一般而言,本發(fā)明涉及生物分子的分析方法,更詳細(xì)地,涉及分析生物分子的生物學(xué)意義,利用在核酸中與靶核酸的特定區(qū)域完整地互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸,通過一次檢查在生物試樣中分析生物分子的方法及裝置,上述核酸包含與多種靶分子相結(jié)合的分析配體及核酸等的靶核酸。
背景技術(shù):
:生物分子為組成生物試樣的多種蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)及碳化物等的物質(zhì),雖然分析這些生物分子的技術(shù)以及在生物試樣中將生物分子的定量狀態(tài)進(jìn)行綜合化的信息,即,生產(chǎn)生物分子的實(shí)驗(yàn)方案(profile)的技術(shù)隨著物理學(xué)、生物化學(xué)及生物信息學(xué)的發(fā)展而被廣泛開發(fā),但由于現(xiàn)有方法或設(shè)備的使用及維護(hù)費(fèi)、容易性、準(zhǔn)確度、靈敏性、檢測時(shí)間及過程的自動化等的問題,對有效的新方法及設(shè)備的需要非常高。生物分子分析及實(shí)驗(yàn)方案生產(chǎn)的技術(shù)其本身并不是最終的目標(biāo),而是用于達(dá)成目標(biāo)的一種手段,但由于能夠有用地使用在微生物、細(xì)胞、組織等中,因此被廣泛地應(yīng)用在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)、環(huán)境工程、食品工程、農(nóng)業(yè)等。包含核酸、蛋白質(zhì)及有機(jī)物質(zhì)等的生物分子的實(shí)驗(yàn)方案利用物理性質(zhì)、化學(xué)性質(zhì),并通過多種方法被生產(chǎn)出來,上述核酸、蛋白質(zhì)及有機(jī)物質(zhì)的組成是作為生物試樣的組織、細(xì)胞塊、細(xì)胞及微生物等。用于分析利用生物試樣中的生物分子的實(shí)驗(yàn)方案的生物學(xué)意義的臨床決策支持系統(tǒng)(CDSS,ClinicalDecisionSupportSystem),在患者診療中支持醫(yī)生進(jìn)行有關(guān)診斷和治療的決策(DecisionMaking)的過程的系統(tǒng)。臨床決策支持系統(tǒng)大體上分成事例基礎(chǔ)機(jī)器學(xué)習(xí)推理系統(tǒng)(CaseBasedMachineLearningInferenceSystem)和專家系統(tǒng)(ExpertSystem)。事例基礎(chǔ)機(jī)器學(xué)習(xí)推理系統(tǒng)能夠收集判定患有疾病的患者的臨床信息(ClinicalInformation)及生物學(xué)信息,即生物分子的實(shí)驗(yàn)方案數(shù)據(jù)之后,利用機(jī)器學(xué)習(xí)并通過現(xiàn)有的臨床信息和生物學(xué)信息等,來對疾病進(jìn)行推理或判別。專家系統(tǒng)依據(jù)由醫(yī)學(xué)專家預(yù)先制定的規(guī)則(Rule)來診斷疾病。若對最具代表性的生物分子的遺傳物質(zhì)的核酸及蛋白質(zhì)進(jìn)行觀察,遺傳信息以組成染色體的脫氧核糖核酸(DNA,Deoxyribonucleicacid)的非常長的分子形態(tài)被存儲,上述染色體包含約30億個(gè)組成人體基因組的核苷酸。在染色體中核苷酸的序列對于決定各個(gè)體的特性起到主要的作用。多數(shù)的普通疾病根據(jù)在個(gè)體之間的人體基因組的核苷酸序列中的變形。屬于同種的生物體個(gè)體的基因組中所包含的遺傳密碼相互不一致,并存在稱作多態(tài)性(polymorphism)的堿基序列上的差異。眾所周知,多態(tài)性中1個(gè)以上的堿基被缺失(deletion)或插入(insertion)、特定堿基序列被反復(fù)(repeat)等。一個(gè)堿基被置換成另一個(gè)堿基被命名為單個(gè)堿基多態(tài)性(SNP,Singlenucleotidepolymorphism,以下簡稱為“SNP”)。作為許多SNP的基因型分析化學(xué)(genotypingchemistries)已提出了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-restrictionfragmentlengthpolymorphismanalysis)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(single-strandconformationpolymorphismdetection)、雙脫氧微測序(dideoxyminisequencing)、寡核苷酸連接分析(oligonucledtideligationassays)、等位基因特異性核酸擴(kuò)增(AS-PCR,allele-specificpolymerasechainreaction,以下簡稱為“AS-PCR”)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ligasechainreaction)、引物-所需核苷酸結(jié)合分析(primer-requirednucleotideincorporationassays)及熒光能量轉(zhuǎn)移-基礎(chǔ)分析(fluorescenceenergytransfer-basedassays)等(Landegren,U.,etal.,1998,GenomeRes,8:769-776;Gut,I.G.,2001,HumMutat,17:475-492;Shi,M.M.,2001,ClinChem,47:164-172)。上述目錄以外,最近添加的有能夠準(zhǔn)確直接地決定短的單脫氧核糖核酸片段的質(zhì)量的質(zhì)譜分析法(massspectrometry)(RossPetal.,2000,BioTechniques,29:620-629)和寡核苷酸微陣列-基礎(chǔ)分析(Oligonucleotidemicroarray-basedanalysis)(Wang,D.G.etal.,1998,Science,280:1077-1082)。等位基因特異性雜交(allelicspecifichybridization)為美國昂飛公司的全基因組SNP陣列(AffymetrixwholegenomeSNParray)(KomuraD.,etal.,2006,GenomeRes.2006;16:1575-84.6)、愛達(dá)荷公司的高分辨率熔解曲線分析系統(tǒng)(IdahoHi-ResMeltingcurveanalysissystem)(GrahamR.,etal.,2005,ClinChem.51:1295-8)、動態(tài)等位基因特異性雜交(DASH,dy-namicallele-specifichybridization)(PrinceJ.A.,etal.,2001,GenomeRes.11:152-62)及億明達(dá)公司的金門SNP基因型分型陳列(IlluminaGoldenGateSNPGenotypingArrays)(GundersonK.L.,etal.,2005,NatGenet.37:549-54),熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET,fluorescenceresonanceenergytransfer)為托曼(TaqMan)(HollowayJ.W.,etal.,1999,HumMutat.14:340-7),分子信標(biāo)檢測(Molecularbeaconsassays)為(BarreiroL.B.,etal.,2009,MethodsMolBiol.578:255-76),以及應(yīng)用AS-PCR的延伸(extension)技術(shù)為億明達(dá)(Illumina)公司的英菲(Infinium)微珠芯片(OliphantA.,etal.,2002,Biotechniques.Suppl:56-8,60-1)、貝克曼公司的基因組GenomeLabSNPstream系統(tǒng)(BeckmanGenomeLabSNPstreamsystem)(BellP.A.,etal.,2002,Biotechniques.2002;Suppl:70-2,74,76-7)以及西格諾公司的分子量陣列SNP系統(tǒng)(SequenomMassARRAYSNPsystem)(HayesB.J.,etal.2007,Bioinformatics.2007;23:1692-3)等。用于SNP鑒定的上述方法,根據(jù)特定目的存在相對的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn),因此不能夠斷定地說哪種方法比其它方法更優(yōu)越。一方面,脫氧核糖核酸-基礎(chǔ)微陣列技術(shù)作為能夠分析特定基因或基因簇的存在、量或者表達(dá)模式的簡單的方法而備受矚目。(chenaetal.,1995,Science,270:467-470;DeRisietal.,1996,NatureGenetics14:457-460)。各個(gè)細(xì)胞中存在5萬至10萬個(gè)左右的基因,但細(xì)胞選擇性地使用基因。其中相當(dāng)數(shù)量為用于細(xì)胞本身的生命維持活動或者日常活動的基因。將這些基因稱作為持家基因(housekeepinggene;以下簡稱為HKG)。并且,根據(jù)說明特定基因的功能,或者探索特定功能的基因,或者制定特定條件的生物體的表達(dá)方式以及除上述之外的多種分子生物學(xué)目的,內(nèi)源性標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)基因存在為了比較特定或者多個(gè)基因表達(dá)量而開發(fā)的利用信使核糖核酸(messengerRNA;以下簡稱為mRNA)的定量分析的多種基因表達(dá)檢測法,其方法有從傳統(tǒng)的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR,reversetranscriptasepolymerasechainreaction;以下稱為RT-PCR)到最近開發(fā)的實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR,quantitativerealtimePCR;以下稱為qRT-PCR)、基因表達(dá)系列分析(SAGE,serialanalysisofgeneexpression;以下稱為SAGE)及微陣列(Microarray)等。但是,由于現(xiàn)有脫氧核糖核酸微陣列僅僅是通過雜交方式來檢測靶序列,會發(fā)生交叉反應(yīng)(crossreaction)引起的假陽性(falsepositives)問題,因此存在需要改善雜交信號的可靠性的問題。并且,由于現(xiàn)有微陣列的情況下,通過雜交方式進(jìn)行檢測,雜交后存在需要困難的清洗過程的問題,且雜交前必須需要將靶序列制備成單鏈的過程。一方面,最近發(fā)表的芯片上的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(on-chipPCR)是通過雜交方式或者探針延伸(probeextension)方式來檢測的,因此如現(xiàn)有微陣列一樣是異質(zhì)性檢測系統(tǒng)(heterogenousassaysystem),且存在不能實(shí)時(shí)檢測并無法準(zhǔn)確地定量的問題。并且,最近通過對蛋白質(zhì)組的高通量篩選(HighThroughputScreening)技術(shù)開發(fā)并使用了蛋白質(zhì)芯片(Proteinchip)或者適配體芯片(Aptamerchip)(Smithetal.,MolCellProtomics,11-18.2003;andMcCauleyetal.,AnalBiochem,319(2),244-250.2003)。這些高通量篩選使用的載體有載玻片、生物傳感器的檢測表面、微珠、納米粒子等。并且,分析實(shí)驗(yàn)方案來決定有用的生物分子,并將其進(jìn)行分離后,通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF,MatrixAssistedLaserDesorption/Ionization-TimeOfFlight)等來執(zhí)行確認(rèn)這些組成成分的方法等。最近通過表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOFMS,Surface-enhancedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry)對蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行許多研究(Adametal.,CancerResearch,62,3609-3614.2002;Lietal.,ClinicalChemistry,48,1296-1304.2002;andPetricoinetal.,TheLancet,359,572-577.2002)。作為又一接近方法,已開發(fā)了利用DNA和核酸聚合酶(polymerase)來擴(kuò)增信號的技術(shù)的免疫PCR(IPCR,immuno-PCR)方法(Sanoetal.,Science258,120-122.1992)。如上所述,免疫分析法在檢測靈敏度的提高及多重分析能力的提高方面再一次得到了發(fā)展,但仍然面臨著節(jié)省分析費(fèi)用、縮短分析時(shí)間、提高靈敏性及增加再現(xiàn)性的技術(shù)問題。雖然本發(fā)明者提出了生產(chǎn)對于蛋白質(zhì)組的實(shí)驗(yàn)方案的反轉(zhuǎn)指數(shù)式富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(reverse-SELEX)(參照韓國專利登錄第10-0670799號)、適配體基礎(chǔ)核酸芯片(參照韓國專利登錄第10-0464225號)、利用適配體基礎(chǔ)核酸芯片的生物學(xué)意義分析技術(shù)(參照韓國專利登錄第10-0923048號)及基因變異分析方法(韓國專利申請第10-2013-0118222號)等,但是存在不能在生物試樣中通過一次檢查來分析蛋白質(zhì)和核酸的問題,因此本發(fā)明用于為了解決上述問題而提出。整體分析生物試樣的生物分子的研究為醫(yī)學(xué)上分析有關(guān)疾病的生物分子的實(shí)驗(yàn)方案,從而將上述研究使用于用來查明能夠診斷疾病的生物分子、能夠分析治療結(jié)果的生物分子、疾病發(fā)病及進(jìn)行中起重要作用的生物分子、對疾病的靈敏度有關(guān)的生物分子以及新藥開發(fā)的靶分子。克服各個(gè)單獨(dú)分析上述現(xiàn)有生物分子的技術(shù)的問題,為了開發(fā)通過進(jìn)一步改善的有效性及靈敏性來實(shí)時(shí)分析生物分子的技術(shù)而研究的結(jié)果,開發(fā)出如本申請能夠通過一次檢查而分析多種種類的生物分子的方法,從而達(dá)成本發(fā)明的目的。最終,整體分析生物試樣的生物分子的研究為醫(yī)學(xué)上分析有關(guān)疾病的生物分子的實(shí)驗(yàn)方案,從而能夠?qū)⑸鲜鲅芯渴褂糜谟脕聿槊髂軌蛟\斷疾病的生物分子、能夠分析治療結(jié)果的生物分子、疾病發(fā)病及進(jìn)行中起重要作用的生物分子、對疾病的靈敏度有關(guān)的生物分子以及新藥開發(fā)的靶分子。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:技術(shù)問題為了達(dá)成上述目的,本發(fā)明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及裝置,其特征在于,通過核酸分析方法分析所要分析的試樣中的包含蛋白質(zhì)的兩個(gè)或者兩個(gè)以上的生物分子。并且,本發(fā)明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及裝置,通過上述方法分析生物試樣中包含的生物分子的生物學(xué)意義,其特征在于,包括:在組成上述試樣的上述生物分子中準(zhǔn)備受體及核酸的步驟,使上述受體和分析配體發(fā)生反應(yīng)來形成受體-分析配體復(fù)合物的步驟,在作為所要分析的上述核酸的靶核酸和作為上述受體-分析配體復(fù)合物的寡核苷酸的靶核酸中制備靶核酸脫氧核糖核酸的步驟,以及分析上述靶核酸脫氧核糖核酸的步驟。并且,本發(fā)明提供核酸芯片,其特征在于,上述核酸芯片用于分析生物試樣中包含的受體及核酸的生物學(xué)意義,并通過一次檢查來分析生物試樣中的生物分子。并且,本發(fā)明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及裝置,其特征在于,上述生物試樣選自由細(xì)菌、真菌類、病毒、細(xì)胞株、組織組成的組中的一種以上。本發(fā)明的目的在于,提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及裝置,且利用它們能夠從有效生成的結(jié)合信息中分析包含有關(guān)生物分子的疾病信息的各種生物學(xué)意義。解決問題的手段本發(fā)明的術(shù)語生物分子作為擔(dān)當(dāng)組成生物體的功能的特殊分子,最主要的是蛋白質(zhì)、核酸、多糖類及脂質(zhì)等的體積大的巨大分子和作為低分子物質(zhì)的氨基酸、核苷酸、單糖類、維生素等的有機(jī)物質(zhì)、鐵、銅等的金屬、無機(jī)離子等。配體作為與受體相結(jié)合的物質(zhì),代表性的有抗體、肽、核酸及適配體等。受體可以是蛋白質(zhì)、縮氨酸、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)(lipid)、多糖類、糖蛋白、激素、受體、抗原、抗體、病毒、病原菌、毒性物質(zhì)、基質(zhì)、代謝物、過渡態(tài)類似物(transitionstateanalog)、輔因子(cofactor)、抑制劑、藥、染料、營養(yǎng)素、生長因子、細(xì)胞、組織等,可以不受限制地使用幾乎所有的化學(xué)或者生物學(xué)的效應(yīng)物(effector),意味著可被檢測出的任何大小分子的靶分子。提出受體包含一個(gè)或者一個(gè)以上的對配體特異性的分子或者分子簇的結(jié)構(gòu),上述分子或者分子簇結(jié)合配體和受體并相互作用或者與受體相聯(lián)合來作用于受體的功能,使它們發(fā)生變化或者無效化??贵w是與抗原進(jìn)行特異性結(jié)合來發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)的物質(zhì)。適配體(aptamer)表示具有能夠從低分子化合物開始到蛋白質(zhì)在多種種類的受體中通過高的親和性和特異性來結(jié)合的特征的小(20~60核苷酸)單鏈核酸(DNA或者RNA)碎片。分析配體為與特定配體連接有設(shè)計(jì)的寡核苷酸的結(jié)構(gòu)體。上述寡核苷酸能夠用作通過核酸分析方法來分析作為與配體相結(jié)合的受體的生物分子的用途。分析配體的寡核苷酸的結(jié)構(gòu)由以下的通式(I)來表示:5’-P1α-T-P3β-3’(I)在上述通式(I)中,P1為信號引物對中與正向引物完整的互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域,T為作為與捕獲探針完整地互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域,為了識別靶單鏈核酸而被利用且能夠設(shè)計(jì)成適合于雜交反應(yīng)中使用的探針。P3為信號引物對中與正向引物完整地互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域。α及β表示核苷酸的個(gè)數(shù),且α及β為8-30的整數(shù)。靶核酸表示從上述所要分析的試樣中被分離的核酸以及與從上述所要分析的試樣中被分離的受體相結(jié)合的適配體,且提出包含與上游寡核苷酸的至少一部分互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域及與下游寡核苷酸的至少一部分互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列的多核苷酸。在個(gè)別實(shí)施方式中,該靶核酸能夠在與兩個(gè)寡核苷酸完整地互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域中具有延伸區(qū)域或者切口(nick)。靶核酸能夠包含單鏈核酸或雙鏈核酸DNA或RNA。并且,靶核酸DNA表示直接結(jié)合有上游寡核苷酸及下游寡核苷酸的模板DNA。為達(dá)成上述目的,本發(fā)明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及裝置,其特征在于,通過核酸分析方法分析所要分析的試樣中的包含蛋白質(zhì)的兩個(gè)或者兩個(gè)以上的生物分子。試樣中存在包含與配體相結(jié)合的蛋白質(zhì)的許多生物分子。由此,生物分子形成生物分子-配體復(fù)合物,從而能夠通過配體信號進(jìn)行檢測,且基于上述功能開發(fā)了生物分子分析技術(shù)。本發(fā)明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及裝置,通過如下方法分析生物試樣中包含的適配體的受體及核酸的生物學(xué)意義,其特征在于,包括:在組成上述試樣的上述生物分子中準(zhǔn)備受體及核酸的步驟;使上述受體和分析配體發(fā)生反應(yīng)來形成受體-分析配體復(fù)合物的步驟;在作為所要分析的上述核酸的靶核酸和作為上述受體-分析配體復(fù)合物的寡核苷酸的靶核酸中制備靶核酸脫氧核糖核酸的步驟;以及分析上述靶核酸脫氧核糖核酸的步驟。圖1為表示從生物試樣中分離核酸及蛋白質(zhì),上述蛋白質(zhì)與分析配體發(fā)生反應(yīng)來制備蛋白質(zhì)-分析配體復(fù)合物,從核酸中分離RNA及DNA后,制備包含所要分析的靶核酸的靶核酸DNA,借助與這些靶核酸的特定區(qū)域完整地互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸來分析生物分子,并在生物試樣中決定生物分子的生物學(xué)意義的整體流程圖。圖2為表示從生物試樣中分離的受體和分析配體的結(jié)構(gòu)體,且分析配體由指示配體和配體的堿基序列及通用PCR引物組成。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)例,優(yōu)選地,能夠優(yōu)選地在由細(xì)胞組成的生物試樣中溶解細(xì)胞來制備作為受體的生物分子,并執(zhí)行追加的步驟,可通過公知方法來分離DNA及RNA等的核酸。使所準(zhǔn)備的上述生物分子和適配體發(fā)生反應(yīng)來制備生物分子-分析配體復(fù)合物,并能夠借助多種方法來分離所制備的復(fù)合物。優(yōu)選地,所制備的生物分子-分析配體復(fù)合物的分離方法如下:首先,使生物分子與載體相結(jié)合后,使分析配體發(fā)生反應(yīng)來形成生物分子-分析配體復(fù)合物,執(zhí)行清洗步驟來去除未結(jié)合分析配體,并準(zhǔn)備純化的復(fù)合物。所分離的上述RNA、DNA及上述生物分子-分析配體復(fù)合物等的核酸能夠作為所要分析的靶核酸并通過普通的核酸分析方法來進(jìn)行靶核酸的定量分析及變異分析。并且,由所分析的結(jié)果可知,在包含生物分子的生物試樣中決定生物分子的生物學(xué)意義。本發(fā)明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及裝置,其特征在于,進(jìn)行上述特定核酸的定量分析、變異分析及甲基化有無分析。上述特定核酸變異作為基因變異具有單堿基多態(tài)性(SNP,SingleNucleotidePolymorphism)和結(jié)構(gòu)變異(StructuralVariation)等?;蜃儺惐还獮闆Q定表現(xiàn)型(phenotype)的變化,對疾病的敏感性,并且對治療藥劑的反應(yīng)的差異等個(gè)體之間的差異,且特別是將參與疾病發(fā)生和進(jìn)行過程的變異稱作疾病相關(guān)基因變異(Disease-associatedGeneticVariants)。SNP為表示DNA堿基序列中一個(gè)堿基序列(A、T、G、C)的差異的基因改變或變異。結(jié)構(gòu)變異表示如缺失、倒位、添加、復(fù)制等的DNA結(jié)構(gòu)變異。并且,對于本發(fā)明,細(xì)胞內(nèi)核酸的甲基化有無分析能夠包含在核酸處理重亞硫酸鹽(bisulfite)來產(chǎn)生的核酸的核苷酸變異。在上述核酸處理重亞硫酸鹽,使沒有甲基化的胞嘧啶(cytosine)殘基變異成尿嘧啶(uracil)殘基,而甲基化胞嘧啶殘基以沒變異的狀態(tài)存在。能夠分析這些重亞硫酸鹽(bisulfite)的處理前后的核苷酸變化,且能夠通過這些變化來確定核酸的甲基化有無。本發(fā)明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及裝置,其特征在于,適配體受體定量分析的內(nèi)部質(zhì)量控制物質(zhì)利用所要分析的生物試樣中不包含的物質(zhì)。優(yōu)選地,普通的定性定量分析的情況下,進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)、檢測時(shí),為了比較通過所要分析的生物試樣中包含的生物分子進(jìn)行內(nèi)部質(zhì)量控制。理想的上述質(zhì)量控制用物質(zhì)為所要分析的試樣中始終適量存在的物質(zhì),當(dāng)不是上述情況時(shí),能夠使用試樣中不包含的物質(zhì)的外來物質(zhì),優(yōu)選地,在所要分析的試樣為生物試樣的情況下,能夠由上述生物試樣中不包含的外來生物分子組成。質(zhì)量控制如管理用試樣不使用外部基準(zhǔn),并表示分析通過每次的測定而獲得的一組的檢查結(jié)果來控制測定值的精密度的內(nèi)部質(zhì)量控制。優(yōu)選地,在內(nèi)部質(zhì)量控制用物質(zhì)分析人源生物試樣的情況下,本發(fā)明能夠通過人源生物試樣中不包含的生物分子來分析植物特異生物分子。目前已結(jié)束了人體基因組項(xiàng)目及植物之一的擬南芥(Arabidopsisthaliana)基因組項(xiàng)目,并報(bào)告植物特異蛋白質(zhì)。為了分析人源生物試樣,本發(fā)明中作為基準(zhǔn)物質(zhì)能夠使用植物特異蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及裝置,其特征在于,定量分析靶核酸或者分析靶核酸的堿基序列。分析上述靶核酸的方法可以是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR,polymeraschainreaction)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR,ligasechainreaction)、鏈替代擴(kuò)增反應(yīng)(SDA,stranddisplacementamplification)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(TMA,transcription-mediatedamplification)、支鏈脫氧核糖核酸(bDNA,branchedDNA)、侵入方法及滾環(huán)擴(kuò)增(RCA,rollingcircleamplification)等。優(yōu)選地,對上述靶核酸能夠?qū)⒂蒐CR組成的雙鏈核酸當(dāng)作模板而發(fā)生PCR,來分析生成的擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及裝置,其特征在于,制備并分析上述靶核酸的方法包括:制備向上述靶核酸相同的方向完整地互補(bǔ)結(jié)合的上游寡核苷酸及下游寡核苷酸的步驟;使上述靶核酸、上述上游寡核苷酸和下游寡核苷酸發(fā)生反應(yīng)來制備完整的雙鏈核酸的步驟;將完整的上述雙鏈核酸當(dāng)作模板來使用信號引物,并標(biāo)記及擴(kuò)增,來制備靶探針的步驟;以及,分析在使上述靶探針與捕獲探針發(fā)生雜交反應(yīng)而組成的產(chǎn)物中產(chǎn)生的信號的步驟。如本發(fā)明所述,提及靶核酸時(shí)的“互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列”為表示允許寡核苷酸的雜交的充分長度的核苷酸,互補(bǔ)的堿基序列在長度為約6個(gè)核苷酸至約1000個(gè)核苷酸的范圍內(nèi),優(yōu)選的范圍為約8個(gè)至30個(gè)核苷酸,最佳的范圍為10個(gè)至25個(gè)核苷酸。本發(fā)明中,在向上述靶核酸相同的方向完整地互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸中,位于上游的寡核苷酸稱作上游寡核苷酸,位于下游的稱作下游寡核苷酸。本發(fā)明的“上游寡核苷酸”優(yōu)選的長度為6個(gè)至100個(gè),更優(yōu)選的為8個(gè)至30個(gè)及最優(yōu)選的為20個(gè)核苷酸。本發(fā)明的“下游寡核苷酸”的3’區(qū)域?qū)Π泻怂嶂辽侔l(fā)生部分性的互補(bǔ),優(yōu)選的為8個(gè)至80個(gè)及最優(yōu)選的為10個(gè)至20個(gè)核苷酸。“捕獲探針”表示在反應(yīng)中利用在確認(rèn)多核苷酸以和/或追蹤多核苷酸的來源的獨(dú)特的核苷酸序列。捕獲探針序列能夠位于信號引物的5末端或者3末端。捕獲探針堿基序列能夠在大小及組成中進(jìn)行廣泛的多變。以下的參考資料提出特定具體例中選擇適合的一系列的捕獲探針堿基序列的方針(美國專利第5635400號;Brenneretal,2000,PNAS.,97:1665-1670;Shoemakeretal,1996,NatureGenetics,14:450-456;歐洲專利公開0799897A1;美國專利第5981179號)。并且,與此類似的,在特定具體例中捕獲探針堿基序列能夠擁有4個(gè)至36個(gè)核苷酸,或者6個(gè)至30個(gè)核苷酸,或者8個(gè)至20個(gè)核苷酸范圍的長度。并且,本發(fā)明的捕獲探針的堿基序列可以是靶核酸的特異堿基序列。本發(fā)明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及裝置,其特征在于,為了上述靶核酸定量分析,上述上游寡核苷酸由作為與正向信號引物完整地互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列的區(qū)域和作為與上述靶核酸完整地互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列的區(qū)域等組成,下游寡核苷酸由與上述靶核酸完整地互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列的區(qū)域、與捕獲探針完整地互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列的區(qū)域、與反向信號引物完整地互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列的區(qū)域等組成。圖3為表示從生物試樣中分離的核糖核酸進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄來形成的核酸中由上游寡核苷酸和下游寡核苷酸形成雙鏈核酸后,進(jìn)行定量分析的方法的圖。并且,為了上述靶核酸定量分析,本發(fā)明的制備上述上游寡核苷酸及下游寡核苷酸的步驟,上述上游寡核苷酸的結(jié)構(gòu)為由(i)在信號引物對中正向引物被完整地互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域及(ii)與雜交的靶核酸實(shí)質(zhì)性地互補(bǔ)雜交的序列區(qū)域等組成的寡核苷酸。在上述內(nèi)容中,本發(fā)明的特征在于,上述上游寡核苷酸由以下的通式(II)來表示:5’-P1α-Hβ-3’(II)在上述通式(II)中,P1為在信號引物對中與正向引物完整地互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域,H為與雜交的靶核酸實(shí)質(zhì)性地互補(bǔ)雜交序列的區(qū)域。α及β為表示核苷酸的個(gè)數(shù),且α及β為8-30的整數(shù)。作為上述上游寡核苷酸能夠在上述特定靶核酸中利用完整的(perfectly)互補(bǔ)序列,但是在不妨礙特異性雜交的范圍內(nèi)也能夠利用實(shí)質(zhì)的(substantially)互補(bǔ)序列。優(yōu)選地,上述上游寡核苷酸包含能夠被包含本發(fā)明的特定靶核酸的10個(gè)至30個(gè)的連續(xù)核苷酸殘基的序列雜交的序列。下游寡核苷酸的結(jié)構(gòu)為(i)與上述靶核酸向上述上游寡核苷酸相同的方向完整地互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域、(ii)與上述捕獲探針完整地互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域及(iii)在信號引物對中與反向引物完整地互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域等。在上述內(nèi)容中,本發(fā)明的特征在于,上述下游寡核苷酸由以下的通式(III)來表示:5’-Hα-Tβ-P3γ-3’(III)上述通式(III)中,H為在上述靶核酸中從使上述上游寡核苷酸的3’末端結(jié)合的位置之后的堿基序列完整地互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域,T作為與捕獲探針完整地互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域,為了識別靶單鏈核酸而被利用,且能夠設(shè)計(jì)成適用于雜交反應(yīng)中使用的探針。P3為在信號引物對中與反向引物完整地互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域。α、β及γ作為核苷酸的個(gè)數(shù)是8-30的整數(shù)。本發(fā)明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及裝置,其特征在于,為了分析上述靶核酸變異,上述上游寡核核苷酸由與正向信號引物完整地互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列的區(qū)域、與上述靶核酸完整地互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列以及在3’末端中能夠區(qū)分上述靶核酸的變異核苷酸的堿基序列的區(qū)域等組成,下游寡核苷酸由與上述靶核酸完整地互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列的區(qū)域、與上述捕獲探針完整地互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列的區(qū)域、與反向信號引物完整地互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列的區(qū)域等組成。圖4示出了從生物試樣中分離核酸及受體,并從核酸及受體-分析配體復(fù)合物等的核酸中制備靶核酸,從而利用與這些靶核酸的特定區(qū)域完整地互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸,來分析靶核酸變異分析的整體流程圖。圖5示出了從生物試樣中分離的核酸處理重亞硫酸鹽(bisulfite),來制備靶核酸脫氧核糖核酸后,利用這些靶核酸的特定區(qū)域中完整地互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸來進(jìn)行核酸甲基化有無分析的整體流程圖。并且,本發(fā)明為了靶核酸變異分析,在對于本發(fā)明的制備上述上游寡核苷酸及下游寡核苷酸的步驟,上述上游寡核苷酸的結(jié)構(gòu)為(i)在信號引物對中與正向引物完整地互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域(P1),(ii)與靶核酸具有完整的互補(bǔ)雜交序列的變異相鄰區(qū)域(H),以及(iii)相當(dāng)于核苷酸變異的變異區(qū)域(V),且具有核苷酸變異信息的上游寡核苷酸為兩種或者兩種以上的寡核苷酸等。在上述內(nèi)容中,本發(fā)明的特征在于,上述上游寡核苷酸由以下的通式(IV)來表示:5’-P1α-Hβ-Vγ-3’(IV)上述通式(IV)中,P1為在信號引物對中使正向引物完整地互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域,H為與雜交的靶核酸具有完整的互補(bǔ)雜交序列的變異相鄰特異區(qū)域,V為相當(dāng)于核苷酸變異的變異相鄰特異區(qū)域。α、β及γ表示核苷酸的個(gè)數(shù),且α及β為8~30的整數(shù),γ為1~3的整數(shù)。作為上述上游寡核苷酸,在包含上述SNP的序列中可利用完整的(perfectly)互補(bǔ)的序列,但是在不妨礙特異性雜交的范圍內(nèi),也能夠利用實(shí)質(zhì)的(substantially)互補(bǔ)的序列。優(yōu)選地,上述上游寡核苷酸包含能夠在包含本發(fā)明的SNP的10-30個(gè)連續(xù)核苷酸殘基的序列中進(jìn)行雜交的序列。更優(yōu)選地,上述上游寡核苷酸的3’-末端具有與上述SNP堿基互補(bǔ)的堿基。通常,通過雜交形成的雙鏈體(duplex)的穩(wěn)定性具有根據(jù)末端的序列的一致而確定的傾向,因此若在3’-末端具有與SNP堿基互補(bǔ)的堿基的上游寡核苷酸中的末端區(qū)域不雜交,則這些雙鏈體能夠在嚴(yán)格的條件下解體。下游寡核苷酸的結(jié)構(gòu)如下:(i)與上述靶核酸向上游寡核苷酸相同的方向完整地互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域(H);(ii)與上述捕獲探針完整地互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域(T);以及(iii)在信號引物對中與反向引物完整地互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域(P3)等。在上述內(nèi)容中,本發(fā)明的特征在于,上述下游寡核苷酸由以下的通式(V)來表示:5’-Hα-Tβ-P3γ-3’(V)上述通式(IV)中,H為與上述靶核酸完整地互補(bǔ)結(jié)合的變異的特異區(qū)域,T為作為與捕獲探針完整地互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域,用于識別具有變異相關(guān)核苷酸的單鏈核酸而使用,能夠設(shè)計(jì)成適用于雜交反應(yīng)中使用的探針。P3為在信號引物對中與反向引物完整地互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域。α、β及γ作為核苷酸的個(gè)數(shù)是8-30的整數(shù)。上述上游寡核苷酸及下游寡核苷酸通過該
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所公知的(如化學(xué)合成)任意的適合方法來合成及制備的。上述上游寡核苷酸及下游寡核苷酸也能夠通過商業(yè)供應(yīng)商而便于利用。本發(fā)明利用的上游寡核苷酸及下游寡核苷酸在模板的一部位雜交或者退火,來形成雙鏈結(jié)構(gòu)。形成這些雙鏈結(jié)構(gòu)的適合的核酸雜交的條件公開在JosephSambrook,等,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(2001)以及Haymes,B.D.,等,NucleicAcidHybridization,APracticalApproach,IRLPress,Washington,D.C.(1985)。本發(fā)明中,退火在靶核苷酸序列與信號引物之間能夠進(jìn)行特異性結(jié)合的苛刻條件下執(zhí)行。用于退火的苛刻條件為序列-依賴性且隨著周圍環(huán)境的變數(shù)而存在多種。如此擴(kuò)增的靶核酸為一個(gè)分子上包含多靶部位的靶核酸分子,且能夠利用上述靶核酸分子的同時(shí),分析多靶部位。本發(fā)明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及裝置,其特征在于,在上述靶核酸、上述上游寡核苷酸和下游寡核苷酸發(fā)生雜交反應(yīng)來形成的部分雙鏈核酸中兩個(gè)寡核苷酸之間具有延伸區(qū)域的情況下發(fā)生延伸反應(yīng),并發(fā)生連接反應(yīng)來形成完整的雙鏈核酸。如本發(fā)明使用的,“延伸區(qū)域”提及通過核酸聚合活性充分允許寡核苷酸的延伸的長度的核苷酸?!把由靺^(qū)域”存在于靶及模板核酸的幾個(gè)模式。在存在的情況下,“延伸區(qū)域”處于靶或者模板核酸的上游寡核苷酸及下游寡核苷酸之間。"延伸區(qū)域"是長度為約一個(gè)核苷酸至約1000個(gè)核苷酸,優(yōu)選的范圍為約1個(gè)至100個(gè)核苷酸,更優(yōu)選的范圍為3個(gè)至50個(gè),以及最佳的長度為3個(gè)至10個(gè)的核苷酸范圍。延伸反應(yīng)(extension)是指利用聚合酶在上述延伸區(qū)域中追加核苷酸,從而延伸引物的反應(yīng)。若延伸與核酸完整地互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸,則這個(gè)核酸起到用于延伸反應(yīng)的模板作用。本發(fā)明特征在于,DNA聚合酶為選自由TaqDNA聚合酶以及PfuDNA聚合酶組成的組中,且并不局限于上述組,若是耐熱(thermostable)DNA聚合酶,則都可使用。連接反應(yīng)(ligation)是指與上游寡核苷酸的3末端或者所延伸的上游寡核苷酸的3末端和下游寡核苷酸以酶催化的方式進(jìn)行連接。本發(fā)明特征在于,連接酶選自由大腸桿菌(E.coli,Escherichiacoli)DNA連接酶、TaqDNA連接酶、T4DNA連接酶及Amp連接酶(ligase)組成的組中。本發(fā)明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及裝置,其特征在于,上述靶核酸和上述上游寡核苷酸與下游寡核苷酸發(fā)生雜交反應(yīng)來形成的部分雙鏈核酸在兩個(gè)寡核苷酸之間具有切口(nick)的情況下,發(fā)生連接反應(yīng)來形成完整的雙鏈核酸。上述連接反應(yīng)是指能夠利用連接酶(ligase)催化核苷酸序列的連接的反應(yīng)。使特定長度的2種寡核苷酸并排完整地互補(bǔ)結(jié)合于靶核酸后,使這時(shí)形成的雙螺旋的切口(nick)部位利用DNA連接酶,并通過以常規(guī)核酸的連接原理為根據(jù)的常規(guī)連接反應(yīng),使2種寡核苷酸以單鏈狀態(tài)的方式連接的反應(yīng)。因此,作為引導(dǎo)核酸的連接的連接酶可不限定地使用本領(lǐng)域中通常使用的酶。在上述連接反應(yīng)中使用的酶的特征在于,其選自由大腸桿菌(E.coli,Escherichiacoli)DNA連接酶、TaqDNA連接酶、T4DNA連接酶及Amp連接酶組成的組中,且并不限定于上述組,若是具有DNA結(jié)合活性的連接酶,則能夠使用任何連接酶。并且,上述連接酶反應(yīng)不僅能夠進(jìn)行單一靶基因檢測或者變異檢測,還可以使用識別多個(gè)靶的多個(gè)寡核苷酸,通過一次反應(yīng)執(zhí)行。在這種情況下,本發(fā)明特征在于,各個(gè)連接酶寡核苷酸堿基序列中,選定符合各個(gè)變異位置的連接酶和寡核苷酸,使得與靶核酸雜交的部分的解鏈溫度(Tm,meltingtemperature)值的誤差在5以內(nèi)。本發(fā)明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法,其特征在于,使上述靶核酸、上述上游寡核苷酸與下游寡核苷酸發(fā)生雜交反應(yīng)形成的上述部分雙鏈核酸發(fā)生連接反應(yīng),來兩次或者兩次以上反復(fù)地執(zhí)行形成上述完整的雙鏈核酸的反應(yīng)。本發(fā)明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及裝置,其特征在于,上述信號引物由作為含有標(biāo)記物質(zhì)的通用PCR引物的正向引物和由通用PCR引物組成的反向引物組成。在上述內(nèi)容中,本發(fā)明的特征在于,上述信號引物(signalprimers)由以下的通式(VI)及通式(VII)來表示:正向引物:5’-X-P-3’(VI);反向引物:5’-P-3’(VII)。在通式(VI)及通式(VII)中,X為作為能夠檢測的標(biāo)記物質(zhì),為了生物分子的定量分析從而對照組試樣中所制備的靶探針和使用于從實(shí)驗(yàn)組試樣中所制備的靶探針的標(biāo)記物質(zhì)有所不同,且優(yōu)選地,前者還可以為Cy3,后者還可以為Cy5。并且,為了核酸的變異分析,上述引物的5’最末端利用作為熒光報(bào)道分子或者具有物理特征的報(bào)道分子等的標(biāo)記物質(zhì)來識別有關(guān)變異的核苷酸的種類,即,用于識別變異類型而使用,優(yōu)選地,熒光分析根據(jù)核苷酸變異,野生型(wildtype)能夠利用Cy3、突變型(mutationtype)能夠利用Cy5來標(biāo)記。P是上游寡核苷酸及下游寡核苷酸中與信號引物完整地互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域。在上述信號引物對中,正向引物(P1或者P2)由堿基序列組成,上述堿基序列在上述上游寡核苷酸的結(jié)構(gòu)中完整地互補(bǔ)結(jié)合于使信號引物結(jié)合的區(qū)域的堿基序列,且優(yōu)選地,可以是通用PCR引物(universalPCRprimer),根據(jù)靶核酸的核苷酸變異,在上述信號引物的5’末端中選定熒光報(bào)道分子或者具有物理特征的報(bào)道分子等的標(biāo)記物質(zhì)(X)并結(jié)束雜交反應(yīng),當(dāng)決定核苷酸變異時(shí),使用從標(biāo)記物質(zhì)中產(chǎn)生的信號。并且,在上述信號引物對中,反向引物(P3)由堿基序列組成,上述堿基序列在上述下游寡核苷酸的結(jié)構(gòu)中完整地互補(bǔ)結(jié)合于使信號引物結(jié)合的區(qū)域的堿基序列,且優(yōu)選地,可以是通用PCR引物(universalPCRprimer)。通用PCR引物通常作為大量使用于堿基序列決定或者PCR等的堿基序列的寡核苷酸,而大量存在于商業(yè)克隆載體。本發(fā)明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法,其特征在于,上述捕獲探針由與具有上述靶探針的標(biāo)記物質(zhì)的單鏈核酸和完整地互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列組成。本發(fā)明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法,其特征在于,上述捕獲探針由與存在于具有靶探針的標(biāo)記物質(zhì)的單鏈核酸的反向下游寡核苷酸的特異堿基序列完整地互補(bǔ)結(jié)合的堿基序列組成。上述捕獲探針(captureprobes)結(jié)合于上述擴(kuò)增產(chǎn)物來起到識別這些的作用,且在將上述靶核酸當(dāng)做模板并利用信號引物來發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)而制備的擴(kuò)增產(chǎn)物中,基于引物結(jié)合區(qū)域(T),上述捕獲探針能夠由與具有包含標(biāo)記物質(zhì)的單鏈核酸互補(bǔ)的堿基序列的單鏈核酸、寡核苷酸及核酸肽(PNA,peptidenucleicacid)等制備。本發(fā)明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法,其特征在于,上述靶探針由從對照組試樣中制備的對照靶探針及從實(shí)驗(yàn)組試樣中制備的分析靶探針構(gòu)成。根據(jù)本發(fā)明,當(dāng)要從對照組和實(shí)驗(yàn)組試樣中分離生物分子來進(jìn)行定量分析的情況下,從對照組試樣中分離的生物分子中制備靶核酸DNA后,將其當(dāng)做模板并利用信號引物發(fā)生PCR來制備對照靶探針,以及將從實(shí)驗(yàn)組試樣中制備的靶核酸DNA當(dāng)做模板發(fā)生PCR來制備分析靶探針?;旌线@些所制備的對照靶探針和分析靶探針來準(zhǔn)備靶探針。能夠?qū)⑹褂糜趯φ瞻刑结樀闹苽涞男盘栆锏臉?biāo)記物質(zhì)和使用于對照靶探針的制備的信號引物的標(biāo)記物質(zhì)變成相互不同。優(yōu)選地,前者能夠使用Cy3熒光物質(zhì),后者能夠使用Cy5熒光物質(zhì)。本發(fā)明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法,其特征在于,上述捕獲探針與載體相結(jié)合。本發(fā)明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法,其特征在于,上述載體包括載玻片、生物傳感器的檢測表面、微珠、納米粒子等。圖6為具有固定于載玻片底物的上述捕獲探針和標(biāo)記物質(zhì)的靶探針進(jìn)行雜交并進(jìn)行清洗后,分析所產(chǎn)生的信號來分析生物分子的圖。優(yōu)選地,捕獲探針能夠結(jié)合于載玻片或者生物傳感器的檢測表面等,且以可結(jié)合的方式能夠變形,這些變形能夠在寡核苷酸的5’的最末端結(jié)合C1~C20烷基,且為了容易地進(jìn)行與載玻片或者檢測表面的結(jié)合,能夠添加硫醇等的物質(zhì)。但是,這些變形根據(jù)目的能夠進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兓?。如上所述,固定有捕獲探針的支架為微陣列的一種,能夠意味著生物傳感器檢測表面,且可以是可測定結(jié)合有靶物質(zhì)而產(chǎn)生的變化,來檢測靶物質(zhì)的所有支架。尤其,能夠分析結(jié)合于捕獲探針的標(biāo)記物質(zhì)的熒光物質(zhì)來測定熒光變化。優(yōu)選地,這里可利用作為現(xiàn)有的固體支架的載玻片。上述內(nèi)容中,在上述雜交反應(yīng)中雜交(退火)溫度為40℃至70℃,更優(yōu)選為45℃至68℃,進(jìn)一步更優(yōu)選為50℃至65℃,最優(yōu)選為60℃至65℃。雜交條件可參考JosephSambrook,etal.,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(2001)以及Haymes,B.D.,etal.,NucleicAcidHybridization,APracticalApproach,IRLPress,Washington,D.C.(1985)中公開的事項(xiàng)來決定。利用于雜交的苛刻條件(stringentcondition)能夠調(diào)整溫度、離子強(qiáng)度(緩沖液濃度)及有機(jī)溶劑之類的化合物的存在等來決定。這些苛刻的條件能夠根據(jù)雜交的序列來決定。例如,上述苛刻條件中高苛刻條件意味著在0.5MNaHPO4、7%的十二烷基硫酸鈉(SDS,sodiumdodecylsulfate)、1mM的EDTA中以65℃條件來進(jìn)行雜交,在0.1x標(biāo)準(zhǔn)枸椽酸鹽水(SSC,standardsalinecitrate)/0.1%的十二烷基硫酸鈉中以68℃條件來進(jìn)行清洗。并且,高苛刻條件意味著在6x標(biāo)準(zhǔn)枸椽酸鹽水/0.05%的焦磷酸鈉中以48℃條件來進(jìn)行清洗。低苛刻條件意味著例如,在0.2x標(biāo)準(zhǔn)枸椽酸鹽水/0.1%的十二烷基硫酸鈉中以42℃條件來進(jìn)行清洗。在上述微陣列中,上述捕獲探針被用作雜交陣列因素(hybridizablearrayelement)且固定于底物(substrate)上。優(yōu)選的底物作為適合的堅(jiān)固性或者半-堅(jiān)固性載體,例如,包括:薄膜、過濾器、芯片、載玻片、晶片、纖維、磁性微珠或者非磁性微珠、凝膠、管材、板、高分子、微小粒子及毛細(xì)管。上述捕獲探針排列且固定于上述底物上。如上所述的固定化通過化學(xué)結(jié)合方法或者UV之類的共價(jià)鍵方法來執(zhí)行。例如,上述捕獲探針能夠結(jié)合于玻璃表面,使得包含環(huán)氧化合物或者醛基,并且,能夠在聚賴氨酸涂敷表面上通過UV進(jìn)行結(jié)合。并且,上述雜交陣列因素能夠通過連接子(例:乙二醇低聚物及二元胺)結(jié)合于底物。上述內(nèi)容中,設(shè)備根據(jù)信號的種類而確定,且在雜交反應(yīng)之后,檢測通過雜交反應(yīng)而產(chǎn)生的雜交信號,上述設(shè)備用于測量從具有結(jié)合于上述捕獲探針的擴(kuò)增產(chǎn)物的標(biāo)記物質(zhì)和變異相關(guān)核苷酸的單鏈核酸產(chǎn)生的信號。雜交信號能夠以多種方法來實(shí)施,例如,根據(jù)結(jié)合于捕獲探針的標(biāo)記的種類。一方面,適用于本發(fā)明的微陣列的試樣DNA能夠進(jìn)行標(biāo)記(labeling),并與微陣列上的捕獲探針進(jìn)行雜交。雜交條件具有多種方法。雜交程度的檢測及分析根據(jù)標(biāo)記物質(zhì)多樣地實(shí)施。結(jié)合于上述捕獲探針的標(biāo)記物質(zhì)能夠提供用于檢測雜交與否的信號,且上述標(biāo)記物質(zhì)能夠連接于寡核苷酸。雖然適合的標(biāo)記包括熒光團(tuán)(例如:熒光素(fluorescein)、藻紅蛋白(phycoerythrin)、羅丹明、麗絲胺(lissamine),并且Cy3和Cy5(法瑪西亞(Pharmacia)))、發(fā)色團(tuán)、化學(xué)發(fā)光團(tuán)、磁性粒子、放射性同位素(P32及S35)、質(zhì)量標(biāo)記、電子密集粒子、酶(堿性磷酸酶或者辣根過氧化物酶)、輔因子、對酶的基質(zhì)、重金屬(例如,金),并且,如抗體、鏈霉親和素、生物素、異羥基洋地黃毒甙元和螯合基具有特定結(jié)合伙伴的半抗原,但并不限定于上述物質(zhì)。標(biāo)記能夠通過本領(lǐng)域通常實(shí)施的多種方法來執(zhí)行,例如,切口平移(nicktranslation)方法、隨機(jī)引發(fā)方法(MultiprimeDNAlabellingsystemsbooklet,“Amersham”(1989))及連環(huán)方法(Maxam&Gilbert,1989,MethodsinEnzymology,65:499)。標(biāo)記提供根據(jù)熒光、放射性、發(fā)色測定、重量測定、X-線衍射或者吸收、磁性、酶活性、質(zhì)譜分析、結(jié)合親和度、雜交高頻、納米晶體而進(jìn)行檢測的信號。上述內(nèi)容中,上述微陣列的制備方法通過該
技術(shù)領(lǐng)域:
公開的任意適合的方法來合成及制備的。并且,微陣列制備設(shè)備能夠通過商業(yè)供應(yīng)商來便利地使用。能夠利用現(xiàn)有公開的多種方法(M.schena,1999,DNAmicroarray;apracticalapproach,Oxford)來使捕捉探針有規(guī)律地制備核酸芯片。本發(fā)明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及裝置,其特征在于,上述標(biāo)記物質(zhì)使用選自生物素(Biotin)、Cy2、綠色熒光蛋白、YO-PRO-1、YOYO-1、鈣黃綠素、異硫氰酸熒光素、FlourX、ALEXA488、羅丹明110、ABI5-FAM、俄勒岡綠500、俄勒岡綠488、RiboGreen、羅丹明綠、羅丹明123、鎂綠、鈣綠、TO-PRO-1、TOTO-1、ABIJOE、氟硼二吡咯530/550、Dil、氟硼二吡咯TMR、氟硼二吡咯558/568、氟硼二吡咯564/570、Alexa546、四甲基異硫氰酸羅丹明、鎂橙、藻紅蛋白R&B、羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽、鈣橙、派洛寧Y、羅丹明B、ABITAMRA、玫瑰紅、Cy3.5、ABIROX、鈣紅、Alexa594、德克薩斯紅、尼羅紅、YO-PRO-3、YOYO-3、紅藻藍(lán)素、C-藻藍(lán)素、TOPRO-3、TOTO-3、DiDDilC(5)、氧雜羰花青(Thiadicarbocyainie)、Cy5.5、Cy5或者Cy3的熒光染料。本發(fā)明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及裝置,其特征在于,在固著上述捕獲探針的底物使上述標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)生雜交反應(yīng)來分析信號的方法包括:制備上述捕獲探針已點(diǎn)樣(spotting)的芯片(chip)的步驟;使上述靶探針與固定于芯片表面的探針之間發(fā)生雜交(hybridization)反應(yīng)并進(jìn)行清洗(washing)的步驟;利用對熒光染料特異性的波長的激光(laser)來掃描(scanning)芯片,并根據(jù)雜交反應(yīng)結(jié)果來測定熒光強(qiáng)度,從而同時(shí)分析靶核酸量以及變異的步驟。本發(fā)明提供用于分析生物試樣包含的受體及核酸的生物學(xué)意義的利用寡核苷酸來分析生物試樣包含的受體及核酸的試劑盒。本發(fā)明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析裝置,其特征在于,生物分子分析系統(tǒng)通過利用寡核苷酸的生物分子分析方法來執(zhí)行,并包括:試樣處理裝置,從包含上述生物分子的試樣中準(zhǔn)備上述受體及核酸,擴(kuò)增裝置,由制備上述靶核酸并擴(kuò)增其上述靶核酸的模塊以及分析上述所擴(kuò)增的產(chǎn)物的模塊構(gòu)成。為了更有效地測定本發(fā)明的生物分子分析方法,對于包括從包含生物分子的試樣中分離適配體受體和核酸的試樣處理裝置,以及由制備上述靶核酸并擴(kuò)增上述靶核酸的模塊以及分析上述所擴(kuò)增的產(chǎn)物的模塊構(gòu)成的擴(kuò)增裝置的利用寡核苷酸的生物分子的分析裝置,本發(fā)明的系統(tǒng)能夠由試樣處理裝置以及擴(kuò)增裝置構(gòu)成,并組合這些來運(yùn)行,上述試樣處理裝置由混合腔室、溶解腔室及反應(yīng)腔室構(gòu)成。認(rèn)為含有感興趣對象的生物分子的樣品的分析伴隨著一系列的樣品準(zhǔn)備的步驟,且在由混合腔室和溶解腔室構(gòu)成的試樣處理裝置中執(zhí)行。在這些步驟能夠包括過濾、細(xì)胞溶解、RNA、DNA及受體的純化、受體-分析配體復(fù)合物的制備以及與試劑的混合。為了對生物分子分析結(jié)果有把握,進(jìn)而對樣品準(zhǔn)備過程的污染的控制非常有用。為了核酸擴(kuò)增反應(yīng)而調(diào)配樣品,并提供驗(yàn)證樣品調(diào)配的有效性的方法。認(rèn)為樣品含有選自由細(xì)胞、孢子、微生物及病毒組成的組中的靶實(shí)體,且這個(gè)靶實(shí)體包含至少一個(gè)靶生物分子。上述方法包括向具備用于混合樣品與樣品調(diào)配對照組的混合腔室的裝置內(nèi)引入樣品的步驟。樣品調(diào)配對照組選自由細(xì)胞、孢子、微生物及病毒組成的組中,這些樣品調(diào)配對照組包含質(zhì)量控制物質(zhì)。上述裝置還具備溶解腔室和反應(yīng)腔室。樣品在混合腔室中與樣品調(diào)配對照組進(jìn)行混合。上述方法還包括:在溶解腔室中溶解處理樣品調(diào)配對照組及樣品內(nèi)存在的情況下的靶實(shí)體來純化生物分子的步驟;形成受體-分析配體復(fù)合物的步驟;在反應(yīng)腔室內(nèi)將在溶解腔室內(nèi)游離的RNA、DNA及受體-分析配體復(fù)合物在核酸擴(kuò)增條件下暴露的步驟;以及,檢測至少一個(gè)質(zhì)量控制物質(zhì)的存在與否的步驟。質(zhì)量控制物質(zhì)的肯定的檢測表示對樣品調(diào)配過程滿足,相反,若無法檢測質(zhì)量控制物質(zhì),則表示不適當(dāng)?shù)刂苽淞藰悠贰1景l(fā)明提供為了核酸擴(kuò)增反應(yīng)而調(diào)配樣品,并驗(yàn)證上述樣品調(diào)配的有效性的擴(kuò)增裝置。認(rèn)為樣品包含選自由細(xì)胞、孢子、微生物及病毒組成的組中的靶實(shí)體,上述靶實(shí)體含有至少一個(gè)靶生物分子。上述裝置包括具有第1腔室的本體,上述第1腔室能夠收容將要與樣品混合的樣品調(diào)配對照組。樣品調(diào)配對照組選自由細(xì)胞、孢子、微生物及病毒組成的組中,這些樣品調(diào)配對照組包含質(zhì)量控制物質(zhì)。上述本體還包括溶解腔室,上述溶解腔室用于溶解處理存在于樣品內(nèi)的情況下的靶實(shí)體及樣品調(diào)配對照組,從中游離生物分子并分離RNA、DNA和受體。上述本體還包括使所游離的適配體受體和適配體發(fā)生反應(yīng)來形成受體-適配體復(fù)合物的分析配體反應(yīng)腔室。上述本體還包括為了擴(kuò)增及檢測而維持核酸的反應(yīng)腔室。上述裝置還包括至少一個(gè)流量控制器,上述至少一個(gè)流量控制器引導(dǎo)與樣品調(diào)配對照組混合的樣品,使得上述樣品從第1腔室流到溶解腔室內(nèi),且使在溶解腔室中游離的生物分子流到反應(yīng)腔室內(nèi)。在各別實(shí)施例中,當(dāng)樣品通過溶解腔室進(jìn)行流動時(shí),溶解腔室收容捕獲存在于樣品內(nèi)的情況下的靶實(shí)體及樣品調(diào)配對照組的酶,至少一個(gè)過濾器以及固體物質(zhì),且上述裝置還包括至少一個(gè)收容通過溶解腔室流動且已使用的樣品流體的廢棄腔室,且上述至少一個(gè)流量控制器還能夠引導(dǎo)通過溶解腔室流動且已使用的樣品流體,以便上述樣品流體流到廢棄腔室。在各別實(shí)施例中,上述裝置還包括超聲波變換器,上述超聲波變換器為了給溶解腔室提供超聲波,結(jié)合于溶解腔室的壁面。在各別實(shí)施例中,上述裝置還包括微珠,上述微珠為了破裂樣品調(diào)配對照組及靶實(shí)體,位于溶解腔室內(nèi)。本發(fā)明的又一實(shí)施方式中,本發(fā)明提供決定溶解過程的有效性的方法。這個(gè)方法包括將包含選自由細(xì)胞、孢子、微生物及病毒組成的組中的靶實(shí)體的樣品與樣品調(diào)配對照組進(jìn)行混合的步驟。靶實(shí)體包含至少一個(gè)質(zhì)量控制物質(zhì)。樣品調(diào)配對照組選自由細(xì)胞、孢子、微生物及病毒組成的組中,該樣品調(diào)配對照組包含質(zhì)量控制物質(zhì)。使樣品調(diào)配對照組和存在于樣品內(nèi)的情況下的靶實(shí)體的混合物進(jìn)行溶解處理。上述方法還包括檢測質(zhì)量控制物質(zhì)的存在與否的步驟,使得決定溶解處理當(dāng)中生物分子是否從樣品調(diào)配對照組中游離。質(zhì)量控制物質(zhì)的肯定的檢測表示對樣品制備過程滿足,相反,若無法檢測質(zhì)量控制物質(zhì),則表示不適當(dāng)?shù)刂苽淞藰悠?。在各別實(shí)施例中,上述方法在溶解處理之前,包括如下步驟:為了利用固體物質(zhì)捕獲樣品調(diào)配對照組及存在于樣品內(nèi)的情況下的靶實(shí)體,與樣品調(diào)配對照組混合的樣品通過收容固體物質(zhì)的腔室而流動的步驟。在各別實(shí)施例中,在混合樣品和樣品調(diào)配對照組之前,樣品能夠進(jìn)行預(yù)過濾。在各別實(shí)施例中,溶解處理包括將樣品調(diào)配對照組及靶實(shí)體在超聲波能量之下暴露的步驟。在各別實(shí)施例中,為了破裂樣品調(diào)配對照組及靶實(shí)體,溶解處理還包括攪拌微珠的步驟。在各別實(shí)施例中,樣品調(diào)配對照組為孢子。在各別實(shí)施例中,混合步驟還包括分析含有樣品調(diào)配對照組的干燥微珠的步驟。在各別實(shí)施例中,溶解處理包括與化學(xué)溶解劑相接觸的步驟。在各別實(shí)施例中,標(biāo)記核酸序列擴(kuò)增標(biāo)記核酸序列(例如,利用PCB),并檢測所擴(kuò)增的標(biāo)記核酸序列,進(jìn)而執(zhí)行檢測。在各別實(shí)施例中,標(biāo)記核酸序列決定從能夠結(jié)合于標(biāo)記核酸序列的探針的信號是否超過閾值,進(jìn)而執(zhí)行檢測。擴(kuò)增裝置的反應(yīng)容器的反應(yīng)腔室內(nèi)的反應(yīng)混合物在核酸擴(kuò)增條件下暴露。利用反應(yīng)的RNA或者DNA模板的擴(kuò)增已被公知(美國專利第4,683,195號;美國專利第4,683,202號;PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(Inniset.al.,,1990))。DNA的核酸擴(kuò)增使DNA發(fā)生熱變性,并在與將要擴(kuò)增的DNA片段一側(cè)相接的序列退火2個(gè)寡核苷酸引物,且伴隨著循環(huán)反復(fù),上述循環(huán)反復(fù)由利用DNA聚合酶使所退火的引物發(fā)生延伸而實(shí)現(xiàn)。引物交配于靶序列的相對的鏈(strand)的同時(shí),被定向成使根據(jù)聚合酶的DNA合成經(jīng)過引物之間的區(qū)域來執(zhí)行,進(jìn)而將DNA片段的量有效地提高了2倍。并且,擴(kuò)張產(chǎn)物具有補(bǔ)充性且能夠結(jié)合引物,因此各個(gè)連續(xù)的循環(huán)將在前一個(gè)循環(huán)中所合成的DNA的量實(shí)質(zhì)地提高了2倍。其以每個(gè)循環(huán)2n(這里n為循環(huán)數(shù))的比率帶來特定靶片段的指數(shù)積累。如擴(kuò)增反應(yīng)及連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR,ligasechainreaction)的方法可使用從mRNA、互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA,complementarydeoxyribonucleicacid)、基因組文庫或者互補(bǔ)脫氧核糖核酸文庫中直接使靶DNA序列的核酸序列用于擴(kuò)增中。等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)已被公知,且能夠根據(jù)本發(fā)明的方法來使用。核酸擴(kuò)增反應(yīng)優(yōu)選地能夠使用使反應(yīng)容器內(nèi)的反應(yīng)混合物以擴(kuò)增反應(yīng)中所需的溫度進(jìn)行加熱和/或冷卻的熱處理裝置來執(zhí)行。上述熱處理裝置還包括一個(gè)以上的檢測機(jī)構(gòu),上述檢測機(jī)構(gòu)用于檢測樣品調(diào)配對照組的標(biāo)記核酸序列及樣品中用于測試的一個(gè)以上的靶核酸序列??墒褂脙?nèi)置有用于擴(kuò)增及檢測反應(yīng)容器內(nèi)的核酸序列的光學(xué)檢測儀的合適的熱處理裝置(美國專利第6,369,893號;美國專利第6,391,541號)。并且,為了控制反應(yīng)混合物的溫度,并在上述反應(yīng)混合物中檢測核酸序列,已有適合于本發(fā)明的許多其他公知的方法。并且,優(yōu)選地,使用探針來檢測樣品調(diào)配對照組的質(zhì)量控制物質(zhì)及樣品中用于測試的一個(gè)以上的質(zhì)量控制物質(zhì)。反應(yīng)容器優(yōu)選地具備一個(gè)以上的透明或者透光性壁面,上述壁面使能夠通過光學(xué)檢測的探針的信號通過。優(yōu)選地,捕獲探針能夠使用于檢測及定量化核酸序列。使用核酸捕獲探針的分析法存在許多種。這些捕獲探針中一部分在與其他分子或者一部分(moiety)的相互作用中根據(jù)變化而生成具有熒光源的熒光發(fā)光中的變化的信號。作為用于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測的其他優(yōu)選的方法,熒光探針由根據(jù)全部的熒光報(bào)道染料(fluorescentreporterdye)而標(biāo)記化的寡核苷酸組成。捕獲探針的分裂產(chǎn)生報(bào)道染料的熒光強(qiáng)度的增加。為了在樣品內(nèi)確認(rèn)靶生物分子的檢測或者靶生物分子的缺乏,需要控制樣品調(diào)配的污染。這就是樣品調(diào)配對照組需要接受與樣品內(nèi)的靶實(shí)體(例如,含有生物分子的靶細(xì)胞、孢子、病毒或者微生物)同樣的處理的理由。若檢測出樣品調(diào)配對照組的質(zhì)量控制物質(zhì),則視為滿足的樣品調(diào)配。若不能夠檢測質(zhì)量控制物質(zhì)的存在,則視為不適當(dāng)?shù)臉悠氛{(diào)配,且對于靶核酸序列的測試結(jié)果視為“未定”。優(yōu)選地,在質(zhì)量控制物質(zhì)的存在與否為從能夠結(jié)合于靶探針的捕獲探針的信號檢測閾值,例如,將分析法看作有效需要滿足或者超過的預(yù)先設(shè)定的熒光發(fā)光的閾值。流體控制裝置能夠根據(jù)需要的協(xié)議由電腦來控制。若使用單個(gè)閥塊,則僅僅因?yàn)橐粋€(gè)失敗要素而能夠產(chǎn)生高制備收率。流體控制及處理結(jié)構(gòu)部件的組合能夠獲得緊湊的裝置(例如,小型整塊式),使成形及組裝的自動化容易進(jìn)行。如前所述,這些系統(tǒng)能夠有利地包括稀釋及混合能力、中間清洗能力及強(qiáng)力的加壓能力。系統(tǒng)內(nèi)的流體路徑通常被關(guān)閉,以最小化系統(tǒng)內(nèi)的流體的污染并容易地進(jìn)行這些流體的收容及控制。反應(yīng)容器能夠便利地分離及更換,且能夠在各別實(shí)施例中廢棄。本發(fā)明提供用于分析包含于生物試樣的適配體的受體及核酸的生物學(xué)意義的利用寡核苷酸來分析生物試樣中的適配體的受體及核酸的核酸芯片。本發(fā)明提供生物分子的分析方法及裝置,其特征在于,用于利用上述生物分子信息數(shù)據(jù)的生物學(xué)意義分析的結(jié)構(gòu)包括:接收所輸入的患者組的上述生物分子信息和對照組的上述生物分子信息數(shù)據(jù),并構(gòu)建數(shù)據(jù)庫的模塊;利用所輸入的上述信息數(shù)據(jù),在分析系統(tǒng)中執(zhí)行預(yù)處理的模塊;借助上述預(yù)處理的結(jié)果來生成患者模型的模塊;加載所生成的上述模型并適用在入院的患者來執(zhí)行盲測(Blindtest)診斷的模塊;以及,通過交叉驗(yàn)證來評價(jià)系統(tǒng)功能的模塊。本發(fā)明中,雖然利用上述生物分子信息數(shù)據(jù)的生物學(xué)意義預(yù)測系統(tǒng)作為示例性的診斷,但不限定于上述診斷。通過本發(fā)明生成的許多生物分子信息數(shù)據(jù)能夠利用具有高層次特征的龐大數(shù)量的信息來生成與細(xì)胞、組織或者疾病有關(guān)的多種信息。在利用所輸入的上述數(shù)據(jù)在分析系統(tǒng)中執(zhí)行預(yù)處理的模塊中,為了找出對患者狀態(tài)產(chǎn)生影響的特征并提高分類性能的多變量分析方法正確地治療和診斷而找出重要變數(shù)來縮小層次,或者通過特性的變形來找出主要特質(zhì)的特征選擇(FeatureSelection)程序。特征提取根據(jù)具體地是否將類別信息使用于學(xué)習(xí)而存在無監(jiān)督學(xué)習(xí)(UnsupervisedLearning)方式或者監(jiān)督學(xué)習(xí)(SupervisedLearning)方式。無監(jiān)督學(xué)習(xí)方式中主要使用的主成分分析(PCA,PrincipalComponentAnalysis)或者獨(dú)立成分分析(ICA,IndependentComponentAnalysis)能夠考慮變數(shù)的特性來提取特質(zhì)。監(jiān)督方式為利用類別信息和變數(shù)之間的統(tǒng)計(jì)上顯著性或者變數(shù)之間的相互關(guān)系來選擇變數(shù)的方式。這個(gè)方式能夠在規(guī)定的特質(zhì)集合中向前(Forward)或者向后(Backward)依次添加或者刪除特質(zhì)的同時(shí),通過適用于分類器的功能來計(jì)算出主要特質(zhì)。根據(jù)上述預(yù)處理的結(jié)果而執(zhí)行學(xué)習(xí)來生成患者模型的模塊為將所選擇的特質(zhì)通過適合的分類器(Classifier)按各類別進(jìn)行分類的程序。本發(fā)明使用了人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ArtificialNeuralNetwork),但因?yàn)楦鶕?jù)輸入和輸出來決定動作的特性,而應(yīng)用在模式識別、函數(shù)逼近、分類技術(shù)等各種領(lǐng)域。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)由多個(gè)層(layer)、節(jié)點(diǎn)(nodes)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)之間連接加權(quán)值構(gòu)成。本發(fā)明使用的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)層之間連接方式為前饋(Feed-forward)方式。根據(jù)輸入模式利用對各節(jié)點(diǎn)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接加權(quán)值和激活函數(shù)來計(jì)算出輸出值。當(dāng)通過所生成的結(jié)合信息來處理一件事時(shí),推定的值和實(shí)際結(jié)果值不同的情況下,將所計(jì)算出的值與實(shí)際結(jié)果值進(jìn)行比較的同時(shí),反復(fù)執(zhí)行較少誤差的過程來找出的方式。本發(fā)明提供生物分子的分析方法及裝置,其特征在于,生成上述患者模型的方法選自由線性模型(linearmodels)、支持向量機(jī)(supportvectormachines)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(neuralnetworks)、分類回歸樹(classificationandregressiontrees)、集成學(xué)習(xí)法(ensemblelearningmethods)、判別分析(discriminantanalysis)、最鄰近法(nearestneighbormethod)、貝葉斯網(wǎng)絡(luò)(Bayesiannetworks)、獨(dú)立成分分析(independentcomponentsanalysis)組成的組中。對于準(zhǔn)確而綜合的原理(Mechanism)沒有被證明的大多數(shù)疾病可以說基于事例的診斷的重要性非常大。但是,局限于特定機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)而發(fā)明的現(xiàn)有事例基礎(chǔ)機(jī)器學(xué)習(xí)推理系統(tǒng)由于準(zhǔn)確度低,因此持續(xù)地要求已改善的系統(tǒng)的開發(fā)。并且,現(xiàn)有的系統(tǒng)只開發(fā)成利用所有已學(xué)習(xí)的臨床檢查項(xiàng)目的疾病鑒別器,且沒有提供能夠使用各疾病的臨床檢查項(xiàng)目的重要度或者優(yōu)先順序。本發(fā)明涉及一種利用用于支援醫(yī)生的準(zhǔn)確的疾病診斷的事例基礎(chǔ)機(jī)器學(xué)習(xí)推理的疾病診斷及檢查項(xiàng)目選定系統(tǒng),且涉及一種根據(jù)患者的事例數(shù)據(jù)庫(Database)通過作為由已訓(xùn)練的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(NeuralNetwork)構(gòu)成的機(jī)器學(xué)習(xí)機(jī)的疾病鑒別器,分析新患者的檢查信息來判別疾病,為了根據(jù)預(yù)防診斷的各疾病的最終判別而選擇最少的重要檢查項(xiàng)目來提供的系統(tǒng)。通過機(jī)器學(xué)習(xí)推理的疾病診斷技術(shù)各別地適用于機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)而構(gòu)成。生成上述患者的模型的方法存在線性模型(linearmodels)、支持向量機(jī)(supportvectormachines)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(neuralnetworks)、分類回歸樹(classificationandregressiontrees)、集成學(xué)習(xí)法(ensemblelearningmethods)、判別分析(discriminantanalysis)、最鄰近法(nearestneighbormethod)、貝葉斯網(wǎng)絡(luò)(Bayesiannetworks)、獨(dú)立成分分析(independentcomponentsanalysis)等。在本系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及實(shí)務(wù)中的應(yīng)用可分成2種結(jié)構(gòu),只為診斷的獨(dú)立(standalone)形態(tài)的診斷系統(tǒng)和現(xiàn)有醫(yī)院信息系統(tǒng),即,能夠與由醫(yī)囑傳輸系統(tǒng)(OCS,OrderCommunicationSyste)、醫(yī)學(xué)影像歸檔與通信系統(tǒng)(PACS,PictureArchivingandCommunicationSystems)、實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)(LIS,LaboratoryInformationManagementSystem)等相連接的組合的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)。為了與組合的系統(tǒng)相連動需要依據(jù)健康信息交換第七層協(xié)議(HL7,HealthLevelSeven)及醫(yī)療數(shù)字影像傳輸協(xié)議(DICOM,DigitalImagingandCommunicationsinMedicine)的規(guī)章來構(gòu)建系統(tǒng)。本系統(tǒng)作為初期模型與病人監(jiān)護(hù)系統(tǒng)(PMS,PatientMonitoringSystem)相連動,進(jìn)而提高了診斷的準(zhǔn)確度。并且,不僅是病人監(jiān)護(hù)系統(tǒng),而且還開發(fā)成與醫(yī)囑傳輸系統(tǒng)、電子病歷(EMR,ElectronicMedicalRecord)、醫(yī)學(xué)影像歸檔與通信系統(tǒng)等多種醫(yī)療信息系統(tǒng)相連動的系統(tǒng),進(jìn)而能夠開發(fā)成包含有多種疾病因子且更準(zhǔn)確的診斷系統(tǒng)。本發(fā)明提供利用寡核苷酸的生物分子的分析方法及裝置,其特征在于,上述生物試樣選自由細(xì)菌、真菌類、病毒、細(xì)胞株、組織組成的組中的一種以上。有益效果本發(fā)明提供一種方法,利用寡核苷酸來分析生物分子,進(jìn)而能夠在生物試樣中確認(rèn)生物分子的生物學(xué)意義,且能夠通過熒光學(xué)以較高的靈敏度來進(jìn)行檢測。尤其,能夠通過一次檢查來分析多種生物分子,進(jìn)而在生物試樣中有效地決定表現(xiàn)型的變化、對疾病的敏感性而且對治療藥劑的反應(yīng)的差異等個(gè)人之間的差異。附圖說明圖1為從生物試樣中分離核酸及蛋白質(zhì)后,從包含蛋白質(zhì)和分析配體發(fā)生反應(yīng)而制備的蛋白質(zhì)-分析配體復(fù)合物及核酸中分離的RNA以及DNA等的靶核酸的核酸中制備所要分析的靶核酸DNA,通過與靶核酸的特定區(qū)域完整地互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸來分析生物分子,并分析生物學(xué)意義的整體流程圖。圖2為從生物試樣中分離的受體和分析配體復(fù)合物。圖3為將從生物試樣中分離的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后,將互補(bǔ)脫氧核糖核酸作為對象進(jìn)行RNA定量分析的圖。圖4為通過與從生物試樣中分離的靶核酸的特定區(qū)域完整地互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸來進(jìn)行靶核酸變異分析的整體流程圖。圖5為進(jìn)行從生物試樣中分離的靶核酸甲基化有無分析的整體流程圖。圖6為通過分析使具有標(biāo)記物質(zhì)的靶探針與陣列上的捕獲探針進(jìn)行雜交而產(chǎn)生的信號來分析生物分子的相關(guān)圖。圖7為在陣列上與白介素17(IL17,interleukin17)及白介素17受體A(IL17RA)相應(yīng)的適配體、mRNA、DNA變異以及與甲基化有無相應(yīng)的捕獲探針的配置圖。圖8為為了分析與白介素17及白介素17受體A相應(yīng)的蛋白質(zhì)、mRNA、DNA變異及甲基化有無,利用寡核苷酸來制備部分雙鏈核酸以及完整的雙鏈核酸后,將它們當(dāng)做模板并利用信號引物發(fā)生PCR,進(jìn)行標(biāo)記及擴(kuò)增而獲得的靶探針與固著于陣列的上述捕獲探針進(jìn)行雜交來形成的圖像。具體實(shí)施方式以下,參照附圖和實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明的基準(zhǔn)物質(zhì)及核酸芯片的制備方法,以及由利用它們的兩個(gè)或者兩個(gè)以上的生物分子組成的生物試樣中存在的生物分子的分析方法。以下的具體例只是示例性地說明本發(fā)明,并不限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明中使用的特定生物分子為白介素17(IL17,interleukin17)及白介素17受體A(IL17RA,Interleukin17receptorA),且利用陣列通過一次檢查來分析它們的蛋白質(zhì)、mRNA及DNA變異。白介素17作為CD4+T細(xì)胞的Th17細(xì)胞生產(chǎn)的細(xì)胞因子,例如,具有以登錄代碼(Accessioncode)AAH67505或者NP002181表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。白介素17也被稱作白介素17A或者細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原-8(CTLA-8,CytotoxicTlymphocytesantigen-8)。白介素17受體意味著結(jié)合有白介素17的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)。作為白介素17受體家族已公知的有IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD、IL-17RE。本發(fā)明的“白介素17介導(dǎo)炎癥性疾病”包括呼吸道疾病、消化系統(tǒng)疾病、皮膚血管疾病或者代謝性疾病、骨關(guān)節(jié)病及腦神經(jīng)疾病等,上述疾病不僅是通過Th17細(xì)胞產(chǎn)生,而且還通過從γ/δT細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等的免疫細(xì)胞或者炎性細(xì)胞中分泌的白介素17而產(chǎn)生或者惡化。具體地,上述呼吸道疾病包括鼻炎、鼻息肉、鼻竇炎、氣喘、氣管炎、慢性阻塞性肺疾患、支氣管擴(kuò)張癥、細(xì)支氣管炎、肺炎、纖維化肺、肺癌等,上述消化系統(tǒng)疾病包括口腔炎、食道炎、胃炎、胃潰瘍、炎癥性腸炎、過敏性大腸綜合征、膽管炎、胰腺炎、口腔癌、食道癌、胃癌、大腸癌、膽道癌、膽囊癌、胰腺癌等。并且,上述血管或者代謝性疾病包括動脈硬化癥、糖尿、痛風(fēng)等,上述骨關(guān)節(jié)病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥等。上述腦神經(jīng)疾病包括血管性癡呆、阿爾茨海默病、腦退行性疾病等。定量分析的蛋白質(zhì)及RNA定量分析的對象為白介素17及白介素17受體A,且為能夠從基因庫(GenBank)數(shù)據(jù)系統(tǒng)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中獲得的白介素17及白介素17受體A基因的堿基序列信息(白介素17的登記號為NM_002190,以及,白介素17受體A的登記號:NM_014339)。DNA變異分析將白介素17及白介素17受體A的SNP當(dāng)做對象,且對上述內(nèi)容的信息搜集于http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp。核酸甲基化與否分析執(zhí)行白介素17啟動子-144位子(Thomas,R.M.,etal.,2012,JBiolChem.287(30):25049-59.)。(表1)靶核酸特定區(qū)域(H)的堿基序列(表2)捕獲探針及捕獲探針的互補(bǔ)堿基序列(指示配體的拉鏈碼(zip-code)堿基序列)(表3)通用引物的堿基序列正向引物(5'→3')反向引物(5'→3')P1:5-ACTTCGTCAGTAACGGAC-3P3:5-GTCTGCCTATAGTGAGTC-3P2:5-GAGTCGAGGTCATATCGT-3實(shí)施例1.準(zhǔn)備生物分子從由細(xì)胞或者細(xì)胞組成的組織試樣中利用AllPrepDNA/RNA/ProteinMinikit(凱杰(Qiagen)公司,美國)來分離生物分子。本發(fā)明將人類的軟骨組織(普諾生(Promocell)公司,德國)當(dāng)做生物試樣使用。利用制造商提供的緩沖液來溶解軟骨組織后,將所溶解的試樣處理在色譜柱后,通過離心分離使DNA結(jié)合于色譜柱膜,并獲得過濾的溶液。存在于色譜柱膜的DNA分離為清洗具有DNA的色譜柱并從膜中提取DNA后,通過離心分離來獲得DNA。將所獲得的上述溶液在制造商提供的色譜柱中進(jìn)行處理,并從過濾的溶液中進(jìn)行沉淀及離心分離來獲得蛋白質(zhì)。并且,清洗存在于色譜柱中的DNA并提取DNA后,通過離心分離來獲得。實(shí)施例2.分析配體的制備2-1.抗體及適配體分析配體為了在上述軟骨組織中進(jìn)行特定蛋白質(zhì)的定量分析,購買了用于制備上述蛋白質(zhì)-抗體分析配體復(fù)合物的白介素17(商品目錄編號BAF317)及白介素17受體A(商品目錄編號BAF177)生物素-抗體(安迪生物科技有限公司(R&DSystems).美國)。為了在上述軟骨組織中進(jìn)行特定蛋白質(zhì)的定量分析,用于制備上述蛋白質(zhì)-適配體復(fù)合物而使用的適配體作為與白介素17(韓國專利,第10-1276519-0000號)及白介素17受體A(Chen,L.,etal.,2011,OsteoarthritisandCartilage19;711~718)特異性地結(jié)合的單鏈核酸,堿基序列提出在(表4)。有機(jī)合成白介素17及白介素17受體A生物素-適配體來進(jìn)行準(zhǔn)備(百奧尼(Bioneer)公司.韓國)。(表4)白介素17及白介素17受體A適配體的堿基序列為了蛋白質(zhì)定量分析的分析配體的生物素-寡核苷酸的結(jié)構(gòu)由以下的通式(I)來表示。5’-生物素-P1-T-P3-3’(I)上述通式(I)中,P1為與具有檢測信號的正向引物互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域,T作為與捕獲探針互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域,為了識別配體所結(jié)合的靶蛋白質(zhì)或相關(guān)的單鏈核酸而使用,且能夠設(shè)計(jì)成適用于在雜交反應(yīng)中使用的探針。P3為在信號引物對中與反向引物互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域。通過抗生物素蛋白(avidin)使所準(zhǔn)備的上述生物素-抗體及生物素-適配體與生物素-寡核苷酸相連接,來制備結(jié)構(gòu)體,且將前者稱為抗體分析配體或者將后者稱為適配體分析配體。2-2.上游及下游寡核苷酸2-2-1.核酸定量分析本發(fā)明的特征在于,用于核酸定量分析的上述上游寡核苷酸的結(jié)構(gòu)由以下的通式(II)來表示:5’-P1-H-3’(II)上述通式(II)中,P1為與具有檢測信號的正向引物互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域,H為與雜交的靶核酸互補(bǔ)雜交的序列區(qū)域。本發(fā)明的特征在于,上述下游寡核苷酸的結(jié)構(gòu)由以下的通式(III)來表示:5’-H-T-P3-3’(III)上述通式(III)中,H為在上述靶核酸中從使上述上游寡核苷酸的3'末端結(jié)合的位置的下游序列進(jìn)行互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域,T作為與捕獲探針互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域,為了識別靶核酸或相關(guān)的單鏈核酸而使用,且能夠被設(shè)計(jì)成適應(yīng)于在雜交反應(yīng)中使用的探針。P3為在信號引物對中與反向引物互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域。上述通式(II)和通式(III)的H是由β-actin、IL17及IL17RmRNA等的特異性堿基序列構(gòu)成,如(表1)所示,而T如(表2)所示,P1和P3如(表3)所示,參閱上述序列對用于核酸變異分析的上、下游寡核苷酸進(jìn)行了有機(jī)合成(百奧尼(Bioneer)公司,韓國)2-2-2.核酸變異分析為了靶核酸變異分析,上述上游寡核苷酸的結(jié)構(gòu)由以下的通式(IV)來表示。5’-P1-H-V-3’(IV)上述通式(IV)中,P1為具有檢測信號的正向引物互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域,H為具有與靶核酸互補(bǔ)雜交的序列的區(qū)域,V為與編譯序列互補(bǔ)雜交的變異序列的特異區(qū)域。上述寡核苷酸可由2個(gè)或者2個(gè)以上構(gòu)成。上述下游寡核苷酸的結(jié)構(gòu)由以下的通式(V)來表示。5’-H-T-P2-3’(V)上述通式(V)中,H為在靶核酸的變異特異區(qū)域下游與靶核酸互補(bǔ)雜交的序列區(qū)域,T作為與捕獲探針互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域,用于識別具有變異的靶核酸或相關(guān)的單鏈核酸而使用,且能夠被設(shè)計(jì)成適用于在雜交反應(yīng)中使用的探針。P2為在信號引物對中與反向引物完整地互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域。上述通式(IV)和通式(V)的H中的IL17的SNP、IL17R的SNP及白介素17等如(表1)所示,T如(表2)所示,P如(表3)所示,參閱上述序列對用于核酸變異分析的上、下游寡核苷酸進(jìn)行了有機(jī)合成(百奧尼(Bioneer)公司,韓國)。實(shí)施例3.質(zhì)量控制單鏈核酸的制備基準(zhǔn)物質(zhì)由從http://genomics.msu.edu/plant_specific/中確保的A、B、C、D及E等5個(gè)種類植物特異蛋白質(zhì)組成(參照表5)。(表5)植物特異蛋白質(zhì)選定的5個(gè)植物特異蛋白質(zhì)利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)相應(yīng)的蛋白質(zhì)后,分離所表達(dá)的蛋白質(zhì)并通過標(biāo)準(zhǔn)指數(shù)式富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX,SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment)方法(Ellington,A.D.andJ.W.Szostak.1990.InvitroselectionofRNAmoleculesthatbindspecificligands.Nature346:818-822;Gold,L.,P.Allen,J.Binkley,D.Brown,D.Schneider,S.R.Eddy,C.Tuerk,L.Green,S.Macdougal,andD.Tasset.1993.RNA:theshapeofthingstocome,pp.497-510.In:R.F.GestelendandJ.F.Atkins(eds.).TheRNAWorld,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.)來確保結(jié)合于基準(zhǔn)物質(zhì)的單鏈核酸。將上述單鏈核酸命名為質(zhì)量控制單鏈核酸,且利用它們的堿基序列來制備了與質(zhì)量控制單鏈核酸相應(yīng)的生物素-質(zhì)量控制單鏈核酸,以及利用(實(shí)施例2)的通式1制備了生物素-寡核苷酸。使生物素-質(zhì)量控制單鏈核酸通過抗生物素蛋白連接生物素-寡核苷酸來制備的結(jié)構(gòu)體稱作質(zhì)量控制配體。實(shí)施例4.核算試樣的準(zhǔn)備4-1.蛋白質(zhì)4-1-1.抗體分析配體將裝有從所準(zhǔn)備的上述軟骨組織中分離的100μl的蛋白質(zhì)溶液的微量測試孔板(microtiterwell)在4℃溫度下擱置一夜或者在37℃溫度下將0.05M碳酸酯緩沖溶液(pH9.6)涂敷了2小時(shí)。在100μl的生物素-抗體(10μg/ml)中添加抗生物素蛋白(7.2μg/ml)的狀態(tài)下,在腔室內(nèi)放置30分鐘后,添加上述生物素-寡核苷酸來制備抗體-抗生物素蛋白-寡核苷酸結(jié)構(gòu)體,且將其稱作抗體分析配體。將這些孔板在磷酸鹽緩沖生理鹽水中利用3%的脫脂奶粉、0.1mM的乙二胺四乙酸、0.02%的疊氮化鈉進(jìn)行嵌段(180μl/孔),利用磷酸鹽緩沖生理鹽水-吐溫(tween)20清洗2次后,添加100μl的抗體分析配體(10μg/ml)并在37℃溫度下培養(yǎng)2小時(shí)。將這些孔板利用吐溫-磷酸鹽緩沖生理鹽水在5分鐘內(nèi)清洗5次后,為了除去非特異性結(jié)合的生物素-寡核苷酸利用蒸餾水在5分鐘內(nèi)清洗了4次。將各孔板中的內(nèi)容物即蛋白質(zhì)-抗體分析配體復(fù)合物轉(zhuǎn)移到500μl的微量離心(Eppendorf)管中保管,并將其當(dāng)作用于蛋白質(zhì)定量分析的核酸試樣來使用。4-1-2.適配體分析配體在上述所準(zhǔn)備的生物素-白介素17適配體(10/)100及生物素-白介素17受體A適配體(10/)100中各添加抗生物素蛋白(7.2/)的狀態(tài)下,在腔室內(nèi)放置30分鐘,添加上述準(zhǔn)備的生物素-寡核苷酸(10/)來制備適配體-抗生物素蛋白-寡核苷酸結(jié)構(gòu)體,且將其稱作適配體分析配體。將從所準(zhǔn)備的上述軟骨組織中分離的蛋白質(zhì)溶液處理并固定在硝化纖維(nitrocellulose)盤后,在SELEX緩沖液中將附著有上述蛋白質(zhì)的盤和白介素17及白介素17受體A適配體分析配體進(jìn)行30分鐘的處理,來形成了蛋白質(zhì)-適配體分析配體復(fù)合物,并執(zhí)行清洗而去除非特異性結(jié)合的適配體,來準(zhǔn)備純化的蛋白質(zhì)-適配體分析配體復(fù)合物,且為了蛋白質(zhì)的定量分析將其用作核酸試樣。4-2.核糖核酸為了特定核糖核酸的定量分析及變異分析,將從軟骨組織中純化的總10ng的RNA、dT20引物(百奧尼(Bioneer)株式會社,100pmoles/20μl反應(yīng)液)、MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(百奧尼(Bioneer)株式會社,200U/20μl反應(yīng)液)、2μl的10x反應(yīng)緩沖溶液、RNasin(普洛麥格公司(Promega),15U/20μl反應(yīng)液)及三甲銨乙內(nèi)酯(西格瑪(Sigma)公司,500mM/20μl反應(yīng)液)進(jìn)行混合來制備反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。利用所制備的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液,在作為現(xiàn)有的單一溫度條件的42℃及52℃溫度下,進(jìn)行10分鐘、20分鐘、40分鐘、60分鐘的反應(yīng)和在37℃溫度下將2分鐘作為一周期、在50℃溫度下將3分鐘作為一周期,通過2次、4次、8次、12次循環(huán)反應(yīng),在37℃溫度下將1分鐘、在47℃溫度下將3分鐘、在55℃溫度下將1分鐘作為一周期通過2次、4次、8次、12次循環(huán)反應(yīng)來執(zhí)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將所生成的cDNA當(dāng)作核酸試樣來使用。4-3.脫氧核糖核酸變異為了在上述軟骨組織中分析特定脫氧核糖核酸的甲基化有無而利用試劑盒,從軟骨組織中提取基因組DNA,并利用納米微滴(NanoDrop)來測定上述基因組DNA的濃度,將其當(dāng)作用于DNA變異分析的核酸試樣來使用。4-4.甲基化為了在上述軟骨組織中分析特定DNA的甲基化有無而使用試劑盒,從軟骨組織中提取基因組DNA,并利用納米微滴來測定上述基因組DNA的濃度。之后,將提取的約1~2μg左右的DNA與0.5N濃度的氫氧化鈉進(jìn)行混合在16℃,并使其在37℃溫度下發(fā)生15分鐘反應(yīng),來使DNA變形成單鏈形態(tài)。之后,添加3.5M濃度的硫酸氫鈉(Sodiumbisulfate)和0.01M濃度的對苯二酚(Hydroquinone)試劑,并在56℃溫度下發(fā)生16小時(shí)化學(xué)反應(yīng)。之后,執(zhí)行利用乙醇的沉淀反應(yīng),并只濃縮變換的DNA來進(jìn)行純度分離,利用50℃的去離子水進(jìn)行溶解后,添加氫氧化鈉使其變成0.1M濃度,并在常溫下發(fā)生15分鐘反應(yīng),進(jìn)而執(zhí)行胞核嘧啶的脫硫反應(yīng),并再一次通過乙醇沉淀反應(yīng)來進(jìn)行濃縮,最終在30℃的去離子水中進(jìn)行溶解并在20℃下保管,且使用于分析甲基化有無的核酸試樣。實(shí)施例5.擴(kuò)增用核酸試樣的制備在利用上述軟骨組織制備并包含靶核酸的RNA的核酸試樣、基因組DNA的核酸試樣、及蛋白質(zhì)-分析配體復(fù)合物等中,按照如下所述的方式制備各個(gè)擴(kuò)增用核酸試樣進(jìn)行混合,并作為擴(kuò)增反應(yīng)中所使用的反應(yīng)溶液使用。將在(實(shí)施例4)中為了蛋白質(zhì)定量分析而獲得的連接有寡核苷酸的蛋白質(zhì)-分析配體復(fù)合物直接作為擴(kuò)增用核酸試樣使用。將在(實(shí)施例4)中為了RNA定量分析而分離的RNA發(fā)生反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)而變換維cDNA的核酸試樣、、為了DNA變異分析而被分離的基因組DNA的核算試樣、以及為了甲基化有無分析而反映基因組DNA的甲基化信息的發(fā)生堿基序列變化的用于甲基化有無分析的核酸試樣,通過如下所述的方式制備了擴(kuò)增用核算試樣。使上述核酸試樣的混合物和上述上、下游寡核苷酸發(fā)生雜交反應(yīng)來制備部分雙鏈核酸,接著,執(zhí)行將部分雙鏈核酸變換成完整的雙鏈核酸的連接反應(yīng)來制備上述靶核酸DNA。接下來,在反應(yīng)溶液中使用PCR設(shè)備,并在95℃溫度下進(jìn)行5分鐘的變性后,執(zhí)行10次如下的步驟:在95℃溫度下進(jìn)行1分鐘、在70℃溫度下進(jìn)行1分鐘、在68℃溫度下進(jìn)行1分鐘、在66℃溫度下進(jìn)行1分鐘,并且,在64℃溫度下進(jìn)行3分鐘的循環(huán)。10-ml的反應(yīng)溶液由20mM的三羥甲基氨基甲烷(TrisHCl,TrisHydroxyMethylAminomethan)(pH7.6)、25mM的乙酸鈉(sodiumacetate)、10mM的乙酸鎂(magnesiumacetate)、1mM的二硫蘇糖醇(dithiothreitol)、1mM的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+,Nicotinamideadeninedinucleotide)、0.1%的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、在實(shí)施例2中所準(zhǔn)備的上游寡核苷酸和下游寡核苷酸(每個(gè)500pM)、1單位(unit)的水生棲熱菌(Taq,(Thermusaquaticus)DNA連接酶(ligase)(紐英倫生物技術(shù)股份有限公司(NewEnglandBiolabs),馬薩諸塞州(MA),美國(USA))、上述內(nèi)容中所準(zhǔn)備的100μg的核酸試樣混合物組成。實(shí)施例6.擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增反應(yīng)在如下的反應(yīng)溶液中利用PCR設(shè)備,并在95℃溫度下進(jìn)行3分鐘的變性后,執(zhí)行42次如下的循環(huán):在95℃溫度下進(jìn)行10秒、在56℃溫度下進(jìn)行10秒,以及在72℃溫度下進(jìn)行20秒。上述25-ml的反應(yīng)溶液由10mM的三羥甲基氨基甲烷(pH8.6)、50mM的氯化鉀(KCl)、2.5mM的氯化鎂(MgCl2)、5%(V/V)的甘油(glycerin)、1U的TaqDNA聚合酶(polymerase)、1皮摩爾(pmol)的正向信號引物(野生型靶核酸分析時(shí)僅使用P1,變異把核算分析時(shí)使用P1和P2)、20皮摩爾的反向信號引物(P3)及2毫升(ml)的實(shí)施例3的反應(yīng)溶液等組成。為了野生型靶核酸分析的引物,由與分析配體或上游寡核苷酸的P1區(qū)域互不結(jié)合并生成檢測信號的Cy3標(biāo)記物質(zhì)與所標(biāo)記的正向引物以及P3區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合的反向引物組成。在用于變異靶核酸分析的引物中,正向引物由2個(gè)或2個(gè)以上的與標(biāo)記為用于對非變異靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增的Cy3的P1區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合的正向引物以及與標(biāo)記為Cy5的P2區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合的正向引物組成,而上述反向引物由P3區(qū)域通用的引物組成。這些PCR引物的堿基序列如(表2)所示。實(shí)施例7.陣列的制備上述捕獲探針為了識別靶核酸,提出了具有與靶核酸相應(yīng)的堿基序列的低聚物(表3),并根據(jù)圖4將通過有機(jī)合成(百奧尼(Bioneer)公司)而制備的捕獲探針固定在陣列中。當(dāng)設(shè)計(jì)上述下游寡核苷酸時(shí),使得(表3)中的捕獲探針指示與(表4)中的下游寡核苷酸完整地互補(bǔ)結(jié)合的靶核酸的特定區(qū)域。若具體地觀察,使得(表1)的1號種類捕獲探針指示與(表2)的順序號1的β-actinmRNA的下游寡核苷酸完整地互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域,使得作為(表1)的3號種類捕獲探針指示與(表2)的順序號3的白介素17mRNA的下游寡核苷酸完整地互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域。利用作為涂敷有γ-氨基丙基硅烷(GAPS,GammaAminoPropylSilane)的載玻片的UltraGAPSTM包被玻片(CoatedSlide)(康寧公司(Corning))來制備以規(guī)定規(guī)則固著有捕捉單鏈核酸的核酸芯片。核酸芯片的制備使用作為針式(pin)方法的微陳列系統(tǒng)(Microarrayersystem,跟拍(GenPak)公司),點(diǎn)距(spotspacing)使中心距(center-to-center)成為150um。將各個(gè)捕捉單鏈核酸溶解在標(biāo)準(zhǔn)溶液來調(diào)節(jié)濃度。此時(shí),微陣列內(nèi)的濕度維持在70%,并執(zhí)行點(diǎn)樣(spotting)。將所點(diǎn)樣的載玻片在加濕腔室(humidifiedchamber)中放置24~48小時(shí)后,在紫外線鏈結(jié)箱(UVcrosslinker)中執(zhí)行烘烤(baking)過程。通過被廣泛公知的方法,將捕捉單鏈核酸固定在載玻片后,對載玻片立即進(jìn)行離心分離來進(jìn)行干燥后,在光線屏蔽的情況下進(jìn)行保管。上述陣列的制備方法中的底物為由玻璃制備的載玻片。此時(shí),底物可使用由胺基或者醛基等涂敷的載玻片。例如,利用作為涂敷有γ-氨基丙基硅烷(GAPS,GammaAminoPropylSilane)的載玻片的UltraGAPSTM包被玻片(康寧公司)來制備使上述捕獲探針以規(guī)定規(guī)則排列并固著的陣列。上述微陣列的制備可使用微陣列系統(tǒng)(Microarrayersystem),將各個(gè)捕獲探針溶解在緩沖液中來調(diào)節(jié)濃度,此時(shí),將微陣列內(nèi)的濕度維持在70%至80%來執(zhí)行點(diǎn)樣(spotting)。將所點(diǎn)樣的載玻片放置在加濕腔室后,在紫外線鏈結(jié)箱中執(zhí)行烘烤過程。如上述本發(fā)明的微陣列中,通過被廣泛公知的方法,將捕捉單鏈核酸固定在載玻片后,對載玻片立即進(jìn)行離心分離來進(jìn)行干燥后,到使用前,以光線屏蔽的狀態(tài)進(jìn)行保管。實(shí)施例8.微陣列雜交及分析將包含上述(表1)中的靶核酸的特定區(qū)域的堿基序列和與捕獲探針完整地互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域的靶探針處理在本發(fā)明的微陣列的捕獲探針,并在60℃溫度下雜交4~12小時(shí),在42℃溫度下利用0.1x標(biāo)準(zhǔn)枸椽酸鹽水溶液進(jìn)行清洗。此時(shí),雜交溶液包含1M的氯化鈉、0.3M的檸檬酸鈉(sodiumcitrate)、0.5%的十二烷基硫酸鈉或者100/鮭魚精DNA、0.2%的牛血清白蛋白或者單鏈核酸。執(zhí)行雜交(Hybridization)后,將微陣列利用清洗溶液進(jìn)行清洗。此時(shí),清洗溶液的組合如下:例如,1X標(biāo)準(zhǔn)枸椽酸鹽水+0.2%十二烷基硫酸鈉、1X標(biāo)準(zhǔn)枸椽酸鹽水+0.2%十二烷基硫酸鈉、0.5X標(biāo)準(zhǔn)枸椽酸鹽水+0.2%十二烷基硫酸鈉、0.01X標(biāo)準(zhǔn)枸椽酸鹽水+0.2%十二烷基硫酸鈉順序的步驟,且每個(gè)步驟在42℃溫度下執(zhí)行30分鐘。實(shí)施例9.核酸芯片的點(diǎn)探索及分析完成上述實(shí)施例6的清洗后,將載玻片通過離心分離進(jìn)行干燥后,利用具有適當(dāng)波長激光(Cy5,635nm)的激光掃描儀(laserscanner,GenePix4000,奧松(Axon)公司)來進(jìn)行探索,上述激光用于激發(fā)(excitation)所使用的熒光染料。熒光圖像以多圖像標(biāo)記圖像文件(TIFF,multi-imageTagedimagefile)形式進(jìn)行存儲后,通過適當(dāng)?shù)膱D像分析(imageanalysis)軟件(GenePixPro3.0,Axon公司)來進(jìn)行分析。每個(gè)點(diǎn)(spot)信號強(qiáng)度(signalintensity,單位:quanta)使用減去周圍背景的基本信號的信號,此時(shí),背景信號是指由特定點(diǎn)的周圍中的4個(gè)點(diǎn)的周邊信號構(gòu)成的局部背景(localbackground)。當(dāng)點(diǎn)具有的像素(pixel)的90%以上示出超過背景信號+2標(biāo)準(zhǔn)偏差(S.D.,standarddeviation)的信號強(qiáng)度時(shí),包括數(shù)據(jù)分析,若不滿足上述條件,則分類成不包括數(shù)據(jù)的點(diǎn)(badspot),通常不包含分析。根據(jù)標(biāo)記效率(Labelingefficient)的偏差(variation)利用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)(IS,internalstandard)的信號來進(jìn)行平準(zhǔn)化(舉例來說,歸一化強(qiáng)度(NormalizedIntensity)=探針強(qiáng)度(ProbeIntensity)/內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)度(ISintensity)),單標(biāo)記(monolabeling)的情況下,通過Cy5信道的信號強(qiáng)度(signalintensity)來記錄其結(jié)果,當(dāng)點(diǎn)樣(spotting)為2倍以上的情況下使用平均值。在靶單鏈核酸的信號強(qiáng)度(S,signalintensity)中,對點(diǎn)具有的像素(pixel)測出各個(gè)信號強(qiáng)度后,使用它們的中值(median)(像素的中值(medianvalueofpixel-by-pixel))。信號強(qiáng)度利用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)并根據(jù)標(biāo)記效率來平準(zhǔn)化偏差。S’(標(biāo)準(zhǔn)值(normalizedvalue))=S(Cy5-參考值(reference))×(Cy5-內(nèi)標(biāo)準(zhǔn))。能夠通過上述方法來查明像素密度的分析結(jié)果和實(shí)際試樣量之間的關(guān)系,進(jìn)而確認(rèn)其相互關(guān)系。觀察作為能夠通過上述實(shí)驗(yàn)來獲得的一例的圖6,能夠通過微陣列上的點(diǎn)熒光程度,在生物試樣中進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析、mRNA定量分析、DNA變異分析及DNA甲基化有無分析等。圖7是為了分析與白介素17及白介素17受體A相應(yīng)的蛋白質(zhì)、mRNA及DNA變異,而利用寡核苷酸來制備部分雙鏈核酸及完整的雙鏈核酸后,將上述部分雙鏈核酸及完整的雙鏈核酸當(dāng)做模板并通過信號引物發(fā)生PCR,使標(biāo)記及擴(kuò)增而獲得的靶探針與固著于微陣列的上述捕獲探針進(jìn)行雜交來形成的圖像。圖8中,根據(jù)由捕獲探針和具有標(biāo)記物質(zhì)的靶探針形成的雙鏈的性質(zhì)而多樣地示出點(diǎn)的熒光程度,且上述熒光程度在由單捕獲探針構(gòu)成的點(diǎn)中根據(jù)具有標(biāo)記物質(zhì)的靶探針的信號而被決定。生物分子中,具有通過靶核酸發(fā)生PCR來獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物中起源的標(biāo)記物質(zhì)的靶探針和微陣列捕獲探針的堿基序列對單鏈核酸-捕獲探針的雙鏈穩(wěn)定性產(chǎn)生影響,且具有微陣列的點(diǎn)中的標(biāo)記物質(zhì)的靶探針的量對熒光程度產(chǎn)生影響。因此,在圖8中,生物分子的定量分析的熒光程度表示具有標(biāo)記物質(zhì)的靶探針的量,具有上述標(biāo)記物質(zhì)的靶探針的量表示與生物試樣中的靶核酸相應(yīng)的生物分子的量。并且,使從對照組試樣和實(shí)驗(yàn)組試樣中分離的靶核酸通過相互不同的標(biāo)記物質(zhì)來準(zhǔn)備靶探針的情況下,優(yōu)選地,前者為通過Cy3來標(biāo)記的信號引物,后者為通過Cy5來標(biāo)記的信號引物,即,所形成的點(diǎn)呈藍(lán)色-黃色-紅色的彩色光譜是因?yàn)榕c捕獲探針結(jié)合的標(biāo)記有Cy-3的靶探針和標(biāo)記有Cy-5的靶探針的比率不同而產(chǎn)生的現(xiàn)象,且特定點(diǎn)的彩色光譜的程度相當(dāng)于對照組試樣和實(shí)驗(yàn)組試樣中存在的特定生物分子的形式。核酸變異的分析情況能夠從點(diǎn)的彩色光譜中確認(rèn)在生物試樣中與靶核酸相應(yīng)的特定基因變異,上述生物試樣包含與點(diǎn)相應(yīng)的靶核酸。僅在與靶核酸的特定區(qū)域的變異核苷酸完整地互補(bǔ)結(jié)合的情況下,生成擴(kuò)增產(chǎn)物,并生成將上述擴(kuò)增產(chǎn)物當(dāng)做模板的靶探針,因此,分析最終形成的點(diǎn)的彩色光譜來確認(rèn)微陣列的所有點(diǎn)的程度,進(jìn)而能夠在生物試樣中確認(rèn)特定基因的變異。即,在圖7中,紅色點(diǎn)為通過Cy5標(biāo)記物質(zhì)而產(chǎn)生的,其與變異相關(guān)信號引物P2相應(yīng),由此,能夠獲知在生物試樣中存在與陣列上的捕獲探針相應(yīng)的SNP。在甲基化有無中,與甲基化特異上游寡核苷酸相應(yīng)的信號引物P1被標(biāo)記成Cy3,并且與非甲基化上游寡核苷酸相應(yīng)的信號引物P2被標(biāo)記成Cy5,在圖7中白介素17甲基化點(diǎn)呈藍(lán)色,進(jìn)而能夠獲知本實(shí)驗(yàn)中試用的試樣的白介素17啟動-144位子胞核嘧啶被甲基化。實(shí)施例10.包含大腸菌的細(xì)胞外分子的生物分子分析11-1.進(jìn)行AmpR基因分析的寡核苷酸的制備用于分析質(zhì)粒pUC19中的AmpR基因的寡核苷酸的結(jié)構(gòu)根據(jù)上述通式(IV)和通式(V)將上述上游寡核苷酸及下游寡核苷酸設(shè)計(jì)成如(表6)所示,來進(jìn)行有機(jī)合成(百奧尼(Bioneer)公司,韓國)(表6)用于分析AmpR基因的寡核苷酸項(xiàng)目堿基序列(5'→3')上游寡核苷酸(野生型)5-GCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATG-3上游寡核苷酸(變異型)5-GCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATA-3下游寡核苷酸5-CCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGT-310-2.細(xì)胞表面分子分析配體的制備本發(fā)明人公開的大腸菌結(jié)合單鏈核酸(參考韓國專利第10-0730359號)的堿基序列如同(表7),且基于(表7),生物素-單鏈核酸配體及生物素-寡核苷酸根據(jù)通式(I)并參照(表2)及(表3)而設(shè)計(jì),進(jìn)而進(jìn)行有機(jī)合成(百奧尼(Bioneer)公司,韓國)。(表7)與大腸菌表面分子相結(jié)合的適配體的堿基序列順序號堿基序列(5'→3')1cgcaguuugcgcgcguuccaaguucucucaucacggaaua2acacugcgugcuuacgacuucuggucccaucauucggcua3aguucgaugagggugacaccgccaggaguguuugcuagac4acccgucgauaaugacugaacuuccucuaucuuaaagggg5ggguaaggggauguuucugggauucaagcgccugauucug6ucuguauuuguacgcaccgaagauaagagagggaguggau7caugggcgggccgcggucuauucgggauuauugcggaucc8ucagggugugaaguucuuccgcgcuaguggcuuguauguu8gucgggguugcaaggcgucguagcguguauuugugauggu10gcguaugggcgggucauuaggacaauuuaaccacucgcga11auugucugugugacuagucggucuagugugggggagaaga12uuaccacugaguuaauuuguacggucugcgguguacuuua13gcuaucaauauuauagaggcggucgggguagugucaucgu14uaggagagcgggagcugagaacuuagaggcgccgauacac15gacguauuacaguuaaguuggcgccauucgauuucugauc16auaccagcuuauucaauuauaccagcuuauucaauuuugu17ccguaaguccggucuuccuugcugagucgcccuuucaggu18uugguggggagggccaguuaggucuaauuuccgacgcgca在所準(zhǔn)備的上述生物素-大腸菌適配體(10μg/μl)中分別添加100μl的抗生物素蛋白(7.2μg/μl),并在腔室常溫下放置30分鐘后,添加上述準(zhǔn)備生物素-寡核苷酸(10μg/μl)來制備適配體-抗生物素蛋白-寡核苷酸結(jié)構(gòu)體,且將其稱作適配體分析配體。10-3.從大腸菌-分析配體復(fù)合物中分離及分析生物分子使大腸菌和適配體分析配體膠發(fā)生反應(yīng)后,對大腸菌-適配體分析配體復(fù)合物進(jìn)行清洗及分離。從獲得的上述大腸菌-分析配體復(fù)合物中分離包含與pUC19質(zhì)粒及大腸菌表面結(jié)合的單鏈核酸等的總核酸。將所分離的總核酸作為靶核酸并通過(實(shí)施例5)的方法來制備靶核酸DNA。通過(實(shí)施例6)的方法來進(jìn)行標(biāo)記及擴(kuò)增,來分析在(實(shí)施例7)中所制備的微陣列。確認(rèn)了大腸菌的表面生物分子的實(shí)驗(yàn)方案及AmpR基因。產(chǎn)業(yè)上可利用性利用本發(fā)明的寡核苷酸,通過一次檢查來分析生物試樣中的生物分子,進(jìn)而能夠確認(rèn)生物試樣的生物分子的生物學(xué)意義,且能夠在熒光學(xué)上以較高的靈敏度來進(jìn)行檢測。因此,本發(fā)明通過一次檢查來分析多種生物分子,進(jìn)而能夠提供在生物試樣中有效地決定表現(xiàn)型的變化、對疾病的敏感性且對治療藥劑的反應(yīng)的差異等個(gè)人之間的差異的方法,由此,對人類克服疾病做出很大貢獻(xiàn),且在經(jīng)濟(jì)層面上對醫(yī)療產(chǎn)業(yè)具有非常有用的效果。當(dāng)前第1頁1 2 3