專利名稱：：分離海姆泊芬異構(gòu)體的方法及分離的異構(gòu)體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及光動(dòng)力治療領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種光動(dòng)力治療的光敏劑。
背景技術(shù)：
：光動(dòng)力治療(PDT)是給患者施以光活性化合物，光敏劑在新生血管部位富集，再以低強(qiáng)度激光照射，激發(fā)光敏劑使之產(chǎn)生光化學(xué)反應(yīng)，在發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)的部位產(chǎn)生自由基，可殺傷該部位的組織細(xì)胞，主要通過直接細(xì)胞毒作用及其封閉病灶部位血管產(chǎn)生治療效果。用于光動(dòng)力治療的光敏劑有血卟啉衍生物(HPD)、苯并卟啉衍生物(BPD)、二氫卟吩e6單天冬氨酸酰胺(Npe6)、磺酸鋁酞菁(CASPc)、中介四(間羥基苯基)-二氫卟吩(mTHPC)、錫乙基初紫紅素(SnEt2)、5-氨基乙酰丙酸(ALA)等，用于腫瘤、皮膚病的光動(dòng)力治療。3(或8)-(1-甲氧基乙基)-8(或3)-(l-羥乙基)次卟啉IX(海姆泊芬)是一種有效的新型光動(dòng)力治療藥物，對(duì)某些癌癥和鮮紅斑痣有良好的治療作用(許德余、陳文暉、沈念慈光動(dòng)力治癌新藥3-或8-3(或8)-(l-甲氧基乙基)-8(或3)-(1-羥乙基)次卟啉IX，中國激光醫(yī)學(xué)雜志，1993，2:1;顧瑛、劉凡光、王開等，血啉甲醚用于光動(dòng)力療法治療鮮紅斑痣的臨床研究，中國激光醫(yī)學(xué)雜志2000，9(3):185)。目前用于光動(dòng)力治療的光敏劑，大部分是復(fù)雜的混合物，組成不確定，結(jié)構(gòu)尚有爭議，影響了藥物制備、治療效果的穩(wěn)定性。目前使用的光動(dòng)力治療藥物3(或8)-(卜甲氧基乙基)-8(或3)-(1-羥乙基)次卟啉IX(海姆泊芬)作為單一的化合物，具有明確的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但仍然包含2種位置異構(gòu)體，其具有的缺點(diǎn)是性質(zhì)不夠穩(wěn)定，從而影響到效果的可靠性。為了獲得分子結(jié)構(gòu)單一，性質(zhì)更穩(wěn)定的藥物，有必要進(jìn)一步分離2種位置異構(gòu)體，用于更有效地對(duì)患者進(jìn)行光動(dòng)力治療。對(duì)海姆泊芬位置異構(gòu)體的拆分仍然是現(xiàn)有技術(shù)中的難點(diǎn)，需要綜合考慮所應(yīng)采取的拆分方法、拆分條件(包括pH值、溫度、時(shí)間等)、拆分試劑等大量因素。目前現(xiàn)有技術(shù)中至今還沒有獲得分離的、分子結(jié)構(gòu)單一且性質(zhì)更穩(wěn)定的該類藥物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供一種分離3(或8)-(l-甲氧基乙基)-8(或3)-(1-羥乙基)次卟啉IX(海姆泊芬)位置異構(gòu)體的方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種根據(jù)所述方法獲得的分子結(jié)構(gòu)單一的化合物8-(1-甲氧基乙基)-3-(1-羥乙基)次卟啉IX(海姆泊芬異構(gòu)體-A)。本發(fā)明的另一目的是提供一種根據(jù)所述方法獲得的分子結(jié)構(gòu)單一的化合物3-(1-甲氧基乙基)-8-(1-羥乙基)次卟啉IX(海姆泊芬異構(gòu)體-B)。兩種異構(gòu)體采用HPLC方法分離3(或8)-(1-甲氧基乙基)-8(或3)-(1-羥乙基)次卟啉IX位置異構(gòu)體混合物上載到反相硅膠柱，用ClC3的單元醇或四氫呋喃作為流動(dòng)相洗脫，在395nm處檢測，收集流出峰。所說的反相硅膠，可選用C18硅膠、C8硅膠、C4硅膠或苯基硅膠中的一種，優(yōu)選C8硅膠；反相硅膠的粒徑為10150ura，優(yōu)選粒徑3070uni;反相硅膠的孔徑60200A，優(yōu)選孔徑60A。流動(dòng)相優(yōu)選甲醇，更優(yōu)選的，流動(dòng)相為含有緩沖液的甲醇溶液，pH45。其中緩沖溶液選自醋酸-醋酸鈉、醋酸-醋酸銨、磷酸-磷酸鹽等，優(yōu)選醋酸-醋酸銨緩沖液。3(或8)-(1-甲氧基乙基)-8(或3)-(1-羥乙基)次卟啉IX用HPLC流動(dòng)相溶解，配制成5mg/mL濃度的樣品溶液，過濾后進(jìn)樣。M0S—Hypersil(G)，10X250mm，以甲醇一1.5M乙酸一乙酸胺緩沖液(pH4.76)(65:35V/V)為流動(dòng)相，在流速2mL/min，柱壓125Bar條件下故采用反相高效液相色譜法進(jìn)行分離。用MD檢測器，在檢測波長395nm檢測，收集流出峰。共有2個(gè)流出峰，異構(gòu)體A為HPLC保留時(shí)間短的組分，異構(gòu)體B為HPLC保留時(shí)間長的組分。收集到的異構(gòu)體A流分、異構(gòu)體B流分用同樣方法進(jìn)行處理。可采用有機(jī)溶劑萃取法和直接濃縮法，優(yōu)選有機(jī)溶劑萃取法，萃取溶劑選自乙酸甲酯、乙酸乙酯、石油醚或乙醚等；有機(jī)溶劑萃取液減壓蒸除溶劑至干，即得所要樣品。具體可采用如下方法收集樣品倒入乙酸乙酯(或乙醚)/蒸餾水二相溶液中，振搖，分取有機(jī)相，以蒸餾水洗滌有機(jī)相數(shù)次，有機(jī)相于4(TC下減壓蒸除溶劑至干，置真空干燥器中，以五氧化二磷真空干燥過夜，得到單一的異構(gòu)體樣品o8-(1-甲氧基乙基)-3-(1-羥乙基)次卟啉IX，具有式(I)所示的結(jié)構(gòu)3-(1-甲氧基乙基)-8-(l-羥乙基)次卟啉IX，具有式(II)所示的結(jié)構(gòu):H3C-CHCH3』70,CH3海姆泊芬異構(gòu)體A<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>圖1為3(或8)-(1-甲氧基乙基)-8(或3)-(1-羥乙基)次葉啉IX的HPLC圖，、並l曰。圖2A為純化后3-(1-甲氧基乙基)-8-(1-羥乙基)次卟啉IX(海姆泊芬異構(gòu)體B)純品HPLC圖譜。圖2B為純化后8-(1-甲氧基乙基)-3-(1-羥乙基)次卟啉IX(海姆泊芬異構(gòu)體A)純品HPLC圖譜。圖3A為大鼠給藥后5分鐘肝組織樣品的HPLC圖譜及兩種異構(gòu)體含量。圖3B為大鼠給藥后30分鐘肝組織樣品的HPLC圖譜及兩種異構(gòu)體含量。圖3C為大鼠給藥后8小時(shí)肝組織樣品的HPLC圖譜及兩種異構(gòu)體含量。具體實(shí)施方式本發(fā)明人經(jīng)過大量的工作，首次從3(或8)-(1-甲氧基乙基)-8(或3)-(1-羥乙基)次卟啉n中分離出2種位置異構(gòu)體，獲得了分子結(jié)構(gòu)單一，性質(zhì)更穩(wěn)定的藥物。并且，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，海姆泊芬的異構(gòu)體A代謝較快，肝臟蓄積少，單獨(dú)應(yīng)用比混合體具有更低的肝毒性，可減少該類不良反應(yīng)；而海姆泊芬的異構(gòu)體B在肝臟濃度更高，停留時(shí)間長，更有利于以肝臟為靶向的光動(dòng)力治療作用，如肝癌的光動(dòng)力治療。光活性化合物兩種異構(gòu)體的化學(xué)結(jié)構(gòu)確證采用一維N0E差譜(1D-NOEDIFF)技術(shù)，結(jié)果如下異構(gòu)體A:氫譜的化學(xué)位移大致可分為三個(gè)部分610—llppm為芳香質(zhì)子信號(hào)；S2—7ppm為脂肪族質(zhì)子信號(hào)；S-3.98ppm為環(huán)內(nèi)NH質(zhì)子信號(hào)，這是由于受芳香環(huán)流正屏蔽的影響而出現(xiàn)在異常的高場。在前述海姆泊芬核磁共振分析測試報(bào)告的基礎(chǔ)上，對(duì)異構(gòu)體A進(jìn)行譜線歸屬Sl0.78(H-5);S10.54(H-10);510.28(H-15);S10.23(H-20);S6.54(辺0H);S6.15(Qi—0CH3);S4.35(C25H2，C27H2);S3.73(C2—CH3);S3.69(C7—CH3);S3.64(C12-CH》；S3.62(C18-CH3);S3.56(0CH3);S3.22(C26H2，C28H2);S2.16(CH逃)；S-3，98(NH)。異構(gòu)體A—維NOE差譜的實(shí)驗(yàn)結(jié)果輻照S10.78，則S6.54、53.69、52.16產(chǎn)生N0E增益；輻照S10.54，則56.15、53.64、53.56、S2.16產(chǎn)生N0E增益；輻照510.28，則54.35、53.22產(chǎn)生N0E增益；輻照S10.23，則S3.73、S3.62產(chǎn)生N0E增益.這些數(shù)據(jù)證明異構(gòu)體A取代基CH0HCH3連在C-8位上，CH-(0CH3)CH3連在C-3位上。分別輻照S6.65、S6.15、54.35、S3.56、S3.22及52.16，亦得到如上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？梢源_定所說的異構(gòu)體A是8-(1-甲氧基乙基)-3-(1-羥乙基)次葉啉IX，為分子結(jié)構(gòu)為下式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>海姆泊芬異構(gòu)體A異構(gòu)體B:氫譜的化學(xué)位移大致可分為三個(gè)部分S10—llppm為芳香質(zhì)子信號(hào)；S2—7ppm為脂肪族質(zhì)子信號(hào)；S-3.98ppm為環(huán)內(nèi)NH質(zhì)子信號(hào)，這是由于受芳香環(huán)流正屏蔽的影響而出現(xiàn)在異常的高場。在前述海姆泊芬核磁共振分析測試報(bào)告的基礎(chǔ)上，異構(gòu)體B的譜線歸屬S10.70(H-5);510.57(H-10);S10,28(H-15);S10.25(H-20);S6.13,H);S6.55(Qi—OCH3);S4.35(C25H、C27H2);S3.58—3.75(C7—CH3、C2—CH3、C1S—CH3);53.56、3.53(C12—CH3);S3.38(0CH3);53.21(C26H2、C28H2);S2.16(CH迅)；S-3.95(NH)。異構(gòu)體B—維差譜的實(shí)驗(yàn)結(jié)果輻照S10.70，則56.55、S3.64、S3.62、S3.38產(chǎn)生N0E增益；輻照510.57，則56.13、53.71、53.68產(chǎn)生N0E增益；輻照S10.28和510.25，則54.35、53.71、S3.68、S3.64、53.62產(chǎn)生NOE增益；輻照56.55，則510.7、S3.71、53.68、S3.38、S2.16產(chǎn)生NOE增益；輻照S6.13，則510.57、53.71、53.68、S3.56、S3.53產(chǎn)生NOE增益。分別輻照S4.35、53.69、53.60、53.53、S3.21及52.16，亦得到如上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？梢源_定所說的異構(gòu)體B是3-(1-甲氧基乙基)-8-(1-羥乙基)次B卜啉IX，分子結(jié)構(gòu)為下式cp3H3C-CH海姆泊芬異構(gòu)體B治療機(jī)理本發(fā)明涉及用光動(dòng)力治療因有害的新生血管形成而導(dǎo)致的疾病，光動(dòng)力學(xué)治療方案使得有害的新血管形成縮減。在本發(fā)明的方法中，給需要治療的患者服用適合的光活性化合物，其量足以使患者病灶內(nèi)的光活性化合物達(dá)到有效濃度。服用后經(jīng)過一段時(shí)間，使有效濃度的化合物聚集在病灶后，用被該光活性化合物吸收的光照射該區(qū)域。光活性化合物被光激發(fā)，產(chǎn)生活性氧和自由基，引起病變區(qū)域細(xì)胞光化學(xué)損傷，封閉病變部位的新生血管，從而治療因有害血管形成而導(dǎo)致的各種疾病。給藥和劑量光活性化合物可以各種途徑給藥，如口服、非腸道給藥或直腸給藥，以非腸道給藥為宜，如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下注射。以靜脈注射為最好。光活性化合物的劑量可以根據(jù)給藥方式、制劑類型、是否偶聯(lián)耙向配體而有很大的變化。一般認(rèn)為，在光活性劑的制劑、給藥方式和劑量水平之間有關(guān)聯(lián)。通常，3-(1-甲氧基乙基)-8-(1-羥乙基)次卟啉IX或8-(l-甲氧基乙基)-3-(1-羥乙基)次卟啉IX的典型劑量范圍為0.1-100mg/kg，較佳的劑量范圍為0.5-50mg/kg，更佳的劑量范圍為1-10mg/kg。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以通過實(shí)驗(yàn)確定合適的劑量。在本發(fā)明中用于有效、選擇性光動(dòng)力學(xué)治療的各種參數(shù)是相互關(guān)聯(lián)的。因此，可以相對(duì)于其他參數(shù)(例如光動(dòng)力學(xué)治療中所使用的光通量、光照度、持續(xù)時(shí)間和劑量、給藥與光照射之間的時(shí)間間隔等)而調(diào)整劑量。使用這些參數(shù)都應(yīng)調(diào)整到能顯著提高視力而不產(chǎn)生正常眼組織的明顯損害為宜。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過實(shí)驗(yàn)確定合適的參數(shù)。換言之，當(dāng)光活性化合物的劑量降低時(shí)，封閉脈絡(luò)膜新生血管組織的光通量有增加的趨勢；反之需要降低光通量，則需要增加光活性化合物的劑量或增加靶向性促進(jìn)增加病變部位光活性化合物的富集程度。光治療方法光治療參數(shù)有關(guān)的某些術(shù)語在不同的作者和出版物中有所不同。比如光通量，也稱光劑量、光能量密度；光照度，也稱功率強(qiáng)度、功率密度。這些術(shù)語是本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用并理解的，在此加以說明。在光活性化合物給藥后，將眼的靶組織在被選擇的藥物吸收波長下進(jìn)行照射。對(duì)于血卟啉單甲醚，所選的波長范圍一般在630土20nm左右，更佳地為在630土10nni左右，該范圍波長在機(jī)體組織內(nèi)的穿透力比較好。照射的結(jié)果導(dǎo)致光活性化合物處于激發(fā)狀態(tài)，并與其他化合物相互作用，形成單線態(tài)氧(SingletOxygen)和其他自由基，引起血管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞。單線態(tài)氧和其他自由基主要損傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，包括細(xì)胞膜、線粒體膜、溶酶體膜和核膜。血管上皮細(xì)胞損傷引發(fā)后續(xù)的血小板凝聚、脫顆粒和血栓形成，造成血管的堵塞和封閉。根據(jù)組織的類型、靶組織深度和其上流體或血液的量，照射的光通量可有很大變動(dòng)。但較佳的為50-200焦耳/cm2。光照度一般變化于50-800mW/cm2，以約100-600mW/ci^為佳。然而，選擇使用較高的光照度，可以縮短治療時(shí)間而達(dá)到同樣的效果。光活性化合物給藥后至光治療之間的最適時(shí)間間隔也根據(jù)給藥方式、給藥形式和制劑類型而不同。光敏劑給藥后的時(shí)間間隔從l分鐘到2小時(shí)，較佳的為5-30分鐘，更佳的為10-25分鐘?？芍委煹募膊”景l(fā)明提供的3-(1-甲氧基乙基)-8-(l-羥乙基)次卩卜啉IX或8-(1-甲氧基乙基)-3-(l-羥乙基)次卟啉IX，用于制備治療因有害的新生血管形成而導(dǎo)致的疾病的藥物，該藥物作為光動(dòng)力治療因有害的新生血管形成而導(dǎo)致的疾病的光敏劑。因有害的新生血管形成而導(dǎo)致的疾病包括皮膚疾病，如鮮紅斑痣；也包括眼科疾病，如黃斑變性。治療的評(píng)價(jià)光動(dòng)力治療的效果在動(dòng)物模型上可用組織學(xué)切片觀察內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和病灶部位新生血管的封閉情況。典型的，新生血管的破壞表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡，細(xì)胞核皺縮異常，血管腔內(nèi)可見血小板聚集和血凝塊的形成。位于皮膚的血管封閉可以直接觀察效果；位于組織深層的血管封閉，例如眼部脈絡(luò)膜，可用血管造影技術(shù)觀察新血管減少。不同異構(gòu)體的分布肝臟是海姆泊芬主要的分布器官，大部分藥物經(jīng)肝臟從膽汁中排出體外。同時(shí)，卟啉類藥物主要的不良反應(yīng)是可能引起肝功能異常，可表現(xiàn)為轉(zhuǎn)氨酶升高。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，海姆泊芬的異構(gòu)體A代謝較快，肝臟蓄積少，單獨(dú)應(yīng)用比混合體具有更低的肝毒性，可減少該類不良反應(yīng)。同時(shí)，海姆泊芬的異構(gòu)體B在肝臟濃度更高，停留時(shí)間長，提示更有利于以肝臟為耙向的光動(dòng)力治療作用，如肝癌的光動(dòng)力治療。因此，在具體實(shí)施治療時(shí)，可根據(jù)患者的狀況來選擇使用海姆泊芬的異構(gòu)體A或異構(gòu)體B，以達(dá)到最佳的治療效果。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)首次提供了一種分離3(或8)-(1-甲氧基乙基)-8(或3)-(1-羥乙基)次卟啉IX(海姆泊芬)位置異構(gòu)體的方法，該方法即可方便地獲得分子結(jié)構(gòu)單一，性質(zhì)更穩(wěn)定的海姆泊芬藥物。(2)首次發(fā)現(xiàn)海姆泊芬的異構(gòu)體A代謝較快，肝臟蓄積少，單獨(dú)應(yīng)用比混合體具有更低的肝毒性；而海姆泊芬的異構(gòu)體B在肝臟濃度更高，停留時(shí)間長，更有利于以肝臟為靶向的光動(dòng)力治療作用。從而在采用海姆泊芬進(jìn)行治療時(shí)，可根據(jù)患者的狀況來選擇使用海姆泊芬的異構(gòu)體A或異構(gòu)體B。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1:海姆泊芬的制備1.3(8)-(1-甲氧基乙基)-8(3)-(l-羥乙基)次卟啉K粗品的制備在50L耐酸搪玻璃反應(yīng)鍋中加入體積比為3:1的甲醇/水混合液30L，攪拌下由液體滴加器緩緩滴入，按中國專利01105208.2說明書實(shí)施例1記載的方法制備得到的3，8-二-(1-溴乙基)-次卟啉K氫溴酸鹽冰醋酸飽和溶液IOL，控制滴加速度使反應(yīng)混合物溫度保持在102CTC。滴加完畢，反應(yīng)液繼續(xù)攪拌2h，放置4h。然后于攪拌下滴加10NNaOH水溶液至反應(yīng)液呈強(qiáng)堿性(PH13左右)，放置10h以上，加醋酸中和至PH45,加5倍體積的水稀釋，放置過夜，沉淀物自然沉淀，傾去上清液后，吸濾收集沉淀，用水充分洗滌，抽干，置真空干燥器中用PA真空干燥。得深褐色的含3(8)-(1-甲氧基乙基)-8(3)-(1-羥乙基)次卟啉K(53.3%HPLC)、3,8-二-(1-甲氧基乙基)-次卟啉IX(19.5%HPLC)和3，8-二-(1-羥乙基)-次卟啉K(27.1%HPLC)的粗品160克，收率80%。2.3(8)-(1-甲氧基乙基)-8(3)-(l-羥乙基)次卟啉IX的色譜分離純化取60X600mra玻璃層析柱10根，分別加入200g經(jīng)活化的硅膠，仔細(xì)敲實(shí)。取上一步制備的3(8)-(1-甲氧基乙基)-8(3)-(1-羥乙基)次葉啉僅粗品6g與30g硅膠H研勻后加于硅膠柱上層，并在其上另加硅膠H20g，同前敲實(shí)。加展開劑(甲醇-氯仿-甲酸(10:1:0.l))進(jìn)行層析分離，分段收集流分，先以薄層層析檢測，當(dāng)TLC檢測顯示所需組分為單一斑點(diǎn)時(shí)，即進(jìn)行HPLC檢測，合并HPLC分析保留時(shí)間3.43min的相對(duì)峰面積》95y。的流分，水洗，有機(jī)相減壓蒸干，即得，3(8)-(1-甲氧基乙基)-8(3)-(l-羥乙基)次P卜啉僅(海姆泊芬)純品約10g(收率16.7%)。實(shí)施例2:海姆泊芬位置異構(gòu)體的HPLC分離儀器AgilentIIOO型高效液相色譜儀；DAD檢測器，檢測波長395nm流動(dòng)相甲醇一1.5M乙酸一乙酸胺緩沖液(pH4.76)(65:35V/V)色譜柱M0S—Hypersil(C8)，10X250mm流速2mL/min柱壓125Bar取上述實(shí)施例1制備的海姆泊芬樣品100毫克，以HPLC流動(dòng)相溶解，配制成5mg/raL濃度的樣品溶液，進(jìn)樣前過濾。每次進(jìn)樣上述溶液400微升，進(jìn)樣后，根據(jù)HPLC色譜圖(見圖l)分別收集流分A，保留時(shí)間為11.94分和流分B保留時(shí)間為14.35分。累計(jì)40次，共收集流分A136ml，流分B133ml。收集液倒入乙酸乙酯(或乙醚)--蒸餾水二相溶液中，振搖，分取有機(jī)相，以蒸餾水洗滌有機(jī)相3次，有機(jī)相于4(TC下減壓蒸除溶劑至干，置真空干燥器中，以五氧化二磷真空干燥過夜。結(jié)果，分別得海姆泊芬位置異構(gòu)體A36.2毫克，異構(gòu)體B35.0毫克。純化后3-(1-甲氧基乙基)-8-(1-羥乙基)次卟啉IX(海姆泊芬異構(gòu)體B)純品的HPLC圖譜見圖2A。純化后8-(1-甲氧基乙基)-3-(l-羥乙基)次卟啉IX(海姆泊芬異構(gòu)體A)純品的HPLC圖譜圖2B。實(shí)施例3:海姆泊芬位置異構(gòu)體的制備級(jí)分離分離系統(tǒng)采用Flashl50M，內(nèi)置預(yù)裝C8層析柱(150mmIDX30cm)，由Biotage公司(美國)生產(chǎn)，硅膠粒徑為3570um，孔徑為60A。樣品準(zhǔn)備取實(shí)施例1制備的3(或8)-(1-甲氧基乙基)-8(或3)-(l-羥乙基)次卟啉IX純品(含量〉95y。)30克，用四氫呋喃溶解過濾，加入C8反相硅膠100克，減壓濃縮，蒸干，加入上樣柱SIM中，以備上樣。上樣及收集以甲醇一1.5M乙酸一乙酸胺緩沖液(pH4.76)(65:35V/V)為流動(dòng)相，將上述樣品通過上樣柱SIM，帶入層析柱中加以分離，流速控制在200ml/rain，檢測器波長395腿，收集海姆泊芬異構(gòu)體-A流分[8-(1-甲氧基乙基)-3_(1-羥乙基)次卟啉IX]和海姆泊芬異構(gòu)體-B流分[3-(1-甲氧基乙基)-8-(1-羥乙基)次卟啉IX]。后處理流分收集液用乙酸乙酯萃取，再將有機(jī)相減壓濃縮、蒸干，減壓干燥，即得樣品，海姆泊芬位置異構(gòu)體A11.8克，異構(gòu)體B11.3克。實(shí)施例4:海姆泊芬異構(gòu)體A和異構(gòu)體B的結(jié)構(gòu)確證(核磁共振譜)1.儀器與方法儀器VarianUNITYInova600核磁共振儀溶劑DMSO—d6內(nèi)標(biāo)TMS2.解析海姆泊芬異構(gòu)體A和異構(gòu)體B從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，僅是C-3和C-8位上二個(gè)取代基互換的差異所致。本項(xiàng)研究采用一維N0E差譜技術(shù)(1D-NOEDIFF)對(duì)這兩個(gè)異構(gòu)體進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。2.1.氫譜的化學(xué)位移大致可分為三個(gè)部分SlO—llppm為芳香質(zhì)子信號(hào)；S2—7ppm為脂肪族質(zhì)子信號(hào)；S-3.98ppm為環(huán)內(nèi)NH質(zhì)子信號(hào)，這是由于受芳香環(huán)流正屏蔽的影響而出現(xiàn)在異常的高場。2.2.異構(gòu)體A的結(jié)構(gòu)論證在海姆泊芬核磁共振分析測試報(bào)告的基礎(chǔ)上，對(duì)異構(gòu)體A進(jìn)行譜線歸屬S10.78(H-5);S10.54(H-10);S10.28(H-15);S10.23(H-20);S6.54(，H);56.15(辺-OCH3);S4.35(C25H2，C27H2);S3.73(C2-CH3);S3.69(C7-CH3);53.64(CI2-CH3);S3.62(C18-CH3);S3.56(OCH3);S3.22(C26H2,C28H2);S2.16(CH逃)；5—3，98(NH)。2.3.異構(gòu)體A的一維NOE差譜輻照SIO.78，則56.54、S3.69、S2.16產(chǎn)生N0E增益；輻照S10.54，則56.15、53.64、33.56、S2.16產(chǎn)生N0E增益；輻照S10.28，則S4.35、S3.22產(chǎn)生NOE增益；輻照510.23，則S3.73、53.62產(chǎn)生N0E增益。這些數(shù)據(jù)證明異構(gòu)體A取代基CH-(0CH3)CH3連在O8位上，CH0HCH3連在C-3位上。分別輻照S6.65、56.15、54.35、53.56、S3.22及52.16，亦得到如上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2.4.異構(gòu)體B的譜線歸屬S10.70(H-5);S10.57(H-10);S10.28(H-15);S10.25(H-20);S6.13(QiOH);S6.55(Qi—0CH3);S4.35(C25H、C27H2);S3.58—3.75(C7—CH3、C2-CH:!、C18-CH3);S3.56、3.53(C12-CH3);S3.38(OCH3);S3.21(C26H2、C28H2);S2.16(C,);5-3.95(NH)。2.5.異構(gòu)體B—維NOE差譜輻照510.70，則S6.55、S3.64、53.62、S3.38產(chǎn)生NOE增益；輻照S10.57，則S6.13、S3.71、S3.68產(chǎn)生NOE增益；輻照S10.28和510.25，則54.35、53.71、53.68、53.64、53.62產(chǎn)生NOE增益;輻照56.55，則510.7、53.71、53.68、53.38、52.16產(chǎn)生NOE增益;輻照S6.13，則510.57、53.71、53.68、53.56、S3.53產(chǎn)生NOE增益。這些NOE數(shù)據(jù)證明異構(gòu)體B取代基CH0HCH3連在C-8位上，CH-(OCH3)CH3連在C-3位上。分別輻照S4.35、33.69、S3.60、33.53、S3.21及S2.16，亦得到如上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3.1.海姆泊芬異構(gòu)體A的化學(xué)結(jié)構(gòu)式鑒定為下式，S卩，3-(l-羥基乙基)-8-(1-甲氧基乙基)-次卟啉IX。3.2.海姆泊芬異構(gòu)體B的化學(xué)結(jié)構(gòu)式鑒定為下式，即，3-a-甲氧基乙基)-8-(1-羥基乙基)-次B卜啉IX。CH~CH3實(shí)施例5:海姆泊芬及其位置異構(gòu)體對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的光動(dòng)力殺傷試驗(yàn)取生長狀態(tài)良好的鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞(RPMVEC，簡稱EC，按下述文獻(xiàn)方法制備ChenSF，F(xiàn)eiX，LiSH.Anewsimplemethodforisolationofmicrovascularendothelialcellsavoidingbothchemicalandmechanicalinjuries.MicrovasRes,1995,50:119)，用0.3%胰酶消化后，吹打成單細(xì)胞懸液，用含5呢血清的DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)整為5.0X10A個(gè)/ml，并將之接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔加入200u1，置于孵箱中孵育18h后，吸出各孔中的培養(yǎng)液。將上述實(shí)施例1、實(shí)施例2制備的海姆泊芬、異構(gòu)體A、異構(gòu)體B，三種光敏劑用不含血清的DMEM培養(yǎng)液配制成濃度分別為0.75ixg/ml、0.625ug/ml、0.5ug/ml、0.375ug/ml、0.25yg/ml、0,125tig/ml、0.05yg/ml的溶液，在避光條件下，每孔加入200ul，每個(gè)濃度點(diǎn)6L，孵育時(shí)間為4h。利用銅蒸氣激光進(jìn)行照射，功率密度為20mw/cm2，時(shí)間為1000秒，能量密度為20J/cm2。其后置于孵箱中孵育24h，再在每孔中加入20u1的MTT(用PBS溶液配制成5mg/ml)，于孵箱孵育4h后，小心的吸出培養(yǎng)液及MTT，每孔加入150u1的DMS0，置于孵箱中孵育12h后，于酶標(biāo)儀測定前振蕩5分鐘，設(shè)定酶標(biāo)儀的參數(shù)，選擇595nm作為測量波長，655nm作為參考波長，測定各孔的光密度(0D)值，打印結(jié)果，求其平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。測得各孔的光密度值后，求其細(xì)胞存活率，公式如下細(xì)胞存活率(％)=(實(shí)驗(yàn)組0D-本底組0D)/(完全空白組0D-本底組OD)X100%統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Stata6.0軟件(美國ComputerResourceCenter研第!j)，取三次實(shí)驗(yàn)的各濃度點(diǎn)細(xì)胞存活率的平均值作曲線擬合，從而計(jì)算出其ic5。。實(shí)驗(yàn)證明這三種光敏劑對(duì)EC均無暗毒性。銅蒸汽激光照射下，海姆泊芬異構(gòu)體-A、海姆泊芬異構(gòu)體-B與海姆泊芬對(duì)EC的半數(shù)致死量(IC5。)分別為0.368yg/ml、0.412yg/ml、0.493ug/ml。海姆泊芬的兩種異構(gòu)體與海姆泊芬所介導(dǎo)的對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的光動(dòng)力殺傷作用強(qiáng)度相似。實(shí)施例6:兩種異構(gòu)體在肝臟的分布取大鼠18只，體重210.0士4.8g，隨機(jī)分成3組，每組6只，雌雄各半。禁食但可自由飲水10小時(shí)后，靜脈注射(iv)10mg/kg海姆泊芬，分別于給藥后5、30和480min，由股動(dòng)脈放血處死動(dòng)物。取血漿0.5ml，并立即分取肝組織。稱取組織約0.3g(精密稱重)，加l.Oml三蒸水制成勻漿后，用3ml乙腈沉淀蛋白(其中肝組織勻漿提取后，經(jīng)稀釋后進(jìn)樣)，于2500rpm離心5min，取上清液0.5ml，于15000rpm離心10min，兩次高速離心后，取160pl上清液于自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，20pl進(jìn)樣。用HPLC法測定組織中兩種異構(gòu)體濃度。大鼠給藥后5、30和480min后肝組織樣品的HPLC圖譜分別如圖3A、圖3B和圖3C所示。由圖可以看出，給藥后肝組織中異構(gòu)體B的含量高于異構(gòu)體A，給藥8小時(shí)后肝組織中只檢測到異構(gòu)體B。因此兩異構(gòu)體在肝臟的分布有差異，異構(gòu)體B在肝臟分布量更高，因而對(duì)于治療肝癌效果更佳。實(shí)施例7:海姆泊芬及其位置異構(gòu)體對(duì)雞冠皮膚的光動(dòng)力損傷試驗(yàn)選取體重0.81.2kg、周齡1216周的雄性萊亨雞共30只，隨機(jī)分為3組。每組動(dòng)物首先肌注麻保靜(O.100.12mg/kg)麻醉，在避光條件下將濃度為10mg/ral的海姆泊芬、異構(gòu)體A、異構(gòu)體B光敏劑按20mg/kg的劑量推注入萊亨雞靜脈。固定雞冠后，標(biāo)記照光區(qū)，每只雞冠設(shè)定4個(gè)照射區(qū)，每個(gè)照射區(qū)直徑為lcm。選擇銅蒸氣激光輸出混合光由光纖輸出垂直進(jìn)行照射，功率密度為100iw/cm2，照射時(shí)間為20分鐘，不照光處適當(dāng)遮蓋。照光前后均使用功率計(jì)檢測輸出功率，保證其波動(dòng)范圍在±5%之間。對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組均在照光后3天和14天時(shí)先行肉眼觀察、記錄處理部位雞冠的顏色和表面情況，然后剪下雞冠照光區(qū)的組織立即置于10%甲醛液中固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋切片、HE染色，光鏡下觀察、記錄其病理改變。根據(jù)光動(dòng)力作用后雞冠皮膚形態(tài)學(xué)改變的劃分標(biāo)準(zhǔn)，將雞冠皮膚靶組織和非靶組織對(duì)光動(dòng)力的反應(yīng)分成輕(L，lightreaction)、中(M，middlereaction)、重(S，severreaction)三度。采用乂2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，設(shè)定P〈0.05為差異顯著。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Stata軟件。三種光敏劑對(duì)雞冠皮膚靶組織和非靶組織光敏損傷大體改變的比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表三種光敏劑對(duì)雞冠皮膚光敏損傷大體改變特點(diǎn)的比較見表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>三組光敏劑的病理組織切片的光鏡下觀察的結(jié)果示乳頭層毛細(xì)血管網(wǎng)減少，管腔小，可見新生毛細(xì)血管，表皮層和真皮深層無改變，網(wǎng)狀層血管擴(kuò)張，對(duì)靶組織都能產(chǎn)生有效的損傷破壞作用，且都具有較為明確的選擇性作用。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求1.一種分離3(或8)-(1-甲氧基乙基)-8(或3)-(1-羥乙基)次卟啉IX位置異構(gòu)體的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將3(或8)-(1-甲氧基乙基)-8(或3)-(1-羥乙基)次卟啉IX混合物上載到反相硅膠柱；(2)用C1～C3的單元醇或四氫呋喃作為流動(dòng)相洗脫；(3)在395nm處檢測，收集流出峰；其中，所述的反相硅膠選自C18硅膠、C8硅膠、C4硅膠或苯基硅膠。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，反相硅膠的粒徑為10150Um，孔徑為60200A。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，反相硅膠粒徑為3070iim，孔徑為60A。4.如權(quán)利要求1-3中的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，反相硅膠為C8硅膠。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，流動(dòng)相為含有緩沖液的甲醇溶液，pH45。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的緩沖液為1.5M乙酸--乙酸胺緩沖液，甲醇與乙酸--乙酸胺緩沖液的體積比為65:35，pH4.76。7.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，包含如下步驟(1)3(或8)-(1-甲氧基乙基)-8(或3)-(1-羥乙基)次葉啉IX用HPLC流動(dòng)相溶解，配制成5mg/mL濃度的樣品溶液，上樣至C8反相層析柱，所述C8反相層析柱的硅膠粒徑為3070um，孔徑為60A;(2)以體積比為65:35的甲醇一L5M乙酸一乙酸胺緩沖液為流動(dòng)相，pH4.76，在流速2mL/min，柱壓125Bar條件下進(jìn)行洗脫；(3)在395nm處檢測，收集保留時(shí)間為11.94分和保留時(shí)間為14.35分的流出峰；(5)流出峰用乙酸乙酯(或乙醚)/蒸餾水二相溶液萃取，取有機(jī)相于4(TC下，蒸干，得到單一的異構(gòu)體樣品。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法獲得的8-(l-甲氧基乙基)-3-(1-羥乙基)次卟啉IX，具有式(I)所示的結(jié)構(gòu):9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法獲得的3-(1-甲氧基乙基)-8-(l-羥乙基)次卟啉IX，具有式(II)所示的結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(II)10.3-(1-甲氧基乙基)-8-(l-羥乙基)次卟啉IX的用途，其特征在于，用于制備治療肝癌的藥物。全文摘要本發(fā)明屬于光動(dòng)力治療領(lǐng)域，尤其涉及光動(dòng)力治療的光敏劑。本發(fā)明提供了一種分離3(或8)-(1-甲氧基乙基)-8(或3)-(1-羥乙基)次卟啉IX位置異構(gòu)體的反相純化方法。應(yīng)用該方法可制備8-(1-甲氧基乙基)-3-(1-羥乙基)次卟啉IX或3-(1-甲氧基乙基)-8-(1-羥乙基)次卟啉IX單一異構(gòu)體。動(dòng)物試驗(yàn)表明，兩種異構(gòu)體作為光敏劑封閉新生血管同樣有效。本發(fā)明提供的單一異構(gòu)體，可用于制備分子結(jié)構(gòu)單一，性質(zhì)更穩(wěn)定的藥物。文檔編號(hào)A61P1/16GK101125855SQ20061003018公開日2008年2月20日申請(qǐng)日期2006年8月18日優(yōu)先權(quán)日2006年8月18日發(fā)明者軍李,陳文輝,陶紀(jì)寧申請(qǐng)人:上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司