本發(fā)明屬于化學(xué)醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及2，4-咪唑啉二酮雜環(huán)衍生物及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
：Pim-1是絲氨酸/蘇氨酸激酶Pim家族中的一種。Pim-1基因最早是作為莫洛尼小鼠白血病病毒的前病毒插入點(diǎn)而被發(fā)現(xiàn)的。Pim-1作為一種原癌基因，在白血病、淋巴瘤以及前列腺癌的形成過(guò)程中均發(fā)現(xiàn)Pim-1過(guò)度表達(dá)。Pim-1基因高表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并阻滯細(xì)胞分化成熟，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。Pim-1激酶通過(guò)多種機(jī)制影響腫瘤細(xì)胞的增殖和存活：Pim-1激酶與轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖；Pim-1激酶也可通過(guò)磷酸化凋亡蛋白BAD和ASK1來(lái)增加細(xì)胞存活；Pim-1激酶通過(guò)調(diào)節(jié)多種細(xì)胞周期因子來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖。Pim-1激酶通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路，增強(qiáng)細(xì)胞存活能力。由于Pim-1蛋白激酶在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，Pim-1蛋白激酶將成為抗腫瘤藥物的重要靶標(biāo)。發(fā)展新型Pim-1蛋白激酶抑制劑作為抗腫瘤藥物具有良好的應(yīng)用前景。目前，臨床上應(yīng)用的抗腫瘤藥物種類繁多，其中化療藥物主要有烷化劑鉬絡(luò)合物抗腫瘤藥物、蒽環(huán)類抗腫瘤藥物、破壞DNA的抗生素等。此外，天然抗腫瘤藥物的研究也占有相當(dāng)大的比例，如目前臨床上常用一些藥物有喜樹堿、長(zhǎng)春新堿、紫杉醇等。然而，現(xiàn)有的抗腫瘤藥物存在著選擇性較差、毒副作用、耐藥性等問(wèn)題。尋找高效低毒的抗腫瘤藥物仍是科學(xué)家面臨的重要課題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種2，4-咪唑啉二酮雜環(huán)衍生物，其結(jié)構(gòu)如式Ⅰ所示：其中，X1、X2獨(dú)立地為O或S；Y1、Y2、Y3、Y4獨(dú)立地為C、N、O或S；R1為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基、R2、R3獨(dú)立地為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基或n＝1～4的整數(shù)；R4為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基、-CF3、-NH2或-OH；R5為-COOH、苯基、C3～C8環(huán)烷基或鹵素。作為本發(fā)明優(yōu)選的方案，X1、X2獨(dú)立地為O或S；Y1、Y2、Y3、Y4獨(dú)立地為C、N、O或S；R1為-H、C1～C4烷基、R2、R3獨(dú)立地為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基或n＝1～4的整數(shù)；R4為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基、-CF3、-NH2或-OH；R5為-COOH、苯基、C3～C8環(huán)烷基或鹵素。優(yōu)選的，X1、X2獨(dú)立地為O或S；Y1、Y2、Y3、Y4獨(dú)立地為C、N、O或S；R1為-H、C1～C4烷基、R2、R3獨(dú)立地為-H、C1～C4烷基或n＝1～4；R4為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基、-CF3、-NH2或-OH；R5為-COOH、苯基、C3～C8環(huán)烷基或鹵素。進(jìn)一步優(yōu)選的，X1、X2獨(dú)立地為O或S；Y1、Y2、Y3、Y4獨(dú)立地為C、N、O或S；R1為-H、C1～C4烷基、R2、R3獨(dú)立地為-H、C1～C4烷基或n＝1或2；R4為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基、-CF3、-NH2或-OH；R5為-COOH、苯基、C3～C8環(huán)烷基或鹵素。更進(jìn)一步優(yōu)選的，X1、X2獨(dú)立地為O或S；Y1、Y2、Y3、Y4獨(dú)立地為C、N、O或S；R1為-H、C1～C4烷基、R2、R3獨(dú)立地為-H、C1～C4烷基或n＝1或2；R4為-H、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、-CF3、-NH2或-OH；R5為-COOH、苯基、C3～C8環(huán)烷基或鹵素。最優(yōu)的，X1、X2獨(dú)立地為O或S；Y1、Y2、Y3、Y4獨(dú)立地為C、N、O或S；R1為-H、C1～C4烷基、R2、R3獨(dú)立地為-H、C1～C4烷基或n＝1或2；R4為-H、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、-CF3、-NH2或-OH；R5為-COOH或苯基。上述2，4-咪唑啉二酮雜環(huán)衍生物，當(dāng)Y1為N、O或S，Y2、Y3和Y4為C時(shí)，其結(jié)構(gòu)如式Ⅱ所示：其中，X1、X2獨(dú)立地為O或S；R1為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基、R2、R3獨(dú)立地為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基或n＝1～4的整數(shù)；R4為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基、-CF3、-NH2或-OH；R5為-COOH、苯基、C3～C8環(huán)烷基或鹵素。作為優(yōu)選的方案，X1、X2獨(dú)立地為O或S；R1為-H、C1～C4烷基、R2、R3獨(dú)立地為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基或n＝1～4的整數(shù)；R4為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基、-CF3、-NH2或-OH；R5為-COOH、苯基、C3～C8環(huán)烷基或鹵素。優(yōu)選的，X1、X2獨(dú)立地為O或S；R1為-H、R2、R3獨(dú)立地為-H、C1～C4烷基或n＝1～4；R4為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基、-CF3、-NH2或-OH；R5為-COOH、苯基、C3～C8環(huán)烷基或鹵素。進(jìn)一步優(yōu)選的，X1、X2獨(dú)立地為O或S；R1為-H、R2、R3獨(dú)立地為-H、C1～C4烷基或n＝1或2；R4為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基、-CF3、-NH2或-OH；R5為-COOH、苯基、C3～C8環(huán)烷基或鹵素。更進(jìn)一步優(yōu)選的，X1、X2獨(dú)立地為O或S；R1為-H、R2、R3獨(dú)立地為-H、C1～C4烷基或n＝1或2；R4為-H、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、-CF3或-NH2；R5為-COOH、苯基、C3～C8環(huán)烷基或鹵素。最優(yōu)的，X1、X2獨(dú)立地為O或S；R1為-H、R2、R3獨(dú)立地為-H、C1～C4烷基或n＝1或2；R4為-H、C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、-CF3或-NH2；R5為-COOH或苯基。上述2，4-咪唑啉二酮雜環(huán)衍生物，當(dāng)Y2為N、O或S，Y1、Y3和Y4為C時(shí)，其結(jié)構(gòu)如Ⅲ所示：其中，X1、X2獨(dú)立地為O或S；R1為-H、C1～C4烷基、R2、R3獨(dú)立地為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基或n＝1～4的整數(shù)；R4為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基、-CF3、-NH2或-OH；R5為-COOH、苯基、C3～C8環(huán)烷基或鹵素。優(yōu)選的，X1、X2獨(dú)立地為O或S；R1為-H、R2、R3獨(dú)立地為-H或C1～C4烷基；R4為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基、-CF3、-NH2或-OH。進(jìn)一步優(yōu)選的，X1、X2獨(dú)立地為O或S；R1為-H或R2、R3獨(dú)立地為-H或C1～C4烷基。最優(yōu)的，X1、X2獨(dú)立地為O或S；R1為-H或R2、R3獨(dú)立地為-H。上述2，4-咪唑啉二酮雜環(huán)衍生物，當(dāng)Y1和Y2為N，Y3和Y4為C時(shí)，其結(jié)構(gòu)如式Ⅳ所示：其中，X1、X2獨(dú)立地為O或S；R1為-H、C1～C4烷基、R2、R3獨(dú)立地為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基或n＝1～4的整數(shù)；R4為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基、-CF3、-NH2或-OH；R5為-COOH、苯基、C3～C8環(huán)烷基或鹵素。優(yōu)選的，X1、X2獨(dú)立地為O或S；R1為-H或R2、R3獨(dú)立地為-H或C1～C4烷基；R4為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基、-CF3、-NH2或-OH。進(jìn)一步優(yōu)選的，X1、X2獨(dú)立地為O或S；R1為-H；R2、R3獨(dú)立地為-H或C1～C4烷基。最優(yōu)的，X1、X2獨(dú)立地為O或S；R1為-H；R2、R3獨(dú)立地為-H。上述2，4-咪唑啉二酮雜環(huán)衍生物，當(dāng)Y1為N、O或S，Y3為N，Y2和Y4為C時(shí)，其結(jié)構(gòu)如式Ⅴ所示：其中，X1、X2獨(dú)立地為O或S；R1為-H、C1～C4烷基、R2、R3獨(dú)立地為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基或n＝1～4的整數(shù)；R4為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基、-CF3、-NH2或-OH；R5為-COOH、苯基、C3～C8環(huán)烷基或鹵素。優(yōu)選的，X1、X2獨(dú)立地為O或S；R1為-H、C1～C4烷基或R2、R3獨(dú)立地為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基或n＝1～4的整數(shù)；R4為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基、-CF3、-NH2或-OH；R5為-COOH、苯基、C3～C8環(huán)烷基或鹵素。進(jìn)一步優(yōu)選的，X1、X2獨(dú)立地為O或S；R1為-H、C1～C4烷基或R2、R3獨(dú)立地為-H、C1～C4烷基、鹵素或C1～C4烷氧基；R4為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基、-CF3、-NH2或-OH。更進(jìn)一步優(yōu)選的，X1、X2獨(dú)立地為O或S；R1為-H、C1～C4烷基或R2、R3獨(dú)立地為-H；R4為-H、C1～C4烷基或-OH。最優(yōu)的，X1、X2獨(dú)立地為O或S；R1為-H、C1～C4烷基或R2、R3獨(dú)立地為-H；R4為-H或-OH。上述2，4-咪唑啉二酮雜環(huán)衍生物，當(dāng)Y1為N或S，Y2和Y3為C，Y4為N時(shí)，其結(jié)構(gòu)如式Ⅵ所示：其中，X1、X2獨(dú)立地為O或S；R1為-H、C1～C4烷基、R2、R3獨(dú)立地為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基或n＝1～4的整數(shù)；R4為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基、-CF3、-NH2或-OH；R5為-COOH、苯基、C3～C8環(huán)烷基或鹵素。優(yōu)選的，X1、X2獨(dú)立地為O或S；R1為-H或R2、R3獨(dú)立地為-H或C1～C4烷基；R4為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基、-CF3、-NH2或-OH。進(jìn)一步優(yōu)選的，X1、X2獨(dú)立地為O或S；R1為-H；R2、R3獨(dú)立地為-H或C1～C4烷基。最優(yōu)的，X1、X2獨(dú)立地為O或S；R1為-H；R2、R3獨(dú)立地為-H。上述2，4-咪唑啉二酮雜環(huán)衍生物，其結(jié)構(gòu)式為：本發(fā)明還提供了上述2，4-咪唑啉二酮雜環(huán)衍生物的制備方法，合成路線如下：其中，X1、X2獨(dú)立地為O或S；Y1、Y2、Y3、Y4獨(dú)立地為C、N、O或S；R1為-H、C1～ C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基、R2、R3獨(dú)立地為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基或n＝1～4的整數(shù)；R4為-H、C1～C4烷基、鹵素、C1～C4烷氧基、-CF3、-NH2或-OH；R5為-COOH、苯基、C3～C8環(huán)烷基或鹵素。上述2，4-咪唑啉二酮雜環(huán)衍生物的制備方法，包括以下步驟：將咪唑啉二酮原料、雜環(huán)甲醛和哌啶在乙醇中回流反應(yīng)24h，然后加入少量水，再用乙酸酸化，得到粗產(chǎn)品，最后經(jīng)重結(jié)晶或柱層析純化后得式Ⅰ化合物。其中，上述2，4-咪唑啉二酮雜環(huán)衍生物的制備方法，所述咪唑啉二酮原料、雜環(huán)甲醛和哌啶的摩爾比為1︰1︰0.8。本發(fā)明還提供了上述2，4-咪唑啉二酮雜環(huán)衍生物藥學(xué)上可接受的鹽或水合物。一種藥物組合物，是由式Ⅰ～式Ⅵ所示的2，4-咪唑啉二酮雜環(huán)衍生物及其鹽或水合物添加藥學(xué)上可以接受的輔助性成分制備而成的。本發(fā)明還提供了上述式Ⅰ～式Ⅵ所示的2，4-咪唑啉二酮雜環(huán)衍生物及其鹽或水合物在制備Pim-1蛋白激酶小分子抑制劑中的用途。本發(fā)明還提供了上述式Ⅰ～式Ⅵ所示的2，4-咪唑啉二酮雜環(huán)衍生物及其鹽或水合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。本發(fā)明提供的2，4-咪唑啉二酮雜環(huán)衍生物對(duì)Pim-1蛋白激酶小分子有較好的抑制作用，具有重要的開發(fā)應(yīng)用前景。具體實(shí)施方式2，4-咪唑啉二酮雜環(huán)衍生物的制備方法，包括以下步驟：將咪唑啉二酮原料、雜環(huán)甲醛和哌啶在乙醇中回流反應(yīng)24h，然后加入少量水，再用乙酸酸化，得到粗產(chǎn)品，最后經(jīng)重結(jié)晶或柱層析純化后得式Ⅰ化合物。其中，上述2，4-咪唑啉二酮雜環(huán)衍生物的制備方法，所述咪唑啉二酮原料、雜環(huán)甲醛和哌啶的摩爾比為1︰1︰0.8。實(shí)施例15-((2-噻吩)-2-乙烯基)-咪唑啉-2,4-二酮(化合物1)的合成稱取2，4-咪唑啉二酮20mmol，2-噻吩甲醛20mmol，哌啶16mmol于圓底燒瓶中，用EtOH(乙醇)150mL溶解，混合液回流反應(yīng)24h。然后加入少量水，用乙酸酸化后得到粗產(chǎn)品，甲醇重結(jié)晶后得得到化合物1，收率50％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ6.04(s,1H),6.52(s,1H),7.50-7.55(m,1H),7.70-7.74(m,1H), 8.10-8.13(m,1H),10.03(s,1H)。實(shí)施例2化合物2～39的合成采用與實(shí)施例1相同的操作步驟，以相應(yīng)原料與2，4-咪唑啉二酮反應(yīng)，制備得到化合物2～39?；衔?～39的結(jié)構(gòu)式、中文名稱及其分子量見(jiàn)表1所示。表1化合物2～39的結(jié)構(gòu)式、中文名稱及其分子量實(shí)施例35-((2-呋喃)-2-乙烯基)-3-甲基-咪唑啉-2,4-二酮(化合物40)的合成將2，4-咪唑啉二酮(1.0equiv)溶解于40mL甲苯中，加入N,N-dimethylacetamidedimethylacetal(N,N-二甲基乙酰胺二甲基縮醛)(3.0equiv),反應(yīng)液110℃攪拌2h后冷卻到室溫在冷卻到0℃15min。過(guò)濾得到濾渣，濾渣用甲苯洗5次后真空干燥后得3-methylimidazolidine-2,4-dione(3-甲基-咪唑啉-2,4-二酮)。收率50％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ3.04(s,3H),3.99(s,2H),6.09(s,1H)。稱取3-methylimidazolidine-2,4-dione(3-甲基-咪唑啉-2,4-二酮)20mmol,2-呋喃甲醛20mmol，哌啶16mmol于圓底燒瓶中，用EtOH(150mL)溶解，混合液回流24h。加入少量水，用乙酸酸化后得粗產(chǎn)品，甲醇重結(jié)晶后得到化合物40，收率45％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ3.05(s,3H),6.04(s,1H),6.54(s,1H),6.85-6.89(m,1H),7.66-7.70(m,1H),8.14-8.17(m,1H)。實(shí)施例45-((2-呋喃)-2-乙烯基)-1,3-二甲基-咪唑啉-2,4-二酮(化合物41)的合成在2，4-咪唑啉二酮(1.0equiv)和K2CO3(3.0equiv)的干燥DMF(N,N-二甲基甲酰胺)5mL溶液中加入MeI(碘甲烷3equiv)，在60℃攪拌反應(yīng)12h。然后加入水后中止反應(yīng)，混合液用乙酸乙酯萃取3次，有機(jī)相用鹽水洗，無(wú)水Na2SO4干燥，過(guò)濾濃縮后柱層析純化得1,3-Dimethylimidazolidine-2,4-dione(1,3-二甲基-咪唑啉-2,4-二酮)，收率54％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ2.87(3H,s),2.87(3H,s),3.76(2H,s)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ24.7,29.5,51.6,157.0,170.0。HRMS(ESI)：129.0664[M+H]+。稱取1,3-Dimethylimidazolidine-2,4-dione(1,3-二甲基-咪唑啉-2,4-二酮)20mmol，2-呋喃甲醛20mmol，哌啶16mmol于圓底燒瓶中，用EtOH(150mL)溶解，混合液回流24h。加入少量水，用乙酸酸化后得粗產(chǎn)品，甲醇重結(jié)晶后得到化合物41，收率35％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ3.16(s,3H),3.32(s,3H),6.55(s,1H),6.81-6.83(m,1H),7.64-7.68(m,1H),8.13-8.17(m,1H)。實(shí)施例5：5-((2-呋喃)-2-乙烯基)-3-芐基-咪唑啉-2,4-二酮(化合物42)的合成2，4-咪唑啉二酮(1.0equiv)、芐溴(1.0equiv)、氫化鈉(1.1equiv)在DMF(20mL)中室溫反應(yīng)18h，反應(yīng)液用水稀釋后用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相水洗6次后無(wú)水硫酸鈉干燥。丙酮、正己烷重結(jié)晶后得3-benzylimidazolidine-2,4-dione(3-芐基-咪唑啉-2,4-二酮)，收率40％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ3.97(s,2H),4.67(s,2H),5.78(s,1H),6.85-7.70(m,5H)；13CNMR(100MHz,CDCl3)δ41.0,46.0,127.3,127.4,128.4,136.8,157.3,171.9。HRMS(m/z):191.0815[M+H]+。稱取3-benzylimidazolidine-2,4-dione(3-芐基-咪唑啉-2,4-二酮)20mmol,2-呋喃甲醛20mmol，哌啶16mmol于圓底燒瓶中，用EtOH(150mL)溶解，混合液回流24h。加入少量水，用乙酸酸化后得粗產(chǎn)品，甲醇重結(jié)晶后得到化合物42，收率35％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ5.20(s,2H),6.02(s,1H),6.52(s,1H),6.81-6.83(m,1H),7.23-7.27(m,5H),7.64-7.68(m,1H),8.13-8.17(m,1H)。實(shí)施例6化合物43(5-((2-呋喃)-2-乙烯基)-3-異丙基-咪唑啉-2,4-二酮)的合成按照實(shí)施例5的操作步驟，以2-溴丙烷為原料與2，4-咪唑啉二酮反應(yīng)，制備得到化合物43。收率41％，分子量：220。實(shí)施例75-((2-呋喃)-2-乙烯基)-3-羧乙基-咪唑啉-2,4-二酮(化合物44)的合成將2，4-咪唑啉二酮(1.0equiv)溶于5mL乙醇(EtOH)中，加入KOH(1.2equiv)的乙醇溶液?；旌弦河?0℃攪拌1h后冰浴冷卻，生成白色固體，過(guò)濾后，沉淀用乙醇洗滌，干燥后可得產(chǎn)物potassium2,5-dioxoimidazolidin-1-ide(2，4-咪唑啉二酮鉀鹽)。將potassium2,5-dioxoimidazolidin-1-ide(2，4-咪唑啉二酮鉀鹽)(1.0.equiv)和KI(1.4equiv)溶于10mL無(wú)水DMF，緩慢加入溴乙酸叔丁酯(1.0equiv)。混合液在95℃攪拌4h。冷卻至室溫后，加入50mL水。加入乙醚萃取。有機(jī)相用飽和NaHCO3，鹽水洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥。蒸干溶劑后殘留物柱層析得到N上取代產(chǎn)物N-Boc-2，4-咪唑啉二酮。將2-呋喃甲醛(1.0equiv)，N-Boc-2，4-咪唑啉二酮(1.0equiv)和哌啶(3.0equiv)稱入圓底燒瓶，加入150mL乙醇溶解?；旌弦夯亓?4h后加入水，然后加入乙酸酸化，生成沉淀。 過(guò)濾，用無(wú)水乙醇洗滌沉淀得產(chǎn)物tert-butyl2-(4-(furan-2-ylmethylene)-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)acetate((5-((2-呋喃)-2-乙烯基)--3-N-Boc)-咪唑啉-2,4-二酮)。將tert-butyl2-(4-(furan-2-ylmethylene)-2,5-dioxoimidazolidin-1-yl)acetate(5-((2-呋喃)-2-乙烯基)-3-N-Boc)-咪唑啉-2,4-二酮)加入圓底燒瓶中，加入二氯甲烷溶解，滴加TFA，反應(yīng)2h，蒸干TFA(三氟乙酸)和二氯甲烷，在殘留物中加入乙酸乙酯生成固體，過(guò)濾并用乙酸乙酯多次洗滌，最后烘干后得到化合物44。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ4.46(s,2H),6.00(s,1H),6.55(s,1H),6.80-6.82(m,1H),7.64-7.66(m,1H),8.14-8.17(m,1H),10.89(s,1H)。實(shí)施例85-((2-呋喃)-2-乙烯基)-3-乙基-咪唑啉-2,4-二酮(化合物45)的合成按照實(shí)施例5的操作步驟，以溴乙烷為原料與2，4-咪唑啉二酮反應(yīng)，制備得到化合物45。收率42％，分子量：206。實(shí)施例95-((2-(5-苯基噻吩)-2-乙烯基)-咪唑啉-2,4-二酮(化合物46)的合成將5-bromo-thiophene-2-carbaldehyde(5-溴噻吩-2-甲醛)(1.0equiv)和phenylboronicacid(苯硼酸)(2.0equiv)溶解于20mL甲苯，20mL乙醇和5mL2N的Na2CO3混合溶液中，反應(yīng)體系脫氧三次后，加入5mol％的Pd(PPh3)4(四三苯基磷鈀),反應(yīng)液加熱回流4h，冷卻后，過(guò)濾固體，水相用乙酸乙酯萃取2次，有機(jī)相合并后無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮后柱層析純化得5-phenylthiophene-2-carbaldehyde(5-苯基噻吩-2-甲醛)，收率99％。1HNMR(CDCl3,400MHz):δ7.32-7.38(m,4H),7.59-7.61(m,2H),7.67(d,J＝3.8Hz,1H),9.82(s,1H)。13CNMR(CDCl3,100MHz):δ123.1,125.4,128.2,128.4,132.1,136.3,141.5,153.3,181.8。MS(ESI):m/z＝189.0[M+H]+。稱取2，4-咪唑啉二酮20mmol,5-phenylthiophene-2-carbaldehyde(5-苯基噻吩-2-甲醛)20mmol，哌啶16mmol于圓底燒瓶中，用EtOH(150mL)溶解，混合液回流24h。加入少量水，用乙酸酸化后得粗產(chǎn)品，柱層析純化得到化合物46，收率40％。1HNMR(CDCl3,400MHz):δ5.89(s,1H),6.55(s,1H),7.41-7.51(m,3H),7.75-7.79(m, 2H),8.00-8.05(m,1H),8.20-8.24(m,1H),10.42(s,1H)。實(shí)施例10化合物47～51的合成采用與實(shí)施例9相同的操作步驟，制備得到化合物47～51?；衔?7～51的結(jié)構(gòu)式、中文名稱及其分子量見(jiàn)表1所示。表1化合物47～51的結(jié)構(gòu)式、中文名稱及其分子量實(shí)施例115-(2-(5-苯基-吡咯)-2-乙烯基)-咪唑啉-2,4-二酮(化合物52)的合成在NaH(1.0equiv)的THF溶液中，5℃時(shí)滴加diethyl(2-oxo-2-phenylethyl)phosphonate(二乙基(2-氧代-2-苯乙基)膦酸)(1.0equiv)。反應(yīng)液室溫?cái)嚢璋胄r(shí)。室溫滴加oxazole-4-carbaldehyde(惡唑-4-甲醛)(1.0equiv)的THF溶液。反應(yīng)液室溫?cái)嚢璋胄r(shí)，加入2N的HCl酸化，乙酸乙酯萃取，有機(jī)相合并后無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮后柱層析純化得3-(oxazol-4-yl)-1-phenylprop-2-en-1-one(3-(4-惡唑基)-1-苯基-2-丙烯-1-酮，收率：80％。1HNMR(400MHz,DMSO)δ7.56-7.60(m,2H),7.66(d,J＝15.6Hz,1H),7.66-7.70(m, 1H),7.74(d,J＝15.6Hz,1H),8.03-8.05(m,2H),8.56(s,1H),8.50(s,1H)。13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ122.7,128.3,128.9,132.5,133.2,136.4,137.3,141.9,153.1,189.1。HRMS(ESI)200.0706[M+H]+。將3-(oxazol-4-yl)-1-phenylprop-2-en-1-one(3-(4-惡唑基)-1-苯基-2-丙烯-1-酮，1.0equiv)溶解于6.0mLTHF中，室溫下加入6.0mL2N的NaOH溶液。反應(yīng)液70℃攪拌14h，冷卻到室溫，用鹽水稀釋后，乙酸乙酯萃取，有機(jī)相濃縮后柱層析純化得5-phenyl-1H-pyrrole-2-carbaldehyde(5-苯基-1H-吡咯-2-甲醛)，收率：80％。1HNMR(400MHz,DMSO)δ6.79(d,J＝4.0Hz,1H),7.08(d,J＝4.0Hz,1H),7.30-7.34(m,1H),7.40-7.44(m,2H),7.88-7.91(m,2H),9.49(s,1H),12.41(s,1H)。13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ108.9,121.9,125.5,128.0,128.8,130.8,133.8,139.5,178.8。HRMS(ESI)172.0756[M+H]+。稱取2，4-咪唑啉二酮20mmol,5-phenyl-1H-pyrrole-2-carbaldehyde(5-苯基-1H-吡咯-2-甲醛)20mmol，哌啶16mmol于圓底燒瓶中，用EtOH(150mL)溶解，混合液回流24h。加入少量水，用乙酸酸化后得粗產(chǎn)品，甲醇重結(jié)晶后得到化合物52，收率40％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ6.02(s,1H),6.54(s,1H),6.75(d,J＝4.0Hz,1H),7.05(d,J＝4.0Hz,1H),7.31-7.35(m,1H),7.40-7.47(m,2H),7.89-7.92(m,2H),9.49(s,1H),10.41(s,1H)。實(shí)施例12化合物53、54的合成采用與實(shí)施例11相同的操作步驟，制備得到化合物53、54?；衔?3、54的結(jié)構(gòu)式、中文名稱及其分子量見(jiàn)表1所示。表1化合物53、54的結(jié)構(gòu)式、中文名稱及其分子量實(shí)施例135-(2-(5-苯基-惡唑)-2-乙烯基)-咪唑啉-2,4-二酮(化合物55)的合成propargylamide(炔丙基苯酰胺)1.0equiv和NIS(N-碘代二酰亞胺)1.2equiv溶解于4mL現(xiàn)置的干燥二氯甲烷中。反應(yīng)液室溫?cái)嚢?h后加入硫代硫酸鈉。用乙醚萃取有機(jī)相，合并有機(jī)相后用鹽水洗，無(wú)水MgSO4，干燥過(guò)濾，濃縮后柱層析純化后得(E)-5-(Iodomethylene)-2-phenyl-4,5-dihydrooxazole((E)-5-(碘代甲基)-2-苯基-4,5-二氫惡唑)，收率:90％。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ4.63(d,J＝3.2Hz,2H),5.78(t,J＝3.2Hz,1H),7.45(t,J＝7.6Hz,2H),7.53(t,J＝7.6Hz,1H),7.86-8.04(m,2H)。13CNMR(100MHz,CDCl3):δ47.0,61.0,126.3,127.8,128.4,131.9,157.8,163.8。將(E)-5-(Iodomethylene)-2-phenyl-4,5-dihydrooxazoler(E)-5-(碘代甲基)-2-苯基-4,5-二氫惡唑)0.2mmol溶解于2mL二氯甲烷溶液中，在O2氛圍下80℃攪拌，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程，反應(yīng)完成后蒸發(fā)溶劑，柱層析純化得2-Phenyloxazole-5-carbaldehyde(2-苯基惡唑-5-甲醛)，收率：80％。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.47-7.57(m,3H),7.96(s,1H),8.18(d,J＝7.2Hz,2H),9.82(s,1H)。13CNMR(100MHz,CDCl3):δ126.0,127.8,129.2,132.4,139.2,149.7,165.6,176.4。HRMS(ESI-TOF)m/z:174.0555[M+H]+。稱取2，4-咪唑啉二酮20mmol,2-Phenyloxazole-5-carbaldehyde(2-苯基惡唑-5-甲醛)20mmol，哌啶16mmol于圓底燒瓶中，用EtOH(150mL)溶解，混合液回流24h。加入少量水，用乙酸酸化后得粗產(chǎn)品，甲醇重結(jié)晶后得到化合物55，收率35％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ6.01(s,1H),6.55(s,1H),7.41-7.47(m,3H),7.92(s,1H),8.08(d,J＝7.2Hz,2H),10.03(s,1H)。實(shí)施例145-((2-(5-間羥基苯基-惡唑)-2-乙烯基-)咪唑啉-2,4-二酮(化合物56)的合成按照實(shí)施例13的操作步驟，以2-間羥基苯基惡唑-5-甲醛為原料與2，4-咪唑啉二酮反應(yīng)， 制備得到化合物56。收率40％，分子量：271。實(shí)施例155-((2-(5-苯基-噻唑)-2-乙烯基-)咪唑啉-2,4-二酮(化合物57)的合成thiobenzamide(硫代苯甲酰胺)(1.0equiv)、5-溴噻吩-2甲醛(1.0equiv)和2-chloromalonedialdehyde(2-氯丙二醛)溶解于丙酮中回流反應(yīng)2h。反應(yīng)完成后加入水稀釋，用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)濾，濃縮后柱層析純化得2-phenylthiazole-5-carbaldehyde(2-苯基噻唑-5-甲醛)。稱取2，4-咪唑啉二酮20mmol,2-Phenylthiazole-5-carbaldehyde(2-苯基噻唑-5-甲醛)20mmol，哌啶16mmol于圓底燒瓶中，用EtOH(150mL)溶解，混合液回流24h。加入少量水，用乙酸酸化后得粗產(chǎn)品，甲醇重結(jié)晶后得到化合物57，收率41％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ6.02(s,1H),6.52(s,1H),7.42-7.51(m,3H),8.00-8.04(m,2H),8.60(s,1H),10.04(s,1H)。實(shí)施例16本發(fā)明化合物的激酶抑制活性檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)的目的是檢測(cè)所發(fā)明化合物對(duì)體外激酶的抑制活性，采用的方法為同位素標(biāo)記法。本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)3種激酶進(jìn)行體外活性測(cè)試，包括PIM-1、PIM-2、PIM-3。受試化合物的激酶抑制活性用IC50來(lái)表示。PIM1、PIM2和PIM3均購(gòu)于美國(guó)MilliporeCorporation公司。1)試驗(yàn)方法：在384孔V型底的聚丙烯板中，加入10μL不同濃度的目標(biāo)化合物(100μM,30μM,10μM,3μM,1μM,0.3μM,0.1μM,0.01μM,0.001μM)，再依次加入①20μL人重組PIM1(50pM)[或PIM2(500pM)，或PIM3(300pM)]，②底物肽(biotin-C6linker-VRRLRRLTAREAA)(20μM)，③20μLλ-[33P]-ATP(5μM,2mCi/μmol)，緩沖液25mMHEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)，pH7.4，0.5mMDTT(二硫蘇糖醇)，10mMMgCl2，100μMNa3VO4，0.075mg/mLTritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)。室溫下培養(yǎng)1h，輕振下加入60μL緩沖液(50mMEDTA(乙二胺四乙酸)，2MNaCl)。轉(zhuǎn)入鏈霉親和素涂覆的384孔V型底的聚丙烯板中，室溫孵化30min，用0.05％吐溫20的PBS(磷酸緩沖溶液)溶液洗三次后，在液閃讀數(shù)儀(WallacMicroBetaTrilux,Turku,Finland)定量測(cè)定放射性PtdIns(3)P，計(jì)算IC50值。2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：表1本發(fā)明化合物對(duì)激酶的IC50(uM)化合物PIM-1PIM-2PIM-311.8567821.7456532.6342141.3263151.2462262.8211270.6231483.6325492.61227108.13447117.92956128.02116136.83919140.31232156.36429166.93325177.421241813.215471911.828462017.93216217.42528229.615682313.214212415.32715252.9184326182127277.93524283.82831291229253093020318.91722327.92030338.81822346.7223835122433368.12824379.24239385.5643139172228404.92142413.8556142143219434.73625448.34651456.13654464.66348478.35345485.74354498.86285509.632445112663652144275538.44336544.94674555.75547566.37868578.26654表1中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物1～57對(duì)Pim-1激酶具有明顯的抑制活性。所有化合物對(duì)PIM-1激酶的活性抑制IC50<20uM。實(shí)施例中的化合物對(duì)PIM-2,Pim-3激酶的活性也有相當(dāng)?shù)囊种谱饔?。?shí)施例17Pim-1蛋白激酶小分子抑制劑的體外腫瘤細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)本發(fā)明的抑制Pim-1蛋白激酶的小分子是一類高效低毒的抗腫瘤活性化合物，對(duì)多種惡性腫瘤有明顯療效。A549為人肺腺癌細(xì)胞，購(gòu)買于AmericanTypeCultureCollection(ATCC,Rockville,MD,USA)。B16為黑色素瘤細(xì)胞，購(gòu)買于AmericanTypeCultureCollection(ATCC,Rockville,MD, USA)。PC-3為前列腺癌細(xì)胞，購(gòu)買于AmericanTypeCultureCollection(ATCC,Rockville,MD,USA)。DU145為前列腺癌細(xì)胞，購(gòu)買于AmericanTypeCultureCollection(ATCC,Rockville,MD,USA)。細(xì)胞培養(yǎng)用胎牛血清購(gòu)杭州四季青生物工程公司1)試驗(yàn)方法：用一組腫瘤細(xì)胞系，即A549，B16，PC-3，DU145來(lái)檢測(cè)上述小分子的體外抗腫瘤活性。A549，B16，PC-3，DU145細(xì)胞用5％胎牛血清的RPIM1640培養(yǎng)基(含100U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素)。在含5％CO2:(v/v)飽和濕度培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)至7-8成滿的時(shí)候，用消化液消化細(xì)胞，1000rpm離心富集細(xì)胞，PBS洗滌一次后按照1/6每瓶分瓶培養(yǎng)于新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)操作。在96孔板中接種最終密度為10000個(gè)細(xì)胞/mL的腫瘤細(xì)胞。利用試驗(yàn)化合物處理細(xì)胞(至少5個(gè)不同濃度)，每濃度均作6個(gè)平行孔，另設(shè)空白孔和對(duì)照孔，藥物作用期間，用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，在37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)后，每孔加入5g/L的MTT(四唑溴鹽)20μL，培養(yǎng)4h，棄上清液，加DMSO(二甲基亞砜)約100μL/孔，振蕩10min，使紫色結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm處的吸光度。根據(jù)IC50的值表示試驗(yàn)化合物的細(xì)胞毒性。上述值表示6個(gè)平行樣的平均值。2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：表2本發(fā)明化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用化合物A549B16PC-3DU145113.925.367.921.8221.64.856.833.034.932.923.144.8434.246.234.921.9518.512.714.915.3622.113.88.518.570.824.811.71.2812.117.521.729.5912.932.721.946.2107.929.512.344.81123.819.314.633.6126.813.212.743.91322.646.325.324.8140.613.72.722.81518.55.825.113.31614.511.415.617.41713.221.823.511.5183.811.927.714.6199.67.224.213.82014.513.335.215.72121.821.525.632.1225.84.613.616.4238.813.316.421.5246.97.813.215.52513.67.912.732.82623.822.612.912.52716.913.215.417.52825.42.92.48.62915.717.841.326.1309.56.315.826.9313.813.228.415.9320.91.28.87.63325.716.212.515.33416.423.527.213.13511.40.523.527.1367.49.312.413.2375.87.624.825.13848.132.654.222.6395.57.80.421.74022.621.632.47.54113.723.19.38.44214.722.47.66.34311.56.512.58.44412.423.528.629.74522.421.613.517.64614.78.422.65.34724.521.55.932.7483.70.712.020.5494.818.516.722.4505.220.813.112.9519.813.231.225.15210.315.317.222.05313.26.611.117.2548.812.47.48.8556.812.77.58.6565.86.612.415.8576.50.76.86.9結(jié)果表明，在上述測(cè)試的化合物1～57都有效地抑制了A549，B16，PC-3，DU145細(xì)胞的生長(zhǎng)。出乎意料的是，它們中大多數(shù)都表示出的IC50值小于1mM，一些甚至小于100nM。其中，化合物7、14、32對(duì)A549細(xì)胞的IC50<1.0μM，化合物35、48、57對(duì)B16細(xì)胞的IC50<1.0μM，化合物39對(duì)PC-3細(xì)胞的IC50<1.0μM。同時(shí)，本發(fā)明提供的化合物在安全性、穩(wěn)定性、溶解性等方面也可能存在一定的優(yōu)勢(shì)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3