本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒定甜櫻桃啤酒花矮化類病抗性的方法。

背景技術(shù)：

啤酒花矮化類病毒 (Hop stunt viroid，HSVd)屬于馬鈴薯紡錘塊莖類病毒科(Pospiviroidae)，是啤酒花矮化類病毒屬 (Hostnviroid)的唯一成員。其寄主范圍非常廣泛，包括啤酒花、黃瓜、葡萄、柑橘、梨、桃、李、杏和扁桃等。其中葡萄和杏在感染HSVd后不表現(xiàn)癥狀，而啤酒花、桃、李和柑橘被感染后則會引發(fā)嚴(yán)重的病害，如啤酒花矮化、李和桃斑果病、柑橘矮化和裂皮病等。

類病毒內(nèi)及類病毒間的重組現(xiàn)已被認(rèn)為對類病毒的起源進(jìn)化具有重要意義且與類病毒致病性密切有關(guān)，而類病毒侵染性克隆技術(shù)是研究類病毒與寄主互作分子機制的有效手段。構(gòu)建類病毒侵染性克隆已成為國際上開展類病毒生物學(xué)活性、序列變異、致病機理等相關(guān)研究的重要實驗手段，因此構(gòu)建啤酒花矮化類病毒侵染性克隆，將對深入研究該類病毒序列與功能之間的關(guān)系具有重要意義?，F(xiàn)有技術(shù)中，針對甜櫻桃啤酒花矮化類病毒克隆的構(gòu)建等方面還未曾有報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種鑒定甜櫻桃啤酒花矮化類病抗性的方法。

本發(fā)明所采用的具體的技術(shù)方案為：

本發(fā)明提供了一種鑒定甜櫻桃啤酒花矮化類病抗性的方法，包括以下步驟：

（1）植物總RNA的提取及引物設(shè)計：提取感病甜櫻桃葉片總RNA， -80℃保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）HSVd全長cDNA克隆及測序：以提取的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的隨機引物進(jìn)行RT-PCR反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為20μL；以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)，R1和F1為引物；

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（康為） 回收目的片段，將回收的片段與pGEM-T（Promega）載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR篩選陽性質(zhì)粒；

（3）HSVd侵染性克隆的構(gòu)建：將所得分離物序列與HSVd序列進(jìn)行比較，對測序正確的菌株搖菌提取質(zhì)粒；以提取的質(zhì)粒為模板，以4個HSVd全長片段的HSVd-F1/HSVd-R1和HSVd-F2/HSVd-R2為引物，引物對HSVd-F1/HSVd-R1用于擴增第一個片段，引物對HSVd-F2/HSVd-R2用于擴增第二個片段，利用高保真酶分別進(jìn)行PCR擴增獲得HSVd全長片段，電泳后切膠回收；將兩個片段與載體進(jìn)行重組反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后瞬時離心，將離心管置于冰上冷卻5min；重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR篩選陽性質(zhì)粒；

（4）質(zhì)粒接種及抗病性鑒定：將獲得含有HSVd cDNA加倍串聯(lián)序列的克隆質(zhì)粒pGEM-HSVd-HSVd，提取質(zhì)粒pGEM-HSVd-HSVd，通過莖桿注射方法進(jìn)行接種甜櫻桃砧木G6，同時以接種空白質(zhì)粒pGEM的植株為陰性對照。

進(jìn)一步的，步驟（2）中，所述引物對序列R1和F1如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

R1（5′-TTGTTCTATCTGCGCCTCTGCC-3′）和F1(5′-AAGCAGGTTGGAGCGAACCGA-3′)

進(jìn)一步的，步驟（2）中，所述反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系中含有總RNA 2μg，2×TS Reation Mix 10 μL，隨機引物2 pmol，TransScriptRT/RI Enzyme Mix 1μL，加ddH₂O至20 μL，混勻；42℃孵育30 min，冰上冷卻2 min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

進(jìn)一步的，步驟（2）中，所述PCR擴增反應(yīng)的體系為50μL，含有5×TransStart FastPfu Buffer 10μL，2.5 mM dNTPs 5μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶1μL，引物對R1和F1各1μL (10μM)，模板2μL，加ddH₂O至50μL, 混勻；PCR擴增反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

進(jìn)一步的，所述第一個片段的上游引物HSVd-F1如SEQ ID NO:3所示；（CGCGGGAATTCGATTGCAACTCTTCTCAGAATCCAG），所述下游引物HSVd-R1如SEQ ID NO:4所示（GAAGAGTTGCCCCGGGGCTCCTTTC）；所述第二個片段的上游引物HSVd-F2如SEQ ID NO:5所示（CCCCGGGGCAACTCTTCTCAGAATC），所述下游引物HSVd-R2如SEQ ID NO:6所示（AATTCACTAGTGATTCCCGGGGCTCCTTTCTCAGG）。

進(jìn)一步的，步驟（3）中，所述重組反應(yīng)的體系為，pGEM-T線性化載體0.25 pmol，兩個插入片段（總量）0.5 pmol，2×EasyGeno Assembly Mix 5μL，加ddH₂O補足至10μL；將混合反應(yīng)液置于50℃反應(yīng)15 min。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明成功構(gòu)建了甜櫻桃HSVd的侵染性克隆，進(jìn)行人工接種進(jìn)行抗病性鑒定。本發(fā)明克服了田間多種病毒復(fù)合侵染癥狀不單一，類病毒毒源保存等技術(shù)難度，構(gòu)建了高效引發(fā)甜櫻桃類病毒病的人工接種鑒定方法。該方法操作簡單、效率高、重復(fù)性和可控性好。能提供相對一致的接種壓力，是一種簡單有效的接種鑒定方法。生物學(xué)活性分析顯示本方法所獲得的HSVd串聯(lián)重復(fù)cDNA克隆能成功地侵染甜櫻桃砧木G6，表明該克隆具有侵染活性，可用于相關(guān)類病毒功能基因研究和植物抗病性分析。

附圖說明

圖1為實施例1中質(zhì)粒接種后的甜櫻桃砧木。

其中，a為健康植株、b為質(zhì)粒接種后的發(fā)病植株。

圖2為質(zhì)粒接種后甜櫻桃葉片。

其中，c、d為健康葉片，e-h為發(fā)病葉片。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述，應(yīng)該明白的是，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對其內(nèi)容進(jìn)行限定。

實施例1

1.1植物總RNA的提取及引物設(shè)計

用EASYspin Plus植物RNA提取試劑盒提取感病甜櫻桃葉片總RNA，具體方法參照試劑盒說明書(AidLab, China)，用NanoDrop2000型紫外分光光度計檢測RNA純度，并用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

HSVd擴增引物根據(jù)Genbank中登錄的HSVd的RNA序列（Acc.NO. KJ754184.1）設(shè)計了兩條引物，引物R1(5′-TTGTTCTATCTGCGCCTCTGCC-3′)和F1(5′-AAGCAGGTTGGAGCGAACCGA-3′) 用于PCR擴增，引物由上海生工生物有限公司設(shè)計合成；

1.2、HSVd全長cDNA克隆及測序

以提取的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TransGen Biotech）中的通用引物進(jìn)行RT-PCR反轉(zhuǎn)錄，體系為20 μL；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中含有總RNA 2μg，2×TS Reation Mix 10 μL，隨機引物2 pmol，TransScriptRT/RI Enzyme Mix 1μL，加ddH₂O至20 μL，混勻；42℃孵育30 min，冰上冷卻2 min，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，R1和F1為引物。PCR擴增體系為50μL，含有5×TransStart FastPfu Buffer 10μL，2.5 mM dNTPs 5μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶1μL，引物對R1和F1各1μL (10μM)，模板2μL，加ddH₂O至50μL, 混勻；PCR反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min；

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（康為） 回收目的片段，將回收的片段與pGEM-T（Promega）載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR篩選陽性質(zhì)粒，送交上海生工生物有限公司測序；

測序結(jié)果已在GenBank中注冊，注冊號為 KX355200；序列如下：

GCAACTCTTCTCAGAATCCAGCGAGAGGCGTGGAGAGAGGGCCGCGGTGCTCTGGAGTAGAGGCTCTGCCTTCGAAACACCATCGATCGTCCCTTCTTCTTTACCTTCTTCTGGCTCTTCTTGGAGACGCGACCGGTGGCACCCCTGCTCGGTTCGCTCCAACCTGCTTTTGTTCTATCTGCGCCTCTGCCGCGGATCCTCTCTTGAGCCCCTCTGGGGAATTCTCGAGTTGCCGCAAAAGGCATGCAAAGAAAAAAACTAGGCAGGGAGGCGCTTACCTGAGAAAGGAGCCCCGGG

1.3、HSVd侵染性克隆的構(gòu)建

采用DNAMAN V.6.0軟件將所得分離物序列與GenBank中已報道HSVd序列進(jìn)行比較，對測序正確的菌株搖菌提取質(zhì)粒；為將HSVd 全長片段以串聯(lián)重復(fù)形式插入到載體pGEM-T（Promega）中，根據(jù)EasyGeno重組克隆試劑盒說明書設(shè)計4個HSVd全長片段的PCR引物，第一個片段的上游引物HSVd-F1（CGCGGGAATTCGATTGCAACTCTTCTCAGAATCCAG），下游引物HSVd-R1（GAAGAGTTGCCCCGGGGCTCCTTTC）；第二個片段的上游引物HSVd-F2（CCCCGGGGCAACTCTTCTCAGAATC），下游引物HSVd-R2（AATTCACTAGTGATTCCCGGGGCTCCTTTCTCAGG）。以提取的質(zhì)粒為模板，HSVd-F1/HSVd-R1和HSVd-F2/HSVd-R2為引物，利用高保真酶分別進(jìn)行PCR擴增獲得HSVd全長片段，電泳后切膠回收；將兩個片段與載體進(jìn)行重組反應(yīng)，反應(yīng)體系為，pGEM-T線性化載體0.25pmol，兩個插入片段（總量）0.5pmol，2×EasyGeno Assembly Mix 5μL，加ddH₂O補足至10μL。將混合反應(yīng)液置于50℃反應(yīng)15min，反應(yīng)結(jié)束后瞬時離心，將離心管置于冰上冷卻5min；重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR篩選陽性質(zhì)粒，送交生上海生工生物有限公司測序；

1.4、質(zhì)粒接種及抗病性鑒定

經(jīng)過對重組質(zhì)粒的篩選鑒定及測序分析，獲得含有HSVd cDNA加倍串聯(lián)序列的克隆質(zhì)粒pGEM-HSVd-HSVd；提取質(zhì)粒pGEM-HSVd-HSVd，通過莖桿注射方法進(jìn)行接種，同時以接種空白質(zhì)粒pGEM的植株為陰性對照；接種30 d后發(fā)現(xiàn)接種pGEM-HSVd-HSVd質(zhì)粒的甜櫻桃砧木出現(xiàn)葉片翻卷、不平整等癥狀，而陰性對照的砧木上則無任何明顯癥狀表現(xiàn)。

對比例1

1.1植物總RNA的提取及引物設(shè)計

用EASYspin Plus植物RNA提取試劑盒提取感病甜櫻桃葉片總RNA，具體方法參照試劑盒說明書(AidLab, China)，用NanoDrop2000型紫外分光光度計檢測RNA純度，并用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

HSVd擴增引物根據(jù)Genbank中登錄的HSVd的RNA序列（Acc.NO. KJ754184.1）設(shè)計了兩條引物，引物R2(5′-AACCTGCTTTTGTTCTATCTG -3′)和F2(5′-AACCTGCTTTTGTTCTATCTG -3′) 用于PCR擴增，引物由上海生工生物有限公司設(shè)計合成；

1.2、HSVd全長cDNA克隆及測序

以提取的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的通用引物進(jìn)行RT-PCR反轉(zhuǎn)錄，體系為20 μL；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中含有總RNA 2μg，2×TS Reation Mix 10 μL，隨機引物2 pmol，TransScriptRT/RI Enzyme Mix 1μL，加ddH₂O至20 μL，混勻；42℃孵育30 min，冰上冷卻2 min，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，R2和F2為引物。PCR擴增體系為50μL，含有5×TransStart FastPfu Buffer 10μL，2.5 mM dNTPs 5μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶1μL，引物對R2和F2各1μL (10μM)，模板2μL，加ddH₂O至50μL, 混勻；PCR反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min；

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，檢測不到目的條帶。

對比例2

2.1植物總RNA的提取及引物設(shè)計

用EASYspin Plus植物RNA提取試劑盒提取感病甜櫻桃葉片總RNA，具體方法參照試劑盒說明書(AidLab, China)，用NanoDrop2000型紫外分光光度計檢測RNA純度，并用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

HSVd擴增引物根據(jù)Genbank中登錄的HSVd的RNA序列（Acc.NO. KJ754184.1）設(shè)計了兩條條引物，引物R3(5′-CTCAGAATCCAGCGAGAG -3′)和F3(5′-AGGCGTGGAGAGAGGGC -3′) 用于PCR擴增，引物由上海生工生物有限公司設(shè)計合成；

2.2、HSVd全長cDNA克隆及測序

以提取的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的通用引物進(jìn)行RT-PCR反轉(zhuǎn)錄，體系為20 μL；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中含有總RNA 2μg，2×TS Reation Mix 10 μL，隨機引物2 pmol，TransScriptRT/RI Enzyme Mix 1μL，加ddH₂O至20 μL，混勻；42℃孵育30 min，冰上冷卻2 min，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，R3和F3為引物。PCR擴增體系為50μL，含有5×TransStart FastPfu Buffer 10μL，2.5 mM dNTPs 5μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶1μL，引物對R3和F3各1μL (10μM)，模板2μL，加ddH₂O至50μL, 混勻；PCR反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min；

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，檢測不到目的條帶。

<110>山東省果樹研究所

<120>一種鑒定甜櫻桃啤酒花矮化類病抗性的方法

<160>6

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

TTGTTCTATC TGCGCCTCTG CC 22

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

AAGCAGGTTG GAGCGAACCG A 21

<210>3

<211>36

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

CGCGGGAATT CGATTGCAAC TCTTCTCAGA ATCCAG 36

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

GAAGAGTTGC CCCGGGGCTC CTTTC 25

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

CCCCGGGGCA ACTCTTCTCA GAATC 25

<210>6

<211>35

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

AATTCACTAG TGATTCCCGG GGCTCCTTTC TCAGG 35