專利名稱：冬凌草甲素在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及冬凌草甲素的用途，尤其涉及其在制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
髓性白血病包括急性髓性白血病(AML)和慢性髓性白血病(CML)。急性髓性白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)是一種異質(zhì)性的惡性血液腫瘤，也是發(fā)生在成人中最普遍的急性白血病種類。據(jù)資料記載，僅2003年就有大約11,000個美國人被診斷為AML，其中大約75％的病人最終由于該病死亡。而在中國，每年新增急性白血病患者達(dá)四萬名之多。AML病人表現(xiàn)為造血細(xì)胞的正常分化以及凋亡途徑受阻，骨髓造血祖細(xì)胞增殖異常，導(dǎo)致骨髓及外周血中不成熟的原始細(xì)胞大量積累，影響了正常血細(xì)胞的生成與功能，導(dǎo)致患者出血、貧血并易發(fā)感染，而且白血病細(xì)胞會在肝、脾等其它臟器浸潤、播散，最終使器官功能衰竭而導(dǎo)致病人死亡。
在過去的二十年間，人們對于AML在生物學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)等方面的認(rèn)識取得了很大的進展，尤其是發(fā)現(xiàn)染色體易位參與白血病的發(fā)生。例如，1982年在M2b型AML病人中發(fā)現(xiàn)特異的t(8；21)易位，約10年后，斷裂點及受累基因被發(fā)現(xiàn)。而另外一種白血病，急性早幼粒細(xì)胞性白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)也是一種常見的血液惡性腫瘤，占急性白血病(acute myeloid leukemia，AML)的10-15％，臨床表現(xiàn)為粒細(xì)胞分化被阻滯于早幼粒細(xì)胞階段，法-美-英(FAB)分類為M3型。Larson RA及Hogge DE等于1984年發(fā)現(xiàn)該型白血病含有特異的t(15；17)染色體易位，并提出該易位與骨髓細(xì)胞分化阻滯于早幼粒細(xì)胞階段有關(guān)，1990-1991年數(shù)個研究小組幾乎同時報道了t(15；17)所致的PML-RARα融合基因，隨后又證明了其致白血病潛能。人們對AML取得巨大認(rèn)識的同時，對于AML病人的治療也取得了長足進步。例如以往對APL的治療一直采用傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性化療為主，該方法容易導(dǎo)致8-46％的病人發(fā)生致死性的顱內(nèi)出血。直到1988年，全反式維甲酸(all-transretinoid acid，ATRA)分化療法的發(fā)現(xiàn)使得該病的治療有了重大突破。上海市血液學(xué)研究所的科研小組發(fā)現(xiàn)單用ATRA即可使含有t(15∶17)易位的APL病人獲得完全緩解。隨后對其分子機制的研究發(fā)現(xiàn)，ATRA可與PML-RARα中的RARα部分結(jié)合，使核共抑制物解離，從而恢復(fù)了RARα的轉(zhuǎn)錄功能，下游靶基因得以轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞重新進入分化程序。Raelson等發(fā)現(xiàn)，ATRA處理可以特異地降解PML-RARα融合蛋白，從而使PML-RARα對野生型PML和RARα的顯性負(fù)的抑制作用被解除。1996-1997年間，我國學(xué)者再次令世界醫(yī)學(xué)界震驚，他們發(fā)現(xiàn)三氧化二砷(As2O3)不僅可以誘導(dǎo)APL細(xì)胞系NB4細(xì)胞凋亡，而且能夠特異地降解PML-RARα融合蛋白。更有意思的是，低劑量As2O3可部分誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化，而高劑量可誘導(dǎo)凋亡。臨床實驗表明As2O3可使APL初發(fā)病人及ATRA治療后復(fù)發(fā)的APL患者獲得完全緩解。而且ATRA和As2O3聯(lián)合使用不但在APL小鼠模型中取得良好效果，而且在臨床上治療APL初發(fā)病人也取得了比單獨使用ATRA及As2O3更好的治療效果。ATRA及As2O3作為靶向治療的典型已被廣泛接受。目前，ATRA和蒽環(huán)類化合物，或與三氧化二砷的聯(lián)合治療應(yīng)用，使得APL這一含特異的t(15；17)染色體易位的M3型AML在大多數(shù)患者可被治愈。雖然阿糖胞苷和含蒽環(huán)類化合物化療的應(yīng)用以及先進的支持治療，使得其它類型AML的預(yù)后也逐漸得以改善，并使約75-80％的AML病人得到臨床緩解，但大部分病人仍會復(fù)發(fā)。干細(xì)胞移植過于昂貴且供體有限、移植相關(guān)死亡亦達(dá)25％-30％，故難以推廣。而且，對年紀(jì)大的AML患者而言，大劑量化療的效果仍然不理想。因此，有必要開發(fā)新的藥物以治療該類疾病。由于凋亡是多細(xì)胞動物用于排除有害細(xì)胞的重要機制，并在發(fā)育、免疫系統(tǒng)成熟、組織動態(tài)平衡和衰老中起著重要作用，因而發(fā)展選擇性誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的藥物也已成為治療AML的一種可行的途徑。
冬凌草甲素及香茶菜屬二萜類化合物抗腫瘤研究進展香茶菜屬植物是我國民間廣泛使用的草藥，它們大都具有清熱解毒、活血化淤、抗菌消炎，抗腫瘤等功效。特別是河南等省產(chǎn)的冬凌草，除用于抗菌消炎外，還應(yīng)用于食道癌、賁門癌等癌癥。這類植物富含二萜化合物，特別是結(jié)構(gòu)獨特的對映-貝殼杉烷類二萜化合物。冬凌草甲素(oridonin)是從唇形科香茶菜屬植物中分離出的一種貝殼杉烯二萜類(ent-kau-renediterpenoid)天然有機化合物，該化合物中的α-亞甲基環(huán)戊酮結(jié)構(gòu)和抗腫瘤活性相關(guān)，也有報道該分子中的7β-OH和14β-OH亦被認(rèn)為與腫瘤細(xì)胞中特殊酶的結(jié)合位點而起著增強抗癌活性的作用。冬凌草甲素為無色棱柱狀結(jié)晶，不溶于水，可溶于乙醚、甲醇、乙醇等有機溶劑。以前人們對冬凌草甲素多種生物學(xué)活性有了初步的認(rèn)識，如免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗炎、抗腫瘤活性。最近的實驗室和臨床前實驗研究數(shù)據(jù)提示了冬凌草甲素具有強烈的抗腫瘤活性，對多種實體腫瘤有效，如前列腺癌，乳腺癌，非小細(xì)胞肺癌以及肝癌、食管癌、胰腺癌等。
M2b型白血病的發(fā)病機制概述急性髓系白血病(acute myeloidleukemia，AML)是因轉(zhuǎn)化的骨髓干、祖細(xì)胞增殖而形成的惡性血液疾病，而染色體易位是導(dǎo)致造血祖細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的最常見的原因。其中t(8；21)(q22；q22)易位的白血病約占10-15％，在M2b型白血病中更是占到了40％-80％以上。在形態(tài)學(xué)上含有t(8；21)易位的白血病90％以上屬于M2b亞型。另外在部分FAB M4型白血病中也含有t(8；21)。t(8；21)易位所累及的基因AML1和ETO，易位后形成AML1-ETO融合基因，它對M2b型白血病的形成有很重要的作用。大量研究發(fā)現(xiàn)，AML1(acute myeloidleukemia 1)也是許多其他類型人類白血病中染色體重排的靶基因，如t(1；21)、t(16；21)、t(12；21)，分別產(chǎn)生融合基因AML1-EVI-1、AML1-MTG16和TEL-AML1。inv(16)通過產(chǎn)生CBFβ-MYH11融合基因，破壞了與AML1形成異源二聚體的伙伴CBFβ，而間接影響了AML1的功能?？梢夾ML1在造血過程中具有非常重要的作用。編碼AML1的基因位于21號染色體長臂22區(qū)。AML1在正常情況下只在造血組織和髓系分化時表達(dá)，也在神經(jīng)組織、骨胳肌和再生組織中表達(dá)。目前已知AML1蛋白有三種異構(gòu)體，分別為AML1a(250aa)、AML1b(453aa)和AML1c(480aa)(又稱AML1B)。AML1B有如下重要結(jié)構(gòu)域。1)Runt同源的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Runt Homology DNA-binding Domain，RHD)。由AML1中間約118個氨基酸組成，因與果蠅的Runt蛋白同源而得名。它與DNA結(jié)合的一致序列為TGT/cGGT。此外，AML1也通過此結(jié)構(gòu)域與CBFβ形成異源二聚體，共同調(diào)節(jié)基因表達(dá)。2)PST區(qū)含有可被磷酸化的位點。3)核基質(zhì)結(jié)合位點(Nuclear Matrix Attachment Sequence，NM)可能和AML1的核定位有關(guān)。4)兩個轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(Transcriptional Activation Domain，TA)作用較強的一個位于AML1的C端，較弱的一個則包含PST和NM。5)可能的轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域(Repression Domain，RD)有兩個，一個緊靠RHD的C端，另一個位于NM和TA之間。此外，在AML1的C末端存在著由5個氨基酸組成的保守序列VWRPY，可與轉(zhuǎn)錄共抑制物Groucho/TLE1-4結(jié)合，抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。AML1主要通過與CBFβ形成異源二聚體而行使其功能。CBFβ不具有結(jié)合DNA的能力，但可穩(wěn)定AML1與DNA的結(jié)合。受AML1調(diào)控的造血相關(guān)基因很多，如GM-CSFR、M-CSFR、IL-3、MPO、TCRβ、NE以及NP-3等。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，單有AML1的結(jié)合位點還不足以使基因的啟動子有活性，許多基因的啟動子上，與AML1結(jié)合位點毗鄰的常有其它轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，如Myb、Ets、AP1以及C/EBP等。因此，有人認(rèn)為AML1/CBFβ是作為轉(zhuǎn)錄組織者起作用。AML1/CBFβ通過與一些基因的增強子序列結(jié)合后，可募集其它轉(zhuǎn)錄因子，形成與激活復(fù)合物共同起作用，可能通過P300/CBP等共激活因子的組蛋白乙酰化酶活性，使染色質(zhì)組蛋白乙?；?，從而導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，以利于轉(zhuǎn)錄。AML1在造血中的中樞調(diào)節(jié)作用已被AML1基因敲除鼠證實。AML1-/-鼠是胚胎致死的，首先是死于神經(jīng)組織出血，其次是造血缺陷。AML1+/-鼠顯示正常的形態(tài)，并有卵黃囊來源的原始紅細(xì)胞。但在卵黃囊和胎肝中缺乏永久的造血祖細(xì)胞。AML1雜合子動物髓系和紅系的祖細(xì)胞減少，另一個等位基因的失活占AML的2％。曾有兩例病人的兩個AML1等位基因同時突變，結(jié)果產(chǎn)生M0型的AML。
ETO的功能ETO(Eight-Twenty-One)基因位于8號染色體長臂22區(qū)，編碼一種604個氨基酸的核磷蛋白。主要在腦和CD34+造血細(xì)胞中表達(dá)，其具體功能還不十分清楚，只是從序列分析中，發(fā)現(xiàn)它與果蠅的Nervy基因同源。目前已知ETO有四個重要的結(jié)構(gòu)域。1)與果蠅TAF110轉(zhuǎn)錄因子同源區(qū)。2)疏水七價重復(fù)序列(Hydrophobic Heptad Repeat，HHR)。3)Nervy同源域。4)C端的兩個鋅指結(jié)構(gòu)域，后一個鋅指也稱MYNY結(jié)構(gòu)域。也有人將以上四個結(jié)構(gòu)域命名為NHR1-4，NHR2可形成兩親性螺旋，介導(dǎo)同源或異源二聚化，且這種結(jié)合很穩(wěn)定。NHR4的兩個鋅指結(jié)構(gòu)域可與SMRT和N-CoR作用。包含NHR2及其兩側(cè)(236-432aa)的一段稱為CRD(Core Repressor Domain)，與mSin3A有強烈作用。目前還沒有證據(jù)表明ETO可以和DNA結(jié)合。但已證實ETO可以通過和N-CoR、SMRT、mSin3A等共抑制物結(jié)合，募集組蛋白去乙?；?HDAC)，使組蛋白去乙?；?，染色體結(jié)構(gòu)變緊密，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。
AML1-ETO融合基因?qū)е掳籽〉目赡軝C制t(8；21)異位產(chǎn)生的AML1-ETO融合蛋白AML1的N端部分(177aa)和幾乎全長的ETO(C端575aa)，因此可以和CBFβ形成異源二聚體，并可與DNA結(jié)合，而且AML1-ETO與CBFβ的親合力比野生型大。據(jù)此提出了AML1-ETO融合蛋白是AML1顯性抑制物的假說，而且也有實驗證明了AML1-ETO可以抑制AML1對TCRβ增強子、IL3和GM-CSF啟動子的激活作用，但不影響這些啟動子本底水平的表達(dá)。另外，AML1-ETO雜合子小鼠是胚胎致死的，與AML1基因敲除小鼠表型幾乎相同，表現(xiàn)為中樞及外周神經(jīng)出血及胎肝造血受阻。關(guān)于AML1-ETO的轉(zhuǎn)錄抑制機制也提出了幾種假說，如競爭DNA結(jié)合位點、與周圍其它因子作用、與共抑制物作用或與本底轉(zhuǎn)錄機器作用等。AML1-ETO部分刪除實驗表明，ETO的C端序列(含HHR和MYND domain)是其抑制功能所必需的。且MYND domain中的兩個鋅指結(jié)構(gòu)中任何一個單位點突變都會使其抑制功能喪失，提示AML1-ETO可能通過與其它因子作用，來介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制。如前所述，ETO部分可與N-CoR、SMRT及mSin3A等共抑制物結(jié)合，形成一高分子量的抑制復(fù)合物，利用其組蛋白去乙酰化酶活性，導(dǎo)致染色質(zhì)組蛋白去乙酰化，使染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)緊縮，從而使一些與造血細(xì)胞增殖、分化密切相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄被抑制，最終使造血細(xì)胞分化受阻、增殖異常而致白血病。HDAC的抑制劑削弱AML1-ETO介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制，似可支持這一觀點。另外的研究發(fā)現(xiàn)，AML1-ETO可和AML1協(xié)同作用，激活M-CSFR，已檢測到Kasumi-1細(xì)胞系表達(dá)M-CSFR比單核細(xì)胞系U937高，而M-CSFR是由原癌基因c-fms編碼的受體酪氨酸激酶。來自M2型病人的骨髓也比正常骨髓的M-CSFR水平高。M-CSFR的信號傳導(dǎo)可通過誘導(dǎo)G1/S過渡而促進細(xì)胞的增殖。AML1-ETO還可以激活Bc1-2的啟動子，所以它也有可能通過促進細(xì)胞增殖、抑制凋亡而致白血病。
然而，在AML1-ETO可誘導(dǎo)性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠，AML1-ETO的表達(dá)并不引起白血病；在造血重建實驗中，受致死量照射的小鼠接受表達(dá)AML1-ETO的造血干/祖細(xì)胞后也不能發(fā)生白血病。這些結(jié)果提示了AML1-ETO單獨表達(dá)不能引起白血病，須與其他的基因突變協(xié)同才能引起AML的發(fā)生。一些實驗證實了這些推測。在AML1-ETO可誘導(dǎo)性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠，應(yīng)用化學(xué)誘變劑ENU(N-ethyl-N-nitrosourea)誘導(dǎo)產(chǎn)生新突變后使AML1-ETO陽性小鼠發(fā)生了AML。有證據(jù)顯示t(8；21)白血病的發(fā)生是逐步發(fā)生的，AML1-ETO融合蛋白的產(chǎn)生是第一步，是基礎(chǔ)的遺傳學(xué)的改變，而C-KIT途徑的激活是第二步，也是發(fā)展成完全白血病關(guān)鍵的一步。在此模型中，前者阻礙了細(xì)胞正常的分化途徑，而后者則授予造血細(xì)胞增殖和/或抗凋亡的能力，這二者的協(xié)同作用可能是白血病形成的原因。
雖然目前關(guān)于冬凌草甲素的研究很多，但迄今為止，還沒有關(guān)于冬凌草甲素在制備治療急性白血病藥物中的應(yīng)用的研究報道。
在中國專利申請?zhí)?004100168916，公開了一種降解AML1-ETO融合蛋白的方法及所用試劑。在該件專利申請只是概括性地描述了冬凌草甲素可以降解AML1-ETO融合蛋白，沒有記載冬凌草甲素對一些適應(yīng)癥的動物模型或臨床實驗數(shù)據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于(1)提供冬凌草甲素在制備治療急性白血病藥物中的應(yīng)用。
(2)提供冬凌草甲素在制備治療慢性粒細(xì)胞性白血病藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方法來實現(xiàn)的首先，進行冬凌草甲素對具有t(8；21)染色體易位白血病細(xì)胞作用的研究，包括對Kasumi-1細(xì)胞株、轉(zhuǎn)染AML1-ETO的U937細(xì)胞(稱為U937-A/E細(xì)胞)、從M2b型，進行冬凌草甲素對其他白血病細(xì)胞作用的研究；然后，建立兩種t(8；21)白血病小鼠模型，再用冬凌草甲素進行治療，以觀察冬凌草甲素在動物水平的抗白血病作用。
冬凌草甲素對具有t(8；21)染色體易位白血病細(xì)胞作用的研究分以下幾部分首先，進行冬凌草甲素誘導(dǎo)具有t(8；21)染色體易位白血病細(xì)胞凋亡的體外研究。發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素在體外可以誘導(dǎo)t(8；21)白血病細(xì)胞凋亡。
其次，進行冬凌草甲素誘導(dǎo)t(8；21)白血病細(xì)胞凋亡分子機制研究。在冬凌草甲素誘導(dǎo)具有t(8；21)染色體易位白血病細(xì)胞凋亡的體外研究的基礎(chǔ)上試圖找尋冬凌草甲素是如何在體外誘導(dǎo)t(8；21)白血病細(xì)胞凋亡的。結(jié)果顯示冬凌草甲素可以誘導(dǎo)Kasumi-1細(xì)胞線粒體跨膜電位的崩解和細(xì)胞色素C從線粒體中釋放，同時使caspase-3和caspase-9的活化，證明在冬凌草甲素誘導(dǎo)Kasumi-1細(xì)胞凋亡的過程中存在內(nèi)源凋亡通路的激活。同時發(fā)現(xiàn)了凋亡過程中存在AML1-ETO融合蛋白降解。
再次，進行AML1-ETO融合蛋白上的caspase-3切割位點的研究。在研究冬凌草甲素誘導(dǎo)Kasumi-1細(xì)胞及其他AML1-ETO融合蛋白陽性細(xì)胞(U937-A/E)凋亡過程中發(fā)現(xiàn)了AML1-ETO融合蛋白的降解這一現(xiàn)象，而AML1-ETO融合蛋白在白血病的發(fā)病中起著關(guān)鍵的作用。在對AML1-ETO融合蛋白降解機制的研究中發(fā)現(xiàn)了AML1-ETO融合蛋白的降解是通過活化的Caspase-3切割的，并且首次確定了一個重要的Caspase-3切割位點Asp188。
最后，進行冬凌草甲素對t(8；21)染色體易位相關(guān)移植性白血病小鼠治療作用及其機制研究。在我們建立了截短型AML1-ETO(ΔAE)移植小鼠模型和Kasumi-1細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型后，在這兩個模型中均證明了冬凌草甲素具有治療作用。確認(rèn)了冬凌草甲素可以延長ΔAE移植小鼠的生存時間，并且可以在體內(nèi)誘導(dǎo)發(fā)病鼠脾臟細(xì)胞的凋亡。我們還比較了冬凌草甲素與阿糖胞苷對Δ-AE移植性白血病小鼠模型的療效，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素在2.5mg/kg/d的劑量下對Δ-AE移植小鼠治療10天產(chǎn)生的療效與阿糖胞苷25mg/kg/d治療5天(小劑量阿糖胞苷)的療效相當(dāng)，7.5、15mg/kg/d冬凌草甲素的療效優(yōu)于小劑量阿糖胞苷；25mg/kg/d阿糖胞苷治療10天(大劑量阿糖胞苷)雖然對部分白血病小鼠(4/9)的療效較冬凌草甲素好，但卻引起其他小鼠(5/9)的早期死亡(生存時間僅為18天)。與大劑量阿糖胞苷不同，冬凌草甲素在2.5-15mg/kg/d的劑量下并不引起小鼠骨髓抑制或體重減輕。因而冬凌草甲素在白血病的治療中有療效確切、毒副作用小的特點。在Kasumi-1細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，冬凌草甲素可以顯著抑制皮下移植瘤的增長，也顯示了冬凌草甲素的體內(nèi)抗白血病作用。
上述研究顯示1、冬凌草甲素在制備治療急性白血病藥物中的應(yīng)用。
2、冬凌草甲素在制備治療含有AML1-ETO融合基因的急性髓性白血病藥物中的應(yīng)用。
3、冬凌草甲素在制備治療不含有AML1-ETO融合基因的急性髓系白血病藥物中的應(yīng)用。
4、冬凌草甲素在制備治療急性單核細(xì)胞性白血病藥物中的應(yīng)用。
5、冬凌草甲素在制備治療急性早幼粒細(xì)胞性白血病藥物中的應(yīng)用。
6、冬凌草甲素在制備治療慢性粒細(xì)胞性白血病藥物中的應(yīng)用。
7、冬凌草甲素治療不引起骨髓抑制或體重減輕，因而是一種相對安全的抗白血病藥物。
本發(fā)明所公開冬凌草甲素在制藥中的應(yīng)用，其優(yōu)點表現(xiàn)在(1)本發(fā)明對冬凌草甲素發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個新的應(yīng)用領(lǐng)域。
(2)本發(fā)明的冬凌草甲素安全無毒，藥理作用強，預(yù)示著很好的藥用前景。
(3)冬凌草甲素在體外可以誘導(dǎo)t(8；21)白血病細(xì)胞凋亡。
(4)冬凌草甲素誘導(dǎo)kasumi-1細(xì)胞凋亡的過程中存在內(nèi)源凋亡通路的激活。同時在凋亡過程中存在AML1-ETO融合蛋白的降解。
(5)我們發(fā)現(xiàn)了冬凌草甲素對AML1-ETO融合蛋白的降解是通過活化的caspase-3切割的，并且首次確定了一個重要的caspase-3切割位點Asp188。
(6)我們建立了Δ-AE移植小鼠模型和Kasumi-1細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型。從Δ-AE小鼠脾臟分離出的白血病細(xì)胞，在體外培養(yǎng)時加入冬凌草甲素可誘導(dǎo)其凋亡。進一步體內(nèi)實驗研究顯示冬凌草甲素能延長Δ-AE移植鼠的生存時間，抑制Kasumi-1細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的生長，而且在這兩種小鼠模型中可顯著減少肝臟、脾臟及骨髓中白血病細(xì)胞的浸潤。提示冬凌草甲素有很強的抗白血病效果。


圖1冬凌草甲素的化學(xué)結(jié)構(gòu)(C20H28O6)。
圖2A冬凌草甲素誘導(dǎo)t(8；21)白血病細(xì)胞凋亡。用冬凌草甲素處理Kasumi-1細(xì)胞后進行瑞氏染液染色，并在顯微鏡下進行形態(tài)學(xué)觀察，顯示細(xì)胞出現(xiàn)了凋亡特征性的改變。
圖2BAnnexin V/PI雙染后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。
圖2C用冬凌草甲素處理后Kasumi-1細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例(AnnexinV陽性的比例)。
圖3冬凌草甲素可以使Kasumi-1細(xì)胞PI(-)Rh123陽性細(xì)胞明顯減少，說明其可誘導(dǎo)粒體跨膜電位的崩解，這種作用呈時間和劑量依賴性。
圖4WB中顯示了冬凌草甲素處理的Kasumi-1細(xì)胞4小時后就出現(xiàn)了細(xì)胞色素C釋放以及Casapse-3，Casapse-9的活化，也顯示了Casapse-3的底物PARP發(fā)生了降解，這些變化在24小時最顯著，并且具有時間依賴性。
圖5(A)WB檢測顯示冬凌草甲素可以引起Kasumi-1細(xì)胞內(nèi)的融合蛋白AML1-ETO的降解。(B)WB檢測顯示冬凌草甲素可以引起誘導(dǎo)表達(dá)AML1-ETO融合蛋白的U937細(xì)胞系(U937-A/E)的AML1-ETO蛋白的降解。
圖6Caspase-3特異抑制劑Z-DQMD-FMK阻止了冬凌草甲素引起的AML1-ETO融合蛋白的降解。箭頭所指為降解片段。
圖7瞬時轉(zhuǎn)染含有Asp188Ala突變的pFLAG-CMV4-A/E質(zhì)粒的U937細(xì)胞中沒有見到AML1-ETO融合蛋白的降解片段。而在轉(zhuǎn)染野生型和含有Asp171Ala或Asp192Ala突變的pFLAG-CMV4-A/E質(zhì)粒的U937細(xì)胞，冬凌草甲素仍可引起AML1-ETO融合蛋白存的降解。箭頭所指為降解片段。
圖81％F68(pluronic)進行增溶的冬凌草甲素(ori/P)對Kasumi-1的細(xì)胞毒作用和DMSO溶解的冬凌草甲素(ori)一致。
圖9Kasumi-1細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤病理檢測顯示其中布滿了大小不等的瘤細(xì)胞。
圖10Kasumi-1細(xì)胞移植瘤小鼠脾臟、肝臟、骨髓在有無冬凌草甲素作用下的病理學(xué)檢測。示冬凌草甲素可明顯減輕白血病細(xì)胞的浸潤、播散，使受到破壞的脾臟、肝臟、骨髓結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常。
圖11冬凌草甲素可以抑制Kasumi-1細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的生長。
圖12AΔAE移植鼠的外周血及骨髓和正常的C57小鼠相比，充斥著大量不成熟細(xì)胞。
圖12BΔ-AE移植鼠的肝、脾有大量異常細(xì)胞的浸潤。
圖13體外經(jīng)冬凌草甲素處理24小時后，Δ-AE移植鼠脾臟分離出來的白血病細(xì)胞出現(xiàn)了大量的凋亡細(xì)胞。
圖14A組織切片顯示，經(jīng)冬凌草甲素治療的Δ-AE移植鼠的肝臟、脾臟白血病細(xì)胞浸潤情況明顯得到改善。
圖14B與對照組相比，經(jīng)冬凌草甲素治療的Δ-AE移植鼠的脾臟腫大明顯得到改善。
圖14C外周血涂片顯示，對照組Δ-AE移植鼠中有大量的原始細(xì)胞存在，而冬凌草甲素治療組上述細(xì)胞明顯減少。
圖15冬凌草甲素治療明顯延長Δ-AE移植鼠的生存時間。其中對照組(control)n＝11，冬凌草甲素2.5mg/kg/d組(ori2.5)組n＝8，冬凌草甲素7.5mg/kg/d組(ori7.5)組n＝12，冬凌草甲素15mg/kg/d組(Ori15)n＝8，大劑量阿糖胞苷組(Ara-C-H)n＝9，小劑量阿糖胞苷組(Ara-C-L)n＝6。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步描述。
實施例1冬凌草甲素誘導(dǎo)t(8；21)白血病細(xì)胞凋亡體外研究一、材料和方法1.試劑和儀器冬凌草甲素純度為98％-99.8％。應(yīng)用DMSO(Sigma)溶解制備成10-2mol/L濃度的儲存液儲存在-20℃。碘化丙碇(Propidium Iodide，PI)為美國Sigma公司產(chǎn)品，碘化丙碇用三蒸水配成250μg/mL的儲存液，4℃避光保存。胎牛血清購自美國Hyclone公司。Annexin V檢測試劑盒(ApoAlert Annexin-V kit)購自美國BD Biosciences公司。流式細(xì)胞儀為美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品。熒光顯微鏡(Olympus，BX60)及相差顯微鏡(Olympus，IMT)均購自日本Olympus公司。細(xì)胞涂片儀cytospin購自英國Shandon公司。
2.細(xì)胞培養(yǎng)和處理，細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察人類t(8；21)白血病細(xì)胞株Kasumi-1(購自美國生物資源中心，ATCC)，以2×105/ml的起始濃度接種于含10％胎牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，在37℃，5％CO2飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。Kasumi-1細(xì)胞在指數(shù)生長期時，細(xì)胞密度調(diào)整到3×105/ml，應(yīng)用冬凌草甲素處理，具體應(yīng)用0.5μM，2μM，5μM三個濃度，在5μM濃度下選擇0h，4h，8h，12h，24h時間點。對照組加入DMSO，濃度為冬凌草甲素處理組相應(yīng)的最高DMSO濃度。處理結(jié)束后應(yīng)用Cytopro甩片儀甩片后晾干，瑞氏染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
3.Annexin V方法檢測細(xì)胞凋亡按照Annexin-V檢測試劑盒說明書進行操作，具體步驟如下(1)收獲10×105Kasumi-1細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的1×PBS洗滌兩次后用試劑盒自帶的Binding Buffer洗滌1次，重懸于100μL Binding Buffer中；(2)加入5μL Annexin V FITC試劑和5μL的PI，輕輕混勻，避光室溫孵育15-20分鐘；(3)加入400μL Binding Buffer，1小時內(nèi)流式細(xì)胞儀測定。
二、結(jié)果和討論冬凌草甲素可以誘導(dǎo)Kasumi-1細(xì)胞凋亡，并且這種作用具有劑量和時間依賴性。冬凌草甲素處理過的Kasumi-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)出了顯著的凋亡特征，如染色質(zhì)凝聚，細(xì)胞核破裂而細(xì)胞膜保持完整。細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞膜雙分子層中的磷脂不平衡分布會被破壞，發(fā)生磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)由內(nèi)層向外層的翻轉(zhuǎn)，暴露在外表面的磷脂酰絲氨酸可被周圍的吞噬細(xì)胞識別、吞噬，從而使凋亡細(xì)胞得以被清除。Annexin V為一種磷脂結(jié)合蛋白，可特異性地識別細(xì)胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸，所以經(jīng)常被用于細(xì)胞凋亡檢測。PI是一種能結(jié)合DNA的紅色熒光染料，但只有在細(xì)胞經(jīng)歷壞死，細(xì)胞膜破裂的情況下才可透過細(xì)胞膜與DNA結(jié)合。所以Annexin V-FITC/PI雙染色的流式細(xì)胞儀分析，是檢測懸浮細(xì)胞凋亡最敏感和最特異的方法。Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)結(jié)果顯示，Annexin V(+)/PI(-)細(xì)胞和冬凌草甲素作用密切相關(guān)，呈時間依賴性。處理4小時之后，Annexin V(+)/PI(-)細(xì)胞就已出現(xiàn)(圖2B)。隨后，在8小時之后出現(xiàn)了壞死樣細(xì)胞，表現(xiàn)為Annexin V(+)/PI(-)(圖2B)，且這種細(xì)胞隨著時間的延長而增多。
1972年Kerr JF最早提出凋亡(apoptosis)這一概念，在古希臘語表示像秋天的樹葉一樣凋落的死亡方式。他發(fā)現(xiàn)結(jié)扎大鼠肝的左、中葉門靜脈后，其周圍細(xì)胞發(fā)生缺血性壞死，但肝動脈供應(yīng)區(qū)的實質(zhì)細(xì)胞仍存活，只是范圍逐漸縮小，其間一些細(xì)胞不斷轉(zhuǎn)變成細(xì)胞質(zhì)小塊，不伴有炎癥發(fā)生，與細(xì)胞壞死不同。細(xì)胞凋亡時，形態(tài)上早期細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)聚集在核膜內(nèi)側(cè)呈新月形、核碎裂；細(xì)胞漿和細(xì)胞器密度增高，細(xì)胞體積變小；線粒體正?；蜉p微腫脹；細(xì)胞膜皺摺、卷曲，早期細(xì)胞膜的完整性未破壞；細(xì)胞膜出泡(blebbing)、芽，生成膜包裹的凋亡小體(apoptotic bodies)，內(nèi)含完整的細(xì)胞器和核碎片，常迅速被鄰近的細(xì)胞吞噬，周圍組織中無炎癥反應(yīng)。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡是一種普遍存在的現(xiàn)象，它是多細(xì)胞生物清除體內(nèi)不需要的及受損傷細(xì)胞的一種天然機制，比如在兩棲類胚胎發(fā)育過程中尾和腮的消失及非哺乳期乳腺的退化過程中，都會發(fā)生細(xì)胞凋亡。正常情況下，磷脂在細(xì)胞膜上的分布是不均勻的，卵磷脂(Phosphatidylcholine)和鞘磷脂(sphingomyelin)主要分布在細(xì)胞膜的外層，而磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine)和磷脂酰絲氨(phosphati dylserine)則分布在內(nèi)膜。Tanaka Y等和McEvoy L等發(fā)現(xiàn)，受損及老化的紅細(xì)胞表面存在PS外翻，可被巨噬細(xì)胞特異地識別、吞噬。Fadok VA等于1992年發(fā)現(xiàn)，凋亡淋巴細(xì)胞的磷脂不對稱分布被破壞，從而被巨噬細(xì)胞清除。隨后發(fā)現(xiàn)PS外翻是凋亡細(xì)胞共有的特征。Annexin V是一種Ca2+離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白，Andree HA等發(fā)現(xiàn)Annexin V優(yōu)先結(jié)合帶負(fù)電荷的PS。Koopman G等于1992年首次報道了用FITC耦聯(lián)的AnnexinV標(biāo)記凋亡細(xì)胞表面外翻的PS，然后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測的方法。他們發(fā)現(xiàn)，碘化丙啶，一種能透過破損的細(xì)胞膜而與DNA結(jié)合的熒光染料，僅能標(biāo)記部分Annexin V陽性細(xì)胞，說明PS外翻是凋亡的早期事件，隨后才會發(fā)生細(xì)胞膜的破裂?，F(xiàn)在，Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法已成為檢測細(xì)胞凋亡的常規(guī)方法。我們的結(jié)果表明，冬凌草甲素作為一種二萜類化合物，可以誘導(dǎo)Kasumi-1細(xì)胞進入自殺程序。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素處理過的Kasumi-1細(xì)胞表現(xiàn)出核固縮、碎裂而細(xì)胞膜保持完整等凋亡特征，同時應(yīng)用Annexin V/PI雙染檢測，也證實冬凌草甲素可以誘導(dǎo)Kasumi-1細(xì)胞凋亡，并且這種作用呈時間依賴性。
實施例2冬凌草甲素誘導(dǎo)kasumi-1細(xì)胞凋亡分子機制研究一、材料和方法1.試劑和儀器冬凌草甲素、碘化丙碇、胎牛血清見實施例1“材料和方法”。羅丹明(Rhodamine，Rh123)為美國Sigma公司產(chǎn)品，羅丹明用三蒸水配成10μg/mL的儲存液，4℃避光保存。Caspase-3特異抑制劑Z-DQMD-FMK為美國Sigma公司產(chǎn)品，使用前溶解于DMSO保存于-20℃。多聚(ADP-核糖)聚合酶(poly(ADP[adenosinediphosphate]-ribose)polymerase，PARP)抗體，抗ETO抗體購自美國Santa Cruz Biotech公司，抗Caspase-3，Caspase-9抗體，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，以及免疫印記顯色系統(tǒng)購于美國Cell Signaling公司。Actin抗體購于美國Sigma公司，細(xì)胞色素C釋放凋亡分析試劑盒(Cytochromec Releasing Apoptosis AssayKit)為BioVision公司產(chǎn)品。硝酸纖維素膜為英國Amarsham Biosciences公司產(chǎn)品。PonasteroneA為美國Invitrogen公司產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀，細(xì)胞涂片儀見實施例1“材料和方法”。
2.細(xì)胞培養(yǎng)和處理Kasumi-1細(xì)胞培養(yǎng)同實施例1，實驗過程中，細(xì)胞以2-4×105/ml的密度接種培養(yǎng)，應(yīng)用1μM，2μM，5μM三個濃度的冬凌草甲素，對照組應(yīng)用處理組中應(yīng)用最大體積的DMSO處理Kasumi-1細(xì)胞24-48小時后行線粒體跨膜電位的檢測；應(yīng)用5μM濃度的冬凌草甲素，處理Kasumi-1細(xì)胞0，4，8，12，24小時時間點后收獲細(xì)胞，收獲細(xì)胞總蛋白行免疫印跡實驗；應(yīng)用2μM，5μM兩個濃度的冬凌草甲素并在有/無50μM Caspase-3特異性抑制劑Z-DQMD-FMK的情況下一起進行孵育觀察細(xì)胞形態(tài)。誘導(dǎo)表達(dá)AML1-ETO融合蛋白的U937穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系(U937-A/E)培養(yǎng)同Kasumi-1，在冬凌草甲素處理前應(yīng)用Ponasterone A(PA)5ul/ml處理12小時誘導(dǎo)AML1-ETO融合蛋白表達(dá)，冬凌草甲素處理0，4，8，12，24，48小時時間點后收獲細(xì)胞，收獲細(xì)胞總蛋白行免疫印跡實驗。用細(xì)胞涂片儀收集至載玻片，用瑞氏染液染色并置于光學(xué)顯微鏡下觀察。
3.流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞線粒體跨膜電位的變化線粒體跨膜電位的檢測應(yīng)用Rh123(10μg/mL)檢測細(xì)胞線粒體跨膜電位，具體操作步驟如下(1)收獲1×106-2×106個kasumi-1細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷1×PBS洗滌兩次后加入100μL Rh123，輕輕混勻，避光37℃孵育30分鐘；(2)預(yù)冷1×PBS洗滌兩次后加入5μL的PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15分鐘；(3)加入400μL 1×PBS，流式細(xì)胞儀測定。
4.細(xì)胞色素C釋放分析應(yīng)用細(xì)胞色素C釋放凋亡分析試劑盒，具體步驟如下(1)600g，5分鐘，4℃條件下收獲5×107細(xì)胞，預(yù)冷1×PBS洗滌1次；(2)用加入DTT和蛋白酶抑制劑的1×Cytosol Extraction BufferMix 1ml重懸細(xì)胞，冰上放置10分鐘；(3)應(yīng)用預(yù)冷的組織勻漿破碎細(xì)胞，保證細(xì)胞膜破碎細(xì)胞核完整，大致30-50次；(4)把勻漿轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，700g，4℃離心10分鐘；(5)收集上清到一個新的1.5ml離心管中，10000g，4℃離心30分鐘；(6)收集上清為無線粒體細(xì)胞漿組分；用加入DTT和蛋白酶抑制劑的Mitochondrial Extraction Buffer Mix 0.1ml重懸沉淀，震蕩混勻10秒鐘為線粒體組分；
(7)應(yīng)用10μg的無線粒體細(xì)胞漿組分和線粒體組分進行常規(guī)的免疫印跡實驗(選擇12％聚丙烯酰胺凝膠電泳；應(yīng)用試劑盒中提供的抗細(xì)胞色素C抗體)5.免疫印跡(westen blot，WB)主要操作步驟如下(1)收獲細(xì)胞，用預(yù)冷1×PBS洗滌2次，每1×106個細(xì)胞加入80μL蛋白裂解液(1×SDS蛋白上樣緩沖液)，輕輕混勻，沸水煮5-8分鐘，上樣或分裝凍存在-20℃；(2)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)，根據(jù)目的蛋白分子量的不同選擇合適的凝膠濃度(8％-12％)，常規(guī)電泳條件(80V電壓溴酚蘭至分離膠后改用120V)；(3)應(yīng)用濕轉(zhuǎn)方法將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到0.22μm硝酸纖維素膜上；(4)硝酸纖維素膜用5％脫脂奶粉-TBS封閉過夜；(5)抗體孵育一抗孵育，選用多克隆或單克隆特異性抗體孵育硝酸纖維素膜，室溫，2小時，70rpm震搖；用TBS-Tween(0.1％)洗膜15分鐘，兩次；二抗孵育，選用對應(yīng)的二抗孵育硝酸纖維素膜，室溫，1.5小時，70rpm震搖；用TBS-Tween(0.1％)洗膜15分鐘，兩次；(6)顯色，應(yīng)用帶有辣根過氧化物酶底物的顯色系統(tǒng)顯色；(7)X線片感光，顯影，定影。
二、結(jié)果和討論1.冬凌草甲素誘導(dǎo)Kasumi-1細(xì)胞的凋亡過程中，伴有線粒體跨膜電位的崩塌，并且誘導(dǎo)Caspases介導(dǎo)的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑。
為了闡明冬凌草甲素誘導(dǎo)Kasumi-1細(xì)胞凋亡的機制，我們首先通過PI和Rh123雙染檢測該化合物對于線粒體跨膜電位(Δψm)的作用。Rh123是一種親脂性陽離子，可發(fā)射綠色熒光，它可被線粒體吸收，正常的活細(xì)胞因為線粒體Δψm高，所以其攝入的Rh123也高，因此，細(xì)胞會發(fā)出綠色熒光。而細(xì)胞發(fā)生凋亡時線粒體Δψm會降低，從而會減低對Rh123的吸收，細(xì)胞表現(xiàn)為Rh123低染。當(dāng)Kasumi-1細(xì)胞用冬凌草甲素5uM處理12小時后(圖3)PI陰性但Rh123低染的細(xì)胞開始出現(xiàn)，并隨冬凌草甲素作用時間和劑量逐漸增加。
細(xì)胞凋亡是一個相關(guān)基因嚴(yán)格調(diào)控的細(xì)胞死亡過程。根據(jù)凋亡信號的來源可以將細(xì)胞凋亡通路分成兩條外源通路(死亡受體通路)和內(nèi)源通路(線粒體通路)。這兩條通路最后都匯聚于下游的效應(yīng)Caspase。效應(yīng)Caspase在細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段能夠直接引起細(xì)胞重要蛋白質(zhì)的降解和核酸酶的激活并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本實驗應(yīng)用免疫印跡來檢測凋亡相關(guān)蛋白的變化見圖4?？梢钥吹綉?yīng)用5μM濃度的冬凌草甲素處理Kasumi-1細(xì)胞0，4，8，12，24小時時間點的Caspase-3的激活和其上游的Caspase-9的激活以及Caspase-3的重要底物的PARP的降解，并且這些改變和冬凌草甲素的作用濃度和時間有顯著的相關(guān)性。我們同時又檢測了細(xì)胞線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C釋放，實驗顯示冬凌草甲素作用Kasumi-1后線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C釋放到了細(xì)胞漿中。
2.冬凌草甲素可以引起Kasumi-1細(xì)胞和誘導(dǎo)表達(dá)AML1-ETO融合蛋白的U937細(xì)胞中融合蛋白AML1-ETO的降解。
冬凌草甲素可以引起Kasumi-1細(xì)胞AML1-ETO融合蛋白降解，其中全長AML1-ETO融合蛋白大小約94KD，AML1-ETO降解片段(ΔAML1-ETO，Δ-AE)大小約70KD。應(yīng)用誘導(dǎo)表達(dá)AML1-ETO融合蛋白的U937細(xì)胞系(U937-A/E)，也觀察到了冬凌草甲素對AML1-ETO融合蛋白的作用。
細(xì)胞凋亡是一個受到一系列相關(guān)基因嚴(yán)格控制的細(xì)胞死亡過程。不同的凋亡信號在細(xì)胞中引發(fā)不同的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。根據(jù)凋亡信號的來源可以將細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分成兩條主要的途經(jīng)(1)外源通路(死亡受體通路)和內(nèi)源通路(線粒體通路)。這兩條通路最后都匯集于下游的效應(yīng)分子Caspase。效應(yīng)Caspase在細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段能夠直接引起重要蛋白質(zhì)的降解和核酸酶的激活并最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。外源凋亡通路主要指死亡受體通路。在一定的受體誘導(dǎo)信號刺激下，細(xì)胞膜上的死亡受體與其細(xì)胞外的相應(yīng)配體結(jié)合后，受體與細(xì)胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)接蛋白和Caspase-8/-10前體蛋白結(jié)合并形成寡聚體，這種寡聚體被稱為“凋亡體”。在凋亡體中激活的Caspase-8/-10進而激活下游的效應(yīng)Caspase(3，6，7)，引起細(xì)胞的凋亡。(2)內(nèi)源通路(線粒體通路)。由于誘變劑，化療藥物和電離輻射造成的細(xì)胞內(nèi)不可修復(fù)的基因組損傷會激活凋亡的內(nèi)源通路，就是線粒體通路。在多種形式的刺激信號作用于線粒體后，將會引起線粒體釋放細(xì)胞色素C，AIF(apoptosis-inducing factor)，和Caspase前體蛋白(2，3，8，9)等促凋亡因子。細(xì)胞色素C從線粒體被釋放出來后，與Apaf-1(apoptosisprotease activating factor-1)形成復(fù)合體，這個復(fù)合體吸引Caspase-9前體加入該復(fù)合體，隨后Caspase-9被激活，活化的Caspase-9繼而作用下游的效應(yīng)Caspase(-3，6，7)，引起細(xì)胞凋亡。然而，內(nèi)源和外源兩條通路并不是孤立存在的，它們之間存在著互相作用。除了以上兩條主要的凋亡通路之外，還存在著其他的一些凋亡途徑。袁鈞英等人發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是另一個在細(xì)胞凋亡執(zhí)行過程中起著重要作用的細(xì)胞器，在某些細(xì)胞類型中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也是內(nèi)源凋亡途徑的重要成員。如鈣離子通路和Caspase-12參與了這個過程。另外，細(xì)胞核的損傷也可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。由誘變劑，化療藥物和電離輻射造成的細(xì)胞內(nèi)DNA損傷，進而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞骨架系統(tǒng)也是細(xì)胞凋亡的感受器。
Caspases是一類特異的半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(Caspase)。在Caspase蛋白酶當(dāng)中，有一部分與細(xì)胞凋亡無關(guān)，而與細(xì)胞因子的加工和成熟相關(guān)，包括Caspase-1，-4，-5，-11，-12和-13。另一部分則參與細(xì)胞凋亡，這部分Caspase又可分為兩類，即啟動性Caspase(initiators)和效應(yīng)性Caspase(effectors)。啟動性Caspase負(fù)責(zé)接受來自于上游的凋亡信號，其被激活的過程即為細(xì)胞凋亡的啟動過程，包括Caspase-2，-8，-9，-10；效應(yīng)性Caspase位于凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游，負(fù)責(zé)執(zhí)行細(xì)胞凋亡過程，包括Caspase-3，-6，-7。Caspase可以被“死亡受體”途徑中的多個分子激活。FAS/CD95和TNFR1的凋亡功能直接依賴于Caspase。Caspase也可以經(jīng)線粒體途徑激活。線粒體損傷或其他原因?qū)е戮€粒體凋亡因子釋放，包括細(xì)胞色素C，Apaf-1和AIF等。在細(xì)胞色素C和ATP存在下，Apaf-1能通過其N端的CARD與Caspase-9相應(yīng)的同源序列結(jié)合，激活Caspase-9而引發(fā)凋亡。細(xì)胞一旦發(fā)生凋亡，往往一系列Caspase被激活。因此Caspase除了上述幾種激活形式外，同一種Caspase分子還可以結(jié)合成多聚體自我激活，或者依賴于其他激活的Caspase來激活，從而引發(fā)一系列的Caspase激活級聯(lián)反應(yīng)，引起細(xì)胞的凋亡?；罨腃aspase的作用主要包括三類其一是降解那些對細(xì)胞有保護作用的蛋白質(zhì)，從而使凋亡抑制蛋白失活。如Caspase可以降解凋亡抑制蛋白Bc1-2/Bc1-x1，使其轉(zhuǎn)變成促凋亡蛋白。第二個途徑是通過直接降解凋亡細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白而使細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞。如Caspase可以通過降解核纖層來破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。核纖層蛋白在核膜下組成核纖層骨架，支撐核膜并且對染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)及核功能也有影響。在凋亡發(fā)生時，核纖層蛋白被Caspase切割，導(dǎo)致核骨架崩潰，染色質(zhì)濃縮等典型的凋亡變化。Caspase第三種特異性的作用方式是切割某些重要的在細(xì)胞中具有維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)功能核修復(fù)功能的靶蛋白。如細(xì)胞核DNA修復(fù)的蛋白質(zhì)，DNA復(fù)制的蛋白質(zhì)，mRNA剪切的蛋白質(zhì)等。
我們的實驗結(jié)果顯示冬凌草甲素作用Kasumi-1細(xì)胞24-48小時后細(xì)胞內(nèi)的Caspase-3被激活，伴有caspase-3重要底物的PARP的降解。應(yīng)用Caspase-3特異抑制劑Z-DQMD-FMK和冬凌草甲素同時作用Kasumi-1細(xì)胞后，細(xì)胞的凋亡被抑制，說明Caspase-3的激活是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟。我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在冬凌草甲素處理后伴隨凋亡的同時，出現(xiàn)了線粒體跨膜電位的降低和Caspase-9的激活，以及線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C釋放。Caspase-9的激活是效應(yīng)Caspase-3激活的上游事件，線粒體中的細(xì)胞色素C釋放和Caspase-9的激活作用下游的Caspase-3，引起細(xì)胞的凋亡，提示冬凌草甲素誘導(dǎo)Kasumi-1細(xì)胞凋亡確實是通過內(nèi)源通路的介導(dǎo)。而在冬凌草甲素誘導(dǎo)Kasumi-1細(xì)胞凋亡的過程中是否還存在著其他的凋亡通路或機制仍需要進一步的研究。
我們的實驗結(jié)果顯示，在冬凌草甲素誘導(dǎo)Kasumi-1細(xì)胞凋亡的過程中，Kasumi-1細(xì)胞中特異的融合蛋白AML1-ETO發(fā)生降解。應(yīng)用誘導(dǎo)表達(dá)AML1-ETO融合蛋白的U937細(xì)胞系(U937-A/E)，也觀察到了冬凌草甲素對AML1-ETO融合蛋白的降解作用(圖5)。
實施例3AML1-ETO融合蛋白上的caspase-3切割位點的研究一、材料和方法1.試劑和儀器冬凌草甲素，胎牛血清見實施例1“材料和方法”。Caspase-3特異抑制劑Z-DQMD-FMK見實施例2“材料和方法”?？笶TO抗體購自美國SantaCruz Biotech公司。Actin抗體購于美國sigma公司。定點突變試劑盒QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit為美國Stratagene公司產(chǎn)品。質(zhì)粒大抽試劑盒Plasmid Maxi Preparation Kit為德國QIAGEN公司產(chǎn)品。Gene Pulser電穿孔儀和Cuvette電轉(zhuǎn)杯為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。
2.Caspase-3特異性抑制劑Z-DQMD-FMK抑制實驗Kasumi-1細(xì)胞培養(yǎng)同實施例1，實驗過程中，細(xì)胞以2-4×105/ml的密度接種培養(yǎng)，應(yīng)用2μM，5μM兩個濃度的冬凌草甲素并在有/無50μMCaspase-3特異性抑制劑Z-DQMD-FMK的情況下一起進行孵育后收獲細(xì)胞，收獲細(xì)胞總蛋白行免疫印跡檢測。
3.突變表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建應(yīng)用QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit進行表達(dá)質(zhì)粒的定點突變。應(yīng)用含有全長AML1-ETO融合基因的質(zhì)粒pFLAG-CMV4-AML1-ETO做模板。選擇突變點為AML1-ETO融合蛋白中的Asp171，Asp188，Asp192，突變?yōu)锳sp171Ala，Asp188Ala，Asp192Ala，均為天冬氨酸突變?yōu)楸彼帷?br> (1)設(shè)計引物見下表。
表1定點突變應(yīng)用引物，下劃線為突變的堿基

(2)突變鏈合成反應(yīng)按照QuickChange Site-Directed Mutagenesis試劑盒說明操作，PCR反應(yīng)條件為95℃ 1分鐘95℃ 50秒60℃ 50秒68℃ 8分鐘68℃ 7分鐘其中95℃ 50秒至68℃ 8分鐘三個步驟進行18個循環(huán)。
(3)DpnI限制性核酸內(nèi)切酶消化合成產(chǎn)物。
突變鏈合成反應(yīng)產(chǎn)物加入1μL DpnI酶，37℃，水浴1小時。
(4)鈣轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，挑菌落，抽質(zhì)粒測序鑒定，大抽質(zhì)粒。
a.應(yīng)用QuickChange Site-Directed Mutagenesis試劑盒中的XL10-Gold ultracompetent cell為感受態(tài)細(xì)菌，取45μL上述細(xì)菌，加入2μLβ巰基乙醇混合后冰上放置10分鐘，隨后加入2μL的Dpn I酶處理后的合成產(chǎn)物冰上放置30分鐘，然后42℃水浴30秒，冰上放置2分鐘，把上述處理后的感受肽細(xì)菌加入500μL預(yù)熱(37℃)的LB液中，37℃，225rpm條件下振搖1小時，鋪于氨芐青霉素陽性LB板上，37℃溫箱孵育16小時后觀察有無菌落長出；b.觀察菌落長出后每個板中挑取6個菌落，擴增細(xì)菌，抽取質(zhì)粒并保存菌種，質(zhì)粒抽提送測序。測序證實突變成功的質(zhì)粒大抽。
4.突變質(zhì)粒瞬時表達(dá)和檢測。
人類白血病細(xì)胞株U937，以3×105/ml的起始濃度接種于含10％胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，在37℃，5％CO2飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。
(1)收獲U937細(xì)胞，離心200g，5-10分鐘；(2)用含0.5％FBS的1640重懸細(xì)胞，離心200g，5-10分鐘；(3)用轉(zhuǎn)染緩沖液重懸細(xì)胞至2×106/ml，取800μl細(xì)胞到1.5mlEppendorf離心管中，加入20μg質(zhì)粒，混勻；(4)把上述細(xì)胞懸液于轉(zhuǎn)移到0.4cm電轉(zhuǎn)杯(Gene Pulser Cuvette，Bio-Rad公司產(chǎn)品)，在Gene Pulser電穿孔儀(Bio-Rad公司產(chǎn)品)上轉(zhuǎn)染，電轉(zhuǎn)染條件電壓280V，電容1050μF；
(5)電轉(zhuǎn)染后室溫放置10分鐘；(6)把電轉(zhuǎn)杯中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到3ml含10％FBS的RPMI1640中，培養(yǎng)24-48小時檢測突變質(zhì)粒的表達(dá)情況。
5.冬凌草甲素作用瞬時轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒的細(xì)胞，觀察AML1-ETO融合蛋白降解情況。
瞬時轉(zhuǎn)染含野生型或突變AML1-ETO基因的質(zhì)粒至U937細(xì)胞，培養(yǎng)24小時后，應(yīng)用5μM冬凌草甲素處理轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，每個突變體分處理組和對照組，對照組應(yīng)用同樣體積的DMSO處理，處理組用5μM冬凌草甲素處理。培養(yǎng)24小時后常規(guī)收獲細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白行Western blot檢測AML1-ETO融合蛋白的降解情況。
二、結(jié)果和討論1.Caspase-3特異性抑制劑Z-DQMD-FMK抑制實驗冬凌草甲素誘導(dǎo)Kasumi-1細(xì)胞凋亡可以被Caspase-3特異抑制劑Z-DQMD-FMK抑制，同時Western blot免疫印跡實驗顯示Z-DQMD-FMK阻止了AML1-ETO融合蛋白的降解(圖6)。
2.突變表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。
應(yīng)用定點突變的方法得到了三個突變表達(dá)質(zhì)粒，為下一步實驗奠定了基礎(chǔ)。
3.冬凌草甲素處理瞬時表達(dá)突變質(zhì)粒的細(xì)胞，觀察各個突變體AML1-ETO融合蛋白的降解情況。
冬凌草甲素可以引起瞬時表達(dá)AML1-ETO質(zhì)粒的細(xì)胞發(fā)生凋亡。Western blot實驗顯示，在瞬時表達(dá)Asp188Ala(D188A)突變質(zhì)粒的U937細(xì)胞(圖7，188)及冬凌草甲素作用該細(xì)胞中沒有見到AML1-ETO融合蛋白的降解；而在表達(dá)野生型(圖7，AE)、Asp171Ala(圖7，171)和Asp192Ala(圖7，192)突變體的細(xì)胞，冬凌草甲素仍可引起AML1-ETO融合蛋白的降解，而且其剪切片段的大小和Kasumi-1細(xì)胞中的AML1-ETO融合蛋白剪切片段的大小一致。
Caspases的水解位點均為天冬氨酸(Asp，D)。在本實驗中，具有AML1-ETO融合蛋白的細(xì)胞(Kasumi-1、U937-A/E)經(jīng)冬凌草甲素處理后該蛋白出現(xiàn)降解，應(yīng)用Caspase-3特異性抑制劑和冬凌草甲素共同作用Kasumi-1細(xì)胞，細(xì)胞凋亡和AML1-ETO融合蛋白的降解均被阻止，說明AML1-ETO融合蛋白的剪切依賴于Caspase-3的激活，因此我們推論AML1-ETO融合蛋白的降解是Caspase-3介導(dǎo)的。由于94 KDa的AML1-ETO融合蛋白降解后產(chǎn)生一個70KDa的片段(本實驗選用的抗ETO抗體是抗ETO蛋白羧基端一小段多肽的抗體)，同時Caspase-3切割位點通常有天冬氨酸的存在，我們選擇了三個最有可能的切割位點進行突變體的構(gòu)建(Asp171，Asp188，Asp192)，突變?yōu)楸彼釟埢?Ala)。如果我們選擇的三個氨基酸殘基中存在Caspase-3的切割位點，其發(fā)生突變后冬凌草甲素處理就不能引起AML1-ETO融合蛋白的降解，反之，冬凌草甲素仍可誘導(dǎo)AML1-ETO融合蛋白降解。本實驗顯示，在表達(dá)AML1-ETO的U937細(xì)胞中，Asp188Ala突變可阻止冬凌草甲素引起的AML1-ETO融合蛋白降解。然而，野生型和其他兩種突變(Asp171Ala、Asp192Ala)則不能阻止AML1-ETO融合蛋白被降解；在表達(dá)野生型和Asp171Ala、Asp192Ala突變體的U937細(xì)胞，AML1-ETO融合蛋白的降解與產(chǎn)生的剪切片段大小和Kasumi-1細(xì)胞中AML1-ETO融合蛋白的降解/剪切方式相同。以上結(jié)果說明了Asp188是Caspase-3切割A(yù)ML1-ETO融合蛋白的關(guān)鍵位點，同時反過來證明了AML1-ETO融合蛋白的剪切是由激活的Caspase-3實施的。
實施例4冬凌草甲素對移植性白血病小鼠的治療作用及其機制研究材料和方法1.試劑和儀器冬凌草甲素、碘化丙碇、胎牛血清、Annexin V檢測試劑盒(ApoAlertAnnexin-Vkit)見實施例1“材料和方法”。CCK-8試劑盒為日本同仁化學(xué)研究所產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡及細(xì)胞涂片儀見實施例1“材料和方法”。酶聯(lián)免疫檢測儀為美國Bio-Tek公司產(chǎn)品。
2.增溶劑增溶的冬凌草甲素細(xì)胞毒性實驗小鼠實驗應(yīng)用的冬凌草甲素是增溶劑助溶的冬凌草甲素儲存液，選用非離子型增溶劑pluronic F68進行增溶，增溶劑濃度為1％，溶劑為雙蒸水，冬凌草甲素濃度為2mg/ml，儲存于4℃。進行小鼠體內(nèi)實驗前應(yīng)用MTT法進行增溶劑助溶的冬凌草甲素儲存液細(xì)胞毒實驗，確定冬凌草甲素的細(xì)胞毒作用沒有受到增溶劑的影響以及增溶劑本身對細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性作用。
MTT試驗方法具體如下(1)接種細(xì)胞Kasumi-1以2×105/ml的起始濃度接種于含10％胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，在37℃，5％CO2飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，后調(diào)至濃度1×105/ml密度，每孔約1×104個細(xì)胞接種于96孔板中，每孔體積90μL；(2)冬凌草甲素處理應(yīng)用DMSO溶解的冬凌草甲素和應(yīng)用1％pluronic F68進行增溶的冬凌草甲素，設(shè)三個濃度(0.5μM，5μM，20μM)以及各自的對照組。每個處理設(shè)三復(fù)管；(3)培養(yǎng)細(xì)胞將培養(yǎng)板在37℃，5％CO2飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)24小時；(4)呈色培養(yǎng)24小時后，每孔加入CCK-8試劑10μL在37℃，5％CO2飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)1-4小時，(5)比色選擇450-490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定每個孔的光吸收值(OD)，記錄結(jié)果，計算抑制率。抑制率＝1-OD處理組/OD對照組。
3.Kasumi-1細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立和冬凌草甲素治療作用(1)Kasumi-1細(xì)胞，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，細(xì)胞記數(shù)，記數(shù)活細(xì)胞數(shù)，調(diào)整至細(xì)胞密度為1.3×108/ml備用。
(2)小鼠的準(zhǔn)備BALB/c裸鼠為中科院上海動物中心購買，4-6周齡，均為雌性，在SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)。
(3)模型建立及冬凌草甲素處理4-6周齡的裸鼠，每只小鼠右頸肩部皮下注射4×107Kasumi-1細(xì)胞，觀察小鼠移植瘤成瘤情況，當(dāng)小鼠瘤塊可觀察到時(約100mm3)，隨機分為三組，第一組為對照組，應(yīng)用溶劑(1％增溶劑Pluronic F68)0.1ml/10g體重腹腔注射；第二組應(yīng)用冬凌草甲素7.5mg/Kg體重腹腔注射治療，每天一次，連續(xù)應(yīng)用至成瘤后12天；第三組應(yīng)用冬凌草甲素15mg/Kg體重腹腔注射治療，每天一次，連用應(yīng)用至成瘤后第12天。觀察三組間移植瘤的生長情況和瘤體積的大小。處理完成后處死小鼠行移植瘤病理形態(tài)學(xué)檢查，以及脾臟、肝臟、骨髓、腎臟等重要臟器的病理形態(tài)學(xué)檢查明確各組織異常細(xì)胞侵潤情況。
4.Δ-AE移植小鼠模型建立和冬凌草甲素治療作用(1)Δ-AE移植小鼠脾臟細(xì)胞的制備用逆轉(zhuǎn)錄病毒將C-末端缺失200個氨基酸的AML1-ETO融合基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入C57小鼠的骨髓單個核細(xì)胞，這些細(xì)胞作為供體細(xì)胞；同時用10cGy的輻射量照射C57小鼠(致死量照射)作為受體鼠。將供體細(xì)胞移植至受體小鼠，然后將小鼠飼養(yǎng)在無特定病原體(SPF)的環(huán)境中。待小鼠發(fā)生白血病后取其脾臟細(xì)胞，供下一步實驗用。
(2)小鼠的準(zhǔn)備C57小鼠從中科院上海動物中心購買，均為雌性，6-8周齡，在SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)。
(3)Δ-AE轉(zhuǎn)基因發(fā)病鼠脾臟細(xì)胞移植及傳代6-8周齡的C57小鼠經(jīng)400cGy輻射量照射后，24小時內(nèi)每只小鼠經(jīng)尾靜脈注射1×106-2×106Δ-AE移植鼠脾臟活細(xì)胞(步驟1得到的細(xì)胞)，觀察小鼠的活動狀態(tài)，兩周后開始每周檢測血常規(guī)，并觀察外周血細(xì)胞形態(tài)，待小鼠發(fā)病后，頸椎脫臼法處死小鼠，取骨髓細(xì)胞和脾臟細(xì)胞用Cytopro甩片儀甩片后晾干，瑞氏染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，用部分脾臟細(xì)胞繼續(xù)傳代，剩余骨髓和脾臟細(xì)胞液氮凍存?zhèn)溆?。第二代移植小鼠建立時每只尾靜脈注射細(xì)胞數(shù)為3×106個。
(4)建立Δ-AE轉(zhuǎn)基因發(fā)病鼠移植小鼠，隨機分成6組，第一組為對照組，應(yīng)用溶劑(1％增溶劑Pluronic F68)0.1ml/10g體重腹腔注射；第二組應(yīng)用低劑量阿糖胞苷(Ara-C-L)，第三組用高劑量阿糖胞苷(Ara-C-H)治療，第四組用冬凌草甲素2.5mg/kg體重腹腔注射治療，每天一次，連用5天，間隔2天，連用2周，第五組用冬凌草甲素7.5mg/kg體重腹腔注射治療，每天一次，連用5天，間隔2天，連用2周，第六組應(yīng)用冬凌草甲素15mg/kg體重腹腔注射治療，每天一次，連用5天，間隔2天，連用2周。處理均在移植后的第7天后進行。實驗期間觀察小鼠一般狀況，生存期，體重，外周血等情況。待小鼠發(fā)病至垂死狀態(tài)時處死小鼠取脾臟，觀察大小，收取脾臟和骨髓細(xì)胞，并行脾臟、肝臟、骨髓、腎臟等重要臟器的病理形態(tài)學(xué)檢查明確各組織異常細(xì)胞侵潤情況。
結(jié)果和討論1.1％F68(pluronic)進行增溶的冬凌草甲素(2mg/ml)對Kasumi-1的細(xì)胞毒作用和DMSO溶解的冬凌草甲素一致，并且1％pluronic F68的溶劑對Kasumi-1的細(xì)胞沒有毒性(結(jié)果未顯示)。
2.Kasumi-1細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立Kasumi-1細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立系采用常規(guī)細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的方法。Kasumi-1細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期調(diào)整至細(xì)胞密度為1.3×108/ml。應(yīng)用4-6周齡的BALB/c裸鼠，每只小鼠右頸肩部皮下注射4×107Kasumi-1細(xì)胞，觀察小鼠移植瘤成瘤情況并計算瘤體積，其中瘤體積＝長×寬2×π/6。當(dāng)小鼠瘤塊可觀察到(此時體積在100mm3左右)時將小鼠隨機分組。裸鼠成瘤時間為移植后5-16天，成瘤率100％。組織形態(tài)學(xué)檢查和重要臟器組織病理檢查，觀察到了小鼠瘤體中大量的Kasumi-1細(xì)胞(圖9)，并且這些細(xì)胞在脾臟和肝臟以及骨髓中都可以見到，尤其在脾臟中彌漫著大量的異常細(xì)胞，導(dǎo)致了脾臟的正常結(jié)構(gòu)的喪失(圖10，CON)。
3.冬凌草甲素可以抑制Kasumi-1細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的生長于小鼠瘤塊可觀察到時隨機分為三組，第一組為對照組，應(yīng)用溶劑(1％增溶劑Pluronic F68)0.1ml/10g體重腹腔注射，第二組應(yīng)用冬凌草甲素7.5mg/Kg體重腹腔注射治療，每天一次，連續(xù)應(yīng)用至成瘤第12天，第三組應(yīng)用冬凌草甲素15mg/Kg體重腹腔注射治療每天一次，連續(xù)應(yīng)用至成瘤第12天。病理學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素治療組的脾臟中異常細(xì)胞比對照組明顯減少，肝臟及骨髓中更是少見異常腫瘤細(xì)胞(圖10，Ori)。觀察三組間移植瘤的生長情況，可以看到在治療組小鼠的移植瘤生長要慢于對照組(圖11)。對照組和冬凌草甲素7.5mg/kg組有顯著性差別(P＝0.002，n＝10)，對照組和冬凌草甲素15mg/kg組有顯著性差別(P＝0.001，n＝10)，冬凌草甲素7.5mg/kg組和冬凌草甲素15mg/kg組沒有顯著性差別(P＝0.892)。
4.Δ-AE移植鼠模型的建立與正常C57小鼠相比，Δ-AE移植鼠的外周血及骨髓中，充斥著大量不成熟細(xì)胞(圖12A)，這些細(xì)胞體積大，核漿比例高，細(xì)胞核多為圓型或橢圓形。此外，患病鼠的脾臟明顯增大。脾臟中的侵潤現(xiàn)象非常嚴(yán)重，存在大量的白血病細(xì)胞，正常的脾小結(jié)結(jié)構(gòu)被破壞。肝臟的血管周圍及肝血竇內(nèi)同樣可觀察到大量侵潤的白血病細(xì)胞存在(圖12B，C57)。
5.冬凌草甲素可以在體外誘導(dǎo)Δ-AE移植鼠脾細(xì)胞的凋亡把從Δ-AE移植鼠發(fā)病鼠脾臟里分離的白血病細(xì)胞在10％胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液中進行體外培養(yǎng)，加入冬凌草甲素5μM后觀察其誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)。冬凌草甲素處理24小時后Annexin V/PI雙染法顯示有57.4％的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而相應(yīng)的沒有用冬凌草甲素處理的細(xì)胞體外培養(yǎng)24小時凋亡細(xì)胞為36.3％。Annexin V/PI雙染法分析表明，盡管脾細(xì)胞體外培養(yǎng)對照組也會出發(fā)生凋亡，但冬凌草甲素處理組凋亡細(xì)胞的比例明顯增加。同時，形態(tài)學(xué)顯示，體外經(jīng)冬凌草甲素處理24小時后，出現(xiàn)了大量的凋亡細(xì)胞，其特征為核固縮破裂等早期凋亡表現(xiàn)，部分細(xì)胞則呈現(xiàn)繼發(fā)性壞死(圖13)。
6.冬凌草甲素可以延長Δ-AE移植鼠的生存期，并減少白血病細(xì)胞的浸潤。
Δ-AE移植小鼠隨機分成6組，按材料和方法中介紹的方法對小鼠進行治療。外周血涂片顯示，患病的Δ-AE轉(zhuǎn)基因小鼠移植鼠中有大量的原始細(xì)胞存在，形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為細(xì)胞體積大，核漿比例高，細(xì)胞核未分葉，多呈圓形，而冬凌草甲素處理組中上述細(xì)胞較少(圖14A)。待小鼠發(fā)病致垂死狀態(tài)，頸椎脫臼法處死小鼠，解剖對照組和藥物處理組小鼠并行病理學(xué)檢測。發(fā)現(xiàn)用藥組小鼠的脾臟明顯小于患病組(圖14B)，肝臟、脾臟病理學(xué)檢測顯示對照組Δ-AE移植鼠肝臟、脾臟內(nèi)存在大量白血病細(xì)胞，而經(jīng)冬凌草甲素治療的小鼠肝、脾浸潤情況明顯改善，其白血病細(xì)胞明顯減少，肝、脾的正常結(jié)構(gòu)得以恢復(fù)(圖14C)。
小鼠生存期比較對照組小鼠于22天開始出現(xiàn)死亡，27天全部死亡，平均生存期為23.8天，中位生存期23.0天；冬凌草甲素2.5mg/kg/d組小鼠25天開始出現(xiàn)死亡，31天全部死亡，平均生存期為28.3天，中位生存期28.0天；冬凌草甲素7.5mg/kg/d組小鼠24天開始出現(xiàn)死亡，36天全部死亡，平均生存期為29.8天，中位生存期30天；冬凌草甲素15mg/kg/d組小鼠24天開始出現(xiàn)死亡，36天全部死亡，平均生存期為31.3天，中位生存期32天。不同處理組的生存期在統(tǒng)計學(xué)上存在顯著差異(P＝0.0001)，表明冬凌草甲素可顯著延長Δ-AE移植小鼠的生存時間，因而對白血病有明確而良好的治療作用。我們還比較了冬凌草甲素與阿糖胞苷對Δ-AE移植性白血病小鼠模型的療效，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素在2.5mg/kg/d的劑量下對Δ-AE移植小鼠治療10天產(chǎn)生的療效與阿糖胞苷25mg/kg/d治療5天(小劑量阿糖胞苷)的療效相當(dāng)，7.5、15mg/kg/d冬凌草甲素的療效優(yōu)于小劑量阿糖胞苷；25mg/kg/d阿糖胞苷治療10天(大劑量阿糖胞苷)雖然對部分白血病小鼠(4/9)的療效較冬凌草甲素好，但卻引起其他小鼠(5/9)的早期死亡(生存時間僅為18天)。與大劑量阿糖胞苷不同，冬凌草甲素在2.5-15mg/kg/d的劑量下并不引起小鼠骨髓抑制或體重減輕。因而冬凌草甲素在白血病的治療中有療效確切、毒副作用小的特點。
Poloxamer188(Pluronic F68)為聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，是目前用于靜脈乳劑極少數(shù)合成乳化劑之一，也是一種非離子型增溶劑。本實驗選用Pluronic F68來增加冬凌草甲素的溶解度。
通過本發(fā)明工作，我們發(fā)現(xiàn)香茶菜屬二萜類化合物冬凌草甲素能延長Δ-AE移植鼠的生存時間，而該化合物也可以抑制Kasumi-1細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的生長，冬凌草甲素同時可以減少這兩種模型小鼠腫瘤細(xì)胞的浸潤；白血病細(xì)胞體外培養(yǎng)實驗表明，冬凌草甲素可在體外迅速誘導(dǎo)Δ-AE移植鼠白血病細(xì)胞凋亡。以上的結(jié)果顯示該化合物有很強的抗白血病效果。
目前，對白血病的治療主要以化療為主，輔以骨髓及臍血移植。全反式維甲酸(ATRA)的分化療法、As2O3的凋亡療法及二者的聯(lián)合使用使人們對APL這種特殊類型的白血病的治療有了里程碑式的飛躍。而對于其他類型的急性白血病還是以殺傷白血病細(xì)胞的化學(xué)治療為主。因此，不斷開發(fā)新型、安全有效的抗白血病藥物仍是擺在廣大科研工作者面前的一項迫切任務(wù)。
綜上研究，冬凌草甲素在Δ-AE移植鼠模型和Kasumi-1細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型中的治療效果說明，該化合物有著很好的臨床應(yīng)用前景，有可能成為一種新的抗白血病藥物。
實施例5冬凌草甲素對其他白血病細(xì)胞作用的研究一、材料和方法1.試劑和儀器冬凌草甲素純度為98％-99.8％。應(yīng)用DMSO(Sigma)溶解制備成10-2mol/L濃度的儲存液儲存在-20℃。碘化丙碇(Propidium Iodide，PI)為美國Sigma公司產(chǎn)品，碘化丙碇用三蒸水配成250μg/mL的儲存液，4℃避光保存。胎牛血清購自美國Hyclone公司。Annexin V檢測試劑盒(ApoAlert Annexin-V kit)購自美國BD Biosciences公司。流式細(xì)胞儀為美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品。熒光顯微鏡(Olympus，BX60)及相差顯微鏡(Olympus，IMT)均購自日本Olympus公司。細(xì)胞涂片儀cytospin購自英國Shandon公司。
2.細(xì)胞培養(yǎng)和處理，細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察不具有t(8；21)染色體易位的AML M2細(xì)胞株HL-60、急性單核細(xì)胞性白血病U937細(xì)胞株、慢性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞株K562、急性早幼粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞株NB4，以及從不具有t(8；21)染色體易位的AML M2病人、急性早幼粒細(xì)胞性白血病和慢性粒細(xì)胞性白血病病人原代白血病細(xì)胞。
上述細(xì)胞株以2×105/ml的起始濃度接種于含10％胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，在37℃，5％CO2飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。上述細(xì)胞在指數(shù)生長期時，細(xì)胞密度調(diào)整到3×105/ml，應(yīng)用冬凌草甲素處理，具體應(yīng)用8μM，20μM，25μM三個濃度，在5μM濃度下選擇0h，4h，8h，12h，24h時間點，對照組應(yīng)用處理組中加入最大體積的DMSO。處理結(jié)束后行流式儀檢測細(xì)胞。凋亡，應(yīng)用Cytopro甩片儀甩片后晾干，瑞氏染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
3.Annexin V方法檢測細(xì)胞凋亡按照Annexin V檢測試劑盒說明書進行操作，具體步驟如下(1)分別收獲(5-10)×105HL-60、U937、K562、NB4細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的1×PBS洗滌兩次后用試劑盒自帶的Binding Buffer洗滌1次，重懸于100μL Binding Buffer中；(2)加入5μL Annexin V-FITC試劑和5μL的PI，輕輕混勻，避光室溫孵育15-20分鐘；(3)加入400μL Binding Buffer，1小時內(nèi)流式細(xì)胞儀測定。
二、結(jié)果和討論冬凌草甲素可以誘導(dǎo)HL-60、U937、K562、NB4細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且這種作用具有劑量和時間依賴性。冬凌草甲素處理過的細(xì)胞形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)出了顯著的凋亡特征，如染色質(zhì)凝聚，細(xì)胞核破裂而細(xì)胞膜保持完整。細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞膜雙分子層中的磷脂不平衡分布會被破壞，發(fā)生磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)由內(nèi)層向外層的翻轉(zhuǎn)，暴露在外表面的磷脂酰絲氨酸可被周圍的吞噬細(xì)胞識別、吞噬，從而使凋亡細(xì)胞得以被清除。Annexin V為一種磷脂結(jié)合蛋白，可特異性地識別細(xì)胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸，所以經(jīng)常被用于細(xì)胞凋亡檢測。PI是一種能結(jié)合DNA的紅色熒光染料，但只有在細(xì)胞經(jīng)歷壞死，細(xì)胞膜破裂的情況下才可透過細(xì)胞膜與DNA結(jié)合。所以Annexin V-FITC/PI雙染色的流式細(xì)胞儀分析，是檢測懸浮細(xì)胞凋亡最敏感和最特異的方法。Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)果顯示，Annexin V(+)/PI(-)細(xì)胞和冬凌草甲素作用密切相關(guān)，呈時間依賴性。處理4小時之后，Annexin V(+)/PI(-)細(xì)胞就已出現(xiàn)。隨后，Annexin V(+)/PI(+)細(xì)胞隨著時間的延長而增多。
冬凌草甲素雖然也可以誘導(dǎo)這些細(xì)胞發(fā)生凋亡，但需要的濃度較高，為8-25μM。
權(quán)利要求
1.冬凌草甲素在制備治療急性白血病藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，冬凌草甲素在制備治療含有AMLl-ETO融合基因的急性髓性白血病藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于白血病細(xì)胞1-20×105個細(xì)胞/毫升，冬凌草甲素使用量0.5-5μM。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于白血病細(xì)胞1-20×105個細(xì)胞/毫升，冬凌草甲素使用量2-5μM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，冬凌草甲素在制備治療不含有AMLl-ETO融合基因的急性髓性白血病藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，冬凌草甲素在制備治療急性單核細(xì)胞性白血病藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，冬凌草甲素在制備治療急性早幼粒細(xì)胞性白血病藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6或7所述的應(yīng)用，其特征在于白血病細(xì)胞1-20×105個細(xì)胞/毫升，冬凌草甲素使用量8-25μM。
9.冬凌草甲素在制備治療慢性粒細(xì)胞性白血病藥物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于白血病細(xì)胞1-20×105個細(xì)胞/毫升，冬凌草甲素使用量8-25μM。
全文摘要
本發(fā)明涉及冬凌草甲素在制備治療急性白血病藥物中的應(yīng)用；和冬凌草甲素在制備治療慢性粒細(xì)胞性白血病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明對冬凌草甲素發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個新的應(yīng)用領(lǐng)域。冬凌草甲素安全無毒，藥理作用強，預(yù)示著很好的藥用前景。冬凌草甲素在體外可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡，在體內(nèi)可延長t(8；21)白血病小鼠模型的生存期，或延緩腫瘤在體內(nèi)的生長。冬凌草甲素可激活內(nèi)源性凋亡通路，使在t(8；21)白血病發(fā)生過程中起關(guān)鍵作用的AML1－ETO融合蛋白發(fā)生降解。冬凌草甲素對AML1－ETO融合蛋白的降解是通過活化caspase－3產(chǎn)生的。本發(fā)明還首次確定了一個重要的caspase－3切割位點。
文檔編號A61P35/00GK1994293SQ200610030200
公開日2007年7月11日 申請日期2006年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月18日
發(fā)明者陳竺, 周光飚, 陳賽娟, 王振義 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院