本發(fā)明涉及超分子水凝膠領域,尤其涉及以Fmoc-Glu-OMe為水凝膠因子,超聲原位合成銀納米粒子,并加入殼聚糖,與氨基酸共組裝形成一種抗菌的超分子雜合水凝膠的制備方法及應用。
背景技術:
盡管醫(yī)藥技術發(fā)展迅猛,然而在世界范圍內(nèi)每年有數(shù)百萬的人飽受由細菌引發(fā)的傳染性疾病的折磨。此外,細菌對傳統(tǒng)抗菌劑的耐藥性日益增長,由細菌引發(fā)的傳染性疾病問題仍然是亟待解決的重要健康問題。因此,設計與發(fā)展新型的抗菌劑就變得越來越重要了,尤其是在生物醫(yī)藥化學領域(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2006,103,15997-16002)??咕鷦?Antimicrobial agent)是一種能夠有效抑制某些微生物生長繁殖的材料。近年來,抗生素等抗菌劑的長期使用,使細菌對抗菌劑產(chǎn)生耐藥性,因此一些細菌已經(jīng)很難用抗生素殺死。研究持久而廣譜,高效又安全的新型抗菌材料越來越受到研究者們的關注。
超分子水凝膠(Supramolecular hydrogels)即小分子水凝膠,是分散在水中的小分子通過非共價鍵的作用自組裝形成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構的凝膠。它具有良好的生物相容性與生物降解能力,常常用于組織工程的支架,創(chuàng)傷修復,藥物輸送,生物傳感等。目前越來越多的研究者關注其作為抗菌劑的應用(Chem.Commun.,2005,35,4414-4416)。水凝膠作為抗菌劑具有吸收傷口滲出物、殺菌、保濕、促進傷口的愈合的作用。設計具有理想的抗菌性和生物相容性的超分子水凝膠復合材料對殺死細菌與促進傷口的愈合具有非常重要的意義。
銀及其化合物是最常見的抗菌劑之一,具有廣譜抗菌性,對革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、真菌等都有良好的抗菌作用。而銀納米粒子(Sliver nanoparticles)可控性好,能夠長時間釋放銀離子,能很好地實現(xiàn)特殊的表面功能化。大量研究表明,銀納米粒子的抗菌性比銀離子的抗菌性能好。又由于銀納米粒子的殺菌機理有所不同,并且與其他的普通的抗菌劑相比,到目前為止還沒有任何報道有任何細菌對其有耐藥性,因此銀納米粒子作為有效的抗菌劑的應用越來越受到人們的關注(Chem.Soc.Rev.,2014,43,1501-1518)。銀納米粒子的合成方法有很多種,包括化學還原法、光化學還原法、電化學還原法、超聲還原法、微波法、紫外輻射法等等(Advances in Colloid and Interface Science,2009,145,83-96)。其中超聲還原法非常便捷,成本低廉,適于大規(guī)模生產(chǎn),無需添加任何的還原劑與穩(wěn)定劑等有毒的化學試劑,綠色環(huán)保。
目前有很多文獻和專利都報道了以銀納米粒子凝膠作為抗菌劑,但大都是分散不均勻,團聚現(xiàn)象較嚴重,抗菌性能受到嚴重影響(中國發(fā)明專利公開說明書CN102218155A);或者在制備銀納米粒子時,使用了毒性較大的化學試劑,細胞毒性較大,生物相容性相對較差(中國發(fā)明專利公開說明書CN101664563A);或者制備工藝比較復雜,生產(chǎn)成本較高,難以規(guī)?;瘧?中國發(fā)明專利公開說明書CN102698313A)。
殼聚糖(Chitosan)是一種親水性的高分子聚合物,由甲殼素脫N-乙?;玫?,是具有生物相容性且能被生物降解的聚電解質(zhì),具有廣泛的生物醫(yī)藥和工業(yè)用途(Biomacromolecules,2003,4,1457-1465)。殼聚糖有良好的廣譜抗菌活性,能抑制一些真菌、細菌和病毒的生長繁殖。同時,殼聚糖具有促進血液凝固的作用,可用作止血劑。它還可用于傷口填料物質(zhì),具有滅菌、吸收傷口滲出物、不易脫水收縮等作用,能夠有效促進傷口的愈合。殼聚糖也具有良好的吸濕、保濕、調(diào)理、抑菌等功能,還常用于化妝品。此外,殼聚糖具有增稠劑的作用,可以增強復合材料的機械強度。
利用上述原理,我們成功制備出以Fmoc-Glu-OMe為水凝膠因子,通過超聲作用形成超分子水凝膠,并在水凝膠中原位合成了銀納米粒子,殼聚糖的加入與氨基酸共組裝,將氨基酸凝膠的納米纖維變成其它納米結(jié)構,增強了水凝膠的機械強度,又能達到增強殺菌性能與促進傷口愈合的目的。本發(fā)明制備過程操作簡便,成本低,適于大規(guī)模生產(chǎn)。實驗結(jié)果表明,該超分子雜合水凝膠有望在抗菌劑與傷口愈合方面的應用等領域有很好的應用。
技術實現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的是提供一種具有優(yōu)良抗菌性的雜合超分子水凝膠的制備方法及其應用,該超分子水凝膠是澄清透明的水凝膠,具有自愈合性、可注射、可涂抹的性能,在抗菌劑與傷口愈合方面的有良好的應用前景。
本發(fā)明中的抗菌性的超分子雜合水凝膠的制備,包括以下步驟:
(1)配制一定濃度的Fmoc-Glu-OMe儲備溶液;
(2)配制一定濃度的硝酸銀儲備溶液;
(3)配制一定濃度的殼聚糖儲備溶液;
(4)將一定量的各組分儲備溶液混合搖勻,超聲即得所述的超分子雜合水凝膠。
上述的制備方法步驟(1)中,所述的Fmoc-Glu-OMe儲備溶液的溶劑為二甲基亞砜,并超聲分散0.5~1min,使Fmoc-Glu-OMe固體粉末完全溶解,F(xiàn)moc-Glu-OMe儲備溶液的濃度為100mg/mL。
上述的制備方法步驟(2)中,所述的硝酸銀儲備溶液的溶劑為超純水,硝酸銀儲備溶液的 濃度為1~4mmol/L,配制硝酸銀儲備溶液的過程中避光處理。
上述的制備方法步驟(3)中,所述的殼聚糖儲備溶液的溶劑為超純水,殼聚糖儲備溶液的濃度為10~20mg/mL,并加入體積比為1%冰乙酸促進殼聚糖的溶解。
上述的制備方法步驟(4)中,取20~40μL的Fmoc-Glu-OMe儲備溶液加入至洗凈吹干的5.0mL避光處理的螺口瓶中,快速加入480~490μL的硝酸銀儲備溶液,迅速搖勻,再加入480~490μL的殼聚糖儲備溶液,配成1.0mL的混合溶液,迅速振蕩搖勻。然后將混合液超聲30~60min,即可形成超分子雜合水凝膠,超聲過程中注意控制水溫不宜過熱。
本發(fā)明使用的水凝膠因子為Fmoc-Glu-OMe,是通過非共價鍵自組裝得到的,F(xiàn)moc-Glu-OMe水凝膠呈納米纖維網(wǎng)絡結(jié)構。該水凝膠在超聲的作用下,原位合成尺寸均勻,成單分散性銀納米粒子。另外,殼聚糖與氨基酸共組裝,增強了水凝膠的機械強度與抗菌性。
有益效果
(1)本發(fā)明制備的超分子雜合水凝膠,生物相容性好,易降解,無細胞毒性。
(2)本發(fā)明制備的超分子雜合凝膠是澄清透明的水凝膠,具有適合的硬度,彈性和粘性,非常適合皮膚涂抹,易于注射,且注射后迅速轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài),為自愈合凝膠。
(3)本發(fā)明制備過程中沒有添加任何還原劑與分散劑,通過超聲原位合成銀納米粒子,綠色環(huán)保,并且合成的銀納米粒子尺寸均勻,成單分散性。
(4)本發(fā)明加入的殼聚糖可以和氨基酸發(fā)生共組裝,增強了水凝膠的機械強度與抗菌性,更易于涂抹,便于皮膚的吸收,使其更適于作傷口敷料。
(5)本發(fā)明制備方法簡單,成本低廉,可商品化,適于大規(guī)模生產(chǎn)。
(6)本發(fā)明制備的超分子雜合水凝膠有良好的抗菌性,能有效促進傷口愈合,將會在抗菌劑與傷口敷料方面(如創(chuàng)可貼、繃帶等有很好的應用前景。
附圖說明
圖1為Fmoc-Glu-OMe超分子水凝膠(左)、Fmoc-Glu-OMe@AgNPs超分子水凝膠(中)、本發(fā)明實施例1中超分子雜合水凝膠(右)的掃描電子顯微鏡(SEM)圖;
圖2為Fmoc-Glu-OMe@AgNPs超分子水凝膠的透射電子顯微鏡(TEM)圖;
圖3為本發(fā)明實施例1中超分子雜合水凝膠的掃描透射電子顯微鏡(STEM)圖;
圖4為Fmoc-Glu-OMe超分子水凝膠(左)、本發(fā)明實施例1中超分子雜合水凝膠(右)的原子力顯微鏡(AFM)圖;
圖5分別為本發(fā)明實施例1中超分子雜合水凝膠的數(shù)碼照片圖(左)、震蕩搖散后的數(shù)碼 照片圖(中)和靜置10分鐘后自愈合的數(shù)碼照片圖(右);
圖6為本發(fā)明實施例1中超分子雜合水凝膠的X射線光電子能譜分析(XPS)圖;
圖7分別為1-5號液體培養(yǎng)基中的菌液接種固體培養(yǎng)基上12h后細菌生長狀況的數(shù)碼照片圖;
圖8為用光學顯微鏡將圖7放大50倍后的數(shù)碼照片圖;
圖9分別為體重大小相似的老鼠在涂抹本發(fā)明實施例2中超分子雜合水凝膠(左列)、涂抹商用的抗菌劑(中列)和對傷口不做任何處理(右列),四天后傷口愈合情況對比的數(shù)碼照片圖。
具體實施方式
為了便于理解本發(fā)明,下文將結(jié)合說明書附圖和具體的實施例對本發(fā)明作更全面細致地描述,但本發(fā)明的保護范圍并不限于以下具體的實施例。
實施例1
稱取10.0mg的Fmoc-Glu-OMe固體粉末,溶于100μL二甲基亞砜,超聲分散1min,使其完全溶解,制得濃度為100mg/mL的Fmoc-Glu-OMe儲備溶液;稱取20.0mg的硝酸銀于棕色避光的離心管中,加入1.0mL的超純水將其溶解,取少許硝酸銀溶液于用錫箔紙避光處理的15mL試管中,加一定量超純水稀釋,配成2mmol/L的硝酸銀水溶液作為硝酸銀儲備溶液;稱取80mg的殼聚糖,加入8.0mL的超純水將其溶解,再加入體積比為1%的冰乙酸以促進殼聚糖的溶解,配成10mg/mL的殼聚糖儲備溶液。
取20μL的Fmoc-Glu-OMe儲備溶液加入至洗凈吹干避光處理的5.0mL螺口瓶中,快速加入490μL的硝酸銀儲備溶液,迅速搖勻,再加入490μL的殼聚糖儲備溶液,迅速振蕩搖勻。將該螺口瓶放入超聲清洗器中超聲一小時后即可形成澄清透明的超分子雜合水凝膠。
抗菌實驗步驟:稱取10.0g胰蛋白胨、5.0g酵母提取物和10.0g氯化鈉于燒杯中,向燒杯中加入超純水溶解,用玻璃棒攪拌促進溶解,用氫氧化鈉調(diào)節(jié)混合液pH至7.4,然后用超純水定容至1L的錐形瓶中制備液體培養(yǎng)基。
稱取10.0g胰蛋白胨、5.0g酵母提取物、10.0g氯化鈉和15.0g瓊脂,向燒杯中加入超純水溶解,用玻璃棒攪拌促進溶解,用氫氧化鈉調(diào)節(jié)混合液pH至7.4,然后用超純水定容至1L的錐形瓶中制備液體培養(yǎng)基。
將配制好的培養(yǎng)基,用棉花塞緊瓶口,用紗布包緊,再用錫箔紙包住,棉線系緊。密封好后經(jīng)110℃高壓滅菌30分鐘。將5支15mL的離心管分別編號1-5,將4℃冰箱中凍存 的大腸桿菌(革蘭氏陰性細菌)菌液取出,于無菌操作臺,分別吸取100μL菌液,加入5支離心管。1號離心管中加入1.0mL的實例1中的超分子雜合凝膠,再加入8.9mL的液體培養(yǎng)基;2號離心管中加入1.0mL Fmoc-Glu-OMe@AgNPs水凝膠,再加入8.9mL的液體培養(yǎng)基;3號離心管中加入1.0mL Fmoc-Glu-OMe@殼聚糖水凝膠,再加入8.9mL的液體培養(yǎng)基;4號離心管中加入1.0mL Fmoc-Glu-OMe水凝膠,再加入8.9mL的液體培養(yǎng)基;5號離心管中加入1.0mL超純水,再加入8.9mL的液體培養(yǎng)基;搖勻后置于37℃恒溫空氣震蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時。取5個滅菌過的玻璃培養(yǎng)皿,分別編號1-5,將固體培養(yǎng)基加熱融化,搖勻,在冷卻未凝固前,分別倒入5個培養(yǎng)皿,每個倒20mL。從離心管中取10μL菌液,將其接種至固體培養(yǎng)基,待基底凝固后翻轉(zhuǎn)過來,置于37℃恒溫空氣震蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時以形成菌落,取出拍照,并在顯微鏡下觀察。
實施例2
取上述實施例1中的Fmoc-Glu-OMe儲備溶液20μL,加入至洗凈吹干避光處理的5.0mL螺口瓶中,快速加入490μL與實施例1配制方法相同的4mmol/L硝酸銀儲備溶液,迅速搖勻,再加入490μL與實施例1配制方法相同的20mg/mL的殼聚糖儲備溶液,迅速振蕩搖勻。將該螺口瓶放入超聲清洗器中超聲一小時后即可形成澄清透明的超分子雜合水凝膠。
老鼠實驗步驟:選用老鼠模型以研究本發(fā)明的超分子雜合水凝膠對傷口治愈的作用。整個實驗于湘雅醫(yī)學院完成,實驗所用的6只老鼠是雄性,SD大鼠,質(zhì)量大約為260g,用以評價本發(fā)明對傷口的治療效果。先將老鼠稱重,用10%的水合氯醛麻醉(按每百克體重0.3mL,腹腔注射)將老鼠麻醉,刀片將鼠背部的毛刮去,再用刀片分別割一個長2cm的十字形傷口。將大鼠分成三組:實驗組(用制得的新型銀納米粒子-殼聚糖-谷氨酸水凝膠復合物抗菌材料處理傷口、對照組(用商用的銀納米粒子抗菌劑處理傷口)和空白組(對傷口不進行任何處理),處理后分別單獨關入籠子,提供等量的食物與水,拍照記錄,連續(xù)觀察飼養(yǎng)七天,每天更換墊料、水和食物并對老鼠的傷口愈合情況進行拍照記錄。
以上顯示和描述了本發(fā)明的制備過程、主要特征和本發(fā)明的應用。本行業(yè)的技術人員應該了解,本發(fā)明不受上述實施例的限制。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權利要求書界定。