本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地，涉及一種冬凌草毛狀根的誘導(dǎo)方法及誘導(dǎo)表達冬凌草甲素的方法。
背景技術(shù)：
：冬凌草（RabdosiarubescensHemsl.Hara），別名碎米椏，為唇形科香茶菜屬植物，于1977年收入《中華人民共和國藥典》。冬凌草以莖以上部分干燥入藥，具有清熱解毒、活血止痛之功效，民間以其治療噎嗝癥(即食道癌或賁門癌)。研究表明，冬凌草主要的藥效組分——冬凌草甲素具有廣譜抗腫瘤作用，可以抑制多種腫瘤細胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，對白血病、食道癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、宮頸癌等均有抑制作用且無明顯毒副作用。我國冬凌草資源分布廣泛，但由于冬凌草生長易于受環(huán)境影響發(fā)生遺傳漂變，故變異種類較多，其藥效成分——冬凌草甲素屬于次生代謝產(chǎn)物，其合成量受種植環(huán)境的土壤、氣候影響，不同產(chǎn)地冬凌草中藥效組分含量有明顯差異。同時，藥用冬凌草的栽植期長（一年以上）且大量占用農(nóng)耕地，制約了冬凌草藥用產(chǎn)品的開發(fā)利用。植物毛狀根是利用發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒誘導(dǎo)外植體后離體培養(yǎng)生成的。毛狀根具有生長迅速、不需外源植物激素、合成次生代謝物質(zhì)能力強而且穩(wěn)定等優(yōu)點，被認為是植物次生代謝產(chǎn)物規(guī)模化合成原材料的優(yōu)勢來源。目前，已有紫草、人參、長春花、甜菜、胡蘿卜等植物的毛狀根用于工業(yè)化生產(chǎn)。發(fā)根培養(yǎng)技術(shù)將成為藥用植物次生代謝物生產(chǎn)的有效途徑。而對于冬凌草來說，目前還未有利用毛狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)體系合成冬凌草甲素的報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種冬凌草毛狀根的誘導(dǎo)方法。本發(fā)明的另一個目的是提供一種誘導(dǎo)冬凌草毛狀根合成冬凌草甲素的方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的：一種冬凌草毛狀根的誘導(dǎo)方法，包含以下步驟：以農(nóng)桿菌ATCC15834侵染冬凌草葉柄外植體20min，即可成功誘導(dǎo)毛狀根生成。作為優(yōu)選實施方案，一種冬凌草毛狀根的誘導(dǎo)方法，具體步驟如下：將冬凌草葉柄外植體接種于預(yù)培養(yǎng)固體培養(yǎng)基中進行預(yù)培養(yǎng)；將預(yù)培養(yǎng)的冬凌草外植體置于發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834菌液中浸泡20min后取出，擦干外植體表面多余的菌液，接種回預(yù)培養(yǎng)固體培養(yǎng)基進行暗培養(yǎng)；然后將外植體轉(zhuǎn)移到除菌生根培養(yǎng)基進行暗培養(yǎng)，即可成功誘導(dǎo)毛狀根生成。預(yù)培養(yǎng)固體培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常規(guī)的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基。優(yōu)選地，預(yù)培養(yǎng)固體培養(yǎng)基為含有0.2mg/L的MS固體培養(yǎng)基。優(yōu)選地，所述預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為25℃、暗培養(yǎng)1d。外植體接種回預(yù)培養(yǎng)固體培養(yǎng)基進行暗培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為25℃、暗培養(yǎng)2d。優(yōu)選地，所述除菌生根培養(yǎng)基為含400mg·L-1頭孢霉素除菌生根培養(yǎng)基。一種誘導(dǎo)冬凌草毛狀根合成冬凌草甲素的方法，包含以下步驟：以農(nóng)桿菌ATCC15834侵染冬凌草葉柄外植體20min，即可成功誘導(dǎo)毛狀根生成；將冬凌草毛狀根在B5培養(yǎng)基培養(yǎng)45d后，提取獲得冬凌草甲素。作為優(yōu)選實施方案，一種誘導(dǎo)冬凌草毛狀根合成冬凌草甲素的方法具體步驟如下：將冬凌草葉柄外植體接種于預(yù)培養(yǎng)固體培養(yǎng)基中進行預(yù)培養(yǎng)；將預(yù)培養(yǎng)的冬凌草外植體置于發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834菌液中浸泡20min后取出，擦干外植體表面多余的菌液，接種回預(yù)培養(yǎng)固體培養(yǎng)基進行暗培養(yǎng)；然后將外植體轉(zhuǎn)移到除菌生根培養(yǎng)基進行暗培養(yǎng)，即可成功誘導(dǎo)毛狀根生成；將冬凌草毛狀根接種在B5培養(yǎng)基，培養(yǎng)45d后，提取獲得冬凌草甲素。更優(yōu)選地，將冬凌草毛狀根按100mL培養(yǎng)基0.2g鮮重毛狀根的比例接種在B5培養(yǎng)基上。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明首次研發(fā)出冬凌草甲素在冬凌草毛狀根中的誘導(dǎo)合成，為毛狀根培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于冬凌草甲素規(guī)?；a(chǎn)打下基礎(chǔ)。附圖說明圖1農(nóng)桿菌15834誘導(dǎo)冬凌草毛狀根萌發(fā)。圖2冬凌草毛狀根的誘導(dǎo)及培養(yǎng)。圖3培養(yǎng)第20天的毛狀根；1.B5液體培養(yǎng)的毛狀根2.1/2MS液體培養(yǎng)的毛狀根3.N6液體培養(yǎng)的毛狀根4.MS液體培養(yǎng)的毛狀根。圖4培養(yǎng)第45天的毛狀根；1為B5液體培養(yǎng)的毛狀根2.1/2MS液體培養(yǎng)的毛狀根3.N6液體培養(yǎng)的毛狀根4.MS液體培養(yǎng)的毛狀根。圖5為薄層色譜檢測圖；1.標(biāo)準品2.培養(yǎng)上清萃取液3.濃縮后培養(yǎng)上清萃取液4.濃縮后毛狀根醇提物5.毛狀根醇提物6.培養(yǎng)上清。圖6冬凌草甲素標(biāo)準品HPLC圖。圖7冬凌草毛狀根醇提物的HPLC色譜圖。具體實施方式下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例對本發(fā)明作出進一步地詳細闡述，所述實施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。冬凌草購自網(wǎng)店(http://ttbcx.taobao.com/?spm=2013.1.1000126.4.VbJHDT)，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院中藥學(xué)副教授馬鴻雁老師鑒定為濟源冬凌草。發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC11325于廣東菌種保藏中心購買，發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834由華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的施和平教授饋贈。冬凌草甲素標(biāo)準品為美國Aladdin公司產(chǎn)品。其余試劑均為AR級實施例1發(fā)根農(nóng)桿菌的培養(yǎng)與活化：將發(fā)根農(nóng)桿菌菌液涂布YNB平板，28℃培養(yǎng)2d，挑單菌落，接種至YNB培養(yǎng)基中，28℃、160r·min-1下培養(yǎng)1d，以1%的接種量將活化后的發(fā)根農(nóng)桿菌接種到錐形瓶中，28℃，160r·min-1下培養(yǎng)30h時，即可用于侵染實驗。毛狀根的誘導(dǎo)：從冬凌草植株上剪下幼嫩的葉片、葉柄與莖部，依次用75%酒精、5s；0.1%升汞、5min；無菌單蒸水沖洗7～8次處理后，接種于預(yù)培養(yǎng)固體培養(yǎng)基中，25℃、暗培養(yǎng)1d進行預(yù)培養(yǎng)。其后，將預(yù)培養(yǎng)1d的冬凌草外植體置于以MS液體培養(yǎng)基5倍稀釋后的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中分別浸泡10、20、30min后取出，用無菌濾紙擦干外植體表面多余的菌液，之后接種回預(yù)培養(yǎng)固體培養(yǎng)基共培養(yǎng)，25℃、暗培養(yǎng)2d，然后將外植體轉(zhuǎn)移到含400mg·L-1頭孢霉素除菌生根培養(yǎng)基，25℃、暗培養(yǎng)，待毛狀根生長至3～4cm，剝離毛狀根進行后續(xù)懸浮培養(yǎng)擴增。發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC11325和發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834以10、20、30min侵染冬凌草葉片，莖部和葉柄。結(jié)果顯示，發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC11325侵染的外植體均未能誘導(dǎo)生根，培養(yǎng)5～6d，外植體大部分由綠色轉(zhuǎn)為褐化。發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834侵染葉柄20min組，暗培養(yǎng)5d始見葉柄長出白色根狀組織，第7d見大部分葉柄長出根狀組織，在部分葉柄同一部位見較多根狀物，呈白色、無向地性且多纖毛，符合毛狀根的形態(tài)及生長特征。發(fā)根農(nóng)桿菌對外植體的發(fā)根誘導(dǎo)有一定的選擇性，不同發(fā)根農(nóng)桿菌的致病力不同。本研究用發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC11325和發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834分別誘導(dǎo)冬凌草毛狀根，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC11325侵染不同部位的外植體均無法成功誘導(dǎo)冬凌草毛狀根。推測原因可能是發(fā)根農(nóng)桿菌的致根能力有一定特異性，與其所帶Ri質(zhì)粒類型和受體植物的種類有關(guān)。此外，也不排除由于采用冬凌草外植體較為幼嫩，發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC11325對細胞損傷過大導(dǎo)致無法增殖。外植體部位的選擇對誘導(dǎo)毛狀根的萌發(fā)至關(guān)重要，同一菌株在同一植物的不同部位轉(zhuǎn)化結(jié)果也有差異。實驗發(fā)現(xiàn)，發(fā)根農(nóng)桿菌感染外植體并暗培養(yǎng)5d后，大部分毛狀根均從葉柄中段以及莖部中段萌發(fā)，葉片表面未見毛狀根長出且逐漸萎縮。其可能原因是，植株中處于形態(tài)學(xué)下端的部位一般生長素含量較高，而適當(dāng)含量的生長素可使誘導(dǎo)毛狀根生成的ro1B,ro1C基因的表達增強。也可能由于不同部位的外植體分化能力不同。一般分化能力強的外植體由于處于轉(zhuǎn)化的敏感期，故誘導(dǎo)分化能力較高。本實驗結(jié)果顯示，以葉柄誘導(dǎo)最為合適。實施例2不同培養(yǎng)基對冬凌草毛狀根生長的影響：分別配制四種的基本培養(yǎng)基：MS、1/2MS、N6、B5，其中MS、N6、B5的配方參考自《植物細胞工程》，1/2MS為MS中大量元素減半，其余不變。121℃滅菌25min，冷卻到室溫備用。冬凌草毛狀根懸浮培養(yǎng)：取生長旺盛、顏色為白色的毛狀根，以每100mL培養(yǎng)基0.2g(鮮重)毛狀根的比例接種，25℃，75r·min-1，黑暗培養(yǎng)45d后取出根部并稱重。培養(yǎng)20d、45d的毛狀根情況見圖3、4。冬凌草毛狀根在不同的基本培養(yǎng)基中增殖倍數(shù)分別是B5>1/2MS>MS>N6，其中B5中毛狀根鮮重達到最大值（見表1），N6中毛狀根基本不生長并且褐化，B5、1/2MS和MS中根的形態(tài)基本一致。表1四種不同培養(yǎng)基對毛狀根的增殖倍數(shù)的影響基本培養(yǎng)基接種鮮重（g）鮮增重量（g）干增重量（g）鮮增殖倍數(shù)MS0.23.923±0.130.135±0.02919.61/2MS0.25.362±0.360.412±0.04526.8N60.20.516±0.230.043±0.0102.58B50.26.290±0.300.481±0.03331.4影響毛狀根增殖速度的因素有很多，培養(yǎng)基的種類對毛狀根生長及次生代謝物質(zhì)的積累也有很大的影響,不同植物種類有不同的最適培養(yǎng)基。據(jù)報道，毛狀根更加適合生長在鹽濃度較低的培養(yǎng)基中。本實驗中將冬凌草毛狀根接種到4種液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最終結(jié)果表明B5培養(yǎng)基增殖倍數(shù)最高，培養(yǎng)45d后增殖倍數(shù)為31.4倍，其次是1/2MS和MS培養(yǎng)基，N6最差，幾乎沒有增殖，由于B5鹽濃度<1/2MS鹽濃度<MS鹽濃度，所以推測冬凌草毛狀根更加適合生長在較低的鹽濃度的培養(yǎng)基中，而N6培養(yǎng)基由于成分簡單，可能缺少某種元素，從而冬凌草毛狀根幾乎沒有增殖。冬凌草毛狀根提取物制備：將冬凌草毛狀根烘干研磨成粉末，稱取2g冬凌草毛狀根粉末，加入6倍體積12ml的80%乙醇，超聲提取1h，過濾得到提取液，將提取液轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，濃縮至1ml。薄層色譜法檢測：取制備好的硅膠G板，點樣，展開劑為氯仿：甲醇=9:1。以標(biāo)準品為對照，標(biāo)準品在紫外光照射下的亮斑RF值為0.57，濃縮后的冬凌草毛狀根醇提物在紫外光照射下的亮斑RF值0.56，故濃縮后的冬凌草毛狀根醇提物中含有和標(biāo)準品一樣的成分（見圖5）。高效液相色譜鑒定：色譜條件PhenomsilC18(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱，冬凌草甲素檢測波長239nm，流動相甲醇-水（55：45），流速1ml/min。與冬凌草甲素標(biāo)準品對比，結(jié)果顯示：樣品的保留時間與標(biāo)準品一致，說明樣品中含有冬凌草甲素（見圖6和圖7）。薄層色譜法可以對冬凌草毛狀根合成冬凌草甲素進行定性檢測。通過與標(biāo)準品對照，在紫外光照射下，與對照品相應(yīng)的位置可見發(fā)光斑點，初步推測冬凌草毛狀根樣品中含有冬凌草甲素。同時，毛狀根培養(yǎng)液萃取物中未見具有相應(yīng)的發(fā)光斑點，顯示冬凌草甲素在冬凌草毛狀根合成后中并非以分泌方式外排。高效液相色譜法可以對冬凌草毛狀根合成冬凌草甲素進行定性與定量檢測。通過高效液相色譜的定性檢測，在與標(biāo)準品相同的出峰時間冬凌草毛狀根樣品有出峰，證明了冬凌草毛狀根中含有冬凌草甲素。本發(fā)明初步實現(xiàn)了冬凌草甲素在冬凌草毛狀根中的誘導(dǎo)合成，為毛狀根培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于冬凌草甲素規(guī)?；a(chǎn)打下基礎(chǔ)。當(dāng)前第1頁1 2 3