本發(fā)明涉及有機生物功能材料
技術領域：
，特別是涉及一種具有氨基和脂質結構的生物可降解的氨基脂質類化合物及其制備方法和應用。
背景技術：
：一些生物活性物質自身難以進入細胞或者靶向組織，例如蛋白質，多肽，DNA，RNA，難溶性分子等，因此輸送載體被設計并用于運送各種生物活性物質至細胞或者體內。其中，含有脂質的兩親性分子可以在水中組裝形成不同尺寸和形態(tài)的顆粒，并能有效結合生物活性物質，其復合物可以增強與細胞的作用從而能夠進入細胞后再釋放出生物活性物質。這就使得一些生物活性物質可以進入細胞調控生理過程，從而使這些生物活性物質用作藥物治療或者生理調節(jié)成為可能。DNA和RNA干擾(RNAi)作為遺傳物質在細胞內或體內調控著各種生理活動，尤其基因組學的發(fā)展使得基因，蛋白質和疾病的關系更加清晰。這樣，可以通過針對性的設計序列，高效并特異性地調控靶向基因的表達，這使得DNA和RNAi具有作為藥物的巨大潛力。但是，由于DNA和RNA較大的分子量和體積，并且在體內容易降解，自身帶負電的磷酸骨架難以和同樣帶負電的細胞膜作用，無法進入細胞。這已經(jīng)成為制約DNA和RNAi臨床應用的最大的限制因素。雖然DNA和RNA載體的功能上有一些細微的差異，但由于它們的性質和輸送目的有著很多相似之處，與之對應的載體的結構和功能亦有很多相似點。目前，非病毒的納米顆粒載體成為當前研究的熱點，這些載體大部分通過正電荷與DNA或者RNA結合，并且正電荷也有助于載體和帶負電的細胞膜結合，所以目前的大部分載體中都含有可以被質子化的氮原子。另一方面，載體和DNA或者RNA復合物需要形成納米顆粒才容易被細胞吸收。基于以上兩點，在多胺上進行疏水修飾成為一種非常有效的制備DNA/RNA載體的方法。其中，多胺一般為含有仲胺，伯胺等含有活潑氫的片段，常用的有不同分子量的聚乙烯亞胺，氨基醇，烷基胺等。疏水修飾則膽固醇，聚酯，脂肪烴等。蘭格等人通過一種簡單的方法，使用不同長度的烷基鏈修飾多種含氨基化合物，得到了不同取代度的氨基脂質類化合物文庫，其中一些化合物在細胞和動物水平上都能夠有效的攜帶siRNA并使目的基因沉默(Akinc,Zumbuehletal.2008；Whitehead,Sahayetal.2011)，但這些載體不具有生物可降解性或者降解速度較慢。本發(fā)明人的研究組也曾使用丙烯辛胺修飾低分子量的聚乙烯亞胺，顯著改善了聚乙烯亞胺的siRNA輸送能力。但是，盡管這些氨基脂質類化合物展現(xiàn)了良好的siRNA輸送能力，可由于這些氨基脂質類化合物的生物降解性能不佳，顯示出了比前體更大的毒性，這些載體的毒性成為siRNA臨床引用中的一個潛在的問題。技術實現(xiàn)要素：基于此，本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的缺陷，提供一種生物可降解的氨基脂質類化合物，該類化合物可以在細胞內的還原性條件下斷裂降解，從而能夠在體內通過代謝降低其毒性。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術方案：一種生物可降解的氨基脂質類化合物，選自如下化合物及其藥學上可接受的鹽：其中：A為-N(R5)2，R5獨立地選自：氫、?；?、甲硅烷基、磺酰基、氨基保護基團、取代或未取代的烷基、取代或未取代的鏈烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的雜烯基、取代或未取代的雜炔基、被取代的或未被取代的碳環(huán)基、取代或未取代的雜環(huán)基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、或是以下通式iii'基團：其中：R3獨立地選自：氫、取的或未取代的烷基、取代或未取代的鏈烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的雜烯基、取代或未取代的雜炔基、取代或未取代的碳環(huán)基、取代或未取代的雜環(huán)基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基；R4獨立地選自：氫、?；⒓坠柰榛?、巰基保護基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的鏈烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的雜烯基、取代或未取代的雜炔基、取代或未取代的碳環(huán)基、取代或未取代的雜環(huán)基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、膽固醇、親水性聚合物或疏水性聚合物；q獨立地選自：1-6的整數(shù)；V獨立地選自：O或者NH，L1相同或者不同的獨立選自：r獨立地選自：1-6的整數(shù)；R1獨立地選自：氫、C1-6烷基；R2、R6獨立地選自：氫、酰基、甲硅烷基、磺?；被Ｗo基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的鏈烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的雜烯基、取代或未取代的雜炔基、取代或未取代的碳環(huán)基、取代或未取代的雜環(huán)基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的聚乙烯亞胺、或是通式iii'基團；n選自：0-45的整數(shù)；Z獨立地選自：氫、酰基、甲硅烷基、磺?；被Ｗo基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的鏈烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的雜烯基、取代或未取代的雜炔基、取的或未取代的碳環(huán)基、取代或未取代的雜環(huán)基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、或是通式iii'基團；并且，A，L1或者Z中至少有一個片段含有通式iii'所示的基團。上述氨基脂質類化合物可通過將式X化合物與氨基化合物邁克爾加成反應，使式X化合物中碳-碳雙鍵斷裂后與氨基化合物中氨基或者單取代氨基加成反應制得；在其中一些實施例中，A為-N(R5)2，R5獨立地選自：氫，甲基，乙基，或者通式iii'基團；Z獨立地選自：氫，甲基，乙基，或者通式iii'基團；L1相同或者不同的獨立選自：r選自：1，2或者3；R1選自：氫，甲基，或乙基；R2、R6獨立地選自：氫、甲基、乙基、取代或未取代的聚乙烯亞胺、或是通式iii'基團。在其中一些實施例中，R3選自：氫或甲基，q選自：2；V選自：O或NH；R4選自：2位取代吡啶，C6-18直鏈烷烴。在其中一些實施例中，R2獨立地選自：取代或未取代的聚乙烯亞胺，該取代或未取代的聚乙烯亞胺基團為如下式xii結構：其中：t選自：1-50的整數(shù)；P獨立地選自：氫、?；?、甲硅烷基、磺?；?、氨基保護基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的鏈烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的雜烯基、取代或未取代的雜炔基、取代或未取代的碳環(huán)基、取代或未取代的雜環(huán)基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、或是通式iii'基團，優(yōu)選為氫、未取代的C1-6烷基或通式iii'基團。R9獨立地選自：氫、如下通式ii'基團、或是通式iii'基團：上述式xii結構中，如R9選取是非ii'基團結構，則xii基團不再延長；如果R9選取是的ii'基團結構，則其中的R2或者R6基團可以繼續(xù)是xii結構，并且xii中的R9還可以繼續(xù)是ii'基團結構并按此種方式一直延伸，直到xii結構中的R9是非ii’基團結構，則該基團截止。在其中一些實施例中，所述通式iii'基團的數(shù)目比氨基上活性氫的個數(shù)少1。即保留一個氨基上的活潑氫不參與反應。本發(fā)明還公開了一種上述生物可降解的氨基脂質類化合物的制備方法，將通式I的氨基化合物與通式X化合物反應，使式X化合物中碳-碳雙鍵斷裂后與I的氨基化合物中氨基邁克爾加成反應；其反應路線如下：其中，R7獨立地選自：氫、C1-6烷基、或是通式ii'基團：并且，通式I的氨基化合物中，R5、R2，R6及其所包含的次級R2和R6基團、Z中至少有一個是氫。在其中一些實施例中，通式I所示的氨基化合物是支化或者線性的聚乙烯亞胺或者以下多胺：本發(fā)明的氨基脂質類化合物通過上述路線反應制得，具體來說，是將前體氨基化合物與一種或多種通式X的二硫鍵單體化合物反應，生成本發(fā)明的氨基脂質類化合物。每個前體溶解在有機溶劑(如四氫呋喃，二氯甲烷，甲醇，乙醇，氯仿，己烷，甲苯，苯，四氯化碳，甘醇二甲醚，乙醚等)中，加入不同當量的一個或多個二硫鍵單體，反應混合物在室溫或者加熱條件下反應，得到不同取代度的氨基脂質類化合物。并且如技術人員在本領域中所理解的，取代的程度可通過合成的反應條件來控制(例如，溫度，原料，濃縮，溶劑等)。本發(fā)明還公開了一種上述生物可降解的氨基脂質類化合物作為載體在制備試劑或藥物輸送系統(tǒng)中的應用。所述試劑或藥物可以是治療，診斷，或預防劑，可以是有機分子(例如，膽固醇，藥物)，無機分子，核酸，蛋白質，肽，核苷酸，靶向制劑，同位素標記的有機或無機分子，疫苗，免疫劑，等等。且該輸送系統(tǒng)的形式可以為復合物，皮米顆粒，納米顆粒，微粒，膠束或脂質體輸送等。并且，該氨基脂質類化合物以及由其制備的復合物，脂質體，膠束，微粒，皮米顆粒和納米顆粒等，由于它通常需要靶向于特定的細胞，一類細胞，或組織，可以被修改以包括靶向劑。本領域已知多種靶向劑引導藥物組合物進入特定的細胞(參見例如庫騰(Cotten)等人酶學方法(MethodsEnzym.)217：618，1993；其以引用的方式并入本文中)。靶向劑可以存在于在整個顆粒，或者可以是僅在表面上。靶向劑可以是蛋白質，肽，糖類，糖蛋白，脂質，小分子，核酸等。靶向劑可用于靶向特定細胞或組織，或者可以被用來促進顆粒的細胞內吞作用或吞噬作用。由于本發(fā)明的生物可降解的氨基脂質類化合物具有以下性質，使得它們特別適用于藥物輸送裝置的制備。這些性質包括：1)氨基脂質類化合物的強結合能力以及能夠“保護”不穩(wěn)定試劑的能力；2)能夠緩沖在核內體中pH的能力；3)充當“質子海綿”的能力，并可導致內涵體破裂；4)，以中和帶負電荷的藥物的電荷的能力。并且，在其中一些實施例中，該氨基脂質類化合物可被制備為包含待輸送藥物的顆粒。這些顆粒還可包含其它材料，如合成的聚合物(例如PEG，PLGA等)、天然聚合物(例如磷脂等)、或其它試劑(例如膽固醇)等。在其中一些實施例中，所述顆粒的直徑范圍為50-370nm。在其中一些實施例中，所述試劑或藥物為多核苷酸。該多核苷酸可以是任何核酸，包括，RNA和DNA。該多核苷酸可以是任何大小或任何序列的，并且它們可以是單鏈或雙鏈的。還可以通過化學或生物學方法進行修改，這些修飾導致增加的多核苷酸的穩(wěn)定性，修飾包括甲基化，磷酸化，封端等在其中一些實施例中，所述多核苷酸和生物可降解的氨基脂質類化合物形成的復合物粒徑為50nm-370nm，優(yōu)選100nm-370nm。在其中一些實施例中，所述氨基脂質類化合物中的氨基與所述多核苷酸中的磷酸基團的比值為1:1-50:1。在其中一些實施例中，該氮磷比介于約5:1至約45：1之間，在約15:1至約45：1之間，或約20:1至約40:1之間。增加氮：磷比，經(jīng)證明可以增加核酸結合力，但是會對傳遞遺傳物質產(chǎn)生積極的影響的同時對傳遞帶來的毒性作用增加。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明的生物可降解的氨基脂質類化合物，可以在適宜的條件下形成納米顆粒，膠束，脂質體，有攜帶生物活性物質進入細胞或者體內的能力，其中由于含有可降解的二硫鍵，可以在細胞內斷裂，從而具有良好的生物相容性和較低的毒性。因而適宜作為藥物輸送系統(tǒng)的載體，例如用于多聚核苷酸的輸送中。并且，本發(fā)明的氨基脂質類化合物與多核苷酸(如RNA特別是siRNA)具有很好的結合能力，在氨基脂質類化合物的巰基降解后即可有效釋放多核苷酸。該氨基脂質類化合物與多核苷酸的復合物粒徑在100-370nm之間時，其電勢大于零，有利于復合物進入細胞。該復合物還具有很好的轉染效果及較低的細胞毒性。附圖說明圖1是bPEI600-C8-4的1HNMR(在CDCl3中)的核磁共振譜圖；圖2是PEI600-C8-8的1HNMR(在CDCl3中)的核磁共振譜圖；圖3是bPEI600-C12-4的1HNMR(在CDCl3中)的核磁共振譜圖；圖4是bPEI600-C12-8的1HNMR(在CDCl3中)的核磁共振譜圖；圖5是bPEI600-C16-4的1HNMR(在CDCl3中)的核磁共振譜圖；圖6是bPEI600-LIPID與siRNA復合物的凝膠電泳圖；其中：a,b,c,d,e,f分別為bPEI600-C8-4、bPEI600-C8-8、bPEI600-C12-4、bPEI600-C12-8、bPEI600-C16-4和bPEI600的凝膠電泳圖，每幅圖的第一泳道是未加入氨基脂質類化合物的siRNA對照，圖上所標數(shù)字對應著復合物的氮磷比。圖7是bPEI600-C12-8/siRNA復合物加入50mMDTT孵化一小時后的凝膠電泳圖；其中：第一泳道是未加入氨基脂質類化合物的siRNA對照。圖8是氮磷比＝10:1的bPEI600-LIPID/siRNA復合物在HEPES(50mM，pH＝6.8)緩沖液中的粒徑與電勢表征。圖9是bPEI600-C12-8加入50mMDTT孵化48小時后測試粒徑的相關曲線；圖10是bPEI600-C12-8未加入50mMDTT孵化48小時后測試粒徑的相關曲線；圖11是siRNA轉染終濃度為50nM時，bPEI600-LIPID/siRNA復合物熒光素酶基因的沉默效果；圖12是siRNA終濃度為10nM時，TEPA-LIPID/siRNA復合物熒光素酶基因的沉默效果；圖13是流式細胞儀測試的帶熒光標記的CY3-siRNA/bPEI600-LIPID復合物在氮磷比＝10:1時，轉染24小時后細胞的平均熒光強度；圖14是帶熒光標記的Cy3-siRNA經(jīng)bPEI600-LIPID轉染(氮磷比＝10:1)24小時后細胞內的熒光分布；其中：灰色大圓點為細胞核，灰白色小圓點為Cy3-siRNA。圖15是bPEI600-LIPID/siRNA復合物48小時孵化后的的細胞毒性。具體實施方式術語“獨立地選自”在本文中用于表示各不同標號的R基團(如R2和R6等)或者片段(如L1)之間，或通式中重復出現(xiàn)的同一標號的R基團(如R5等)或者片段(如L1)可相同或不同。術語“烷基”是指具有1至50個碳原子直鏈或支鏈的飽和烴基(“C1-50烷基“)。術語“鏈烯基”是指含有2至50個碳原子直鏈或支鏈的烴基并具有一個或多個碳-碳雙鍵(“C2-50鏈烯基“)。術語“炔基”是指含有2至50個碳原子直鏈或支鏈的烴基并具有一個或多個碳-碳三鍵(“C2-50炔基“)。術語“雜烷基”是指如本文所定義的烷基，其中主鏈還包括1個或多個(例如，1-25個)雜原子(如氧，硫，氮，硼，硅，磷)。術語“雜烯基”是指如本文定義的鏈烯基，其中，主鏈還包括1個或多個(例如，1-25個)雜原子(如氧，硫，氮，硼，硅，磷)。術語“雜炔基”是指如文中定義的炔基，其中，主鏈還包括1個或多個(例如，1-25個)的雜原子(如氧，硫，氮，硼，硅，磷)。術語“碳環(huán)基”是指含有3至10個環(huán)碳原子的且不具有芳香性的環(huán)狀烴基(“C3-10碳環(huán)基“)，并且在該非芳香環(huán)系統(tǒng)中沒有雜原子。術語“雜環(huán)基”是指一種基團，具有3～14個環(huán)碳原子的非芳香族環(huán)系統(tǒng)并且環(huán)上有1至4個雜原子，其中每個雜原子獨立地選自氮，氧和硫(“3-14元雜環(huán)基“)。包含一個或多個氮原子的雜環(huán)基團，如果化合價允許的話，連接點可以是碳或氮原子。雜環(huán)基可以是單環(huán)的(“單環(huán)雜環(huán)基”)或多環(huán)(例如，稠合，橋接或螺環(huán)系統(tǒng)，諸如雙環(huán)系統(tǒng)(“雙環(huán)雜環(huán)基”)或三環(huán)系統(tǒng)(“三環(huán)雜環(huán)基”))，可以是飽和的或包含一個或多個碳-碳雙鍵或三鍵的。雜環(huán)基的多環(huán)系統(tǒng)可以在一個或者兩個環(huán)上包含一個或多個雜原子。術語“芳基”是指包含單個或多環(huán)的(例如，雙環(huán)或三環(huán))4n+2芳香環(huán)系統(tǒng)(例如，在環(huán)狀軌道共享6，10或14個π電子)，并且芳環(huán)體系具有6-14個環(huán)碳原子且不含雜原子(“C6-14芳基“)。術語“雜芳基”是指含有5-14元單環(huán)或多環(huán)(例如，雙環(huán)或三環(huán))的4n+2芳香環(huán)系統(tǒng)(例如，在環(huán)狀軌道共享6，10或14個π電子)，并且芳環(huán)體系具有環(huán)碳原子和1-4個環(huán)雜原子，其中每個環(huán)雜原子獨立地選自氮，氧和硫(“5-14元雜芳基”)。包含一個或多個氮原子的雜芳基，如果過化學價允許，連接點可以是碳或氮原子。雜芳基的多環(huán)系統(tǒng)的一個環(huán)或者兩個環(huán)可以包括一個或多個雜原子。烷基、鏈烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、碳環(huán)基、雜環(huán)基、雜芳基，如本文所定義，是可以被任意取代的。在一般情況下，“取代的”一詞，意味著至少有一個氫存在于基團(例如，碳原子或氮原子)，被替換為一個允許的取代基，例如，取代基在取代后產(chǎn)生穩(wěn)定的化合物，例如，取代后的化合物不能自發(fā)的進行轉化，例如發(fā)生重排，環(huán)化，消除或其它反應。除非另有指明，否則“取代的”基團具有一個或多個可取代的位置，并且當在任何給定結構中多于一個以上位置被取代時，取代基可以是相同的或在每個取代位都不同?！叭〈摹币辉~可以涵蓋有機化合物的所有允許的取代物，也涵蓋了任何本文所述的可以產(chǎn)生穩(wěn)定的化合物的取代。對于滿足本發(fā)明的目的，雜原子如氮可具有氫取代基和/或如本文所述的任何合適的取代基，只要其滿足雜原子的化合價并形成穩(wěn)定的結構即可。術語“?；笔侵高@樣的基團，其中直接連接到母體分子上的碳是SP2雜化，且被氧，氮或硫原子所取代，例如，選自酮類的基團(-C(═O)Raa-)，羧酸(-CO2H)，醛類(-CHO)，酯(-CO2Raa，-C(═O)SRaa，-C(═S)SRaa)，酰胺類(-C(═O)N(Rbb)2，-C(═O)NRbbSO2Raa，-C(═S)N(Rbb)2)，和亞胺(-C(═NRbb)Raa，-C(═NRbb)ORaa，-C(═NRbb)N(Rbb)2)，其中Raa和Rbb如本文所定義等。術語“甲硅烷基”是指基團-Si(Raa)3，其中Raa是如本文所定義。術語“亞烷基”是指二價飽和脂肪族基團，可視為烯烴打開雙鍵后所得到的二價基團，或者視為烷烴不同碳原子上去掉兩個氫所得到的二價產(chǎn)物。術語“保護基”是指暫時阻斷特定官能部分(例如O、S或N)以使得可在多官能化合物中的另一反應性位點選擇性進行反應。在某些實施例中，保護基以良好產(chǎn)率選擇性反應以產(chǎn)生對所計劃的反應穩(wěn)定的受保護物質；保護基應通過不會攻擊其它官能團的容易得到且優(yōu)選無毒的試劑以良好產(chǎn)率選擇性去除；保護基形成容易分離的衍生物(更優(yōu)選地不會產(chǎn)生新的立體對稱中心)；并且保護基具有極少額外官能團，從而避免其它反應位點。如本文所詳述，可利用氧、硫、氮和碳保護基。術語“巰基保護基”包括但不限于半硫縮醛如1-乙氧基乙基和甲氧基甲基硫酯，或硫代碳酸酯，芐基、取代芐基、三苯甲基及叔丁基硫醚，乙?；?，苯甲?；?。氨基保護基指暫時阻斷氨基官能部分以使得可在多官能化合物中的另一反應性位點選擇性進行反應的取代基。另外，多種保護基描述于有機合成中的保護基(ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis)，第3版Τ·W.格林(Greene，Τ.W.)和P.G.伍茲(Wuts，P.G.)編，約翰威利父子出版社(JohnWiley&Sons)，紐約(NewYork)：1999中，所述文獻的整體內容以引用的方式并入本文中。術語“聚合物”是指由至少3個(例如，至少10個，20個，30個，40個，50個，60個，70個，80個，90個，100個，等等)共價結合的重復結構單元組成的化合物。如“親水性聚合物”指重復單元中含有至少一種可以形成氫鍵的基團(例如氧，氮，硫)的聚合物。親水性的聚合物一般具有良好的生物相容性，包括但不限于多肽，纖維素聚合物，多糖，聚丙烯酸，聚乙烯醇，聚乙烯基吡咯烷酮，聚乙二醇等；如“疏水性聚合物”指重復單元中不含有可以形成氫鍵的基團的聚合物，如聚碳酸酯，聚乳酸，聚己內酯，聚3-羥基丁酸酯等。術語“磺酰基”是指選自-SO2N(Rbb)2，-SO2Raa，和-SO2ORaa的基團，其中Raa和Rbb如本文所定義。Raa獨立地選自：C1-10烷基，C2-10鏈烯基，C2-9炔基，C3-10碳環(huán)基，3-14元雜環(huán)基，C6-14芳基，5-14元雜芳基，或兩個Raa基團一起形成3-14元雜環(huán)基或5-14元雜芳環(huán)，其中每個烷基，鏈烯基，炔基，碳環(huán)基，雜環(huán)基，芳基，雜芳基都可以具有0，1，2，3，4或5個獨立的Rdd取代基。Rbb獨立地選自：氫，-OH，-ORaa，-N(Rcc)2，-CN，-C(═O)Raa，-C(═O)N(Rcc)2，-CO2Raa，-SO2Raa，-C(═NRcc)ORaa，-C(═NRcc)N(Rcc)2，-SO2N(Rcc)2，-SO2Rcc，-SO2ORcc，-SORaa，-C(═S)N(Rcc)2，-C(═O)SRcc，-C(═S)SRcc，-P(═O)2Raa，-P(═O)(Raa)2，-P(═O)2N(Rcc)2，-P(═O)(NRcc)2，C1-10烷基，鏈烯基，C2-9炔基，C3-10碳環(huán)基，3-14元雜環(huán)基，C6-14芳基，和5-14元雜芳基，或兩個Rbb基團連接以形成3-14元雜環(huán)基或5-14元雜芳環(huán)，其中每個烷基，鏈烯基，炔基，碳環(huán)基，雜環(huán)基，芳基，雜芳基都可以具有0，1，2，3，4或5個獨立的Rdd取代基。Rcc獨立地選自氫，C1-10烷基，C2-10鏈烯基，C2-9炔基，C3-10碳環(huán)基，3-14元雜環(huán)基，C6-14芳基，和5-14元雜芳基，或兩個Rcc基團連接以形成3-14元雜環(huán)基或5-14元雜芳環(huán)，其中每個烷基，鏈烯基，炔基，碳環(huán)基，雜環(huán)基，芳基，雜芳基都可以具有0，1，2，3，4或5個獨立的Rdd取代基；Rdd獨立地選自：鹵素，-CN，-NO2，-N3，-SO2H，-SO3H，-OH，-ORee，-ON(Rff)2，-N(Rff)2，N(Rff)3+x-，-N(ORee)Rff，-SH，-SRee，-SSRee，-C(═O)Ree，-CO2H，-CO2Ree，-OC(═O)Ree，-OCO2Ree，-C(═O)N(Rff)2，-OC(═O)N(Rff)2，-NRffC(═O)Ree，-NRffCO2Ree，-NRffC(═O)N(Rff)2，-C(═NRff)ORee，-OC(═NRff)Ree，-OC(═NRff)ORee，-C(═NRff)N(Rff)2，-OC(═NRff)N(Rff)2，-NRffC(═NRff)N(Rff)2，-NRffSO2Ree，-SO2N(Rff)2，-SO2Ree，-SO2ORee，-OSO2Ree，-S(═O)Ree，-Si(Ree)3，-OSi(Ree)3，-C(═S)N(Rff)2，-C(═O)SRee，-C(═S)SRee，-SC(═S)SRee，-P(═O)2Ree，-P(═O)(Ree)2，-OP(═O)(Ree)2，-OP(═O)(ORee)2，C1-6烷基，C1-6全鹵代烷基，C2-6鏈烯基，C2-6炔基，C3-10碳環(huán)基，3-9元雜環(huán)基，C6-10芳基，5-10元雜芳基，其中每個烷基，鏈烯基，炔基，碳環(huán)基，雜環(huán)基，芳基，和雜芳基都可以具有0，1，2，3，4或5個獨立的Rgg取代基，或兩個偕Rdd取代基可用═O或═S替代。Ree獨立地選自：C1-6烷基，C1-6全鹵代烷基，C2-6鏈烯基，C2-6炔基，C3-10碳環(huán)基，C6-10芳基，3-10元雜環(huán)基，和3-10元雜芳基，其中每個烷基，鏈烯基，炔基，碳環(huán)基，雜環(huán)基，芳基，和雜芳基可以具有0，1，2，3，4或5個Rgg取代基；Rff獨立地選自：氫，C1-6烷基，C1-6全鹵代烷基，C2-6鏈烯基，C2-6炔基，C3-10碳環(huán)基，3-9元雜環(huán)基，C6-10芳基和5-10元雜芳基，或兩個Rff基團一起形成3-14元雜環(huán)基或5-14元雜芳環(huán)，其中每個烷基，鏈烯基，炔基，碳環(huán)基，雜環(huán)基，芳基，和雜芳基可以具有0，1，2，3，4或5個Rgg取代基；Rgg獨立地選自：鹵素，CN，-NO2，-N3，-SO2H，-SO3H，-OH，-OC1-6烷基，-ON(C1-6烷基)2，-N(C1-6烷基)2，-N(C1-6烷基)3+-X-，-NH(C1-6烷基)2+X-，-NH2(C1-6烷基)+X-，-NH3+X-，-N(OC1-6烷基)(C1-6烷基)，N(OH)(C1-6烷基)，NH(OH)，-SH，-SC1-6烷基，-SS(C1-6烷基)，-C(═O)(C1-6烷基)，-CO2H，-CO2(C1-6烷基)，-OC(═O)(C1-6烷基)，-OCO2(C1-6烷基)，-C(═O)NH2，-C(═O)N(C1-6烷基)2，-OC(═O)NH(C1-6烷基)，-NHC(═O)(C1-6烷基)，-N(C1-6烷基)C(═O)(C1-6烷基)，-NHCO2(C1-6烷基)，-NHC(═O)N(C1-6烷基)2，NHC(═O)NH(C1-6烷基)，-NHC(═O)NH2C(═NH)O(C1-6烷基)，-OC(═NH)(C1-6烷基)，-OC(═NH)OC1-6烷基，-C(═NH)N(烷基)2，-C(═NH)NH(C1-6烷基)，-C(═NH)NH2，-OC(═NH)N(C1-6烷基)2，-OC(NH)NH(C1-6烷基)，OC(NH)NH2，NHC(NH)N(C1-6烷基)2，NHC(═NH)NH2，-NHSO2(C1-6烷基)，-SO2N(1-6烷基)2，-SO2NH(C1-6烷基)，-SO2NH2，-SO2烷基，-SO2OC1-6烷基，-OSO2烷基，-SOC1-6烷基，-Si(C1-6烷基)3，-OSi(C1-6烷基)3C(═S)N(C1-6烷基)2，-C(═S)NH(C1-6烷基)，-C(═S)NH2，-C(═O)O(C1-6烷基)，-C(═S)SC1-6烷基，-SC(═S)SC1-6烷基，-P(═O)2(C1-6烷基)，-P(═O)(C1-6烷基)2，-OP(═O)(C1-6烷基)2，-OP(═O)(OC1-6烷基)2，C1-6烷基，C1-6全鹵代烷基，C2-6鏈烯基，C2-6炔基，C3-10碳環(huán)基，C6-10芳基，3-10元雜環(huán)基，5元-10元雜芳基；或者兩個偕Rgg取代基可被═O或═S替代。其中X-為抗衡離子，即帶負電荷的基團，它與一個帶正電荷的季胺結合，以保持電中性。示例性的抗衡離子包括鹵離子(例如，F(xiàn)-，Cl-，Br-，I-)，NO3-，ClO4-，OH-，H2PO4-，HSO4-，磺酸離子(例如，甲磺酸，三氟甲，對甲苯磺酸鹽，苯磺酸鹽，10-樟腦磺酸鹽，萘-2-磺酸鹽，萘-1-磺酸，5-磺酸，乙烷-1-磺酸，2-磺酸酯，和其它類似物)，和其它羧酸根離子(例如，乙酸鹽，丙酸乙酯，苯甲酸鹽，甘油酸，乳酸，酒石酸，乙醇酸，和其它類似物)。以下結合具體實施例對上述方案做進一步說明。應理解，這些實施例是用于說明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據(jù)具體廠家的條件進一步調整，未注明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。以下實施例中所用部分試劑和儀器如下：正辛硫醇，正十二硫醇，丙烯酰氯，四乙烯五胺：購于上海晶純實業(yè)有限公司。支化聚乙烯亞胺bPEI600(polyethyleneimine，PEI，Mn＝600)，正十六硫醇：購于阿法埃莎(天津)化學有限公司。2,2'-二硫二吡啶：購自南京康滿林化工實業(yè)有限公司。三乙胺：為分析純，使用氫化鈣回流24h后使用。丙酮，二氯甲烷，甲醇，石油醚，乙酸乙酯，乙醇等其他原料皆為分析純，未純化。巰基乙醇，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacid，HEPES)，二硫蘇糖醇(DTT)：均購于廣州威佳科技有限公司。胎牛血清(FBS)，胰蛋白酶，磷酸鹽緩沖液(PBS，pH＝7.2)，LipofectamineTM2000(LIPO)，RoswellParkMemorialInstitute1640培養(yǎng)基(RPMI1640)：均購于美國Invitrogen公司。Cellcountingkit-8(CCK-8)試劑盒：購于日本Dojindo公司。遺傳霉素G418購自Amresco公司。化學合成的常規(guī)siRNA，帶Cy3熒光標記的siRNA：購于廣州市銳博生物科技有限公司。穩(wěn)定表達螢火蟲螢光素酶的人肺腺癌細胞株(A549-luc)：由本實驗室以前通過遺傳霉素G418篩選獲得，細胞在37℃，5％潮濕的CO2下培養(yǎng)，使用含有10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基。1HNMR由BrukerAVANCEIII400M測定。粒徑和電勢由馬爾文ZetasizerNanoZS90激光粒度儀測定。螢火蟲螢光素酶發(fā)光效率由Veritas9100-002熒光照度計測定。帶熒光的siRNA細胞攝入效率分別由BDFACSCalibur流式細胞儀和LEICATCSSP2AOBS激光共聚焦顯微鏡測定。實施例1氨基脂質類化合物的合成一、含有二硫鍵的脂質丙烯酸酯的合成按照以下合成路線1制備：(1)化合物4a的制備：中間體2-(辛基二硫烷基)吡啶(2a)的制備：2,2’-二硫二吡啶(12g,54.55mmol,2eq)溶解在150mL乙醇中，辛硫醇(4.7mL,27.37mmol,1eq)溶解在20mL二氯甲烷中，在氮氣保護下，將正辛硫醇慢慢滴加入二硫二吡啶的溶液中，反應液隨著滴加的進行變?yōu)榱咙S色，室溫攪拌下反應24-48小時，TLC跟蹤反應進程。辛硫醇反應完畢后，將反應液濃縮，通過柱色譜梯度洗脫分離，使用5％-10％乙酸乙酯的石油醚溶液作為流動相，得到產(chǎn)物2a,為淡黃色液體，收率為67％。中間體2-(辛基二硫烷基)乙烷-1-醇(3a)的制備：將化合物2a(4.05g,15.88mmol,1eq)溶解于50mL二氯甲烷中，巰基乙醇(1.15mL,16.54mmol,1.05eq)溶解于10mL甲醇中，然后滴加入化合物2a的溶液中，氮氣保護下攪拌反應24小時，TLC跟蹤反應進程。原料反應完畢后將反應液濃縮，通過柱色譜梯度洗脫分離，使用10％-20％乙酸乙酯的石油醚溶液作為流動相，得到產(chǎn)物3a，為無色液體，收率為75％。2-(辛基二硫烷基)乙基丙烯酰酸酯4a的制備：將化合物3a(2g,9mmol,1eq)溶解于干燥的二氯甲烷DCM，然后加入三乙胺TEA(1.87mL,13.45mmol,1.5eq)，將反應液冰浴冷卻至0℃，滴加丙烯酰氯(0.73mL,9mmol,1eq),滴加完畢后反應溫度升至室溫，氮氣保護下反應過夜。反應液水洗干燥后濃縮，通過柱色譜梯度洗脫分離，使用5％-10％乙酸乙酯的石油醚溶液作為流動，得到產(chǎn)物4a為淡黃色液體，收率為86％。產(chǎn)物表征數(shù)據(jù)為：1HNMR(400MHZ,CDCl3,PPM)δ6.43(d,1H),6.13(m,1H),5.84(d,1H),4.42(t,2H),2.94(t,2H),2.70(t,2H),1.67(m,2H),1.37(t,8H),1.27(m,8H),0.88(t,3H)。(2)化合物4b的制備：中間體2-(十二基二硫烷基)吡啶2b的制備：2,2’-二硫二吡啶(10g,45.45mmol,2eq)溶解在120mL乙醇中，正十二硫醇(5.44mL,22.75mmol,1eq)溶解在20mL二氯甲烷中，在氮氣保護下，將十二硫醇慢慢滴加入二硫二吡啶的溶液中，反應液隨著滴加的進行變?yōu)榱咙S色，室溫攪拌下反應24-48小時，TLC跟蹤反應進程。正十二硫醇反應完畢后，將反應液濃縮，通過柱色譜梯度洗脫分離，使用5％-10％乙酸乙酯的石油醚溶液作為流動相，得到產(chǎn)物2b,為淡黃色液體，收率為80％。中間體2-(十二基二硫烷基)乙烷-1-醇3b的制備：將化合物2b(5g,16.07mmol,1eq)溶解于50mL二氯甲烷中，巰基乙醇(1.18mL,16.79mmol,1.05eq)溶解于10mL甲醇中，然后滴加入化合物2b的溶液中，氮氣保護下攪拌反應24小時，TLC跟蹤反應進程。原料反應完畢后將反應液濃縮，通過柱色譜梯度洗脫分離，使用10％-20％乙酸乙酯的石油醚溶液作為流動相梯度洗脫，得到產(chǎn)物3b，為白色固體，收率為82％。2-(十二基二硫烷基)乙基丙烯酰酸酯4b的制備：將化合物3b(2g,7.19mmol,1eq)溶解于干燥的二氯甲烷DCM，然后加入三乙胺TEA(1.49mL,10.68mmol,1.5eq)，將反應液冰浴冷卻至0℃，滴加丙烯酰氯(0.59mL,7.19mmol,1eq),滴加完畢后反應溫度升至室溫，氮氣保護下反應過夜。反應液水洗干燥后濃縮，通過柱色譜梯度洗脫分離，使用5％-10％乙酸乙酯的石油醚溶液作為流動相，得到產(chǎn)物4b為淡黃色液體，收率為77％。產(chǎn)物表征數(shù)據(jù)為：1HNMR(400MHZ,CDCl3,PPM)δ6.43(d,1H),6.12(m,1H),5.84(d,1H),4.42(t,2H),2.94(t,2H),2.70(t,2H),1.67(m,2H),1.37(t,8H),1.26(m,16H),0.88(t,3H)。(3)化合物4c的制備：中間體2-(十六基二硫烷基)吡啶2c的制備：2,2’-二硫二吡啶(10g,45.45mmol,2eq)溶解在120mL乙醇中，正十六硫醇(6g,23.25mmol,1eq)溶解在30mL二氯甲烷中，在氮氣保護下，將十六硫醇慢慢滴加入二硫二吡啶的溶液中，反應液隨著滴加的進行變?yōu)榱咙S色，室溫攪拌下反應24-48小時，TLC跟蹤反應進程。正十六硫醇反應完畢后，將反應液濃縮，通過柱色譜梯度洗脫分離，使用5％-10％乙酸乙酯的石油醚溶液作為流動相，得到產(chǎn)物2b，為淡黃色液體，收率為64％。中間體2-(十六基二硫烷基)乙烷-1-醇3c的制備：將化合物2c(4.7g,12.80mmol,1eq)溶解于30mL二氯甲烷中，巰基乙醇(0.95mL,13.46mmol,1.05eq)溶解于10mL甲醇中，然后滴加入化合物2c的溶液中，氮氣保護下攪拌反應24小時，TLC跟蹤反應進程。原料反應完畢后將反應液濃縮，通過柱色譜梯度洗脫分離，使用10％-20％乙酸乙酯的石油醚溶液作為流動相梯度洗脫，得到產(chǎn)物3c，為白色固體，收率為78％。2-(十六基二硫烷基)乙基丙烯酰酸酯4c的制備：將化合物3c(2.7g,8.08mmol,1eq)溶解于干燥的二氯甲烷DCM，然后加入三乙胺TEA(1.68mL,12.08mmol,1.5eq)，將反應液冰浴冷卻至0℃，滴加丙烯酰氯(0.66mL,8.09mmol,1eq),滴加完畢后反應溫度升至室溫，氮氣保護下反應過夜。反應液水洗干燥后濃縮，通過柱色譜梯度洗脫分離，使用5％-10％乙酸乙酯的石油醚溶液作為流動相，得到產(chǎn)物4c，為白色固體，收率為83％。產(chǎn)物表征數(shù)據(jù)為：1HNMR(400MHZ,CDCl3,PPM)δ6.43(d,1H),6.12(m,1H),5.84(d,1H),4.42(t,2H),2.94(t,2H),2.70(t,2H),1.67(m,2H),1.37(t,8H),1.26(m,24H),0.88(t,3H)。二、bPEI600-LIPID的合成(1)bPEI600-LIPID的合成按照以下合成路線2制備：其中，R2獨立是氫、取代或未取代的聚乙烯亞胺、或是：上述bPEI600為平均分子量為600D的支化聚乙烯亞胺。表格1.不同取代度和脂質修飾的bPEI600-LIPID的其中：bPEI600-C8-4表示將平均分子量為600D的支鏈聚乙烯亞胺與2-(辛基二硫烷基)乙基丙烯酰酸酯(4a)按照摩爾比為4：1的比例投料制備得到的氨基脂類化合物，其核磁共振譜圖如圖1所示；bPEI600-C8-8表示將平均分子量為600D的支鏈聚乙烯亞胺與2-(辛基二硫烷基)乙基丙烯酰酸酯(4a)按照摩爾比為8：1的比例投料制備得到的氨基脂類化合物，其核磁共振譜圖如圖2所示；bPEI600-C12-4表示將平均分子量為600D的支鏈聚乙烯亞胺與2-(十二基二硫烷基)乙基丙烯酰酸酯(4b)按照摩爾比為4：1的比例投料制備得到的氨基脂類化合物，其核磁共振譜圖如圖3所示；bPEI600-C12-8表示將平均分子量為600D的支鏈聚乙烯亞胺與2-(十二基二硫烷基)乙基丙烯酰酸酯(4b)按照摩爾比為8：1的比例投料制備得到的氨基脂類化合物，其核磁共振譜圖如圖4所示；bPEI600-C16-4表示將平均分子量為600D的支鏈聚乙烯亞胺與2-(十六基二硫烷基)乙基丙烯酰酸酯(4c)按照摩爾比為4：1的比例投料制備得到的氨基脂類化合物，其核磁共振譜圖如圖5所示；。上述bPEI600-LIPID的合成方法：將bPEI600與相應比例的脂質化合物加入燒瓶中，加入乙醇溶解，反應3-12小時，使用NMR監(jiān)測丙烯酸酯的雙鍵特征峰，待其特征峰消失或者相對含量不再變化時，將反應物在40℃以下濃縮至最小體積，然后用大量鹽酸丙酮溶液沉淀，離心后沉淀物真空干燥后用少量DCM溶解，再次使用鹽酸丙酮溶液沉淀，離心干燥后得到最終產(chǎn)物。三、TEPA-LIPID的合成按照以下合成路線3制備：上述TEPA-C12的合成方法：取干燥過的TEPA(30mg，0.159mmol，1eq)以及263.1mg的2-(十二基二硫烷基)乙基丙烯酰酸酯(化合物4b)(263.1mg，0.792mmol，5eq)，用5mL乙醇溶解，室溫反應24小時，粗產(chǎn)物使用柱色譜(80％DCM,，18％甲醇，2％氨水作為流動相)分離，獲得不同取代度的氨基脂質類化合物，R為通式iii'基團，其中，R4為十二烷基，q為2，V為氧，R3為氫。表格2.不同取代度的TEPA-C12的質譜表征名稱m/z[M+H+]TEPA-C12-4(異構體3)15181519TEPA-C12-5(異構體2)18501853TEPA-C12-6(異構體1)21822187實施例2聚合物-siRNA復合物的制備將siRNA用無RNase水(無核糖核酸酶)配制成儲存液(20μM)，然后用HEPES緩沖液(pH＝6.8,50mM)稀釋到預定的濃度，并將氨基脂質類化合物的水溶液用鹽酸調節(jié)pH至7-8，,再用同樣的緩沖液按照預定的氮磷比稀釋，將氨基脂質類化合物溶液等體積的加入到siRNA溶液中，渦旋2-3秒，然后在37℃下孵化20-30分鐘，即得聚合物-siRNA復合物。實施例3siRNA結合能力測試將20pmolsiRNA溶解在5μLHEPES緩沖液(pH＝6.8,50mM)中，并加入梯度濃度的等體積的氨基脂質類化合物溶液，。在37℃孵化30分鐘后，加入2μL6×上樣緩沖液(40％甘油，0.05％二甲苯青FF，30mMEDTA二鈉，1：1000SYBRGoldstain)，混合均勻后，2％瓊脂糖凝膠上樣，加入TBE緩沖液(trizma堿5.4g,硼酸2.75g,EDTA二鈉0.375gand1L去離子水)，在120V電壓下進行10分鐘電泳，紫外曝光后取得siRNA的熒光圖片。結果如圖6所示，所有氨基脂質類化合物均可以在氮磷比小于等于2的比例下完全結合siRNA。為了進一步驗證氨基脂質類化合物降解后對于siRNA的結合能力，將bPEI600-C12-8在50MmDTT孵化1小時后，目的使脂質與bPEI相連的二硫鍵斷裂，再通過凝膠阻滯實驗測定其siRNA結合能力。圖7顯示了bPEI600-C12-8加入DTT之后對于siRNA的凝膠阻滯效果，從圖中可以發(fā)現(xiàn)，降解后的氨基脂質對于siRNA的結合能力迅速下降，在氮磷比等于32也無法完全結合siRNA，這說明降解后的氨基脂質復合物可以有效釋放siRNA。實施例4動態(tài)光散射和zeta電勢測試對于動態(tài)光散射實驗，按照上述實施例2的復合物制備方法，siRNA的最終濃度是50nM，與轉染實驗的濃度一致，總體積為1mL。采用文獻(Nguyen,Steeleetal.2008)中描述的方法測定了siRNA復合物的粒徑和電勢。圖8顯示了siRNA復合物在氮磷比等于10的粒徑和電勢，所有siRNA-氨基脂質復合物的粒徑在100nm到370nm之間，大部分復合物的電勢大于零，這有利于復合物進入細胞。為了驗證氨基脂質化合物的降解，bPEI600-C12-8分別在含有50mMDTT的緩沖液和未加入DTT的緩沖液中放置兩天,然后測定其在緩沖液中中的粒徑。圖9、10的結果顯示，降解后的氨基脂質的散射光子數(shù)僅為120kcps，而對照組則為946.1kcps，前者已經(jīng)無法滿足光散射發(fā)測定粒徑的要求，這說明降解后的氨基脂質溶液中基本沒有納米顆粒的存在。圖9、10的相關曲線也證實了這一點。實施例5細胞轉染實驗轉染之前，將A549-luc細胞提前24小時種在96孔板中，每孔大約5000個細胞，重復三個復孔。具體的轉染過程如下：siRNA用HEPES緩沖液稀釋到500nM濃度，加入等體積的氨基脂質類化合物溶液，混合后室溫靜置20分鐘，加入含有10％FBS的RoswellParkMemorialInstitutemedium1640培養(yǎng)基，siRNA的最終濃度為50nM。除去板中舊的培養(yǎng)基，向每個孔中加入含有復合物的培養(yǎng)基，加藥后細胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時，換液繼續(xù)培養(yǎng)48小時。螢光素酶的表達通過Promegaluciferase試劑盒測定。將螢光素酶底物用RPMI1640稀釋一倍，除去細胞中的所有培養(yǎng)基，每孔加入70μL底物，震蕩10分鐘，然后轉移到光學檢測板上通過熒光照度計檢測化學發(fā)光強度，轉染效率以未加藥細胞的熒光強度作為參照歸一化處理得到。結果如圖11所示，其中bPEI600-C8-8和bPEI600-C12-8顯示出了和商業(yè)轉染試劑lipofectamine2000相當?shù)幕虺聊Ч?，而且沒有表現(xiàn)出明顯的細胞毒性。按照上述方法，在低濃度siRNA轉染實驗中，如圖12所示，TEPA-C12-5和TEPA-C12-6在siRNA最終濃度為10nM也顯示了良好的基因敲除能力，優(yōu)于或者約等于商業(yè)轉染試劑Lipofectamine2000在推薦濃度下的沉默效果。實施例6流式細胞術實驗將A549-luc細胞以每孔2×106個密度種在6孔板內，培養(yǎng)24小時。復合物的制備使用Cy3標記的siRNA，同樣按照上述的過程，相應質量的氨基脂質類化合物和siRNA分別溶解在50μLHEPES緩沖液中等體積混合。室溫靜置20分鐘后，6孔板內的舊培養(yǎng)基換為1.8mL新鮮培養(yǎng)基，再加入剛才制備的復合物溶液，最終Cy3-siRNA的濃度為25nM，混合均勻后培養(yǎng)24小時。轉染完畢后，用冷的PBS溶液洗滌4-5次細胞，用胰蛋白酶消化并收集所有細胞到EP管中，PBS洗滌一次，用70％乙醇固定半小時后洗滌，最終懸浮在PBS中，300目過濾后進行流式細胞儀分析。結果如圖13所示，氨基脂質類化合物處理后細胞的熒光強度是對照的2-4倍，這說明本發(fā)明合成的氨基脂質化合物可以有效攜帶siRNA進入細胞。實施例7共聚焦顯微鏡實驗將24mm×24mm的蓋玻片放入6孔板內，A549-luc細胞以每孔1×106個密度種在6孔板內的蓋玻片上，培養(yǎng)24小時。復合物的制備使用Cy3標記的siRNA，同樣按照上述的過程，相應質量的氨基脂質和siRNA分別溶解在50μLHEPES緩沖液中等體積混合。室溫靜置20分鐘后，6孔板內的舊培養(yǎng)基換為1.8mL新鮮培養(yǎng)基，再加入剛才制備的復合物溶液，最終cy3-siRNA的濃度為分別為25nM，混合均勻后培養(yǎng)24小時。轉染完畢后，用冷的PBS溶液洗滌4-5次細胞，然后每孔用2mL4％多聚甲醛固定半個小時，吸出多聚甲醛，加入1mL2mg/mL甘氨酸水溶液浸泡5分鐘，以終止固定，用PBS洗滌兩到三次，加入1：5000的DAPI溶液使細胞核染色十分鐘，PBS洗滌兩到三次，加入70％乙醇水溶液震蕩半個小時，重復一次，以除掉未進入細胞的Cy3-siRNA。取干凈的載玻片滴小滴甘油，取出蓋玻片，小心倒扣在載玻片的甘油上面，有細胞的那一面朝下。細胞片在激光共聚焦顯微鏡下觀察，分別在405nm和543nm激發(fā)。結果如圖14所示，僅采用Cy3-siRNA孵化的細胞的細胞核周圍沒有發(fā)現(xiàn)代表Cy3-siRNA的灰白色斑點出現(xiàn)，而使用氨基脂質化合物-Cy3-siRNA復合物孵化的細胞的細胞核周圍則出現(xiàn)了較多灰白色斑點，即為Cy3-siRNA，此結果進一步驗證了流式的結果，證明bPEI600-LIPID均能攜帶siRNA進入細胞。實施例8細胞毒性測試將A549-luc細胞以每孔5000個種在96孔板中，重復三個復孔。24小時培養(yǎng)后使細胞完全貼壁。按照上面的方法分別制備不同氮磷比的復合物溶液，加入含有10％FBS的RPMI培養(yǎng)基使siRNA的最終濃度為50nM。在細胞生長48小時后，用CCK-8試劑盒測試毒性。具體方法如下，先配制含有10％CCK-8母液的培養(yǎng)基，吸出舊培養(yǎng)基，再加入CCK-8溶液，在37℃孵化1-2小時，用超級酶標儀檢測450nm的吸光度，通過以下公式計算細胞毒性:CellViability(％)＝(OD450(sample)/OD450(untreated))×100％.結果如圖15所示，可降解的氨基脂質的細胞毒性比以前合成的不可降解的氨基脂質PEI-OA-8的細胞毒性有顯著的降低。其中，PEI-OA-8的結構為：其中，R’為氫或者n’為1，R’在通式中的平均個數(shù)約為8。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。當前第1頁1 2 3