本發(fā)明屬于枯草芽孢桿菌T-500脂肽類抗生素的發(fā)酵工藝技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種對枯草芽孢桿菌T-500高產(chǎn)脂肽抗生素的搖瓶發(fā)酵工藝優(yōu)化的方法。

背景技術(shù)：

芽孢桿菌是一種目前研究較為深入的生防菌資源，它具有發(fā)達(dá)的分泌系統(tǒng)和較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性，對多種植物病原菌具有拮抗性，且無毒、無污染、無殘留，不易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，目前已被廣泛應(yīng)用于生物農(nóng)藥的創(chuàng)制和開發(fā)。國內(nèi)外已推廣應(yīng)用的活性菌株有Bacillus amyloliquefaciens FZB42，Bacillus subtilis GB03和Bacillus pumilus GB34等；陳志誼等開發(fā)的微生物殺菌劑“紋曲寧”，其活性成分為枯草芽孢桿菌Bs916，該制劑對水稻紋枯病、稻曲病具有良好防效。

已有生防機(jī)理研究表明，芽孢桿菌非核糖體合成途徑產(chǎn)生的脂肽類抗生素，如Surfactin(表面活性素)，Iturin(伊枯草菌素)和Fengycin(泛革素)等，具有直接殺死或抑制病原物生長、與病原菌進(jìn)行營養(yǎng)和空間的競爭及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性的作用。目前，芽胞桿菌發(fā)酵的常用培養(yǎng)基主要成分有小麥粉、玉米糊、黃豆餅粉、魚粉和酵母膏(粉)以及一些微量元素(陽離子)，然而，針對不同的菌株，培養(yǎng)基組分的不同對發(fā)酵液菌含量和抗菌物質(zhì)合成影響較大。張榮勝等對解淀粉芽胞桿菌Lx-11進(jìn)行了發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，使得發(fā)酵菌含量和抑菌效果分別提高了180％和30％。章四平等通過對B.subtilis NJ-18發(fā)酵優(yōu)化研究，發(fā)現(xiàn)豆粕對菌含量和抑菌活性影響最大。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)T-500是本研究室前期分離獲得的一株對水稻紋枯病和稻瘟病均有良好防治效果的生防菌。該菌株已經(jīng)在中國普通微生物保藏中心進(jìn)行保藏，并申請了名稱為“一株枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用”、申請?zhí)枮?01210328716.5的發(fā)明專利，且已經(jīng)獲得授權(quán)。此外，本研究室基于T-500為活性成分進(jìn)行了枯草芽孢桿菌干懸浮粉劑的研制，申請了名稱為“一種枯草芽孢桿菌的干懸浮劑及其制備方法”、申請?zhí)枮?01310301606.4的發(fā)明專利，并獲得授權(quán)。為了進(jìn)一步提高枯草芽孢桿菌T-500干懸浮粉劑中脂肽類抗生素的含量，本研究通過比較已報道的10種常用于芽孢桿菌發(fā)酵的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件對T-500菌株產(chǎn)脂肽類抗生素的影響，篩選影響T-500的脂肽類抗生素的關(guān)鍵培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件因子；并通過響應(yīng)面法對發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為該菌株工業(yè)化生產(chǎn)和獲得高產(chǎn)脂肽類抗菌物質(zhì)提供技術(shù)支撐和理論指導(dǎo)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有枯草芽孢桿菌T-500干懸浮粉劑中脂肽類抗生素的含量較低的不足，而提供一種對枯草芽孢桿菌T-500高產(chǎn)脂肽抗生素的搖瓶發(fā)酵工藝優(yōu)化的方法，本發(fā)明為枯草芽孢桿菌T-500菌株工業(yè)化生產(chǎn)和獲得高產(chǎn)脂肽類抗菌物質(zhì)提供技術(shù)支撐和理論指導(dǎo)。

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

對枯草芽孢桿菌T-500高產(chǎn)脂肽抗生素的搖瓶發(fā)酵工藝優(yōu)化的方法，包含如下步驟：

步驟一：制備枯草芽孢桿菌T-500的發(fā)酵種子液，并從發(fā)酵過程中得到的發(fā)酵液中提取脂肽類抗生素，脂肽類抗生素的提取具體為：將枯草芽孢桿菌T-500發(fā)酵過程中得到的發(fā)酵液進(jìn)行離心，上清液進(jìn)行酸沉淀，調(diào)節(jié)pH，過夜，離心收集沉淀，晾干后，加入色譜級甲醇溶解沉淀，并調(diào)節(jié)pH，溶解后離心獲得甲醇溶液，后用細(xì)菌濾器過濾，得到無菌甲醇濾液；

步驟二：將發(fā)酵種子液接種于各培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，分別測定菌含量和脂肽類抗生素的抑菌效果，比較各培養(yǎng)基對T-500菌株發(fā)酵液菌含量和產(chǎn)脂肽類抗生素的影響，篩選較佳培養(yǎng)基成分；

步驟三：培養(yǎng)基成分的Plackett-Burman設(shè)計：以步驟二中篩選出的較佳培養(yǎng)基的組成為基礎(chǔ)，并結(jié)合裝液量、轉(zhuǎn)速，進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計，篩選出培養(yǎng)基成分關(guān)鍵因素；培養(yǎng)條件的Plackett-Burman設(shè)計：采用Plackett-Burman設(shè)計，從培養(yǎng)條件中篩選對菌株T-500脂肽類抗生素抑菌效果具有顯著影響的因子；

步驟四：(a)：對培養(yǎng)基成分的Plackett-Burman實驗結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得主要因子編碼方程，并對該回歸模型進(jìn)行方差分析，對培養(yǎng)基成分關(guān)鍵因素進(jìn)行進(jìn)一步篩選；(b)：對培養(yǎng)條件的Plackett-Burman設(shè)計結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得主要因子編碼方程，并對該回歸模型進(jìn)行方差分析，對培養(yǎng)條件關(guān)鍵因素進(jìn)行進(jìn)一步篩選；

步驟五：(a)：根據(jù)培養(yǎng)基成分的Plackett-Burman實驗結(jié)果，綜合選出三個對脂肽類抗生素抑菌效果均產(chǎn)生顯著影響的培養(yǎng)基成分關(guān)鍵因素，并確定中心點(diǎn)數(shù)值，然后利用三因素五水平中心組合實驗進(jìn)一步篩選最佳培養(yǎng)基成分組合，共設(shè)20組實驗，每組三個重復(fù)；(b)根據(jù)培養(yǎng)條件的Plackett-Burman實驗結(jié)果，選出三個對脂肽類抗生素抑菌效果產(chǎn)生顯著性影響的因素，并確定中心點(diǎn)數(shù)值，然后利用三因素五水平中心組合實驗進(jìn)一步篩選最佳培養(yǎng)基條件組合，共設(shè)20組實驗，每組三個重復(fù)；

步驟六：(a)：選取三個由步驟四(a)獲得的培養(yǎng)基成分關(guān)鍵因素，按照步驟四(a)進(jìn)行三因素五水平的中心組合設(shè)計，對中心組合實驗所得抑菌帶寬度的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得主要因子編碼方程，由該方程求得三因素的最優(yōu)值，得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基；(b)：選取三個由步驟四(b)獲得的培養(yǎng)條件關(guān)鍵因素，按照步驟四(b)進(jìn)行三因素五水平的中心組合設(shè)計，對中心組合實驗所得抑菌帶寬度的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得主要因子編碼方程，由該方程求得三因素的最優(yōu)值，得到最佳培養(yǎng)條件。

更進(jìn)一步地，步驟一中所述的制備枯草芽孢桿菌T-500的發(fā)酵種子液具體為：將低溫保存的枯草芽孢桿菌T-500菌種劃線入LB固體培養(yǎng)基平板，靜置培養(yǎng)后，挑取單胞接種于YPG液體中，震蕩培養(yǎng)，即得發(fā)酵種子液；步驟一中所述酸沉淀時的pH＝2.0，過夜時的溫度為4℃。

更進(jìn)一步地，步驟一中所述低溫為-70℃，所述靜置培養(yǎng)為于28℃靜置培養(yǎng)24h，所述震蕩培養(yǎng)為于28℃、180rpm下震蕩培養(yǎng)12h。

更進(jìn)一步地，步驟二中所述培養(yǎng)基為如表1所示的1號、2號、3號、4號、5號、6號、7號、8號、9號或10號培養(yǎng)基。

更進(jìn)一步地，步驟二中所述測定菌含量具體為：采取10倍梯度倍比稀釋涂平板法，將發(fā)酵種子液稀釋后涂平板，培養(yǎng)后記錄每皿菌落數(shù)，計算發(fā)酵液菌含量；所述抗菌活性測定具體為：采用平板對峙法，將水稻紋枯病菌在PDA平板活化，待長滿平板后，制作菌餅，并轉(zhuǎn)接入PDA平板中央，以菌餅為中心，向十字方位距離中心處打孔，后將無菌甲醇濾液滴入，待晾干后，培養(yǎng)，測量抑菌帶寬。

更進(jìn)一步地，步驟二中將發(fā)酵液稀釋至10^-8～10^-7CFU/mL后涂布平板，于28℃下培養(yǎng)16h后記錄每皿菌落數(shù)，計算發(fā)酵液菌含量；所述抗菌活性測定具體為：采用平板對峙法，將水稻紋枯病菌在PDA平板活化，待長滿平板后，用打孔器制作5mm的菌餅，并轉(zhuǎn)接入PDA平板中央，以菌餅為中心，向十字方位距離中心2.5cm處打孔器打孔(5mm)，后將50μL無菌甲醇提取濾液滴入，待晾干后，28℃培養(yǎng)，2-3d測量抑菌帶寬。

更進(jìn)一步地，步驟三中所述培養(yǎng)條件為溫度、轉(zhuǎn)速、裝液量、接種量及發(fā)酵時間，步驟三中所述較佳培養(yǎng)基成分為小麥粉(5～10g/L)、黃豆餅粉(10～20g/L)、玉米糊(5～10g/L)、蛋白胨(2.5～10g/L)、酵母粉(1.25～5g/L)、氯化鈉(1～5g/L)及陽離子，步驟三中所述Plackett-Burman設(shè)計中，每因素取2水平，每組實驗3次重復(fù)。

更進(jìn)一步地，步驟四(a)中所述主要因子編碼方程為γ＝8.54-0.017A-1.07B-0.21C-0.76D-0.32E-0.12F+0.30G-0.85H+0.21I，公式中γ為抑菌圈寬度的預(yù)測值；步驟四(b)中所述主要因子編碼方程為γ＝8.83-0.057A-0.17B+0.33C-0.44D-0.66E，公式中γ為抑菌圈寬度的預(yù)測值。

更進(jìn)一步地，步驟六(a)所述主要因子編碼方程為：γ＝9.90-0.60A+0.58B-0.033C+0.21AB-0.29AC-0.29BC--0.94A²-0.61B²-0.41C²，R²＝0.9610，校正R²＝0.9276，公式中γ為抑菌圈寬度的預(yù)測值；步驟六(b)所述主要因子編碼方程為：γ＝10.95+0.65A-0.13B-0.51C-0.45AB+0.80AC+0.55BC-0.89A²-0.53B²-0.53C²，R²＝0.9635，校正R²＝0.9306，公式中γ為抑菌圈寬度的預(yù)測值。

更進(jìn)一步地，步驟六(a)中所述最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為黃豆餅粉7.00g/L，蛋白胨4.92g/L，酵母粉1.90g/L，小麥粉5.00g/L，玉米糊5.00g/L，NaCl1.00g/L，MgSO₄0.20g/L，MnSO₄5.0mg/L，F(xiàn)eSO₄0.5mg/L；步驟六(b)所述最佳培養(yǎng)條件為：裝液量：105mL/500mL三角瓶，接種量：0.87％，發(fā)酵時間：41.35h，溫度28℃，轉(zhuǎn)速：180rpm。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明通過比較菌株T-500在不同培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵產(chǎn)脂肽類物質(zhì)的抑菌差異，篩選出對T-500菌株產(chǎn)脂肽類物質(zhì)影響較大的培養(yǎng)基組成，再通過Plackett-Burman設(shè)計和響應(yīng)面實驗，優(yōu)化了T-500搖瓶發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基成分，隨后又利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)條件。與初始篩選T-500最佳培養(yǎng)基組成成分時表現(xiàn)最好的3號培養(yǎng)基相比，發(fā)酵工藝優(yōu)化后的T-500發(fā)酵產(chǎn)生的脂肽類抗生素對水稻紋枯病的抑菌帶寬提高了20.4％，發(fā)酵菌含量也提高了62.9％。本發(fā)明為枯草芽孢桿菌T-500菌株工業(yè)化生產(chǎn)和獲得高產(chǎn)脂肽類抗菌物質(zhì)提供了技術(shù)支撐和理論指導(dǎo)。

附圖說明

圖1為不同培養(yǎng)基對T-500菌株發(fā)酵液含菌量的影響圖；

圖2為不同培養(yǎng)基對T-500菌株產(chǎn)脂肽類抗物質(zhì)抑菌能力的影響圖；

圖3為黃豆餅粉和蛋白胨(a)、黃豆餅粉和酵母粉(b)、蛋白胨和酵母粉(c)對T-500菌株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)脂肽類抗生素抑菌效果的影響的響應(yīng)曲面三維圖；

圖4為裝液量和接種量(a)、裝液量和發(fā)酵時間(b)、接種量和發(fā)酵時間(c)對T-500菌株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)脂肽類抗生素抑菌效果的影響的響應(yīng)曲面三維圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。

實施例

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)T-500和水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)RH-2由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所水稻病害與生物防治研究室保存。

枯草芽孢桿菌T-500常規(guī)活化采用LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g)，發(fā)酵種子液用常用培養(yǎng)基YPG(胰蛋白胨5.0g/L，酵母膏5.0g/L，葡萄糖5.0g/L)準(zhǔn)備。水稻紋枯病菌RH-2用PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200.0g/L，葡萄糖20.0g/L，瓊脂15.0g/L)活化培養(yǎng)。本研究10種常用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基詳見表1。

表1培養(yǎng)基的種類與組成

發(fā)酵種子液的制備：挑取-70℃冰箱保存的T-500菌種劃線入LB固體平板，28℃靜置培養(yǎng)24h后，挑取單胞接種于含有20mL YPG的100mL三角瓶中，28℃、180rpm震蕩培養(yǎng)12h，即為發(fā)酵種子液。

酵液菌含量和抑菌活性的測定：發(fā)酵液菌含量：采取10倍梯度倍比稀釋涂平板法，將發(fā)酵液稀釋至10^-8～10^-7CFU/mL，然后取0.1mL均勻涂布LB平板，28℃培養(yǎng)16h后記錄每皿菌落數(shù)，計算發(fā)酵液菌含量。

脂肽類抗生素的提取：將T-500發(fā)酵過程中得到的發(fā)酵液于6000rpm離心15min，上清液用HCl沉淀，調(diào)pH到2.0，4℃過夜，10000rpm離心5min，收集沉淀，晾干后，按照1/10體積發(fā)酵液的量加入色譜級甲醇溶解沉淀，并調(diào)pH到7.0，室溫溶解24h，離心獲得甲醇溶液，隨后用細(xì)菌濾器(φ＝0.22μm)過濾，得到無菌濾液，用于抗菌活性測定。

抑菌活性的測定：采用平板對峙法，將水稻紋枯病菌在PDA平板活化，待長滿平板后，用打孔器制作5mm的菌餅，并轉(zhuǎn)接入PDA平板中央，以菌餅為中心，向十字方位距離中心2.5cm處打孔器打孔(5mm)，隨后將50μL無菌甲醇提取濾液滴入，待晾干后，28℃培養(yǎng)，2-3d測量抑菌帶寬。

發(fā)酵工藝的優(yōu)化：

培養(yǎng)基的篩選：在含100mL培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，接種1％的種子液，于28℃、180r/min培養(yǎng)，48h后分別測定菌含量和脂肽類抗生素的抑菌效果，比較表1中各培養(yǎng)基對T-500菌株發(fā)酵液菌含量和產(chǎn)脂肽類抗生素的影響，篩選最佳培養(yǎng)基成分。

培養(yǎng)基組分關(guān)鍵因子篩選：根據(jù)實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)2號、3號和5號培養(yǎng)基發(fā)酵的T-500含菌量較高；3號和5號培養(yǎng)基發(fā)酵液產(chǎn)生的抑菌效果最好。為此，以2號、3號和5號培養(yǎng)基組成為基礎(chǔ)，采用design-expert軟件進(jìn)行Plackett-Burman搖瓶發(fā)酵實驗設(shè)計，從A：小麥粉(5～10g/L)，B：黃豆餅粉(10～20g/L)，C：玉米糊(5～10g/L)，D：蛋白胨(2.5～10g/L)，E：酵母粉(1.25～5g/L)，F(xiàn)：氯化鈉(1～5g/L)，G：陽離子(51.37～205.5mg/L，將MgSO4，MnSO4和FeSO4作為整體進(jìn)行等比例改變)，H：裝液量(80～120mL/500mL三角瓶)和I：轉(zhuǎn)速(150～180rpm)9個因素中篩選關(guān)鍵因子。試驗中每因素取2水平：即高水平“1”(范圍區(qū)間最大值)和低水平“-1”(范圍區(qū)間最小值)，每組實驗3次重復(fù)。

培養(yǎng)條件關(guān)鍵因子篩選：采用Plackett-Burman設(shè)計從A：溫度(25～30℃)，B：轉(zhuǎn)速(120～180r.min-1)，C：裝液量(80～120mL/500mL三角瓶)，D：接種量(1％～3％)，E：發(fā)酵時間(48～72h)等5個因素中篩選對菌株T-500脂肽類抗生素抑菌能力具有顯著影響的因子。試驗中每因素取2水平：即高水平“1”和低水平“-1”，每組實驗3次重復(fù)。

中心組合實驗(CCD)響應(yīng)曲面法試驗設(shè)計：

培養(yǎng)基關(guān)鍵因子中心組合實驗：根據(jù)培養(yǎng)基成分的Plackett-Burman實驗結(jié)果，綜合選出三個對發(fā)酵菌含量和脂肽類抗生素抑菌效果均產(chǎn)生顯著影響的培養(yǎng)基成分關(guān)鍵因素(黃豆餅粉、蛋白胨和酵母粉)，并確定中心點(diǎn)數(shù)值。然后利用中心組合實驗進(jìn)行三因素實驗，根據(jù)其設(shè)計原理，得到的軸向點(diǎn)a值為1.68179，角點(diǎn)的值為1，得到“-1.68179，-1，0，1，1.68179”五水平，然后根據(jù)不同的水平設(shè)計實驗，共設(shè)20組實驗，每組三個重復(fù)(表2)。

表2關(guān)鍵培養(yǎng)基成分中心組合實驗設(shè)計各因素水平

培養(yǎng)條件關(guān)鍵因子中心組合實驗：根據(jù)培養(yǎng)條件的Plackett-Burman實驗結(jié)果，選出三個對脂肽類抗生素抑菌效果產(chǎn)生顯著性影響的因素(裝液量、接種量、發(fā)酵時間)，并確定中心點(diǎn)數(shù)值。然后利用中心組合實驗進(jìn)行三因素實驗，根據(jù)其設(shè)計原理，得到的軸向點(diǎn)a值為1.68179，角點(diǎn)的值為1，得到“-1.68179，-1，0，1，1.68179”五水平，然后根據(jù)不同的水平設(shè)計實驗，共設(shè)20組實驗，每組三個重復(fù)(表3)。

表3關(guān)鍵培養(yǎng)條件中心組合實驗設(shè)計各因素水平

該研究中的Plackett-Burman試驗、中心組合實驗及響應(yīng)面分析均利用Design-expert.v.8.0.6.1軟件進(jìn)行設(shè)計和分析。

T-500發(fā)酵最佳培養(yǎng)基組成成分篩選：圖1顯示，不同基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基對T-500發(fā)酵菌含量和產(chǎn)生脂肽類抗生素的抑制水稻紋枯病菌的影響。在這10種培養(yǎng)基中，T-500菌株在培養(yǎng)基3、5和2號中生長較好，尤其是3號培養(yǎng)基，菌含量達(dá)4.55×10⁹CFU/mL。不同培養(yǎng)基對T-500產(chǎn)生脂肽類抗生素的抑菌效果也有顯著影響，其中，3號和5號培養(yǎng)基抑菌帶寬最大，分別為9.33和9.13mm?；谏鲜雠囵B(yǎng)基的效果，初步篩選認(rèn)為：2、3和5號培養(yǎng)基中的組分是影響T-500發(fā)酵菌含量和抑菌效果的主要成分，下一步進(jìn)行培養(yǎng)基成分的Plackett-Burman關(guān)鍵因素篩選。

Plackett-Burman篩選培養(yǎng)基關(guān)鍵因素：9因素2水平的Plackett-Burman實驗設(shè)計及實驗結(jié)果見表4。對表4的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，所得主要因子編碼方程為：γ＝8.54-0.017A-1.07B-0.21C-0.76D-0.32E-0.12F+0.30G-0.85H+0.21I，校正R²＝0.9798，公式中γ為抑菌圈寬度的預(yù)測值。由校正系數(shù)可知γ的變化中97.98％能被回歸方程解釋。Design-Expert對回歸模型的方差分析顯示(表5)，首先，回歸模型是顯著的(P＝0.0164)；此外，黃豆餅粉(B)、蛋白胨(D)、酵母粉(E)和裝液量(H)對T-500菌株產(chǎn)脂肽類抗生素的抑紋枯菌作用有顯著性影響(P＜0.05)，而小麥粉(A)、玉米糊(C)、NaCl(F)、陽離子(G)和轉(zhuǎn)速(I)對T-500菌株的抑菌效果沒有顯著影響。在下一步的中心組合實驗設(shè)計中主要以培養(yǎng)基成分(黃豆餅粉、蛋白胨、酵母粉)作為研究對象進(jìn)行優(yōu)化，培養(yǎng)條件因素將在后續(xù)中繼續(xù)深入篩選和優(yōu)化。

表4培養(yǎng)基成分部分因子Plackett-Burman試驗設(shè)計及試驗結(jié)果

表5培養(yǎng)基成分部分因子Plackett-Burman試驗設(shè)計的方差分析

培養(yǎng)基關(guān)鍵因素中心組合設(shè)計實驗及響應(yīng)面分析

根據(jù)上述的實驗結(jié)果，獲得培養(yǎng)基成分的三個關(guān)鍵因素(黃豆餅粉、蛋白胨、酵母粉)，然后進(jìn)行三因素五水平的中心組合設(shè)計(表2)，進(jìn)一步優(yōu)化影響T-500搖瓶發(fā)酵脂肽類抗生素抑制紋枯病菌的培養(yǎng)基成分最優(yōu)組合。對中心組合實驗所得抑菌帶寬度的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，獲得主要因子編碼方程為：γ＝9.90-0.60A+0.58B-0.033C+0.21AB-0.29AC-0.29BC--0.94A²-0.61B²-0.41C²，R²＝0.9610，校正R²＝0.9276，公式中γ為抑菌圈寬度的預(yù)測值?；貧w方程的方差分析顯示(表6)，模型的P值小于0.0001，表明該模型正確，T-500產(chǎn)生的抑菌帶寬度實際測定值與方程預(yù)測值存在顯著相關(guān)性。該模型變異系數(shù)CV為3.95％，小于10％，屬于弱變異，這進(jìn)一步表明實驗數(shù)據(jù)的可靠性。缺失擬合項值(表示回歸方程未能擬合的部分)為2.05(P＞0.05)，說明該回歸方程的失擬不顯著，被認(rèn)為所建立的回歸方程擬合度高。以上結(jié)果表明該模型可以用于描述發(fā)酵培養(yǎng)基成分對T-500菌株所產(chǎn)生脂肽類抗生素的抑菌效果的影響。

表6培養(yǎng)基關(guān)鍵因素中心組合實驗(CCD)回歸方程方差分析

圖3a至3c為A(黃豆餅粉)、B(蛋白胨)和C(酵母粉)三因素對T-500菌株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)脂肽類抗生素抑菌效果的影響的響應(yīng)曲面三維圖。圖3a、3b和3c都有凸起的最高點(diǎn)，可以確定三個變量的優(yōu)化值范圍。根據(jù)上述得到的二階多元方程求得三因素的最優(yōu)值，分別是黃豆餅粉7.00g/L、蛋白胨為4.92g/L、酵母粉為1.90g/L，在此條件下，脂肽類抗生素的抑制紋枯病菌的抑菌帶寬達(dá)10.11mm。基于此，我們得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：黃豆餅粉7.00g/L，蛋白胨4.92g/L，酵母粉1.90g/L，小麥粉5.00g/L，玉米糊5.00g/L，NaCl1.00g/L，MgSO₄0.20g/L，MnSO₄5.0mg/L，F(xiàn)eSO₄0.5mg/L。

Plackett-Burman篩選培養(yǎng)條件關(guān)鍵因素：培養(yǎng)條件的5個因素2水平的Plackett-Burman實驗設(shè)計及實驗結(jié)果見表7。對表7的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，所得主要因子編碼方程為：γ＝8.83-0.057A-0.17B+0.33C-0.44D-0.66E，公式中γ為抑菌圈寬度的預(yù)測值。由校正系數(shù)可知γ的變化中87.25％能被回歸方程解釋?；貧w方程的方差分析顯示該回歸模型的P值＜0.05，表明模型是正確的。此外，裝液量(C)、接種量(D)和發(fā)酵時間(E)對T-500菌株產(chǎn)脂肽類抗生素的抑紋枯菌作用有顯著性影響(P＜0.05)，而溫度(A)和轉(zhuǎn)速(B)對T-500菌株的抑菌作用沒有顯著影響。我們繼續(xù)利用中心組合實驗設(shè)計(CCD)進(jìn)一步優(yōu)化裝液量、接種量和發(fā)酵時間的最優(yōu)組合。

表7培養(yǎng)條件部分因子Plackett-Burman試驗設(shè)計及試驗結(jié)果

表8培養(yǎng)條件部分因子Plackett-Burman試驗設(shè)計的方差分析

培養(yǎng)條件關(guān)鍵因素中心組合設(shè)計實驗及響應(yīng)面分析：根據(jù)上述實驗結(jié)果，獲得培養(yǎng)條件的三個關(guān)鍵因素(裝液量、接種量、發(fā)酵時間)，然后進(jìn)行三因素五水平的中心組合設(shè)計(表3)，進(jìn)一步優(yōu)化影響T-500搖瓶發(fā)酵脂肽類抗生素抑制紋枯菌的培養(yǎng)條件最優(yōu)組合。對中心組合實驗所得抑菌帶寬度的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，獲得主要因子編碼方程為：γ＝10.95+0.65A-0.13B-0.51C-0.45AB+0.80AC+0.55BC-0.89A²-0.53B²-0.53C²，R²＝0.9635，校正R²＝0.9306，公式中γ為抑菌圈寬度的預(yù)測值?；貧w方程的方差分析顯示(表9)，模型的P值小于0.0001，表明該模型正確。該模型的變異系數(shù)CV為3.80％，小于10％，屬于弱變異，這進(jìn)一步表明實驗數(shù)據(jù)的可靠性。缺失擬合項值(表示回歸方程未能擬合的部分)為3.33(P＞0.05)，說明所建立的回歸方程擬合度高。以上分析表明，該發(fā)酵培養(yǎng)條件的回歸模型可以用于描述發(fā)酵培養(yǎng)條件對T-500菌株所產(chǎn)生脂肽類抗生素的抑菌效果的影響。

表9培養(yǎng)條件關(guān)鍵因素中心組合實驗回歸方程方差分析

圖4a至4c為A(裝液量)、B(接種量)和C(發(fā)酵時間)三因素對T-500菌株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)脂肽類抗生素抑菌效果的影響的響應(yīng)曲面三維圖。圖4a、4b和4c顯示三因素兩兩交互都有凸起的最高點(diǎn)，因此可以確定三個變量的優(yōu)化值范圍。根據(jù)2.5得到的二階多元方程求得三因素的最優(yōu)值，分別是裝液量105mL/500mL三角瓶、接種量為0.87％、發(fā)酵時間為41.35h，在此條件下，脂肽類抗生素的抑制紋枯菌的抑菌帶寬達(dá)到11.20mm?；诖?，我們得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為：裝液量：105mL/500mL三角瓶，接種量：0.87％，發(fā)酵時間：41.35h，溫度28℃，轉(zhuǎn)速：180rpm。

發(fā)酵優(yōu)化工藝的實驗驗證：基于本研究篩選的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方(黃豆餅粉7.00g/L，蛋白4.92g/L，酵母粉1.90g/L，小麥粉5.00g/L，玉米糊5.00g/L，NaCl1.00g/L，MgSO₄0.20g/L，MnSO₄5.0mg/L，F(xiàn)eSO₄0.5mg/L)和最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件下(裝液量105mL/500mL三角瓶，接種量0.87％，發(fā)酵時間41.35h，溫度28℃，轉(zhuǎn)速180rpm)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)實驗，菌株T-500發(fā)酵產(chǎn)生的脂肽類抗生素抑制水稻紋枯病菌的帶寬為11.23±0.15mm，與預(yù)測值11.20mm無顯著性差異，發(fā)酵菌含量為7.41±1.18×10⁹CFU/mL。與初始篩選T-500最佳培養(yǎng)基組成成分時表現(xiàn)最好的3號培養(yǎng)基相比，發(fā)酵工藝優(yōu)化后的T-500發(fā)酵產(chǎn)生的脂肽類抗生素對水稻紋枯病的抑菌帶寬提高了20.4％，發(fā)酵菌含量也提高了62.9％。

分泌抗菌物質(zhì)是生防芽孢桿菌的重要生防機(jī)制之一，脂肽類抗生素是芽孢桿菌的主要抗菌活性成分，它不僅具有拮抗作用，且可影響生物膜的形成從而影響生防菌的定殖能力，還可以作為激發(fā)子引起植物的誘導(dǎo)抗病性，因此，提高脂肽類物質(zhì)的產(chǎn)量對增強(qiáng)生防芽孢桿菌的防效具有重要意義。發(fā)酵是生防微生物產(chǎn)業(yè)化過程中的重要環(huán)節(jié)，Plackett-Burman(PB)試驗設(shè)計方法和響應(yīng)面分析法(RSM)被廣泛應(yīng)用于微生物發(fā)酵工藝的篩選和優(yōu)化。劉京蘭等利用PB和中心組合試驗法優(yōu)化了解淀粉芽孢桿菌CC09菌株合成Iturin A條件，優(yōu)化后，CC09合成iturinA的產(chǎn)量達(dá)501mg/L，較優(yōu)化前的138mg/L提高了4.2倍。Sen等采用響應(yīng)曲面法(response surface methodology)分別對影響surfactin產(chǎn)量的關(guān)鍵培養(yǎng)基組分、發(fā)酵條件以及接種液菌齡和接種量進(jìn)行了優(yōu)化研究。方傳記等用PB試驗設(shè)計對影響B(tài).amyloliquefaciens ES-2-4脂肽類抗菌物質(zhì)13個因子進(jìn)行篩選，并優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基成分，優(yōu)化后，脂肽類抗菌物質(zhì)粗提物的產(chǎn)量高達(dá)6.76g/L，較優(yōu)化前增加了39.7％。

本發(fā)明通過比較菌株T-500在不同培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵產(chǎn)脂肽類物質(zhì)的抑菌差異，篩選出對T-500菌株產(chǎn)脂肽類物質(zhì)影響較大的培養(yǎng)基組成，再通過Plackett-Burman設(shè)計和響應(yīng)面實驗，優(yōu)化了T-500搖瓶發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基成分，隨后又利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)條件。與初始篩選T-500最佳培養(yǎng)基組成成分時表現(xiàn)最好的3號培養(yǎng)基相比，發(fā)酵工藝優(yōu)化后的T-500發(fā)酵產(chǎn)生的脂肽類抗生素對水稻紋枯病的抑菌帶寬提高了20.4％，發(fā)酵菌含量也提高了62.9％。

本發(fā)明只是在搖瓶中對枯草芽孢桿菌T-500的發(fā)酵培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進(jìn)行了篩選優(yōu)化，并提供了優(yōu)化方法，尚需進(jìn)一步小試、中試完善發(fā)酵工藝，以期為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供可靠的理論參數(shù)。

本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。