原料被認(rèn)為是作為制造和生產(chǎn)其他產(chǎn)品的基礎(chǔ)的所有材料或物質(zhì)，所述其他產(chǎn)品通過使用能夠獲得所需成品的合適的加工和工業(yè)處理來制造和生產(chǎn)。

舉例而言，用于生產(chǎn)食品或補充劑或醫(yī)學(xué)裝置或藥物產(chǎn)品的原料包括調(diào)味劑、提取物、有機和/或無機來源的助劑(co-formulant)、技術(shù)添加劑、維生素、蛋白質(zhì)、氨基酸、蛋白胨、天然和/或合成聚合物等等。

說明性而非窮舉性地舉例而言，可以從植物和/或其果實制備調(diào)味劑和/或提取物。

公知的是，目前例如用化學(xué)物質(zhì)處理結(jié)果植物及其果實，以保護(hù)其免受微生物或真菌或昆蟲的攻擊，從而使果實能夠生長直到達(dá)到成熟，然后收獲和消費。

同樣公知的是，該處理后，一部分所用的化學(xué)物質(zhì)保持吸附在果實的外表面(通常稱為果皮或外皮)上。在用水連續(xù)洗滌果實后被吸附的化學(xué)物質(zhì)也存留。

果皮(外果皮(exocarp))是可以剝離的果實或植物的保護(hù)性外層(表皮，其進(jìn)而由角質(zhì)層和厚壁組織組成)。保護(hù)性外層也被不正確地稱為外皮。

此外，不能排除一部分吸附在果實外表面上的化學(xué)物質(zhì)可能滲透到果實自身中(滲透到果肉中)，結(jié)果所述化學(xué)物質(zhì)從果實外部吸收到內(nèi)部。

目前收獲的部分果實用于生產(chǎn)在食物、藥物和營養(yǎng)品工業(yè)中應(yīng)用的天然植物性提取物和/或調(diào)味劑(原料)。

通常，天然植物性提取物和/或調(diào)味劑，借助于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的設(shè)備和/或技術(shù)，通過機械和/或化學(xué)提取從全果實(果皮和果肉)或從單獨處理的果皮和/或果肉獲得。

例如，在通過用溶劑提取獲得的調(diào)味劑和/或提取物和/或有機化合物的情況下，可能會發(fā)生即使用水和/或有機溶劑進(jìn)行數(shù)次洗滌步驟也不能成功地完全消除所有所用溶劑的情形，因此即使少量存在也引起對益生菌的毒性。

所以，期望的是能夠存在下述方法，其具有高敏感性和能夠鑒定直到何時在給定物質(zhì)或原料中仍存在殘留毒性，以安排用于使原料沒有對益生菌的毒性的純化或洗滌或沉淀工序。

這也適用于蛋白質(zhì)提取或氨基酸制備。在該情況下，也使用了可能作為殘留物遺留并引起對益生菌的毒性的化學(xué)試劑和/或溶劑。

對于廣泛用于配制成品的無機原料，例如二氧化硅，其自身也存在同樣的問題。

對于通過化學(xué)和/或機械提取獲得的天然植物性提取物和/或調(diào)味劑以及對于通過合成和/或提取工藝制備的其他上述原料，不能忽視下述事實，即在原料內(nèi)可能存在少量的賦有“毒”性的物質(zhì)或化合物，其對原料自身賦予一定的固有毒性。

因此，對于天然植物性提取物和/或?qū)τ谄渌鲜鲈希荒芘懦渲写嬖诟鞣N量的毒性物質(zhì)，所述量取決于果實所采用的栽培類型和/或進(jìn)行機械和/或化學(xué)提取所采用的操作條件。

在任何情況下，在天然植物性提取物和/或調(diào)味劑和/或原料中存在的任何毒性物質(zhì)通常引起兩種問題：間接問題和直接問題。

前者(或間接問題)與下述影響有關(guān)，即，所述毒性物質(zhì)的攝入能夠改變腸道益生微生物叢，因而也影響消化系統(tǒng)的生理機能，以至于會影響維生素、生物活性肽和代謝物的吸收，并類似地允許產(chǎn)生有害的生源胺(biogenic amine)，已知這改變腸道滲透性并且引起一系列的健康問題，甚至達(dá)到產(chǎn)生作為公知的致癌性物質(zhì)的亞硝胺的程度，所述生源胺由獲益于上述改變的菌株產(chǎn)生。

在這點上，應(yīng)該強調(diào)的是，如果由于賦有脫羧性的能夠通過消除羧基而使氨基酸轉(zhuǎn)化成胺的大腸菌群病原性細(xì)菌(例如大腸桿菌)的定殖的增加而改變益生菌叢，則會產(chǎn)生有害的異常量的生源胺。

此外，腸道微生物叢的失衡似乎能夠?qū)е鲁霈F(xiàn)各種病癥：糖尿病和自體免疫疾病，或者據(jù)假設(shè)會在對一些食物過敏原的不平衡的局部和全身免疫響應(yīng)方面起作用。

第二問題或直接問題涉及已經(jīng)能夠殺死益生菌細(xì)胞的所述毒性物質(zhì)在處于兒童年齡或處在發(fā)育階段的個體中可能具有的效應(yīng)，該效應(yīng)由于即刻和/或累積的毒性作用所致，其不僅針對細(xì)菌細(xì)胞也針對真核細(xì)胞，后者在分化期和生長期特別敏感。

因此，仍然需要以確保無毒的方式產(chǎn)生原料和成品，并且需要存在用于確定提取物和/或調(diào)味劑和/或原料的毒性的有把握的、簡單實用、經(jīng)濟且可重復(fù)的方法。

特別是，仍然需要用于確定構(gòu)成成品(例如食物、補充劑或醫(yī)學(xué)裝置或藥品)的個體成分對于益生菌的毒性的方法。

申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)無毒原料和成品的創(chuàng)新性途徑，其通過使通常的提取物和/或調(diào)味劑和/或原料進(jìn)行新毒性測試以確定其針對益生菌的毒性來進(jìn)行。

本發(fā)明的主題是一種用于生產(chǎn)無毒原料和成品的方法，該方法有賴于申請人提供的能夠通過創(chuàng)新性方法確定針對在所述原料和成品中存在的益生菌的毒性的可能性，該創(chuàng)新性方法同樣也形成本發(fā)明的主題。

申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用本發(fā)明的方法確定的毒性不僅取決于所用原料本身，而且最重要的是，還取決于用于生產(chǎn)所述原料的機械和/或化學(xué)提取的類型。事實上，原料的化學(xué)提取可能包括使用化學(xué)溶劑，以及能夠在原料自身留下殘留毒性的一些洗滌或沉淀步驟。

所述方法包括其中使益生菌菌株(毒性標(biāo)志物)與待測原料接觸的步驟，所用的原料的量與制劑中通常使用的量相等。

在實踐方面，制備第一樣品，其包含益生菌菌株(毒性標(biāo)志物)、所述益生菌菌株的最佳培養(yǎng)物質(zhì)和待測原料。

接著制備第二樣品(內(nèi)部參照)，其包括所述第一樣品中使用的相同益生菌菌株(毒性標(biāo)志物)，以及僅最佳培養(yǎng)基質(zhì)(無待測原料)。

如下所述，通過所述第一樣品和所述第二樣品的細(xì)菌板計數(shù)進(jìn)行所述確定。

所述第一樣品的細(xì)菌計數(shù)(板上數(shù)出的細(xì)胞數(shù))與所述第二樣品的細(xì)菌計數(shù)(板上數(shù)出的細(xì)胞數(shù))之比給出小于1的數(shù)值，如果將其表示為百分比，其提供與原料接觸時存活的細(xì)菌的計數(shù)，因此還表示在用作標(biāo)志物的益生菌中由所述原料引起的死亡率％。

第一實施方式涉及確定原料的毒性，所述原料例如通常的天然植物性提取物和/或調(diào)味劑和/或原料。

在該情況下，測試針對益生菌的毒性需要在實驗室里如上所述建立2個測試。

在實踐方面，制備第一樣品，其包含益生菌菌株(毒性標(biāo)志物)、所述益生菌菌株的最佳培養(yǎng)基質(zhì)和待測原料。

接著制備第二樣品(內(nèi)部參照)，其包括所述第一樣品中使用的相同益生菌菌株(毒性標(biāo)志物)，以及僅最佳培養(yǎng)基質(zhì)(無待測原料)。

如下所述，通過所述第一樣品和所述第二樣品的細(xì)菌板計數(shù)進(jìn)行所述確定。

優(yōu)選的是，所述第一和第二測試在相同的操作條件下平行地進(jìn)行。

所述第一樣品的細(xì)菌計數(shù)(板上數(shù)出的細(xì)胞數(shù))與所述第二樣品的細(xì)菌計數(shù)(板上數(shù)出的細(xì)胞數(shù))之比給出小于1的數(shù)值，如果將其表示為百分比，其提供與原料接觸時存活的細(xì)菌的計數(shù)，因此還表示在用作標(biāo)志物的益生菌中由所述原料引起的死亡率％。

在所述第一測試中進(jìn)行的細(xì)菌計數(shù)和在所述第二測試中進(jìn)行的細(xì)菌計數(shù)之間的差異提供細(xì)菌致死率的百分比，這提供了與所述原料相關(guān)的針對益生菌的毒性的指示。

通過非窮舉性實例，申請人測試了市場中存在的數(shù)種調(diào)味劑和提取物，例如檸檬和藍(lán)莓調(diào)味劑，其也用于制備成品。這些測試的目的在于驗證所述食物或原料(檸檬和藍(lán)莓調(diào)味劑)是否擁有針對益生菌的固有毒性。

出于該理由，使所述原料(檸檬和藍(lán)莓調(diào)味劑)在特定操作條件下與給定的益生乳酸菌(lactic bacteria)或雙歧桿菌接觸。

在本發(fā)明方法中用作毒性標(biāo)志物的益生菌菌株屬于選自由乳桿菌(lactobacilli)和雙歧桿菌組成的組的物種，優(yōu)選是益生菌性的。

優(yōu)選實施方式設(shè)想使用表1所列出的菌株中細(xì)菌菌株。

表1

對所述食物或原料(檸檬和藍(lán)莓調(diào)味劑)進(jìn)行的測試顯示了針對用作毒性標(biāo)志物的益生菌菌株的急性毒性。在實踐方面，測試了來自不同供應(yīng)商的兩種檸檬提取物(原料)和兩種藍(lán)莓提取物(原料)。可以驗證第一檸檬提取物和第二藍(lán)莓提取物引起針對所用益生菌菌株的急性毒性，分別為57％和58％死亡率，所述益生菌菌株具有6×10⁹CFU/g的起始理論載量。使用由Anidral Srl公司于2002年1月31日保藏的益生菌菌株嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)LA02LMG P-21381和由Anidral Srl公司于2002年1月31日保藏的益生菌菌株動物雙歧桿菌乳亞種(Bifidobacterium animalis subsp.Lactis)BS01LMG P-21384進(jìn)行該測試。

在這點上，申請人使用僅從果實(檸檬和藍(lán)莓)的果肉通過溫和擠壓獲得的調(diào)味劑代替市場上存在的藍(lán)莓和檸檬調(diào)味劑重復(fù)了上述測試。在實踐方面，在檸檬和藍(lán)莓兩種情況下，都將果皮事先與果肉分離，并且僅使后者在溫和條件下使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的設(shè)備和方法進(jìn)行機械提取。在該情況下，使用在溫和條件下從果肉的提取物獲得的提取物/原料，發(fā)現(xiàn)不存在針對益生菌的毒性；事實上，使用起始載量等于6.7×10⁹CFU/g的益生菌菌株，使用藍(lán)莓果汁獲得6.5×10⁹CFU/g，使用檸檬果汁獲得6.4×10⁹CFU/g，因此獲得了比之前情況好得多的值，并且毒性極低，死亡率接近零。

以與檸檬和藍(lán)莓提取物相同的方式測試了其他原料，如下所述。

申請人測試了市場上存在的數(shù)種成品，目的是確定針對益生菌的毒性程度，并且鑒定在所述成品使用的原料中哪些所用原料對毒性最具貢獻(xiàn)。

在優(yōu)選實施方式中，確定原料針對益生菌的毒性，原料例如是具有例如總共5種成分的成品的配方內(nèi)的提取物和/或調(diào)味劑。

在該情況下，毒性測試包括在實驗室中建立一定數(shù)量的測試，該數(shù)量等于成分的數(shù)量(在該示例性情況下存在5種成分)加上分析參照。

為了顯示本發(fā)明的潛力，申請人測試了在將用于成品(例如P1)制備中的蔓越莓提取物的一系列樣品。

確定了原料蔓越莓提取物(批次L1、批次L2，來自不同供應(yīng)商)的毒性，所述原料必須與成品(P1)內(nèi)的其他組分/成分一同存在。

在該情況下，建立兩種測試。在第一測試中，制備由益生菌菌株(例如LS01(用作毒性標(biāo)志物))組成的混合物。該第一測試表示內(nèi)部分析參照：Ref.1。預(yù)期的理論細(xì)菌計數(shù)等于25MLD/劑量(內(nèi)部參照)。

在第二測試中，制備了含有益生菌菌株LS01(用作毒性標(biāo)志物))與來自不同供應(yīng)商的所述成品中的第一蔓越莓提取物(L1和L2)的混合物。

在相同的操作條件下以與所述成品中存在的量相同的量平行地進(jìn)行所述第一和第二細(xì)菌計數(shù)。

隨后，確定所述第一測試(Ref.1)的真實細(xì)菌計數(shù)和所述第二測試的細(xì)菌計數(shù)。采用相同的操作條件進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)。

供應(yīng)商V：批次1(L1)和批次2(L2)–Var蔓越莓

供應(yīng)商V：批次1(L1)和批次2(L2)–Var蔓越莓

供應(yīng)商K：批次1(L1)和批次2(L2)–Kem蔓越莓

供應(yīng)商K：批次1(L1)和批次2(L2)–Kem蔓越莓

供應(yīng)商P：批次1(L1)和批次2(L2)–Pac蔓越莓

供應(yīng)商P：批次1(L1)和批次2(L2)–Pac蔓越莓

供應(yīng)商N：批次1(L1)和批次2(L2)–Nut蔓越莓

供應(yīng)商N：批次1(L1)和批次2(L2)–Nut蔓越莓

將各種原料(蔓越莓)供應(yīng)品(批次)基于其原花青素含量(至少1.5％(HPLC))引入用于毒性測試的混合物中，以確保該成分在成品P1中的濃度相同。

表2

使用表1中所示的編號為9、33、39、46、54、59、73、84、95、101、116、130、138、143、169和185的益生菌菌株也重復(fù)表2的測試，獲得的結(jié)果與表2中所示結(jié)果非常相似。

在所述第一測試(Ref.1)中進(jìn)行的細(xì)菌計數(shù)和在所述第二測試中進(jìn)行的細(xì)菌計數(shù)之間的差提供益生菌菌株LS01的死亡率百分比，其提供所述蔓越莓提取物針對所述菌株的毒性的指示。

如所述第一測試和在所述第二測試中所確定的獲自細(xì)菌計數(shù)的活細(xì)胞載量，使得可以確立所測試原料是否對在所述成品P1中存在的益生菌菌株LS01的細(xì)胞發(fā)揮毒性作用。

將在細(xì)菌計數(shù)方面相對于參照(Ref.1)的百分比減少表示為由進(jìn)行本發(fā)明的毒性測試的原料引起的死亡率％。

申請人進(jìn)一步將上述方法應(yīng)用至成品中存在的檸檬和藍(lán)莓提取物，獲得與以上使用蔓越莓相當(dāng)時的結(jié)果。

表2顯示某些常用于配制成品的提取物(例如蔓越莓提取物)會對成品賦予毒性并且因此也對使用該成品的個體的身體賦予毒性，但是同樣也適用于其它原料。

因此，利用本發(fā)明可以開發(fā)無毒或毒性極大減少的成品的配方，所述成品例如膳食補充劑或醫(yī)學(xué)裝置或藥物產(chǎn)品，因為可以鑒定所用原料是否賦予針對益生菌的毒性。

在本發(fā)明的背景下，相對于內(nèi)部參照的細(xì)菌載量的百分比減少[(測試樣品的細(xì)菌計數(shù))/(內(nèi)部參照的細(xì)菌計數(shù))]＝由原料引起的死亡率％，其為1％至5％表示無死亡率；大于5％至15％的值表示低死亡率，仍然可接受；大于15％至25％的值表示中等至高死亡率，而超過25％則面對急性死亡率。

本發(fā)明的方法例如在測試用在補充劑和醫(yī)學(xué)裝置(成品)的配方中的毒性賦形劑或原料(例如橙調(diào)味劑、紅花、黑胡蘿卜(black Carrot)、藍(lán)莓提取物等)的存在時具有有效應(yīng)用。

以下通過實例說明本發(fā)明的方法，并且因此不限制本發(fā)明的范圍。

在優(yōu)選實施方式中，在含有例如以下成分A、B、C(完全配方A+B+C)的成品的情況下，可以使用本發(fā)明的方法以確定作為整體(A+B+C)的成品是否發(fā)揮針對益生菌菌株的毒性。

在該情況下，針對益生菌的毒性的測試包括在實驗室里建立2個測試。

在實踐方面，制備第一樣品，其包含益生菌菌株(毒性標(biāo)志物)、所述益生菌菌株的最佳培養(yǎng)基質(zhì)和待測原料(在該情況下為配方A+B+C)。

接著制備第二樣品(內(nèi)部參照)，其包括所述第一樣品中使用的相同益生菌菌株(毒性標(biāo)志物)，以及僅最佳培養(yǎng)基質(zhì)(無待測原料)。

如下所述，通過所述第一樣品和所述第二樣品的細(xì)菌板計數(shù)進(jìn)行所述確定。

優(yōu)選的是，所述第一和第二測試在相同的操作條件下平行地進(jìn)行。

如果所述第一樣品的細(xì)菌計數(shù)(板上數(shù)出的細(xì)胞數(shù))與所述第二樣品的細(xì)菌計數(shù)(板上數(shù)出的細(xì)胞數(shù))之比給出小于1的數(shù)值，例如0.55(或55％)，這意味著與原料接觸后存活的細(xì)菌的計數(shù)是55％，因此，在用作標(biāo)志物的益生菌菌株中由A+B+C引起的死亡率％是45％。

確切地說，如果出現(xiàn)針對用作標(biāo)志物的益生菌菌株的毒性，則下一步將確定構(gòu)成成品(A+B+C)中的成分A、B和C中的哪一種發(fā)揮所檢測的毒性。

在該情況下，所述方法包括準(zhǔn)備如下所述的三個測試(測試1、測試2和測試3)。

例如，對原料A進(jìn)行測試1，該測試1包括制備以下樣品：

(i)制備第一樣品，其包含益生菌菌株(毒性標(biāo)志物)、所述益生菌菌株的最佳培養(yǎng)基質(zhì)和待測原料(在該情況下為A)。

(ii)接著制備第二樣品(內(nèi)部參照)，其包括所述第一樣品中使用的相同益生菌菌株(毒性標(biāo)志物)，以及僅最佳培養(yǎng)基質(zhì)(無待測原料)。

(iii)對所述第一樣品和所述第二樣品進(jìn)行細(xì)菌板計數(shù)。

(iv)確定死亡率百分比。

類似地，用相同方法準(zhǔn)備使用原料B的測試2和使用原料C的測試3。

以此方式，可以鑒定在配方A+B+C存在的成分A、B和C中哪一些是發(fā)揮針對益生菌菌株的毒性的成分。在相同的操作條件并且以在成品中指示出的濃度進(jìn)行毒性測試(連續(xù)法)。

對于板計數(shù)，采用下文作為測試方法的非限制性實例所描述的方法，該方法包括常規(guī)的微生物計數(shù)，首先使樣品再懸浮，在合適的稀釋劑中連續(xù)稀釋，在瓊脂化的培養(yǎng)基上鋪平板，并在最佳條件下溫育后進(jìn)行集落計數(shù)。測定出與參照樣品相當(dāng)?shù)陌逅劳雎实馁x形劑/原料被認(rèn)為是相符(毒性減少或無任何毒性)。

如下文所注解，對用于益生菌應(yīng)用的乳酸菌和雙歧桿菌進(jìn)行總的、區(qū)分性和/或選擇性(在瓊脂化培養(yǎng)基)的計數(shù)，所述乳酸菌和雙歧桿菌在待確定活的活力細(xì)胞濃度的樣品中單獨存在或以共混物存在。

配制培養(yǎng)基以確保屬于上述微生物組的所有各種益生菌物種的生長，并且必要時，通過添加選擇性試劑(通常為抗生素和/或糖)或區(qū)分性試劑(通常為pH和/或氧化還原顏色變化指示劑)。

該方法提供瓊脂化培養(yǎng)基LAPTg的應(yīng)用，所述的配方僅由存在的兩種不同的N源、作為碳源的糖和作為維生素B及生長因子來源的酵母提取物組成。不存在有機和無機鹽和具有選擇性作用的物質(zhì)使得所有的屬于乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的各個益生菌物種可以蓬勃生長。

通過對LAPTg瓊脂添加選擇性和/或區(qū)分性試劑，可以對存在于復(fù)合混合物中的益生菌進(jìn)行區(qū)分性計數(shù)。基于構(gòu)成混合物的菌株的特定基因型和表型特征，視情況選擇選擇性試劑(通常為抗生素和/或糖)或區(qū)分性試劑(通常為pH和/或氧化還原顏色變化指示劑)。

如果待分析樣品由兩種以上乳桿菌和雙歧桿菌的混合物組成，建議將LAPTg的選擇性計數(shù)與使用HHD培養(yǎng)基對組成混合物的菌株進(jìn)行的定量評估結(jié)合。更進(jìn)一步的細(xì)節(jié)參考以下科技論文：

-Molecular Cloning a Laboratory Manual(Sambrook,Fritsch,Maniatis)；

-Susceptibility of Lactobacillus spp.to antimicrobial agents.M.Danielsen A.Wind.2002；

-Antibiotic Susceptibility of Lactobacillus and Bifidobacterium species from Human Gastrointestinal tract,S.Delgrado A.B.Florez B.Mayo,2005；

-ISO 6887-1:2000；

-Preparation of LAPTg medium:FONT DE VALDEZ,G,and Coll.:Influence of the recovery medium on the viability of injured freeze-dried lactic acid bacteria Milchwissenschaft 40(9)518-520(1985)；

-UNI EN ISO 6887-1:2000“Buffered Peptone Water”；

-A differential medium for the enumeration of homofermentative and heterofermentative lactic acid bacteria.LC.McDonald R.F.McFeeters,M.A.Daeschel and HP Felming.Applied and Environmental Microbiology.1987年6月:1382-1384。

首字母縮寫：

-活的活力細(xì)胞的濃度＝能夠在培養(yǎng)基中生長并且形成不同集落的細(xì)胞數(shù)量/單

位(g或ml)(CFU/g或ml)

-CFU/g或ml＝集落形成單位，即活的活力細(xì)胞的濃度的度量單位

-MIC＝最小抑制濃度

該方法提供使用瓊脂化培養(yǎng)基LAPTg，配方僅由存在的兩種不同的N源、作為碳源的糖和作為維生素B及生長因子來源的酵母提取物組成。不存在有機和無機鹽和具有選擇性作用的物質(zhì)使得所有的屬于乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的各個益生菌物種可以蓬勃生長。通過對LAPTg瓊脂添加選擇性和/或區(qū)分性試劑，可以對存在于復(fù)合混合物中的益生菌進(jìn)行區(qū)分性計數(shù)?；跇?gòu)成混合物的菌株的特定基因型和表型特征，視情況選擇選擇性試劑(通常為抗生素和/或糖)或區(qū)分性試劑(通常為pH和/或氧化還原顏色變化指示劑)(參見8.2)。如果待分析樣品由兩種以上乳桿菌和雙歧桿菌的混合物組成，建議將LAPTg的選擇性計數(shù)輔以使用HHD培養(yǎng)基對組成混合物的菌株進(jìn)行的定量評估。

材料和試劑

LAPTg培養(yǎng)基，基礎(chǔ)培養(yǎng)基：

-細(xì)菌蛋白胨(動物蛋白的酶促水解物)15g

-胰蛋白胨(酪蛋白的胰酶水解物)10g

-酵母提取物10g

-Tween 80ml 1

-瓊脂g 15

-適量蒸餾水至900ml

注意：以上所示重量理解為具有±5％的精度t

將除瓊脂之外的成分溶于蒸餾水中。檢查pH并且必要時校正至6.55±0.05，然后添加瓊脂并在水浴中溶解。將培養(yǎng)基在尚溫?zé)釙r加入Bibby燒杯中，并在高壓釜中于121℃滅菌15分鐘，滅菌后在25℃±1的pH應(yīng)該是6.5±0.5。

完全培養(yǎng)基:

使用時，溶解(8.1)后，向基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加1體積的經(jīng)過濾滅菌的10％葡萄糖溶液，從而具有10g/L的葡萄糖終濃度。

HHD培養(yǎng)基:

最終pH＝6.90+0.10

乙醇、Minisart一次性使用無菌0.45μm注射式過濾器、用于重建樣品的稀釋劑：

液體細(xì)菌培養(yǎng)物的重建和連續(xù)10倍稀釋的制品-蛋白胨鹽水溶液

-細(xì)菌蛋白胨 1.0g

-氯化鈉(NaCl) 8.5g

-足量蒸餾水至 1000ml

具有游離形式益生菌(未微膠囊化)的無水(凍干)細(xì)菌培養(yǎng)物和成品的重建。

(凍干)細(xì)菌培養(yǎng)物未以劑量或單位制備

磷酸鹽緩沖液pH 6.8

袋劑(Sachet)、膠囊劑、丸劑、片劑、栓劑和瓶內(nèi)蓋(undercaps of bottles)：

磷酸鹽緩沖液pH 6.8

將組分溶于蒸餾水中，必要時加熱。檢查pH為6.8±0.10。將稀釋劑加入Bibby燒杯中，在高壓釜中于121℃滅菌15分鐘，在暗處于4℃至5℃貯存不多于1個月。

如果成品含有油和/或脂質(zhì)物質(zhì)，必須向pH6.8的緩沖液添加1％Tween 80(5.5.2.1)。

厭氧試劑盒(AnaeroGen-Oxoid):化學(xué)結(jié)合氧，產(chǎn)生CO₂；小的10ml無菌注射器也可購自藥房；5％_fin L-半胱氨酸HCl溶液：稱量5g L-半胱氨酸鹽酸鹽1-水合物(BDH370553)，用MQ水補足至100ml；然后在無菌離心管中用0.45μm過濾器過濾，并在+4℃±2貯存至多1年(該溶液必須添加至LAPTg培養(yǎng)基以獲得0.05％的終濃度)。

步驟

8.1 以對于要準(zhǔn)備的板的數(shù)量而言足夠的量(參見段落8.5.5的“注意”)將LAPTg培養(yǎng)基(5.1)溶解，考慮到對于每個板需要約12±1ml培養(yǎng)基。

如果計劃對所述樣品不僅在所述LAPTg培養(yǎng)基中還在補充有一種或多種選擇性試劑(N)的相同LAPTg培養(yǎng)基中的相同稀釋液進(jìn)行計數(shù)，考慮將(板的數(shù)量)乘以N。使培養(yǎng)基在恒溫水浴中于45℃±0.5靜置至少3小時。

8.2 選擇性試劑和對應(yīng)制品的列表

8.2.1 抗生素

·萬古霉素

貯存：1.5ml等分試樣，在+4℃貯存15天或在-20℃至多4個月。

·氯霉素

貯存:2ml等分試樣，在-20℃貯存至多4個月。

·克林霉素+環(huán)丙沙星

貯存：對于環(huán)丙沙星，1.5ml等分試樣在-20℃貯存至多6個月(克林霉素未確定(n.d.)).

·頭孢呋辛

貯存:1.5ml等分試樣，在-20℃至多2年。

·頭孢西丁

貯存:1.5ml等分試樣，在-20℃下至多2年。

·莫匹羅星

貯存:1.5ml等分試樣，在-20℃至多6個月

·環(huán)丙沙星(陽性選擇LP02與LF10的共混物)

貯存:1.5ml等分試樣，在-20℃至多6個月

8.2.2 其他選擇性條件

8.3 如果待分析樣品由兩種以上乳桿菌和雙歧桿菌的混合物組成，建議將LAPTg的選擇性計數(shù)輔以使用HHD培養(yǎng)基對組成混合物的菌株進(jìn)行的定量評估。將上述培養(yǎng)基溶解，并如LAPTg培養(yǎng)基所述一樣將其置于恒溫水浴中。然后將培養(yǎng)基以12±1ml的量分配在Petri板中，使其固化；

8.4 如果計劃使用一種或多種選擇性試劑，在無菌瓶中向溶解的LAPTg培養(yǎng)基的等分試樣(例如對于約8個板為100ml)以規(guī)定的終濃度添加用于區(qū)分組成樣品的菌株所需的抗生素溶液或其它選擇性試劑；

8.5 制備樣品的連續(xù)10倍稀釋液(ISO 6887-1:2000的章節(jié)Ia，9.2段)

8.5.1 使用無菌移液管將1ml的第一稀釋液(如果是液體則直接移取1ml樣品培養(yǎng)液)添加至含有9ml無菌稀釋液的試管中；

8.5.2 不要將移液管深入起始懸浮液超過1cm；

8.5.3 每次稀釋后更換移液管；

8.5.4 用機械振蕩器充分將稀釋液勻質(zhì)化，振搖試管3次，每次不少于5秒，以獲得稀釋液10^-2；

8.5.5 使用10^-2稀釋液重復(fù)這些步驟，并且進(jìn)一步稀釋直到獲得在板上培養(yǎng)時給出顯著集落數(shù)的微生物濃度；

注意：接種2個連續(xù)10倍稀釋液(例如10^-8、10^-9)應(yīng)該使得能夠看到兩個臨近稀釋液含有10～300個細(xì)胞數(shù)量。如果不清楚包含在樣品中的細(xì)胞數(shù)量，需要的是接種超過2個連續(xù)10倍稀釋液(例如10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10)，然后僅考慮產(chǎn)生包含10～300個集落數(shù)的那些。

8.6 將從判斷為合適(8.5.5)的樣品稀釋液抽取的1ml分配至Petri板上；

8.7 以12±1ml的量在第一系列的板上添加培養(yǎng)基LAPTg，并且在第二系列上添加補充有選擇性試劑的LAPTg；

注意：樣品重建和系列稀釋液與Petri板上的培養(yǎng)基接觸(8.6)的時刻之間經(jīng)過的時間必須不超過30分鐘。

8.8 首先利用旋轉(zhuǎn)移動、然后水平和垂直平移來均勻地混合培養(yǎng)基和樣品；

8.9 允許進(jìn)行15至20分鐘固化；

8.10 在由兩種以上乳桿菌和雙歧桿菌菌株的混合物組成的樣品和/或?qū)ζ渫扑]使用HHD培養(yǎng)基的情況下，添加100μl合適稀釋液至HHD(8.3)的分型板(ready plate)，并用藥匙均勻地分配樣品；

8.11 在厭氧條件(Gas-Pak+厭氧試劑盒)下將板翻轉(zhuǎn)在37±1℃溫育72小時。關(guān)于如何使用厭氧系統(tǒng)，遵循包含在試劑盒中的說明書。

結(jié)果的計算：通過在板觀察器的透鏡下觀察集落而驗證集落的存在，并且專門對含有10～300個集落數(shù)的板進(jìn)行計數(shù)。結(jié)果表示為CFU，即集落形成單位。使用以下公式表達(dá)結(jié)果：

$\frac{\mathrm{\Σ}C}{(n_1+0,{\ln }_2)d}$

其中：

ΣC是對所有板計得的集落的總和

n₁是第一稀釋度下計數(shù)的板的數(shù)量

n₂是第二稀釋度下計數(shù)的板的數(shù)量

d是從其獲得第一計數(shù)的稀釋度

實施例:

10^-8稀釋度的板:250

10^-9稀釋度的板:23

結(jié)果

$\frac{250+23}{(1+0.1){10}^{-1}}={24810}^{-8}CFU/g$

使獲得的結(jié)果四舍五入為兩位有效數(shù)字。在液體樣品的情況下所示實例的結(jié)果會是250 10^–8CFU/g或ml(具體結(jié)果的表達(dá)基于特定類型)。在HHD中展開的樣品的情形中，目視檢查培養(yǎng)的集落中的不同形態(tài)，從而鑒定出共混物中存在的乳桿菌和雙歧桿菌的各種菌株。

進(jìn)行計數(shù)并檢查板培養(yǎng)的集落(步驟9)后，將得到：在單菌株樣品的情況下，如此從具有LAPTg的板獲得的計數(shù)表示組成樣品的益生菌載量的總載量。

在由兩種以上乳桿菌和雙歧桿菌菌株組成的樣品的情況下：

a)如此從用LAPTg培養(yǎng)基制備的一系列板獲得的計數(shù)表示進(jìn)行分析的樣品中的益生菌的總載量；

b)用補充有選擇性試劑的LAPTg培養(yǎng)基制備的一系列板獲得的計數(shù)表示能夠在添加至培養(yǎng)基作為選擇性試劑的特定物質(zhì)的存在下進(jìn)行復(fù)制的菌株的載量；

c)從用選擇性培養(yǎng)基獲得的個體益生菌的計數(shù)，可以通過與LAPTg中的總計數(shù)(a)項)之差推斷出在選擇性試劑的存在下沒有發(fā)育的其余菌株的計數(shù)；

d)在HHD培養(yǎng)基中接種使得可以目視區(qū)分共混物形式的樣品中存在的不同菌株，并且在LAPTg培養(yǎng)基中選擇性計數(shù)。

在使用表1中所示的益生菌菌株(編號17、22、41、60、74、98、121、145、174)作為毒性標(biāo)志物的多次測試中，申請人用本發(fā)明方法測試了以下原料。

實驗數(shù)據(jù)顯示，在許多情況下意想不到地發(fā)現(xiàn)毒性總是以不同水平存在，且具有實質(zhì)性的死亡率％。

蘆薈(Aloe)測試：發(fā)現(xiàn)死亡率等于5％。

檸檬酸測試：發(fā)現(xiàn)死亡率等于2％。

阿拉伯半乳聚糖測試：發(fā)現(xiàn)死亡率等于6％。

樹莓(Raspberry)調(diào)味劑測試：發(fā)現(xiàn)死亡率等于2％。

樹莓調(diào)味劑測試：發(fā)現(xiàn)死亡率等于26％。

藍(lán)莓測試：發(fā)現(xiàn)死亡率等于5％。

二氧化硅測試：發(fā)現(xiàn)死亡率等于50％。

二氧化硅測試：發(fā)現(xiàn)死亡率等于28％。

二氧化硅測試：發(fā)現(xiàn)死亡率等于23％。

塔拉膠(Tara gum)測試：發(fā)現(xiàn)死亡率等于14％。

維生素B1、B2和B6測試：發(fā)現(xiàn)死亡率等于33％。

沸石測試：發(fā)現(xiàn)死亡率等于2％。