各組份及雜質(zhì)的峰面積比例檢測情況B2P比例％B2比例％B3比例％B1-1比例％B1比例％有效組份總比例％發(fā)酵液1.329.780.4314.9534.4659.62成品2.8917.491.0516.9350.4185.88由表1的結(jié)果可知，成品主要雜質(zhì)B2P含量低于3％，符合EP及CP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有效組份總比例也符合相關(guān)的EP及CP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施例2將硫酸多粘菌素B產(chǎn)生菌Paenibacilluspolymyxa的種子培養(yǎng)物接入含有如下成份的發(fā)酵培養(yǎng)基中：面粉8g/100ml、高溫淀粉酶5g/100ml、棉籽餅粉0.8g/100ml、玉米漿0.8ml/100ml、磷酸氫二鉀0.012g/100ml、硫酸銨0.5g/100ml、碳酸鈣0.25g/100ml、消泡劑0.06ml/100ml，接種量10％，溫度30℃，培養(yǎng)46小時(shí)后結(jié)束發(fā)酵。將發(fā)酵液及提取后的成品用外標(biāo)法分別進(jìn)行高壓液相檢測，結(jié)果各組份及雜質(zhì)的峰面積比例如下表2所示。表2實(shí)施例2中發(fā)酵產(chǎn)物各組份及雜質(zhì)的峰面積比例檢測情況B2P比例％B2比例％B3比例％B1-1比例％B1比例％有效組份總比例％發(fā)酵液1.439.270.7513.033.756.72成品2.9615.380.6619.6151.2486.89由表2的結(jié)果可知，成品主要雜質(zhì)B2P含量低于3％，符合EP及CP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有效組份總比例也符合相關(guān)的EP及CP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施例3將硫酸多粘菌素B產(chǎn)生菌Paenibacilluspolymyxa的種子培養(yǎng)物接入含有如下成份的發(fā)酵培養(yǎng)基中：面粉11g/100ml、高溫淀粉酶3.5g/100ml、棉籽餅粉1.5g/100ml、玉米漿0.4ml/100ml、磷酸氫二鉀0.03g/100ml、硫酸銨0.3g/100ml、碳酸鈣0.5g/100ml、消泡劑0.04ml/100ml，接種量15％，溫度28℃，培養(yǎng)42小時(shí)后結(jié)束發(fā)酵。將發(fā)酵液及提取后的成品用外標(biāo)法分別進(jìn)行高壓液相檢測，結(jié)果各組份及雜質(zhì)的峰面積比例如下表3所示。表3實(shí)施例3中發(fā)酵產(chǎn)物各組份及雜質(zhì)的峰面積比例檢測情況B2P比例％B2比例％B3比例％B1-1比例％B1比例％有效組份總比例％發(fā)酵液1.358.780.878.0431.3749.06成品2.2517.300.7913.9354.2386.25由表3的結(jié)果可知，成品主要雜質(zhì)B2P含量低于3％，符合EP及CP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有效組份總比例也符合相關(guān)的EP及CP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施例4將硫酸多粘菌素B產(chǎn)生菌Paenibacilluspolymyxa的種子培養(yǎng)物接入含有如下成份的發(fā)酵培養(yǎng)基中：面粉6g/100ml、高溫淀粉酶6g/100ml、棉籽餅粉0.4g/100ml、玉米漿1ml/100ml、磷酸氫二鉀0.01g/100ml、硫酸銨0.6g/100ml、碳酸鈣0.2g/100ml、消泡劑0.08ml/100ml，接種量15％，溫度28℃，培養(yǎng)42小時(shí)后結(jié)束發(fā)酵。將發(fā)酵液及提取后的成品用外標(biāo)法分別進(jìn)行高壓液相檢測，結(jié)果各組份及雜質(zhì)的峰面積比例如下表4所示。表4實(shí)施例4中發(fā)酵產(chǎn)物各組份及雜質(zhì)的峰面積比例檢測情況B2P比例％B2比例％B3比例％B1-1比例％B1比例％有效組份總比例％發(fā)酵液1.769.430.9910.0234.1756.37成品2.8819.541.2911.1252.7887.61由表4的結(jié)果可知，成品主要雜質(zhì)B2P含量低于3％，符合EP及CP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有效組份總比例也符合相關(guān)的EP及CP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施例5將硫酸多粘菌素B產(chǎn)生菌Paenibacilluspolymyxa的種子培養(yǎng)物接入含有如下成份的發(fā)酵培養(yǎng)基中：面粉12g/100ml、高溫淀粉酶3g/100ml、棉籽餅粉2g/100ml、玉米漿0.3ml/100ml、磷酸氫二鉀0.05g/100ml、硫酸銨0.2g/100ml、碳酸鈣0.6g/100ml、消泡劑0.02ml/100ml，接種量15％，溫度28℃，培養(yǎng)42小時(shí)后結(jié)束發(fā)酵。將發(fā)酵液及提取后的成品用外標(biāo)法分別進(jìn)行高壓液相檢測，結(jié)果各組份及雜質(zhì)的峰面積比例如下表5所示。表5實(shí)施例5中發(fā)酵產(chǎn)物各組份及雜質(zhì)的峰面積比例檢測情況B2P比例％B2比例％B3比例％B1-1比例％B1比例％有效組份總比例％發(fā)酵液1.699.781.4710.0936.1159.14成品2.8316.322.0712.4551.1684.83由表5的結(jié)果可知，成品主要雜質(zhì)B2P含量低于3％，符合EP及CP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有效組份總比例也符合相關(guān)的EP及CP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。為了說明本發(fā)明的有益效果，采用與實(shí)施例相同的菌種及原有配方進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)的情況見對比例。對比例1將硫酸多粘菌素B產(chǎn)生菌Paenibacilluspolymyxa的種子培養(yǎng)物接入含有如下成份的發(fā)酵培養(yǎng)基中：糊精6g/100ml、葡萄糖2g/100ml、酵母粉0.8g/100ml、磷酸氫二鉀0.015g/100ml、硫酸銨0.3g/100ml、碳酸鈣0.3g/100ml、消泡劑0.04ml/100ml，接種量7％，溫度29℃，培養(yǎng)44小時(shí)后結(jié)束發(fā)酵，將發(fā)酵液及提取后的成品用外標(biāo)法分別進(jìn)行高壓液相檢測，結(jié)果各組份及雜質(zhì)的峰面積比例如下表6所示。表6對比例1中發(fā)酵產(chǎn)物各組份及雜質(zhì)的峰面積比例檢測情況B2P比例％B2比例％B3比例％B1-1比例％B1比例％有效組份總比例％發(fā)酵液3.5616.11.0510.236.3963.74成品5.0515.601.6314.1251.7883.13由表的結(jié)果可知成品有效組份符合EP及CP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但主要雜質(zhì)B2P超過3％的規(guī)定，不符合相關(guān)的EP及CP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。對比例2將硫酸多粘菌素B產(chǎn)生菌Paenibacilluspolymyxa的種子培養(yǎng)物接入含有如下成份的發(fā)酵培養(yǎng)基中：糊精6g/100ml、葡萄糖2g/100ml、酵母粉0.8g/100ml、磷酸氫二鉀0.015g/100ml、硫酸銨0.3g/100ml、碳酸鈣0.3g/100ml、消泡劑0.04ml/100ml，接種量10％，溫度30℃，培養(yǎng)46小時(shí)后結(jié)束發(fā)酵，將發(fā)酵液及提取后的成品用外標(biāo)法分別進(jìn)行高壓液相檢測，結(jié)果各組份及雜質(zhì)的峰面積比例如下表6所示。表6對比例2中發(fā)酵產(chǎn)物各組份及雜質(zhì)的峰面積比例檢測情況B2P比例％B2比例％B3比例％B1-1比例％B1比例％有效組份總比例％發(fā)酵液3.7911.11.459.7833.5155.84成品5.0016.101.1215.1851.8784.27由上表的結(jié)果可知成品有效組份符合EP及CP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但主要雜質(zhì)B2P超過3％的規(guī)定，不符合相關(guān)的EP及CP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。對比例3將硫酸多粘菌素B產(chǎn)生菌Paenibacilluspolymyxa的種子培養(yǎng)物接入含有如下成份的發(fā)酵培養(yǎng)基中：糊精6g/100ml、葡萄糖2g/100ml、酵母粉0.8g/100ml、磷酸氫二鉀0.015g/100ml、硫酸銨0.3g/100ml、碳酸鈣0.3g/100ml、消泡劑0.04ml/100ml，接種量15％，溫度28℃，培養(yǎng)42小時(shí)后結(jié)束發(fā)酵，將發(fā)酵液及提取后的成品用外標(biāo)法分別進(jìn)行高壓液相檢測，結(jié)果各組份及雜質(zhì)的峰面積比例如下表7所示。表7對比例3發(fā)酵產(chǎn)物各組份及雜質(zhì)的峰面積比例檢測情況B2P比例％B2比例％B3比例％B1-1比例％B1比例％有效組份總比例％發(fā)酵液4.1112.51.798.1136.7559.15成品5.4117.542.1111.5350.3081.48由上表的結(jié)果可知成品有效組份不符合EP及CP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，主要雜質(zhì)B2P超過3％的規(guī)定，也不符合相關(guān)的EP及CP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。對比例4將硫酸多粘菌素B產(chǎn)生菌Paenibacilluspolymyxa的種子培養(yǎng)物接入含有如下成份的發(fā)酵培養(yǎng)基中：葡萄糖10g/100ml、蔗糖4g/100ml、胰蛋白胨2g/ml、磷酸氫二鉀0.015g/100ml、硫酸銨0.4g/100ml、碳酸鈣0.3g/100ml、消泡劑0.05ml/100ml，接種量7％，溫度29℃，溶氧控制20％，培養(yǎng)44小時(shí)后結(jié)束發(fā)酵。將發(fā)酵液及提取后的成品用外標(biāo)法分別進(jìn)行高壓液相檢測，結(jié)果各組份及雜質(zhì)的峰面積比例如下表8所示。表8對比例4發(fā)酵產(chǎn)物各組份及雜質(zhì)的峰面積比例檢測情況B2P比例％B2比例％B3比例％B1-1比例％B1比例％有效組份總比例％發(fā)酵液3.7311.751.559.4933.4359.95成品4.9113.862.4413.0148.2882.50由上表的結(jié)果可知成品有效組份不符合EP及CP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，主要雜質(zhì)B2P超過3％的規(guī)定，也不符合相關(guān)的EP及CP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。對比例5將硫酸多粘菌素B產(chǎn)生菌Paenibacilluspolymyxa的種子培養(yǎng)物接入含有如下成份的發(fā)酵培養(yǎng)基中：面粉10g/100ml、高溫淀粉酶9g/100ml、棉籽餅粉4g/100ml、玉米漿0.1ml/100ml、磷酸氫二鉀0.05g/100ml、硫酸銨0.2g/100ml、碳酸鈣0.6g/100ml、消泡劑0.05ml/100ml，接種量7％，溫度29℃，溶氧控制20％，培養(yǎng)44小時(shí)后結(jié)束發(fā)酵。將發(fā)酵液及提取后的成品用外標(biāo)法分別進(jìn)行高壓液相檢測，結(jié)果各組份及雜質(zhì)的峰面積比例如下表9所示。表9對比例6發(fā)酵產(chǎn)物各組份及雜質(zhì)的峰面積比例檢測情況B2P比例％B2比例％B3比例％B1-1比例％B1比例％有效組份總比例％發(fā)酵液3.4613.151.728.5130.3657.2成品4.8315.832.6712.7445.9081.97由上表的結(jié)果可知成品有效組份不符合EP及CP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，主要雜質(zhì)B2P超過3％的規(guī)定，也不符合相關(guān)的EP及CP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。由實(shí)施例1～5的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明提供的發(fā)酵硫酸多粘菌素B用培養(yǎng)基能夠有效發(fā)酵生產(chǎn)目的產(chǎn)物-發(fā)酵硫酸多粘菌素B，并且各組分的含量以及單一B2P沒有超過3％的規(guī)定，符合相關(guān)的EP及CP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。由對比例1～3與實(shí)施例1～5相比，通過改變產(chǎn)硫酸多粘菌素B菌種發(fā)酵過程中碳源和氮源的種類，能夠有效避免發(fā)酵過程中雜質(zhì)B2P的產(chǎn)生，有利于提高產(chǎn)品的純度，從而提高產(chǎn)品的品質(zhì)。由對比例4與實(shí)施例1相比，對比例4通過選擇微生物發(fā)酵培養(yǎng)過程中常用的碳源和氮源組合，并且其他組分相同的情況下，發(fā)酵產(chǎn)物檢測結(jié)果顯示，對比例4的方案不能克服雜質(zhì)B2P的產(chǎn)生問題。由此可見，本申請的技術(shù)方案中各組分并不是單獨(dú)發(fā)揮碳源和氮源的作用，而是各組分協(xié)同配合，從而確保硫酸多粘菌素B的生物代謝途徑順利進(jìn)行，同時(shí)有效抑制雜質(zhì)B2P的產(chǎn)生。由對比例5與實(shí)施例1～5相比，對比例5的技術(shù)方案中選擇與本發(fā)明相同的原料組分，但是原料含量與實(shí)施例1～5的方案中各組分的用量具有較大差異，對比例5的方案不能克服雜質(zhì)B2P的產(chǎn)生問題。由此可見，本申請的技術(shù)方案中各組分是在一定配比的條件下發(fā)揮協(xié)同配合作用，有效抑制雜質(zhì)B2P的產(chǎn)生，實(shí)現(xiàn)硫酸多粘菌素B的生物代謝途徑順利進(jìn)行。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3