本發(fā)明屬于生物催化劑生物合成技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖苷及其制備方法和在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide)為爵床科植物穿心蓮中的二萜內(nèi)酯類化合物，是中藥穿心蓮的主要有效成分之一(N.Pholphana；N.Rangkadilok；S.Thongnest；S.Ruchirawat；M.Ruchirawat；J.Satayavivad；Determination and variation of three active diterpenoids in Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees,Phytochem.Anal.15(2004)365–371.)。穿心蓮內(nèi)酯主要存在于葉子中(大約0.5～1.0％)，具有較好的抗菌、抗炎、抗病毒等功能。由于穿心蓮內(nèi)酯在水中的最大溶解度僅為60μg/mL，同時也難溶于大多數(shù)有機溶劑中，因而限制其應(yīng)用及結(jié)構(gòu)修飾。糖基化修飾是增強水溶性和藥理活性的重要方法(F.J.Li；H.Maag；T.Alfredson；Prodrugs of nucleoside analogues for improvedoral absorption and tissue targeting；J.Pharm.Sci.97(2008)1109–1134.)。穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖苷也存在于穿心蓮中，但含量極低。通過對穿心蓮內(nèi)酯結(jié)構(gòu)進行糖基化改造，是尋找水溶性好、活性更強的穿心蓮內(nèi)酯衍生物的有效方法。

目前，主要有兩種方法合成穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖苷，一種是用化學(xué)方法(王秀萍；穿心蓮內(nèi)酯糖苷衍生物的合成；中國藥師,2005,8(6):406-408)。這種方法合成穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖苷，能耗大、立體和區(qū)域選擇性差、易產(chǎn)生副產(chǎn)物；并且由于反應(yīng)過程中使用大量有毒有機溶劑和催化劑，一方面會帶來較嚴(yán)重的環(huán)境污染問題，另一方面產(chǎn)物中常殘留一些有毒的化學(xué)物質(zhì)而存在安全隱患。另外一種是生物合成法制備穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖苷(Ying Qiao；Yao Huang；Fang Feng；Zhi-Gang Chen；Efficient enzymatic synthesis and antibacterial activity of andrographolide glycoside；Process Biochemistry 51(2016)675–680)，這種方法在目前文獻報到了穿心蓮內(nèi)酯-19-O-半乳糖苷的合成，產(chǎn)率較低(大約25.5～67.5％)。

OleD是鏈霉菌屬的一種糖基轉(zhuǎn)移酶，其天然底物是竹桃霉素、紅霉素和泰樂菌素，能夠?qū)⑵咸烟菑腢DP-葡萄糖轉(zhuǎn)移到這些大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的去氧糖胺結(jié)構(gòu)的2-OH位置，將其糖基化，該過程在鏈霉菌的自我保護機制中發(fā)揮著重要作用(Williams,Gavin J；Zhang,Changsheng；Thorson,Jon S；Expanding the promiscuity of a natural-product glycosyltransferase by directed evolution；Nat Chem Biol,2007,3,657-662)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖苷的制備方法。

本發(fā)明另一目的在于提供上述方法制備的穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖苷。

本發(fā)明再一目的在于提供上述穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖苷在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述方案實現(xiàn)：

一種穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖苷的制備方法，具體為緩沖溶液體系中，以尿苷-5'-二磷酸葡萄糖二鈉鹽(UDPG)為糖基供體，運用糖基轉(zhuǎn)移酶OleD的突變體A242V/S132F/P67T(ASP)催化穿心蓮內(nèi)酯進行糖基化反應(yīng)，得到穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖苷。

所用穿心蓮內(nèi)酯與糖基轉(zhuǎn)移酶OleD的突變體ASP的質(zhì)量比為1.75:0.1～1.75:6，優(yōu)選為1.75:2。

所用穿心蓮內(nèi)酯與尿苷-5'-二磷酸葡萄糖二鈉鹽(UDPG)的摩爾比為0.05:1～0.8:1，優(yōu)選為0.1:1。

所述緩沖溶液體系優(yōu)選為50mM pH 6.0～10.0的Tris-HCl的緩沖體系，更優(yōu)選為50mM pH 8.0的Tris-HCl的緩沖體系。

所述緩沖溶液體系中還含有5mM的MgCl₂。

所述糖基化反應(yīng)優(yōu)選在20～45℃下進行，更優(yōu)選為37℃。

所述反應(yīng)的時間優(yōu)選為8～24h，更優(yōu)選為16h。

所述反應(yīng)后體系，通過添加等體積的甲醇終止反應(yīng)，再離心、過大孔樹脂柱洗脫得到純化的穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖苷。

所述離心優(yōu)選為在12000rpm離心15min，得到上清液。

所述洗脫先用純水洗脫去掉水溶性雜質(zhì)，再用50％的乙醇洗脫，得到產(chǎn)物。

本發(fā)明還提供上述方法制備的穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖苷。

本發(fā)明的穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖苷可應(yīng)用于制備抗炎藥物中，其經(jīng)過糖基化處理，大大增加了藥物的水溶性，改善了藥物原有的抗炎活性。

所述的藥物含有本發(fā)明的穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖苷、其藥用鹽及其溶劑化物中的至少一種。

所述的藥物含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，所述的賦形劑包括稀釋劑、濕潤劑、潤滑劑、填充劑和防腐劑中的至少一種。

所述的藥物采用本領(lǐng)域的常規(guī)方法制備成各種劑型，包括膠囊、丸劑、片劑、口服液、顆粒劑、酊劑的劑型及注射液。

本發(fā)明首次采用糖基轉(zhuǎn)移酶對穿心蓮內(nèi)酯進行糖基化修飾，該反應(yīng)體系中反應(yīng)條件溫和、能耗少、產(chǎn)率高、立體和區(qū)域選擇性好、副產(chǎn)品少以及產(chǎn)物易分離等優(yōu)點。同時由于采用生物酶為催化劑，反應(yīng)過程中沒有類似化學(xué)合成中的諸多基團保護-脫保護的步驟，保證了酶催化穿心蓮內(nèi)酯糖基化過程對環(huán)境友好，更綠色環(huán)保，產(chǎn)品質(zhì)量更放心。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及有益效果：

1、本發(fā)明采用糖基轉(zhuǎn)移酶催化穿心蓮內(nèi)酯葡萄糖苷化合物的生物轉(zhuǎn)化，可實現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯葡萄糖苷化合物的產(chǎn)率高達99％，相比其他的酶催化，大大提高了目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率。

2、本發(fā)明方法將穿心蓮內(nèi)酯進行糖基化后，大大的增加了藥物的水溶性，并且增強了藥物原有的抗炎的活性，具有良好的藥用前景。

3、本發(fā)明方法采用糖基轉(zhuǎn)移酶法合成穿心蓮內(nèi)酯葡萄糖苷，酶催化反應(yīng)具有高度選擇性，因而產(chǎn)物穿心蓮內(nèi)酯糖苷的純度高，純化容易；克服了傳統(tǒng)化學(xué)方法的立體和區(qū)域選擇性低，因而副產(chǎn)物多的缺點。

4、由于本發(fā)明方法采用糖基轉(zhuǎn)移酶作為催化劑，克服了傳統(tǒng)化學(xué)方法使用大量有毒有害的金屬鹽作為催化劑的缺點，同時反應(yīng)過程中沒有類似化學(xué)合成中的諸多基團保護-脫保護的步驟，時間短，且使得糖基化過程更綠色環(huán)保。

附圖說明

圖1為穿心蓮內(nèi)酯葡萄糖苷的生物合成路線圖。

圖2為穿心蓮內(nèi)酯及其葡萄糖苷的HPLC分析圖。

圖3為穿心蓮內(nèi)酯葡萄糖苷的質(zhì)譜圖。

圖4為穿心蓮內(nèi)酯葡萄糖苷的¹H NMR核磁圖譜。

圖5為穿心蓮內(nèi)酯葡萄糖苷的¹³C NMR核磁圖譜。

圖6為穿心蓮內(nèi)酯葡萄糖苷的轉(zhuǎn)化率隨酶濃度變化。

圖7為穿心蓮內(nèi)酯葡萄糖苷的轉(zhuǎn)化率隨糖供體量變化。

圖8為穿心蓮內(nèi)酯葡萄糖苷的轉(zhuǎn)化率隨pH值變化。

圖9為誘導(dǎo)產(chǎn)生NO的活性測定。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

下列實施例中使用的試劑均可從商業(yè)渠道獲得。

實施例1

把1.75g的穿心蓮內(nèi)酯、25mM的尿苷-5'-二磷酸葡萄糖鈉鹽(UDPG)、2g來源于大腸桿菌BL21(DE3)PLysS表達的ASP(A242V/S132F/P67T)糖基轉(zhuǎn)移酶(制備方法參照文獻Williams,Gavin J；Zhang,Changsheng；Thorson,Jon S；Expanding the promiscuity of a natural-product glycosyltransferase by directed evolution；Nat Chem Biol,2007,3,657-662)和5mM MgCl₂、50mM Tris-HCl(pH 8.0)混合后，置于37℃的培養(yǎng)箱中，反應(yīng)16h，12000rpm離心15min，取上清濃縮將混合物上大孔樹脂柱，先用純水洗脫2個保留體積，去掉水溶性雜質(zhì)，再用50％的乙醇洗脫2個保留體積，50％的乙醇洗脫液濃縮后，即得到穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖苷(產(chǎn)率80％)，生物合成路線圖見圖1。

所得產(chǎn)物的表征圖見圖2～圖5，根據(jù)高分辨HRESI-MS(negative)給出分子準(zhǔn)分子離子峰m/z：[M+COOH]^-為557.3828，結(jié)合¹H NMR、¹³C NMR確定分子式為C₂₆H₄₀O₁₀。在¹³C NMR譜圖中給出了26個碳信號，其中，在δ172.5處為16位酯羰基碳信號，δ109.6處為17位環(huán)外亞甲基碳信號，δ109.6為19位碳信號，相比19位碳未成苷的穿心蓮內(nèi)酯，該化學(xué)位移向低場移動了8.8ppm。在¹H NMR譜圖中19位H(5.39,m,1H；4.11,dd,J＝4.8,1H)說明糖連在19位上。將碳氫譜圖數(shù)據(jù)與文獻(王秀萍；穿心蓮內(nèi)酯糖苷衍生物的合成；中國藥師2005,8(6):406-408)相比基本一致，因此鑒定出化合物為穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖苷。

¹H NMR(400MHz,CD3OD):δ_H 0.75(3H,s,H-20),5.39(1H,m,H-19β)；4.11,(1H,dd,J＝4.8,8Hz,H-19α),1.22(s,3H,H-18),4.88(s,1H,H-17β)；4.69(s,1H,H-17α),4.43(dd,J＝8,4.8Hz,1H,H-15β)；4.39(dd,J＝8,6.0Hz,1H,H-15α),6.88(t,J＝6.4,3H,H-12),3.38(t,J＝12,2H,H-11),4.45(s,1H,H’-1),4.36(s,1H,H’-3),3.65(m,1H),3.34-3.41(m,2H),3.15-3.23(m,2H),4.36(bs,1H)。

¹³C NMR(400MHz,CD₃OD)δ_C如下：38.1(C1)，29.0(C2),78.3(C3)，43.6(C4)，56.4(C5)，25.3(C6)，39.0(C7)，148.8(C8)，57.5(C9)，40.1(C10)，26.3(C11)，151.8(C12)，126.8(C13)，65.0(C14)，74.9(C15)，172.5(C16)，109.6(C17)，23.4(C18)，72.0(C19)，15.7(C20)，60.3(C6′)，71.7(C4′)，73.7(C2′)，81.0(C3′)，71.9(C5′)，102.0(C1′)。

實施例2

把1.75g的穿心蓮內(nèi)酯、50mM的尿苷-5'-二磷酸葡萄糖鈉鹽(UDPG)、2g來源于大腸桿菌BL21(DE3)PLysS表達的ASP(A242V/S132F/P67T)糖基轉(zhuǎn)移酶和5mM MgCl₂、50mM Tris-HCl(pH 8.0)混合后，置于37℃的培養(yǎng)箱中，反應(yīng)16h，12000rpm離心15min，取上清濃縮將混合物上大孔樹脂柱，先用純水洗脫2個保留體積，去掉水溶性雜質(zhì)，再用50％的乙醇洗脫2個保留體積，50％的乙醇洗脫液濃縮后，即得到穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖苷(產(chǎn)率99％)。

實施例3

把1.75g的穿心蓮內(nèi)酯、25mM的尿苷-5'-二磷酸葡萄糖鈉鹽(UDPG)、2g來源于大腸桿菌BL21(DE3)PLysS表達的ASP(A242V/S132F/P67T)糖基轉(zhuǎn)移酶和5mM MgCl₂、50mM Tris-HCl(pH 6.0)混合后，置于37℃的培養(yǎng)箱中，反應(yīng)16h后，12000rpm離心15min，取上清濃縮將混合物上大孔樹脂柱，先用純水洗脫2個保留體積，去掉水溶性雜質(zhì)，再用50％的乙醇洗脫2個保留體積，50％的乙醇洗脫液濃縮后，得到白色粉末，即為穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖(產(chǎn)率37％)。

實施例4

把1.75g的穿心蓮內(nèi)酯、25mM的尿苷-5'-二磷酸葡萄糖鈉鹽(UDPG)、0.1～6g來源于大腸桿菌BL21(DE3)PLysS表達的ASP(A242V/S132F/P67T)糖基轉(zhuǎn)移酶和5mM MgCl₂、50mM Tris-HCl(pH 8.0)混合后，置于37℃的培養(yǎng)箱中，反應(yīng)16h，12000rpm離心15min，取上清濃縮將混合物上大孔樹脂柱，先用純水洗脫2個保留體積，去掉水溶性雜質(zhì)，再用50％的乙醇洗脫2個保留體積，50％的乙醇洗脫液濃縮后，即得到穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖苷，結(jié)果見圖6。如圖所示，隨著糖基轉(zhuǎn)移酶的增加其轉(zhuǎn)化率不斷增加，超過4g時，則反而有所下降。

實施例5

把1.75g的穿心蓮內(nèi)酯、穿心蓮內(nèi)酯與尿苷-5'-二磷酸葡萄糖鈉鹽(UDPG)的物質(zhì)的量之比為0.05:1～0.8:1、2g來源于大腸桿菌BL21(DE3)PLysS表達的ASP(A242V/S132F/P67T)糖基轉(zhuǎn)移酶和5mM MgCl₂、50mM Tris-HCl(pH 8.0)混合后，置于37℃的培養(yǎng)箱中，反應(yīng)16h，12000rpm離心15min，取上清濃縮將混合物上大孔樹脂柱，先用純水洗脫2個保留體積，去掉水溶性雜質(zhì)，再用50％的乙醇洗脫2個保留體積，50％的乙醇洗脫液濃縮后，即得到穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖苷，結(jié)果見圖7。在物質(zhì)的量之比為0.05:1～0.1:1中其轉(zhuǎn)化率隨著比例增加而增加，當(dāng)物質(zhì)的量之比0.1:1～0.8:1其轉(zhuǎn)化率隨著比例增加而有所降低。

實施例6

把1.75g的穿心蓮內(nèi)酯、25mM尿苷-5'-二磷酸葡萄糖鈉鹽(UDPG)、2g來源于大腸桿菌BL21(DE3)PLysS表達的ASP(A242V/S132F/P67T)糖基轉(zhuǎn)移酶和5mM MgCl₂、50mM Tris-HCl(pH分別為6.0～10.0)混合后，置于37℃的培養(yǎng)箱中，反應(yīng)16h，12000rpm離心15min，取上清濃縮將混合物上大孔樹脂柱，先用純水洗脫2個保留體積，去掉水溶性雜質(zhì)，再用50％的乙醇洗脫2個保留體積，50％的乙醇洗脫液濃縮后，即得到穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖苷，結(jié)果見圖8。在pH值為6～8時其轉(zhuǎn)化率隨著pH值增大而增加，當(dāng)pH值為8～10時其轉(zhuǎn)化率隨著pH值增大而有所降低。

實施例7：LPS(脂多糖)誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO的測定

NO在自然界只短暫存在數(shù)秒鐘，體液或溶液中主要以其穩(wěn)定的產(chǎn)物亞硝酸鹽(nitrite)與硝酸鹽(nitrate)存在，根據(jù)文獻方法(Chiou W.F.；Lin J.J.；Chen C.F.Andrographolide suppress the expression of inducible nitric oxide synthase in macrophage and restores the vasoconstriction in rat aorta treated with lipopolysaccharide.British J.Pharm.；1998,125:327-334)，該方法的主要原理是：利用由1％4-氨基苯磺酰胺(sulfanilamide)、5％磷酸(phosphoric acid)和0.1％鹽酸萘乙二胺(naphthylethylenediamine dihydrochloride)組成的Griess試劑與nitrite結(jié)合，呈現(xiàn)紅棕色產(chǎn)物，在吸光值540nm處檢測，以溶液中nitrite的含量代表NO的生成量。具體實驗方法如下：

(1)亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定：將亞硝酸鈉溶于去離子水并配置為2μM的儲存液，每次實驗前用DMEM(Dulbec改良的Eagle培養(yǎng)基)培養(yǎng)液依次將亞硝酸鈉儲存液稀釋為50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM的亞硝酸標(biāo)準(zhǔn)液，并加入Griess試劑(1％sulfanilamide,5％phosphoricacid,0.1％naphthylethylenediamine dihydrochloride)于波長540nm測定nitrite的含量，相關(guān)系數(shù)大于0.95時接受標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用上述標(biāo)準(zhǔn)曲線可計算出對應(yīng)樣品的nitrite含量。

(2)將RAW264.7細胞(購買自Thermo scientific)接種于96孔板中，每孔0.5mL，密度為4×10⁴個細胞/孔，于37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)24h。

(3)更換新鮮培養(yǎng)液，藥物處理組加入相應(yīng)的不同濃度的待測化合物(每個樣品以其安全濃度作為最高濃度，共設(shè)六個濃度)，空白及LPS對照組加入等體積的DMSO(0.5μL/孔)，與細胞共培養(yǎng)2h后除空白對照組外各孔均加入100ng/mL的LPS，24h后吸出培養(yǎng)液100μL加入96孔培養(yǎng)板中，各孔再加入等量的Griess試劑，輕搖培養(yǎng)板并混勻。

(4)利用ELISA讀取儀于波長540nm下測量培養(yǎng)液中nitrite含量，以反映細胞產(chǎn)生NO的情況。以亞硝酸鈉為標(biāo)準(zhǔn)液取得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各孔nitrite的含量，將藥物處理組與LPS對照組所得結(jié)果進行比較，可判斷化合物對LPS誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生的影響。

(5)經(jīng)過計算得知，穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖的抗炎活性IC₅₀值為4.47+0.08μM比相同條件下穿心蓮內(nèi)酯的抗炎活性IC₅₀值(6.13+0.10μM)高(見圖9)。

實施例8：穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖在制備抗炎藥中的應(yīng)用

穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖在制備抗炎藥中普通片劑中的應(yīng)用

取穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖50g、淀粉190g混合均勻，用70％乙醇制成軟材，制粒，烘干。加入1g硬脂酸鎂混合均勻，壓片，制成2000片，包薄膜衣，每片含穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖25mg。

實施例9：穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖在制備抗炎藥膠囊劑中的應(yīng)用

取穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖100g、乳糖200g、淀粉130g、硬脂酸鎂20g，加65％乙醇制成軟材，干燥、過篩、制粒、裝入膠囊，制成2000粒。每粒膠囊含穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖50mg。

實施例10：穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖在制備抗炎藥注射液劑中的應(yīng)用

穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖100g，丙二醇5000g，研磨，再加適量注射用水稀釋，混勻，然后加入重量百分比為0.9％的氯化鈉，溶解后再加入注射用水至100L，調(diào)pH值7.0～7.4，濾過、灌封、滅菌、即得1萬支注射用針劑，每支含穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖10mg。

實施例11：穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖在制備抗炎藥脂質(zhì)體納米粒中的應(yīng)用

穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖100g，大豆卵磷脂50g，溶于2500mL乙醇中，另取硬脂酸20g和大豆卵磷脂脂50g溶于2500mL環(huán)己烷中，混合攪拌均勻。于37℃恒溫水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，使藥物及輔料在燒瓶壁形成均勻脂質(zhì)薄膜，于真空干燥器中放置過夜，除盡有機溶劑；另取聚乙二醇單硬脂酸酯375g，攪拌溶解在17.5L水中，加入上述薄膜中，超聲30min，定溶至25L，得淡黃色透明溶液。將此溶液冷凍干燥可得凍干粉，用球磨機研磨24h，制得粒徑均勻的納米粒，混勻并分裝。每袋含穿心蓮內(nèi)酯-19-O-葡萄糖10mg。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。