本發(fā)明總體上涉及用于調(diào)節(jié)由細(xì)胞培養(yǎng)物(包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)物，諸如CHO細(xì)胞培養(yǎng)物)產(chǎn)生的重組蛋白的一個(gè)或多個(gè)特性的方法。相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2014年1月29日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/933,192的權(quán)益，所述申請(qǐng)以引用的方式并入本文。發(fā)明背景糖基化是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中常見(jiàn)的翻譯后修飾；正常人免疫球蛋白和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中產(chǎn)生的治療性單克隆抗體(mAb)都是糖蛋白。治療性mAb的藥代動(dòng)力學(xué)特性和效應(yīng)功能都可受糖基化影響。末端糖諸如巖藻糖和半乳糖可影響抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC；Wright，A.和S.L.Morrison，TrendsBiotechnol(1997)15：26-32)。高甘露聚糖可增加某些mAb的血清清除率，因此潛在地影響了功效(Goetze等，(2011)Glycobiology21：949-59)。另選地，高甘露糖糖型可增加FcγIII受體的抗體親和性，因此增加了某些抗體的ADCC活性(Yu等(2012)MAb4：475-87)。因此，對(duì)于每個(gè)重組mAb，需維持某些最好地支持mAb治療潛力的糖基化特性。用于在細(xì)胞培養(yǎng)中操控蛋白質(zhì)的高甘露糖糖型含量的方法包括改變培養(yǎng)基組成、重量摩爾滲透壓濃度、pH、溫度等(Yu等，同上，Pacis等，同上，CheeFurngWong等(2005)BiotechnolBioeng89：164-177；Ahn等(2008)BiotechnolBioeng101：1234-44)。這些方法的有效性對(duì)于細(xì)胞系、分子類型和培養(yǎng)基環(huán)境是特異的，并且通常通過(guò)試錯(cuò)法來(lái)獲得。另選地，這些方法可能也會(huì)改變抗體生產(chǎn)率、細(xì)胞培養(yǎng)物行為和其他抗體質(zhì)量屬性。仍存在鑒定可在沒(méi)有降低CHO生產(chǎn)培養(yǎng)物性能和抗體產(chǎn)率的情況下調(diào)控mAb上的高甘露糖糖型(特別是甘露糖5)的機(jī)制的需要。這種方法將有益于治療性蛋白質(zhì)的工藝過(guò)程開(kāi)發(fā)。本發(fā)明提供一種通過(guò)操控涉及N-糖基化途徑的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平來(lái)調(diào)控高甘露糖糖型含量的方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供一種用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程期間調(diào)控重組蛋白的高甘露糖糖型含量的方法，其包括轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以過(guò)表達(dá)涉及N-糖基化途徑的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供一種用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程期間減少重組蛋白的高甘露糖糖型含量的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)是N-乙酰基-葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶-1(由Mgat1編碼)；在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)是N-乙?；?葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶-2(由Mgat2編碼)。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)是UDP-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(由Slc35a2編碼)。本發(fā)明的附加實(shí)施方案包括轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以過(guò)表達(dá)兩種或更多種涉及N-糖基化途徑的蛋白質(zhì)，包括上述蛋白質(zhì)的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，用Mgat1和Mgat2轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；在其他實(shí)施方案中，用Mgat1和Slc35a2、用Mgat2和Slc35a2或者用Mgat1、Mgat2和Slc35a2轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供先前已經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染以表達(dá)重組蛋白的宿主細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組蛋白是包含抗體Fc區(qū)的蛋白質(zhì)。再一個(gè)實(shí)施方案包括表達(dá)選自由Fc融合蛋白、抗體、免疫球蛋白和肽體組成的組的重組蛋白的宿主細(xì)胞。在再一個(gè)實(shí)施方案中，首先轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞以過(guò)表達(dá)Mgat1、Mgat2和Slc35a2中的一種或多種，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)染以表達(dá)重組蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組蛋白是包含抗體Fc區(qū)的蛋白質(zhì)。再一個(gè)實(shí)施方案包括選自由Fc融合蛋白、抗體、免疫球蛋白和肽體組成的組的重組蛋白的表達(dá)。任選地，本發(fā)明還包括收獲由細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的重組蛋白的步驟。在再一個(gè)實(shí)施方案中，將宿主細(xì)胞產(chǎn)生的重組蛋白純化并配制成藥學(xué)上可接受的制劑。在再一個(gè)實(shí)施方案中，重組蛋白的高甘露糖糖型含量與由細(xì)胞未通過(guò)轉(zhuǎn)染以過(guò)表達(dá)涉及N-連接糖基化的蛋白質(zhì)來(lái)進(jìn)行操控的培養(yǎng)物產(chǎn)生的重組蛋白相比是減少的。在一個(gè)實(shí)施方案中，高甘露聚糖物質(zhì)為甘露糖5(Man5)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，高甘露聚糖物質(zhì)為甘露糖6(Man6)、甘露糖7(Man7)、甘露糖8(包括甘露糖8a和8b；Man8a和8b或甘露糖9(Man9)。在再一個(gè)實(shí)施方案中，高甘露聚糖物質(zhì)包括Man5、Man6、Man7、Man8a、Man8b和/或Man9的混合物。本發(fā)明提供重組蛋白高甘露糖糖型含量減少的再一個(gè)實(shí)施方案。在再一個(gè)實(shí)施方案中，重組蛋白的高甘露糖糖型含量小于或等于5％。在另一個(gè)實(shí)施方案中，重組蛋白的高甘露糖糖型含量小于或等于10％。在再一個(gè)實(shí)施方案中，由本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的重組蛋白的高甘露糖糖型含量小于6％、7％、8％、9％或10％。在又一個(gè)實(shí)施方案中，由本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的重組蛋白的高甘露糖糖型含量小于0.5％、1％、2％、3％、4％或5％。再一個(gè)實(shí)施方案包括小于12％、小于15％、小于20％或小于30％、40％或50％的高甘露糖糖型含量。附加的實(shí)施方案包括使用分批或補(bǔ)料分批培養(yǎng)物和使用灌流培養(yǎng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用交替式切向流(ATF)灌流所述培養(yǎng)物。與本文描述的本發(fā)明的任何實(shí)施方案相結(jié)合，根據(jù)需要還可向培養(yǎng)容器中添加消泡劑?？蛇x地或此外，使用1M碳酸鈉或另一種適合的堿來(lái)使pH維持在所需設(shè)定值。如本文所述，在本發(fā)明的一個(gè)方面，可通過(guò)灌流維持細(xì)胞培養(yǎng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，灌流開(kāi)始于細(xì)胞培養(yǎng)的第1天或大約第1天至第9天或大約第9天。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，灌流開(kāi)始于細(xì)胞培養(yǎng)的第3天或大約第3天至第7天或大約第7天。在一個(gè)實(shí)施方案中，灌流在細(xì)胞已達(dá)到生產(chǎn)期時(shí)開(kāi)始。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，灌流通過(guò)交替式切向流來(lái)完成。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，通過(guò)交替式切向流使用超濾器或微濾器來(lái)完成灌流。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中提供了連續(xù)灌流；在又一個(gè)實(shí)施方案中，灌流速率是恒定的。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中提供了以每天小于或等于1.0個(gè)工作容積的速率進(jìn)行的灌流。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，在細(xì)胞培養(yǎng)期間以在生產(chǎn)期期間從每天0.25個(gè)工作容積增加至每天1.0個(gè)工作容積的速率進(jìn)行灌流。在另一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，在細(xì)胞培養(yǎng)的第9天至第11天以達(dá)到每天1.0個(gè)工作容積的速率進(jìn)行灌流。在另一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，在細(xì)胞培養(yǎng)的第10天以達(dá)到每天1.0個(gè)工作容積的速率進(jìn)行灌流。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物在培養(yǎng)的第3天-第7天之前接受灌注細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)料。在本發(fā)明的又一方面，通過(guò)分批補(bǔ)料來(lái)維持細(xì)胞培養(yǎng)物。在補(bǔ)料分批培養(yǎng)的一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)物在生產(chǎn)期間補(bǔ)料三次。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)物在第二天與第四天之間的一天、在第5天與第7天之間的一天以及在第8天與第10天之間的一天補(bǔ)料。另一個(gè)實(shí)施方案提供了所述培養(yǎng)物在生產(chǎn)期間補(bǔ)料四次的補(bǔ)料分批法。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)物在第二天與第四天之間的一天、在第5天與第6天之間的一天、在第7天與第8天之間的一天以及在第8天與第10天或更遲之間的一天補(bǔ)料。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物通過(guò)用無(wú)血清培養(yǎng)基中的至少0.5x106個(gè)細(xì)胞/mL至3.0x106個(gè)細(xì)胞/mL接種生物反應(yīng)器來(lái)建立。在一個(gè)可選或再一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物通過(guò)用無(wú)血清培養(yǎng)基中的至少0.5x106個(gè)細(xì)胞/mL至1.5x106個(gè)細(xì)胞/mL接種生物反應(yīng)器來(lái)建立。本發(fā)明還可包括培養(yǎng)期間的溫度變化。在一個(gè)實(shí)施方案中，溫度變化為36℃至31℃。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還包括36℃至33℃的溫度變化。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，溫度變化發(fā)生在生長(zhǎng)期與生產(chǎn)期之間的過(guò)渡處。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，溫度變化在生產(chǎn)期期間發(fā)生。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還包括通過(guò)L-天冬酰胺饑餓隨后用具有5mM或更少的L-天冬酰胺濃度的無(wú)血清灌流培養(yǎng)基灌流來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還包括通過(guò)用具有5mM或更少的L-天冬酰胺濃度的無(wú)血清灌流培養(yǎng)基灌流來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，無(wú)血清灌流培養(yǎng)基中L-天冬酰胺的濃度小于或等于5mM。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，無(wú)血清灌流培養(yǎng)基中L-天冬酰胺的濃度小于或等于4.0mM。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，無(wú)血清灌流培養(yǎng)基中L-天冬酰胺的濃度小于或等于3.0mM。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，無(wú)血清灌流培養(yǎng)基中L-天冬酰胺的濃度小于或等于2.0mM。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，無(wú)血清灌流培養(yǎng)基中L-天冬酰胺的濃度小于或等于1.0mM。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，無(wú)血清灌流培養(yǎng)基中L-天冬酰胺的濃度為0mM。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，在L-天冬酰胺饑餓之前或期間監(jiān)控細(xì)胞培養(yǎng)基的L-天冬酰胺濃度。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在生產(chǎn)期期間細(xì)胞壓積小于或等于35％。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞壓積小于或等于35％。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞壓積小于或等于30％。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，在小于或等于35％的細(xì)胞壓積時(shí)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物的活細(xì)胞密度為10x106個(gè)活細(xì)胞/ml至80x106個(gè)活細(xì)胞/ml。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物的活細(xì)胞密度為20x106個(gè)活細(xì)胞/ml至30x106個(gè)活細(xì)胞/ml。在又一個(gè)實(shí)施方案中，生物反應(yīng)器的容量為至少500L。在又一個(gè)實(shí)施方案中，生物反應(yīng)器的容量為至少500L至2000L。在又一個(gè)實(shí)施方案中，生物反應(yīng)器的容量為至少1000L至2000L。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。在又一個(gè)實(shí)施方案中，重組蛋白選自由人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、重組融合蛋白或細(xì)胞因子組成的組。附圖簡(jiǎn)述圖1展示在用于實(shí)施例2中第一組補(bǔ)料分批培養(yǎng)物的細(xì)胞系的傳代期間倍增時(shí)間的克隆可變性。在這個(gè)實(shí)施例中，使來(lái)自表達(dá)MAbB的細(xì)胞系的細(xì)胞轉(zhuǎn)化以過(guò)表達(dá)Mgat1、Mgat2和/或Slc35A2。M1M2表示過(guò)表達(dá)Mgat1和Mgat2(由實(shí)心圓代表的個(gè)別克隆)的細(xì)胞系；M1M2S表示過(guò)表達(dá)Mgat1、Mgat2和Slc35a2(由空心三角形代表的個(gè)別克隆)的細(xì)胞系；并且S表示過(guò)表達(dá)Slc35A2(由實(shí)心正方形代表的個(gè)別克隆)的細(xì)胞系。用空載體轉(zhuǎn)化對(duì)照細(xì)胞(由空心正方形代表的個(gè)別克隆)。中央方框涵蓋第一四分位數(shù)(Q1)至第三四分位數(shù)(Q3)，并且方框的高度為四分位數(shù)間距(IQR)，方框內(nèi)的條帶是中值，如果沒(méi)有值大于Q3+1.5IQR，則上線(topwhisker)從Q3延伸至低于Q3+1.5IQR的最大值或極大值。如果沒(méi)有值小于Q1-1.5IQR，則下線(bottomwhisker)從Q1延伸至高于Q1-1.5IQR的最小值或極小值。圖2展示在用于實(shí)施例2中第二組補(bǔ)料分批細(xì)胞的細(xì)胞系的傳代期間倍增時(shí)間的克隆可變性。在這個(gè)實(shí)施例中，使來(lái)自表達(dá)MAbB的細(xì)胞系的細(xì)胞轉(zhuǎn)化以過(guò)表達(dá)Mgat1、Mgat2和/或Slc35A2。M1M2表示過(guò)表達(dá)Mgat1和Mgat2的細(xì)胞系；M1M2S表示過(guò)表達(dá)Mgat1、Mgat2和Slc35a2的細(xì)胞系；并且S表示過(guò)表達(dá)Slc35A2的細(xì)胞系。用空載體轉(zhuǎn)化對(duì)照細(xì)胞。如對(duì)圖1所描述的，表示個(gè)別克隆；各方框的參數(shù)如對(duì)圖1所描述的一樣。圖3呈現(xiàn)與實(shí)施例2描述的第二補(bǔ)料分批實(shí)驗(yàn)第10天的對(duì)照相比，就活細(xì)胞密度而言顯示的生長(zhǎng)對(duì)于所有過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系(M1M2、M1M2S和S)是相似的。各方框中的個(gè)別值再次說(shuō)明了觀察到的克隆可變性。如對(duì)圖1所描述的，表示個(gè)別克隆；各方框的參數(shù)如對(duì)圖1所描述的一樣。圖4呈現(xiàn)在實(shí)施例2描述的第二補(bǔ)料分批實(shí)驗(yàn)期間產(chǎn)生的抗體的效價(jià)的克隆可變性比較。如對(duì)圖1所描述的，表示個(gè)別克?。桓鞣娇虻膮?shù)如對(duì)圖1所描述的一樣。圖5呈現(xiàn)在實(shí)施例2描述的第二補(bǔ)料分批實(shí)驗(yàn)期間產(chǎn)生的抗體的比產(chǎn)率的克隆可變性。如對(duì)圖1所描述的，表示個(gè)別克??；各方框的參數(shù)如對(duì)圖1所描述的一樣。圖6提供在實(shí)施例2描述的第二補(bǔ)料分批實(shí)驗(yàn)期間產(chǎn)生的抗體的HM百分比的克隆可變性指示。如對(duì)圖1所描述的，表示個(gè)別克??；各方框的參數(shù)如對(duì)圖1所描述的一樣。發(fā)明詳述雖然在本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ)在本領(lǐng)域中是標(biāo)準(zhǔn)的，但是本文提供了某些術(shù)語(yǔ)的定義以確保權(quán)利要求意思的清楚和明確。單位、前綴和符號(hào)可以他們的SI(國(guó)際單位制)接受的形式來(lái)表示。本文列舉的數(shù)值范圍包括界定了范圍的數(shù)字，并且包括并支持所界定的范圍內(nèi)的每個(gè)整數(shù)。除非另外指示，否則本文描述的方法和技術(shù)一般根據(jù)本領(lǐng)域中所熟知且如在整篇本說(shuō)明書中所引用并論述的各種一般參考文獻(xiàn)和更特定參考文獻(xiàn)中所述的常規(guī)方法來(lái)進(jìn)行。參見(jiàn)，例如，Sambrook等MolecularCloning：ALaboratoryManual，第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.(2001)和Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingAssociates(1992)以及Harlow和LaneAntibodies：ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.(1990)。公開(kāi)的方法適用于在攪拌釜反應(yīng)器(包括傳統(tǒng)分批細(xì)胞培養(yǎng)物和補(bǔ)料分批細(xì)胞培養(yǎng)物，其可能但不必包括自旋濾器)、灌流系統(tǒng)(包括交替式切向流(“ATF”)培養(yǎng)物、聲學(xué)(acoustic)灌流系統(tǒng)、深度濾器灌流系統(tǒng)及其他系統(tǒng))、中空纖維生物反應(yīng)器(HFB，其在一些情況下可用于灌流工藝)以及各種其他細(xì)胞培養(yǎng)方法中生長(zhǎng)的貼壁培養(yǎng)物或懸浮培養(yǎng)物(參見(jiàn)，例如，以引用的方式整體并入本文的Tao等，(2003)Biotechnol.Bioeng.82：751-65；Kuystermans和Al-Rubeai，(2011)“BioreactorSystemsforProducingAntibodyfromMammalianCells”inAntibodyExpressionandProduction，CellEngineering7：25-52，Al-Rubeai(ed)Springer；Catapano等，(2009)“BioreactorDesignandScale-Up”inCellandTissueReactionEngineering：PrinciplesandPractice，Eibl等(編)Springer-Verlag)。本申請(qǐng)中引用的所有文件或文件的部分，包括但不限于專利、專利申請(qǐng)、文章、書籍和論文，均特此明確地以引用的方式并入。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中描述的可與本發(fā)明的其他實(shí)施方案組合。定義如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“一個(gè)(a)”和“一種(an)”意指一個(gè)(種)或多個(gè)(種)，除非另外確切地指出。此外，除非另外為上下文所需，否則單數(shù)術(shù)語(yǔ)將包括復(fù)數(shù)，并且復(fù)數(shù)術(shù)語(yǔ)將包括單數(shù)。通常，與本文所述的細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)和蛋白質(zhì)及核酸化學(xué)以及雜交關(guān)聯(lián)使用的命名以及細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)和蛋白質(zhì)及核酸化學(xué)以及雜交的技術(shù)是本領(lǐng)域中熟知和常用的那些命名和技術(shù)。本公開(kāi)提供調(diào)節(jié)表達(dá)“目標(biāo)蛋白”的細(xì)胞培養(yǎng)物的特性的方法；“目標(biāo)蛋白”包括天然存在的蛋白質(zhì)、重組蛋白和改造的蛋白質(zhì)(例如，不存在于自然中且已由人類設(shè)計(jì)和/或創(chuàng)造的蛋白質(zhì))。目標(biāo)蛋白可為但不必為已知或疑似是治療學(xué)上相關(guān)的蛋白質(zhì)。目標(biāo)蛋白的具體實(shí)例包括抗原結(jié)合蛋白(如本文所描述或定義的)、肽體(即，包含直接或間接與其他分子諸如抗體的Fc結(jié)構(gòu)域融合的肽，其中肽部分特異性地與所需靶標(biāo)結(jié)合；例如，如以引用的方式整體并入本文的美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)US2006/0140934所述的，所述肽可與Fc區(qū)融合或者嵌入Fc-環(huán)或修飾的Fc分子中)、融合蛋白(例如，F(xiàn)c融合蛋白，其中Fc片段與蛋白質(zhì)或肽(包括肽體)融合)、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、激素和其他天然存在的分泌蛋白以及天然存在的蛋白質(zhì)的突變形式。術(shù)語(yǔ)“抗原結(jié)合蛋白”被以其廣義使用并且意指包含與抗原或靶標(biāo)結(jié)合的一部分并且任選地包含允許抗原結(jié)合部分采用促進(jìn)抗原結(jié)合蛋白與抗原結(jié)合的構(gòu)型的構(gòu)架或框架部分的蛋白質(zhì)?？乖Y(jié)合蛋白的實(shí)例包括人抗體、人源化抗體；嵌合抗體；重組抗體；單鏈抗體；雙功能抗體；三功能抗體；四功能抗體；Fab片段；F(ab’)2片段；IgD抗體；IgE抗體；IgM抗體；IgG1抗體；IgG2抗體；IgG3抗體；或IgG4抗體以及其片段?？乖Y(jié)合蛋白可以包括，例如具有移植的CDR或CDR衍生物的替代蛋白構(gòu)架或人工構(gòu)架。此類構(gòu)架包括，但不限于：抗體來(lái)源的構(gòu)架，其包含被引入以便例如使抗原結(jié)合蛋白的三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的突變；以及完全合成的構(gòu)架，其包含例如生物相容性聚合物。參見(jiàn)，例如，Korndorfer等，2003，Proteins：Structure，F(xiàn)unction，andBioinformatics，53(1)：121-129(2003)；Roque等，Biotechnol.Prog.20：639-654(2004)。此外，可使用肽抗體模擬物(“PAM”)，也可使用基于抗體模擬物的構(gòu)架，所述抗體模擬物利用纖連蛋白組分作為構(gòu)架?？乖Y(jié)合蛋白可以具有例如天然存在的免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)?！懊庖咔虻鞍住笔撬木垠w分子。在天然存在的免疫球蛋白中，每個(gè)四聚體主要由兩個(gè)相同的多肽鏈對(duì)組成，每對(duì)具有一個(gè)“輕”鏈(約25kDa)和一個(gè)“重”鏈(約50kDa-70kDa)。每條鏈的氨基端部分包括主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的具有約100至110個(gè)或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)。每條鏈的羧基端部分限定了主要負(fù)責(zé)效應(yīng)功能的恒定區(qū)。人輕鏈被分類為κ輕鏈和λ輕鏈。重鏈被分類為μ、δ、γ、α或ε，并且將抗體的同種型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA以及IgE。天然存在的免疫球蛋白鏈展現(xiàn)出由三個(gè)高變區(qū)連接的相對(duì)保守的框架區(qū)(FR)的相同通用結(jié)構(gòu)，所述高變區(qū)又稱為互補(bǔ)決定區(qū)或CDR。從N端至C端，輕鏈和重鏈均包含結(jié)構(gòu)域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3以及FR4?？筛鶕?jù)Kabat等inSequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，USDept.ofHealthandHumanServices，PHS，NIH，NIH出版號(hào)91-3242，(1991)的定義來(lái)進(jìn)行每個(gè)結(jié)構(gòu)域的氨基酸分配。按照要求，也可根據(jù)另選命名方案諸如Chothia的命名方案(參見(jiàn)，Chothia和Lesk，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等，(1989)Nature342：878-883或者Honegger和Pluckthun，(2001)J.Mol.Biol.309：657-670)重新定義CDR。在本公開(kāi)的上下文中，當(dāng)離解數(shù)(KD)≤10-8M時(shí)，稱抗原結(jié)合蛋白“特異性地結(jié)合”或“選擇性地結(jié)合”其靶標(biāo)抗原。當(dāng)KD≤5x10-9M時(shí)，抗體以“高親和性”特異性地結(jié)合抗原，并且當(dāng)KD≤5x10-10M時(shí)，抗體以“極高親和性”特異性地結(jié)合抗原。除非另外說(shuō)明，否則術(shù)語(yǔ)“抗體”包括對(duì)任何同種型或亞類的糖基化的和非糖基化的免疫球蛋白或與完整抗體競(jìng)爭(zhēng)以特異性結(jié)合的其抗原結(jié)合區(qū)的提及。此外，除非另外說(shuō)明，否則術(shù)語(yǔ)“抗體”是指完整免疫球蛋白或與完整抗體競(jìng)爭(zhēng)以特異性結(jié)合的其抗原結(jié)合部分?？乖Y(jié)合部分可以通過(guò)重組DNA技術(shù)或通過(guò)完整抗體的酶促裂解或化學(xué)裂解來(lái)產(chǎn)生，并且可形成目標(biāo)蛋白的元件?？乖Y(jié)合部分尤其包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)、包括互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的片段、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體以及含有足以賦予與多肽的特異性抗原結(jié)合的至少一部分免疫球蛋白的多肽。Fab片段是具有VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域的單價(jià)片段；F(ab’)2是具有兩個(gè)由鉸鏈區(qū)二硫鍵連接的Fab片段的二價(jià)片段；Fd片段具有VH和CH1結(jié)構(gòu)域；Fv片段具有抗體的單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域；并且dAb片段具有VH結(jié)構(gòu)域、VL結(jié)構(gòu)域或者VH或VL結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合片段(美國(guó)專利號(hào)6,846,634、6,696,245、美國(guó)申請(qǐng)公布號(hào)05/0202512、04/0202995、04/0038291、04/0009507、03/0039958，Ward等，(1989)Nature341：544-546)。單鏈抗體(scFv)是VL區(qū)和VH區(qū)通過(guò)接頭(例如，具有氨基酸殘基的合成序列)連接以形成連續(xù)的蛋白質(zhì)鏈的抗體，其中接頭足夠長(zhǎng)以允許蛋白質(zhì)鏈在其自身上向后折疊并形成單價(jià)抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見(jiàn)，例如，Bird等，Science242：423-26(1988)以及Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-83)。雙功能抗體是包含兩個(gè)多肽鏈的二價(jià)抗體，其中每個(gè)多肽鏈包含通過(guò)接頭連接的VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域，所述接頭太短以致不能允許同一鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間成對(duì)，由此允許每個(gè)結(jié)構(gòu)域與另一個(gè)多肽鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域成對(duì)(參見(jiàn)，例如，Holliger等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-48；以及Poljak等，(1994)Structure2：1121-23)。如果雙功能抗體的兩個(gè)多肽鏈?zhǔn)窍嗤?，那么由它們成?duì)而產(chǎn)生的雙功能抗體將具有兩個(gè)相同的抗原結(jié)合位點(diǎn)。具有不同序列的多肽鏈可以周來(lái)制造具有兩個(gè)不同抗原結(jié)合位點(diǎn)的雙功能抗體。類似地，三功能抗體和四功能抗體是分別包含三個(gè)和四個(gè)多肽鏈并且分別形成三個(gè)和四個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體，所述抗原結(jié)合位點(diǎn)可以是相同的或不同的?？蓪⒁粋€(gè)或多個(gè)CDR共價(jià)地或非共價(jià)地并入到分子中以使所述分子成為抗原結(jié)合蛋白。抗原結(jié)合蛋白可以并入一個(gè)或多個(gè)CDR作為更大的多肽鏈的部分，可以使一個(gè)或多個(gè)CDR與另一個(gè)多肽鏈共價(jià)地連接，或可以非共價(jià)地并入一個(gè)或多個(gè)CDR。CDR容許抗原結(jié)合蛋白特異性地與特定的目標(biāo)抗原結(jié)合?？乖Y(jié)合蛋白可以具有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。如果存在多于一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，則結(jié)合位點(diǎn)可以彼此相同或可以不同。例如，天然存在的人免疫球蛋白通常具有兩個(gè)相同的結(jié)合位點(diǎn)，而“雙特異性”或“雙功能性”抗體具有兩個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)。為了清楚的目的，并且如本文所述，應(yīng)當(dāng)指出抗原結(jié)合蛋白可但不必為人源的(例如，人抗體)，并且在一些情況下將包括非人蛋白例如大鼠蛋白或小鼠蛋白，并且在其他情況下，抗原結(jié)合蛋白可包括人蛋白和非人蛋白的雜交種(例如，人源化抗體)。目標(biāo)蛋白可包括人抗體。術(shù)語(yǔ)“人抗體”包括具有一個(gè)或多個(gè)源自人免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的所有抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所有的可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域均源自人免疫球蛋白序列(完全人抗體)。此類抗體可以各種方式(包括通過(guò)與小鼠的目標(biāo)抗原的免疫作用)來(lái)制備，所述小鼠，諸如源自UltiMabTM或系統(tǒng)的小鼠，被遺傳修飾以表達(dá)源自人重鏈編碼基因和/或輕鏈編碼基因的抗體。還可采用基于噬菌體的方法。另選地，目標(biāo)蛋白可包括人源化抗體?！叭嗽椿贵w”具有因一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、缺失和/或添加而與源自非人物種的抗體的序列不同的序列，這樣使得與非人物種抗體相比，當(dāng)向人類受試者施用時(shí)人源化抗體不太可能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和/或誘導(dǎo)不太嚴(yán)重的免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，非人物種抗體的重鏈和/或輕鏈的框架結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域中的某些氨基酸被突變以產(chǎn)生人源化抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使來(lái)自人抗體的一個(gè)或多個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域與非人物種的一個(gè)或多個(gè)可變結(jié)構(gòu)域融合。如何制得人源化抗體的實(shí)例可見(jiàn)于美國(guó)專利號(hào)6,054,297、5,886,152和5,877,293中。如本文所用，“Fc”區(qū)包含兩個(gè)重鏈片段，所述重鏈片段包含抗體的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。兩個(gè)重鏈片段通過(guò)兩個(gè)或更多個(gè)二硫鍵且通過(guò)CH3結(jié)構(gòu)域的疏水性相互作用結(jié)合在一起。包含F(xiàn)c區(qū)的目標(biāo)蛋白(包括抗原結(jié)合蛋白和Fc融合蛋白)形成了本公開(kāi)的另一個(gè)方面?！鞍肟贵w(hemibody)”是包含完整重鏈、完整輕鏈以及與完整重鏈的Fc區(qū)成對(duì)的第二重鏈Fc區(qū)的免疫功能性免疫球蛋白構(gòu)建體?？傻槐夭捎媒宇^來(lái)連接重鏈Fc區(qū)和第二重鏈Fc區(qū)。在具體實(shí)施方案中，半抗體為本文所公開(kāi)的抗原結(jié)合蛋白的單價(jià)形式。在其他實(shí)施方案中，可采用帶電的殘基對(duì)來(lái)使一個(gè)Fc區(qū)與第二Fc區(qū)締合。在本公開(kāi)的上下文中，半抗體可為目標(biāo)蛋白。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”意指已用或能夠用核酸序列轉(zhuǎn)化并且因此表達(dá)目標(biāo)基因的細(xì)胞。所述術(shù)語(yǔ)包括親本細(xì)胞的子代，無(wú)論子代在形態(tài)或基因組成方面是否與原始親本細(xì)胞相同，只要存在目標(biāo)基因即可。細(xì)胞培養(yǎng)物可包含一個(gè)或多個(gè)宿主細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“雜交瘤”意指由永生化細(xì)胞與抗體產(chǎn)生細(xì)胞的融合而產(chǎn)生的細(xì)胞或細(xì)胞的子代。產(chǎn)生的雜交瘤是產(chǎn)生抗體的永生化細(xì)胞。用來(lái)創(chuàng)建雜交瘤的單個(gè)細(xì)胞可來(lái)自任何哺乳動(dòng)物源，包括但不限于倉(cāng)鼠、大鼠、豬、兔、綿羊、山羊和人。所述術(shù)語(yǔ)還包括當(dāng)異雜交骨髓瘤融合時(shí)產(chǎn)生的三源雜交瘤細(xì)胞系，三源雜交瘤細(xì)胞系是人細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞系之間的融合的產(chǎn)物，隨后與漿細(xì)胞融合。所述術(shù)語(yǔ)旨在包括產(chǎn)生抗體的任何永生化雜交細(xì)胞系，例如像四源雜交瘤(參見(jiàn)，例如，Milstein等，(1983)Nature，537：3053)。術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)物”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用，并且是指在培養(yǎng)基中在適于細(xì)胞群的存活和/或生長(zhǎng)的條件下維持的細(xì)胞群。本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚，這些術(shù)語(yǔ)是指包含細(xì)胞群和所述群所懸浮于的培養(yǎng)基的組合。術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白質(zhì)”(例如，如在目標(biāo)蛋白或目標(biāo)多肽的上下文中所用)在本文可互換使用以指氨基酸殘基的聚合物。所述術(shù)語(yǔ)還適用于一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)天然存在的氨基酸的類似物或模擬物的氨基酸聚合物以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。所述術(shù)語(yǔ)還可包括已被修飾(例如，通過(guò)添加碳水化合物殘基以形成糖蛋白)或被磷酸化的氨基酸聚合物。多肽和蛋白質(zhì)可由天然存在的和非重組的細(xì)胞產(chǎn)生，或者多肽和蛋白質(zhì)可由基因工程改造的或重組的細(xì)胞產(chǎn)生。多肽和蛋白質(zhì)可包含具有天然蛋白質(zhì)的氨基酸序列的分子，或者具有缺失、添加和/或置換的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的天然序列的分子。術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白質(zhì)”包括只包含天然存在的氨基酸的分子，以及包含非天然存在的氨基酸的分子。非天然存在的氨基酸的實(shí)例(按照要求，其可置換存在于本文公開(kāi)的任何序列中的任何天然存在的氨基酸)包括：4-羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基賴氨酸、ε-N-乙酰賴氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥賴氨酸、σ-N-甲基精氨酸及其他類似的氨基酸和亞氨基酸(例如，4-羥脯氨酸)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)用法和慣例，在本文所用的多肽符號(hào)中，左手方向是氨基末端方向且右手方向是羧基末端方向。可被插入蛋白質(zhì)或多肽序列或者置換蛋白質(zhì)或多肽序列中的野生型殘基的非天然存在的氨基酸的實(shí)例的非限制性列表包括β-氨基酸、高氨基酸、環(huán)狀氨基酸以及具有衍生側(cè)鏈的氨基酸。實(shí)例包括(呈L-型或D-型；如括號(hào)中縮寫的)：瓜氨酸(Cit)、高瓜氨酸(hCit)、Nα-甲基瓜氨酸(NMeCit)、Nα-甲基高瓜氨酸(Nα-MeHoCit)、鳥(niǎo)氨酸(Orn)、Nα-甲基鳥(niǎo)氨酸(Nα-MeOrn或NMeOrn)、肌氨酸(Sar)、高賴氨酸(hLys或hK)、高精氨酸(hArg或hR)、高谷氨酰胺(hQ)、Nα-甲基精氨酸(NMeR)、Nα-甲基亮氨酸(Na-MeL或NMeL)、N-甲基高賴氨酸(NMeHoK)、Nα-甲基谷氨酰胺(NMeQ)、正亮氨酸(Nle)、正纈氨酸(Nva)、1，2，3，4-四氫異喹啉(Tic)、八氫吲哚-2-羧酸(Oic)、3-(1-萘基)丙氨酸(1-Nal)、3-(2-萘基)丙氨酸(2-Nal)、1，2，3，4-四氫異喹啉(Tic)、2-茚滿基甘氨酸(IgI)、對(duì)-吲哚苯丙氨酸(pI-Phe)、對(duì)-氨基苯丙氨酸(4AmP或4-氨基-Phe)、4-胍基苯丙氨酸(Guf)、甘氨酰賴氨酸(縮寫“K(Nε-甘氨酰)”或“K(甘氨酰)”或“K(gly)”)、硝基苯丙氨酸(硝基phe)、氨基苯丙氨酸(氨基phe或氨基-Phe)、芐基苯丙氨酸(芐基phe)、γ-羧基谷氨酸(γ-羧基glu)、羧脯氨酸(羥基pro)、對(duì)羧基-苯丙氨酸(Cpa)、α-氨基己二酸(Aad)、Nα-甲基纈氨酸(NMeVal)、N-α-甲基亮氨酸(NMeLeu)、Nα-甲基正亮氨酸(NMeNle)、環(huán)戊基甘氨酸(Cpg)、環(huán)己基甘氨酸(Chg)、乙酰精氨酸(乙酰arg)、α，β-二氨基丙酸(Dpr)、α，γ-二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dap)、環(huán)己基丙氨酸(Cha)、4-甲基-苯丙氨酸(MePhe)、β，β-二苯基-丙氨酸(BiPhA)、氨基丁酸(Abu)、4-苯基-苯丙氨酸(或二苯基丙氨酸；4Bip)、α-氨基-異丁酸(Aib)、β-丙氨酸、β-氨基丙酸、哌啶酸、氨基己酸、氨基庚酸、氨基庚二酸、鎖鏈素、二氨基庚二酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羥賴氨酸、別-羥賴氨酸、異鎖鏈素、別-異亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基異亮氨酸、N-甲基纈氨酸、4-羥脯氨酸(Hyp)、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基賴氨酸、ε-N-乙酰賴氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥賴氨酸、ω-甲基精氨酸、4-氨基-O-鄰苯二甲酸(4APA)以及其他類似氨基酸和明確列出的那些氨基酸中的任一種的衍生形式?！凹?xì)胞培養(yǎng)”或“培養(yǎng)”指的是多細(xì)胞生物或組織外的細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的適合的培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)，例如，Animalcellculture：APracticalApproach，D.Rickwood，編，OxfordUniversityPress，NewYork(1992)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞可在懸浮液中或當(dāng)附著到固體基質(zhì)上時(shí)培養(yǎng)?？墒褂镁哂谢驔](méi)有微載體的流化床生物反應(yīng)器、中空纖維生物反應(yīng)器、轉(zhuǎn)瓶、搖瓶或攪拌釜生物反應(yīng)器。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用500L至2000L生物反應(yīng)器。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用1000L至2000L生物反應(yīng)器。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞培養(yǎng)基”(也稱為“培養(yǎng)基”、“細(xì)胞培養(yǎng)基(cellculturemedia)”、“組織培養(yǎng)基”)是指用于使細(xì)胞例如動(dòng)物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)的任何營(yíng)養(yǎng)液，并且其通常提供來(lái)自以下的至少一種或多種組分：能量來(lái)源(通常呈碳水化合物的形式，諸如葡萄糖)；所有必需氨基酸中的一種或多種，并且通常為20種基本氨基酸，外加半胱氨酸；通常以低濃度需要的維生素和/或其他有機(jī)化合物；脂質(zhì)或游離脂肪酸；以及微量元素，例如通常以極低的濃度(常在微摩爾濃度范圍內(nèi))需要的無(wú)機(jī)化合物或天然存在的元素。取決于要培養(yǎng)的細(xì)胞的需要和/或所需的細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)，所述營(yíng)養(yǎng)液可任選地增補(bǔ)有附加的任選組分以使細(xì)胞生長(zhǎng)優(yōu)化，諸如激素和其他生長(zhǎng)因子例如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長(zhǎng)因子、血清等；鹽類，例如鈣、鎂和磷酸鹽以及緩沖液，例如HEPES；核苷和堿基，例如腺苷、胸苷、次黃嘌呤；以及蛋白質(zhì)和組織水解產(chǎn)物，例如水解的動(dòng)物蛋白或植物蛋白(蛋白胨或蛋白胨混合物，其可獲得自動(dòng)物副產(chǎn)品、精制明膠或植物物質(zhì))；抗生素，例如慶大霉素；細(xì)胞保護(hù)劑或表面活性劑，諸如F68(還被稱為F68和P188；非離子三嵌段共聚物，其由側(cè)接聚氧化乙烯(聚環(huán)氧乙烷)的兩個(gè)親水鏈的聚氧化丙烯(聚環(huán)氧丙烷)的中央疏水鏈構(gòu)成)；聚胺，例如腐胺、亞精胺和精胺(參見(jiàn)，例如，WIPO公布號(hào)WO2008/154014)以及丙酮酸鹽(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)8053238)。細(xì)胞培養(yǎng)基包括通常在任何細(xì)胞培養(yǎng)方法中采用的和/或已知用于任何細(xì)胞培養(yǎng)方法的那些，諸如但不限于細(xì)胞的分批培養(yǎng)、延長(zhǎng)分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)和/或灌流培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)。“基礎(chǔ)”(或分批)細(xì)胞培養(yǎng)基是指通常用來(lái)啟動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)，并且足夠完全支持細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基?！吧L(zhǎng)”細(xì)胞培養(yǎng)基是指通常用于指數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期(生長(zhǎng)期)期間的細(xì)胞培養(yǎng)中并且足夠完全支持此階段期間的細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基。生長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基還可含有賦予對(duì)并入宿主細(xì)胞系內(nèi)的選擇標(biāo)記的抗性或存活性的選擇劑。此類選擇劑包括但不限于遺傳霉素(G4118)、新霉素、潮霉素B、嘌呤霉素、博萊霉素、蛋氨酸亞砜亞胺、氨甲蝶呤、無(wú)谷氨酰胺細(xì)胞培養(yǎng)基、缺乏甘氨酸、次黃嘌呤和胸苷或單獨(dú)缺乏胸苷的細(xì)胞培養(yǎng)基?！吧a(chǎn)”細(xì)胞培養(yǎng)基是指通常在指數(shù)生長(zhǎng)將要結(jié)束且蛋白生產(chǎn)接管“過(guò)渡”期和/或“產(chǎn)物”期時(shí)用于過(guò)渡期間的細(xì)胞培養(yǎng)中并且足夠完全維持此階段期間所需的細(xì)胞密度、細(xì)胞活力和/或產(chǎn)物效價(jià)的細(xì)胞培養(yǎng)基?！肮嗔鳌奔?xì)胞培養(yǎng)基是指通常用于通過(guò)灌流培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)方法維持的細(xì)胞培養(yǎng)中，并且足夠完全支持此過(guò)程期間的細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基。灌流細(xì)胞培養(yǎng)基制劑可更為富集或比基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基制劑更為濃縮以適應(yīng)用來(lái)移除廢培養(yǎng)基的方法。灌流細(xì)胞培養(yǎng)基可在生長(zhǎng)期和生產(chǎn)期期間使用。濃縮細(xì)胞培養(yǎng)基可含有一些或所有維持細(xì)胞培養(yǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物；特別是可含有鑒定為或已知是在細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)期過(guò)程期間消耗的營(yíng)養(yǎng)物的濃縮培養(yǎng)基。濃縮培養(yǎng)基可基于幾乎任何細(xì)胞培養(yǎng)基制劑。此類濃縮補(bǔ)料培養(yǎng)基可含有例如約2X、3X、4X、5X、6X、7X、8X、9X、10X、12X、14X、16X、20X、30X、50X、100x、200X、400X、600X、800X乃至1000X它們的正常量的細(xì)胞培養(yǎng)基的一些或所有組分。用來(lái)制備細(xì)胞培養(yǎng)基的組分可完全地碾磨成粉末培養(yǎng)基制劑；部分地與液體增補(bǔ)物一起碾磨，按需添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中；或以完全液體形式向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加。細(xì)胞培養(yǎng)物還可增補(bǔ)有可能難以制備或在細(xì)胞培養(yǎng)中快速耗乏的特定營(yíng)養(yǎng)物的獨(dú)立濃縮補(bǔ)料。此類營(yíng)養(yǎng)物可為氨基酸，諸如酪氨酸、半胱氨酸和/或胱氨酸(參見(jiàn)，例如，WIPO公布號(hào)2012/145682)。在一個(gè)實(shí)施方案中，獨(dú)立地向在含有酪氨酸的細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物中補(bǔ)料濃縮的酪氨酸溶液，以使酪氨酸在細(xì)胞培養(yǎng)物中的濃度不超過(guò)8mM。在另一個(gè)實(shí)施方案中，獨(dú)立地向在缺乏酪氨酸、胱氨酸或半胱氨酸的細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物中補(bǔ)料酪氨酸和胱氨酸的濃縮溶液。所述獨(dú)立補(bǔ)料可在生產(chǎn)期之前或生產(chǎn)期開(kāi)始時(shí)開(kāi)始。所述獨(dú)立補(bǔ)料可在與濃縮補(bǔ)料培養(yǎng)基相同或不同的日子通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)基的分批補(bǔ)料來(lái)實(shí)現(xiàn)。所述獨(dú)立補(bǔ)料還可在與灌流培養(yǎng)基相同或不同的日子進(jìn)行灌流?！盁o(wú)血清”應(yīng)用于不含動(dòng)物血清諸如胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中。在其他情況中，各種組織培養(yǎng)基(包括確定的培養(yǎng)基)是可商購(gòu)獲得的，例如，可使用下列細(xì)胞培養(yǎng)基中的任何一種或組合：RPMI-1640培養(yǎng)基、RPMI-1641培養(yǎng)基、Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)、最低必需Eagle培養(yǎng)基、F-12K培養(yǎng)基、Ham氏F12培養(yǎng)基、Iscove氏改良的Dulbecco氏培養(yǎng)基、McCoy氏5A培養(yǎng)基、Leibovitz氏L-15培養(yǎng)基以及無(wú)血清培養(yǎng)基，諸如EX-CELLTM300系列(JRHBiosciences，Lenexa，Kansas)。此類培養(yǎng)基的無(wú)血清版也是可獲得的。取決于要培養(yǎng)的細(xì)胞的需要和/或所需的細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)，細(xì)胞培養(yǎng)基可增補(bǔ)有附加的或增加濃度的組分，諸如氨基酸、鹽類、糖類、維生素、激素、生長(zhǎng)因子、緩沖液、抗生素、脂類、微量元素等。術(shù)語(yǔ)“生物反應(yīng)器”意指用于細(xì)胞培養(yǎng)物的生長(zhǎng)的任何容器。本公開(kāi)的細(xì)胞培養(yǎng)物可在生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)，可基于由生長(zhǎng)于所述生物反應(yīng)器中的細(xì)胞產(chǎn)生的目標(biāo)蛋白的應(yīng)用而選擇所述生物反應(yīng)器。生物反應(yīng)器可為任何尺寸，只要它對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有用；通常，生物反應(yīng)器的尺寸適于在其之內(nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物的容積。通常，生物反應(yīng)器會(huì)是至少1升，并且可為2、5、10、50、100、200、250、500、1,000、1500、2000、2,500、5,000、8,000、10,000、12,000升或更多或在中間的任何容積?？稍谂囵B(yǎng)期期間控制生物反應(yīng)器的內(nèi)部條件，包括但不限于pH和溫度。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道并且將能夠基于相關(guān)考慮而選擇用于實(shí)踐本發(fā)明的適合的生物反應(yīng)器?！凹?xì)胞密度”是指給定容積的培養(yǎng)基中的細(xì)胞數(shù)量?！盎罴?xì)胞密度”是指如通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)活力測(cè)定(諸如臺(tái)盼藍(lán)染料排斥方法)所確定的給定容積的培養(yǎng)基中的活細(xì)胞數(shù)量。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞活力”意指培養(yǎng)中的細(xì)胞在給定組的培養(yǎng)條件或?qū)嶒?yàn)變量下生存的能力。所述術(shù)語(yǔ)還指在當(dāng)時(shí)的培養(yǎng)中在特定時(shí)間相對(duì)于總數(shù)的細(xì)胞(活的和死的)活著的細(xì)胞的部分?！凹?xì)胞壓積”(PCV)，也稱為“細(xì)胞壓積百分比”(％PCV)，是細(xì)胞所占容積與細(xì)胞培養(yǎng)物的總?cè)莘e的比率，表示為百分比(參見(jiàn)，Stettler等，(2006)BiotechnolBioeng.Dec20：95(6)：1228-33)。細(xì)胞壓積是細(xì)胞密度和細(xì)胞直徑的函數(shù)；細(xì)胞壓積的增加可由細(xì)胞密度或細(xì)胞直徑或兩者的增加而引起。細(xì)胞壓積是細(xì)胞培養(yǎng)物中固體含量的量度。在收獲和下游純化期間去除固體。更多的固體意味著在收獲和下游純化步驟期間從所需產(chǎn)物中分離所述固體物料的更多的努力。另外，在收獲過(guò)程期間所需產(chǎn)物可困于所述固體中并損失，導(dǎo)致產(chǎn)物收率減少。因?yàn)樗拗骷?xì)胞大小不同并且細(xì)胞培養(yǎng)物還可含有死的和垂死的細(xì)胞以及其他細(xì)胞碎片，所以細(xì)胞壓積比起細(xì)胞密度或活細(xì)胞密度是描述細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)固體含量的更加精確的方式。例如，取決于細(xì)胞大小，具有50x106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度的2000L培養(yǎng)物將具有迥然不同的細(xì)胞壓積。此外，一些細(xì)胞當(dāng)處于生長(zhǎng)停滯狀態(tài)時(shí)將在大小方面增加，因此由于細(xì)胞大小增加而導(dǎo)致生物量增加，使得在生長(zhǎng)停滯和后生長(zhǎng)停滯之前的細(xì)胞壓積很可能會(huì)不同。“生長(zhǎng)停滯”，其還被稱為“細(xì)胞生長(zhǎng)停滯”，是細(xì)胞在數(shù)量上停止增加或當(dāng)細(xì)胞周期不再進(jìn)行時(shí)的時(shí)刻?？赏ㄟ^(guò)測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物的活細(xì)胞密度來(lái)監(jiān)控生長(zhǎng)停滯。處于生長(zhǎng)停滯狀態(tài)的一些細(xì)胞可在大小而非數(shù)量方面增加，因此生長(zhǎng)停滯的培養(yǎng)物的細(xì)胞壓積可能增加。如果細(xì)胞不處于健康下降中，那么可通過(guò)反轉(zhuǎn)導(dǎo)致生長(zhǎng)停滯的條件來(lái)在某種程度上反轉(zhuǎn)生長(zhǎng)停滯。術(shù)語(yǔ)“效價(jià)”意指由給定量的培養(yǎng)基體積中的細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的目標(biāo)多肽或目標(biāo)蛋白(其可為天然存在的或重組的目標(biāo)蛋白)的總量。效價(jià)可以每毫升(或其他體積的量度)培養(yǎng)基毫克或微克多肽或蛋白質(zhì)的單位表示。“累積效價(jià)”是由細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程期間產(chǎn)生的效價(jià)，并且可例如通過(guò)測(cè)量每日效價(jià)并利用這些值來(lái)計(jì)算累積效價(jià)而確定。術(shù)語(yǔ)“補(bǔ)料分批培養(yǎng)”是指懸浮培養(yǎng)的形式，并且意指繼培養(yǎng)過(guò)程開(kāi)始之后一次或多次向培養(yǎng)物中提供附加組分的培養(yǎng)細(xì)胞的方法。提供的組分通常包含已在培養(yǎng)過(guò)程期間耗乏的用于細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。此外或可選地，附加組分可包括補(bǔ)充性組分(例如，細(xì)胞周期抑制性化合物)。通常在某點(diǎn)處停止補(bǔ)料分批培養(yǎng)，并且將培養(yǎng)基中的細(xì)胞和/或組分收獲并任選地純化。術(shù)語(yǔ)“綜合活細(xì)胞密度”或“IVCD”可互換使用，并且意指培養(yǎng)過(guò)程中的平均活細(xì)胞密度乘以培養(yǎng)已運(yùn)行的時(shí)間量。通過(guò)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間的平均活細(xì)胞密度(VCD)乘以這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間的持續(xù)時(shí)間來(lái)計(jì)算“累積活細(xì)胞密度”(CVCD)。CVCD是由VCD對(duì)時(shí)間繪圖形成的曲線下的面積。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的描述在重組蛋白產(chǎn)生期間，期望具有使細(xì)胞生長(zhǎng)至所需密度的可控系統(tǒng)，然后使細(xì)胞的生理狀態(tài)轉(zhuǎn)換至細(xì)胞利用能量和底物來(lái)產(chǎn)生目標(biāo)重組蛋白而不是形成更多細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯的高生產(chǎn)率狀態(tài)。用于到達(dá)這個(gè)目標(biāo)的各種方法存在并且包括溫度變化和氨基酸饑餓以及使用細(xì)胞周期抑制劑或可停滯細(xì)胞生長(zhǎng)而不引起細(xì)胞死亡的其他分子。重組蛋白的生產(chǎn)開(kāi)始于在培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)試管、生物反應(yīng)器或其他適合的容器中建立表達(dá)蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)型細(xì)胞培養(yǎng)物。通常使用較小的生產(chǎn)型生物反應(yīng)器，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物反應(yīng)器為500L至2000L。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用1000L-2000L生物反應(yīng)器。用來(lái)接種生物反應(yīng)器的種子細(xì)胞密度可對(duì)產(chǎn)生的重組蛋白水平具有積極影響。在一個(gè)實(shí)施方案中，用無(wú)血清培養(yǎng)基中的至少0.5x106個(gè)活細(xì)胞/mL至和超過(guò)3.0x106個(gè)活細(xì)胞/mL接種生物反應(yīng)器。在另一個(gè)實(shí)施方案中，接種為1.0x106個(gè)活細(xì)胞/mL。哺乳動(dòng)物細(xì)胞然后經(jīng)受指數(shù)生長(zhǎng)期。可在沒(méi)有補(bǔ)充性補(bǔ)料的情況下維持細(xì)胞培養(yǎng)物直至達(dá)到所需細(xì)胞密度。在一個(gè)實(shí)施方案中，在有或沒(méi)有補(bǔ)充性補(bǔ)料的情況下維持細(xì)胞培養(yǎng)物持續(xù)多達(dá)三天。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可按照所需細(xì)胞密度接種培養(yǎng)物以開(kāi)始生產(chǎn)期，而沒(méi)有簡(jiǎn)短的生長(zhǎng)期。在本文的任何實(shí)施方案中，還可通過(guò)任何前述的方法來(lái)啟動(dòng)生長(zhǎng)期至生產(chǎn)期的轉(zhuǎn)換。在生長(zhǎng)期與生產(chǎn)期之間的過(guò)渡處以及在生產(chǎn)期期間，細(xì)胞壓積百分比(％PCV)等于或小于35％。生產(chǎn)期期間維持的所需細(xì)胞壓積等于或小于35％。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞壓積等于或小于30％。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞壓積等于或小于20％。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞壓積等于或小于15％。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞壓積等于或小于10％。在生長(zhǎng)期與生產(chǎn)期之間的過(guò)渡處的和在生產(chǎn)期期間維持的所需活細(xì)胞密度可根據(jù)項(xiàng)目而不同。它可基于來(lái)自歷史數(shù)據(jù)的當(dāng)量細(xì)胞壓積來(lái)確定。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述活細(xì)胞密度為至少約10x106個(gè)活細(xì)胞/mL至80x106個(gè)活細(xì)胞/mL。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述活細(xì)胞密度為至少約10x106個(gè)活細(xì)胞/mL至70x106個(gè)活細(xì)胞/mL。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述活細(xì)胞密度為至少約10x106個(gè)活細(xì)胞/mL至60x106個(gè)活細(xì)胞/mL。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述活細(xì)胞密度為至少約10x106個(gè)活細(xì)胞/mL至50x106個(gè)活細(xì)胞/mL。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述活細(xì)胞密度為至少約10x106個(gè)活細(xì)胞/mL至40x106個(gè)活細(xì)胞/mL。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述活細(xì)胞密度為至少約10x106個(gè)活細(xì)胞/mL至30x106個(gè)活細(xì)胞/mL。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述活細(xì)胞密度為至少約10x106個(gè)活細(xì)胞/mL至20x106個(gè)活細(xì)胞/mL。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述活細(xì)胞密度為至少約20x106個(gè)活細(xì)胞/mL至30x106個(gè)活細(xì)胞/mL。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述活細(xì)胞密度為至少約20x106個(gè)活細(xì)胞/mL至至少約25x106個(gè)活細(xì)胞/mL，或者至少約20x106個(gè)活細(xì)胞/mL。生產(chǎn)期期間較低的細(xì)胞壓積有助于緩解可阻礙更高細(xì)胞密度灌流培養(yǎng)的溶解氧鼓泡問(wèn)題。較低的細(xì)胞壓積還允許較小的培養(yǎng)基體積，所述較小的培養(yǎng)基體積允許使用較小的培養(yǎng)基儲(chǔ)存容器并且可與較小流速組合。與較高的細(xì)胞生物量培養(yǎng)物相比，較小的細(xì)胞壓積還對(duì)收獲和下游處理具有較小影響。所有這些都降低了與生產(chǎn)重組蛋白治療劑相關(guān)的成本。通常在用于通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)重組蛋白的商業(yè)過(guò)程中使用三種方法：分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)和灌流培養(yǎng)。分批培養(yǎng)是使細(xì)胞在固定體積的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)持續(xù)較短時(shí)間段隨后全部收獲的不連續(xù)的方法。利用分批法生長(zhǎng)的培養(yǎng)物經(jīng)歷細(xì)胞密度的增加直至達(dá)到最大細(xì)胞密度，隨后隨著培養(yǎng)基組分消耗和代謝副產(chǎn)物(諸如乳酸鹽和氨)的水平積累，活細(xì)胞密度下降。通常收獲發(fā)生在當(dāng)達(dá)到最大細(xì)胞密度(取決于培養(yǎng)基制劑、細(xì)胞系等，通常為5x106個(gè)細(xì)胞/mL-10x106個(gè)細(xì)胞/mL)時(shí)的時(shí)刻。分批法是最簡(jiǎn)單的培養(yǎng)方法，然而活細(xì)胞密度受養(yǎng)分有效性的限制，并且一旦細(xì)胞處于最大密度，培養(yǎng)物就衰退且生產(chǎn)就減少。不存在延長(zhǎng)生產(chǎn)期的能力，因?yàn)閺U物積累和營(yíng)養(yǎng)耗乏快速地導(dǎo)致了培養(yǎng)物衰退，(通常大約3天至7天)。補(bǔ)料分批培養(yǎng)通過(guò)提供灌注或連續(xù)培養(yǎng)基補(bǔ)料以補(bǔ)充已消耗的那些培養(yǎng)基組分來(lái)改進(jìn)分批法。因?yàn)檠a(bǔ)料分批培養(yǎng)物在整個(gè)操作過(guò)程中始終接受附加的營(yíng)養(yǎng)物，所以當(dāng)與分批法相比時(shí)它們具有達(dá)到較高的細(xì)胞密度(取決于培養(yǎng)基制劑、細(xì)胞系等，＞10x106個(gè)細(xì)胞/ml至30x106個(gè)細(xì)胞/ml))和增加的產(chǎn)物效價(jià)的潛力。不同于分批法，雙相培養(yǎng)可通過(guò)操控補(bǔ)料策略和培養(yǎng)基制劑來(lái)建立和維持，以區(qū)分達(dá)成所需細(xì)胞密度(生長(zhǎng)期)的細(xì)胞增殖時(shí)期與暫停的或緩慢的細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)期(生產(chǎn)期)。如此，與分批培養(yǎng)相比，補(bǔ)料分批培養(yǎng)具有達(dá)到較高產(chǎn)物效價(jià)的潛力。通常，在生長(zhǎng)期使用分批法并且在生產(chǎn)期使用補(bǔ)料分批法，但是可在整個(gè)過(guò)程中使用補(bǔ)料分批補(bǔ)料策略。然而，不同于分批法，生物反應(yīng)器容積是限制補(bǔ)料量的限制因素。另外，如同分批法一樣，代謝副產(chǎn)物積累會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)物衰退，這限制了生產(chǎn)期的持續(xù)時(shí)間，約1.5周至3周。補(bǔ)料分批培養(yǎng)是不連續(xù)的，并且收獲通常在代謝副產(chǎn)物水平或培養(yǎng)物活力達(dá)到預(yù)定水平時(shí)發(fā)生。當(dāng)與沒(méi)有補(bǔ)料發(fā)生的分批培養(yǎng)相比時(shí)，補(bǔ)料分批培養(yǎng)可產(chǎn)生更大量的重組蛋白。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)5,672,502。灌流法通過(guò)添加新鮮培養(yǎng)基并同時(shí)移除廢培養(yǎng)基而提供了優(yōu)于分批法和補(bǔ)料分批法的潛在改進(jìn)。典型的大規(guī)模商業(yè)細(xì)胞培養(yǎng)策略努力達(dá)到幾乎三分之一至超過(guò)二分之一的反應(yīng)器容積為生物量的高細(xì)胞密度，60x106個(gè)細(xì)胞/mL-90(+)x106個(gè)細(xì)胞/mL。用灌流培養(yǎng)已達(dá)到了＞1x108個(gè)細(xì)胞/mL的極限細(xì)胞密度，并且甚至預(yù)測(cè)了更高的密度。典型的灌流培養(yǎng)開(kāi)始于持續(xù)一天或兩天的分批培養(yǎng)啟動(dòng)，隨后在培養(yǎng)的整個(gè)生長(zhǎng)期和生產(chǎn)期中向培養(yǎng)物中連續(xù)、逐步和/或間歇添加新鮮補(bǔ)料培養(yǎng)基并同時(shí)移除廢培養(yǎng)基并保留細(xì)胞和另外的高分子量化合物諸如蛋白質(zhì)(基于濾器分子量截?cái)嘀?。諸如沉降、離心或過(guò)濾的各種方法可用來(lái)移除廢培養(yǎng)基，同時(shí)維持細(xì)胞密度。已報(bào)告了每天一部分工作容積至每天許多多個(gè)工作容積的灌流流速。灌流法的優(yōu)勢(shì)為比起分批培養(yǎng)方法或補(bǔ)料分批培養(yǎng)方法，生產(chǎn)培養(yǎng)可維持較長(zhǎng)期間。然而，需要增加的培養(yǎng)基制備、使用、存儲(chǔ)和處理以支持長(zhǎng)期灌流培養(yǎng)，特別是具有高細(xì)胞密度的那些灌流培養(yǎng)，其還需要甚至更多的營(yíng)養(yǎng)物，并且與分批法或補(bǔ)料分批法相比，這一切驅(qū)使生產(chǎn)成本甚至更高。此外，更高的細(xì)胞密度可引起生產(chǎn)期間的問(wèn)題，諸如維持溶解氧水平和具有增加的放氣的問(wèn)題，其包括提供更多氧氣并去除更多二氧化碳，這將導(dǎo)致更多發(fā)泡和對(duì)消泡劑策略的改變的需要；以及收獲和下游處理期間的問(wèn)題，其中去除過(guò)多的細(xì)胞材料所需的努力可導(dǎo)致產(chǎn)物損失，由于增加的細(xì)胞團(tuán)塊而否定了增加的效價(jià)的效益。還提供組合了生長(zhǎng)期期間的補(bǔ)料分批補(bǔ)料隨后是生產(chǎn)期期間的連續(xù)灌流的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)策略。所述方法把以小于或等于35％細(xì)胞壓積維持細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)期作為目標(biāo)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在生長(zhǎng)期期間使用具有灌注補(bǔ)料的補(bǔ)料分批培養(yǎng)來(lái)維持細(xì)胞培養(yǎng)。然后可在生產(chǎn)期期間使用灌流補(bǔ)料。在一個(gè)實(shí)施方案中，灌流在細(xì)胞已達(dá)到生產(chǎn)期時(shí)開(kāi)始。在另一個(gè)實(shí)施方案中，灌流開(kāi)始于細(xì)胞培養(yǎng)的第3天或大約第3天至第9天或大約第9天。在另一個(gè)實(shí)施方案中，灌流開(kāi)始于細(xì)胞培養(yǎng)的第5天或大約第5天至第7天或大約第7天。生長(zhǎng)期期間使用灌注補(bǔ)料允許細(xì)胞過(guò)渡至生產(chǎn)期中，引起了作為啟動(dòng)并控制生產(chǎn)期的手段的對(duì)溫度變化更少的依賴性，然而36℃至31℃的溫度變化可在生長(zhǎng)期與生產(chǎn)期之間發(fā)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，變化為36℃至33℃。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)使補(bǔ)料分批培養(yǎng)物暴露于細(xì)胞周期抑制劑中來(lái)啟動(dòng)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中的啟動(dòng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)用包含細(xì)胞周期抑制劑的無(wú)血清灌流培養(yǎng)基灌流來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中的啟動(dòng)。如本文所述，可用至少0.5x106個(gè)活細(xì)胞/mL至和超過(guò)3.0x106個(gè)活細(xì)胞/mL在無(wú)血清培養(yǎng)基中接種生物反應(yīng)器，例如1.0x106個(gè)活細(xì)胞/mL。灌流培養(yǎng)是細(xì)胞培養(yǎng)物接受新鮮灌流補(bǔ)料培養(yǎng)基并同時(shí)移除廢培養(yǎng)基的一種培養(yǎng)。灌流可為連續(xù)的、逐步的、間歇的或者這些中的任何的任一種或全部的組合。灌流速率可為每天小于一個(gè)工作容積至每天許多個(gè)工作容積。細(xì)胞在培養(yǎng)物中保留并且移除的廢培養(yǎng)基基本不含細(xì)胞或比所述培養(yǎng)物具有顯著較少的細(xì)胞。由細(xì)胞培養(yǎng)物表達(dá)的重組蛋白也可在培養(yǎng)物中保留。灌流可通過(guò)包括離心、沉降或過(guò)濾的若干手段來(lái)實(shí)現(xiàn)，參見(jiàn)，例如，Voisard等，(2003)，BiotechnologyandBioengineering82：751-65。過(guò)濾法的一個(gè)實(shí)例為交替式切向流過(guò)濾。交替式切向流通過(guò)將培養(yǎng)基泵送通過(guò)中空纖維濾器組件來(lái)維持。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)6,544,424；Furey(2002)Gen.Eng.News.22(7)，62-63?！肮嗔髁魉佟笔窃诮o定時(shí)間內(nèi)從生物反應(yīng)器穿過(guò)(添加和移除)的培養(yǎng)基的量，通常表現(xiàn)為一部分或多倍的工作容積?！肮ぷ魅莘e”是指用于細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器容積的量。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述灌流流速為每天一個(gè)工作容積或更少?？膳渲乒嗔餮a(bǔ)料培養(yǎng)基以使灌流營(yíng)養(yǎng)濃度最大化，使灌流速率最小化?？捎煤性诩?xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)期過(guò)程期間消耗的組分諸如營(yíng)養(yǎng)物和氨基酸的濃縮補(bǔ)料培養(yǎng)基增補(bǔ)細(xì)胞培養(yǎng)物。濃縮補(bǔ)料培養(yǎng)基可基于幾乎任何細(xì)胞培養(yǎng)基制劑。這種濃縮補(bǔ)料培養(yǎng)基可含有例如約5X、6X、7X、8X、9X、10X、12X、14X、16X、20X、30X、50X、100x、200X、400X、600X、800X乃至1000X它們的正常量的細(xì)胞培養(yǎng)基的大部分組分。濃縮補(bǔ)料培養(yǎng)基經(jīng)常用于補(bǔ)料分批培養(yǎng)過(guò)程中。根據(jù)本發(fā)明的方法可用來(lái)在多階段培養(yǎng)過(guò)程中改進(jìn)重組蛋白的生產(chǎn)。在多階段過(guò)程中，以兩個(gè)或更多個(gè)不同階段培養(yǎng)細(xì)胞。例如，細(xì)胞可首先以一個(gè)或多個(gè)生長(zhǎng)期在使細(xì)胞增殖和活力最大化的環(huán)境條件下培養(yǎng)，然后在使蛋白質(zhì)生產(chǎn)最大化的條件下轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)期。在用于通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)的商業(yè)過(guò)程中，在最終生產(chǎn)培養(yǎng)之前，通常有存在于不同培養(yǎng)容器中的多個(gè)(例如，至少約2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè))生長(zhǎng)期。一個(gè)或多個(gè)過(guò)渡期可先于或隔開(kāi)生長(zhǎng)期和生產(chǎn)期。在多階段過(guò)程中，可至少在商業(yè)細(xì)胞培養(yǎng)最終生產(chǎn)期的生長(zhǎng)期和生產(chǎn)期期間采用根據(jù)本發(fā)明的方法，然而它還可在前生長(zhǎng)期中采用?？梢源笠?guī)模進(jìn)行生產(chǎn)期?？梢灾辽偌s100、500、1000、2000、3000、5000、7000、8000、10,000、15,000、20,000升的容積進(jìn)行大規(guī)模過(guò)程。在一個(gè)實(shí)施方案中，生產(chǎn)在500L、1000L和/或2000L生物反應(yīng)器中進(jìn)行。生長(zhǎng)期可在比生產(chǎn)期更高的溫度下存在。例如，生長(zhǎng)期可在約35℃至約38℃的第一溫度下存在，并且生產(chǎn)期可在約29℃至37℃，任選地約30℃至約36℃或約30℃至約34℃的第二溫度下存在。此外，可在溫度變化的同時(shí)、之前和/或之后添加蛋白生產(chǎn)的化學(xué)誘導(dǎo)物，例如像咖啡因、丁酸鹽和六亞甲基二乙酰胺(HMBA)。如果在溫度變化后添加誘導(dǎo)物，它們可在溫度變化后一小時(shí)至五天，任選地在溫度變化后一至兩天添加。當(dāng)細(xì)胞產(chǎn)生所需蛋白質(zhì)時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)物可維持?jǐn)?shù)天乃至數(shù)周。可使用本領(lǐng)域已知的任何分析技術(shù)監(jiān)控并評(píng)估來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)物的樣品?？稍谂囵B(yǎng)期間監(jiān)控包括重組蛋白和培養(yǎng)基質(zhì)量和特征的多種參數(shù)?？梢院弦獾念l率間歇地獲取并監(jiān)控樣品，包括實(shí)時(shí)或近實(shí)時(shí)的連續(xù)監(jiān)控。通常，最終生產(chǎn)培養(yǎng)物(N-xtoN-1)之前的細(xì)胞培養(yǎng)物用來(lái)產(chǎn)生將用來(lái)接種生產(chǎn)型生物反應(yīng)器(N-1培養(yǎng)物)的種子細(xì)胞。種子細(xì)胞密度可對(duì)產(chǎn)生的重組蛋白水平具有積極影響。產(chǎn)物水平傾向于隨著增加種子密度而升高。效價(jià)的改善不但受制于更高的種子密度，而且很可能受制于生產(chǎn)中的細(xì)胞的代謝狀態(tài)和細(xì)胞周期狀態(tài)的影響?？赏ㄟ^(guò)任何培養(yǎng)方法來(lái)生產(chǎn)種子細(xì)胞。一個(gè)這樣的方法是使用交替式切向流過(guò)濾的灌流培養(yǎng)。可使用交替式切向流過(guò)濾操作N-1生物反應(yīng)器以提供高密度的細(xì)胞來(lái)接種生產(chǎn)型生物反應(yīng)器。N-1階段可用來(lái)使細(xì)胞生長(zhǎng)至＞90x106個(gè)細(xì)胞/mL的密度。N-1生物反應(yīng)器可用來(lái)產(chǎn)生灌注種子培養(yǎng)物或可用作滾種儲(chǔ)備培養(yǎng)物(rollingseedstockculture)，可維持所述滾種儲(chǔ)備培養(yǎng)物來(lái)以高種子細(xì)胞密度接種多生產(chǎn)型生物反應(yīng)器。生產(chǎn)的生長(zhǎng)階段持續(xù)時(shí)間的范圍可為7至14天，并且可被設(shè)計(jì)以便在接種生產(chǎn)型生物反應(yīng)器之前使細(xì)胞維持指數(shù)生長(zhǎng)。優(yōu)化灌流速率、培養(yǎng)基制劑和定時(shí)以使細(xì)胞生長(zhǎng)并將他們以最有益于優(yōu)化他們的生產(chǎn)的狀態(tài)遞送至生產(chǎn)型生物反應(yīng)器。對(duì)于接種生產(chǎn)型生物反應(yīng)器，可達(dá)到＞15x106個(gè)細(xì)胞/mL的種子細(xì)胞密度。接種時(shí)更高的種子細(xì)胞密度可減少乃至消除達(dá)到所需生產(chǎn)密度所需的時(shí)間。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了在調(diào)控重組蛋白糖基化的存在和/或量方面的特定效用。本發(fā)明所用的細(xì)胞系(也稱為“宿主細(xì)胞”)經(jīng)過(guò)基因工程改造以表達(dá)具有商業(yè)或科學(xué)價(jià)值的多肽。細(xì)胞系通常從起源于原代培養(yǎng)物的譜系得到，所述原代培養(yǎng)物可在培養(yǎng)中維持無(wú)限時(shí)間。基因工程改造的細(xì)胞系涉及用重組多核苷酸分子轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)所述細(xì)胞和/或另外的改變(例如，通過(guò)同源重組和基因活化或重組細(xì)胞與非重組細(xì)胞的融合)，以便引起宿主細(xì)胞表達(dá)所需重組多肽。用于基因工程改造細(xì)胞和/或細(xì)胞系以表達(dá)目標(biāo)多肽的方法和載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知；例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubel等，編.(Wiley和Sons，NewYork，1988，和季刊更新)；Sambrook等，MolecularCloning：ALaboratoryManual(ColdSpringLaboratoryPress，1989)；Kaufman，R.J.，LargeScaleMammalianCellCulture，1990，pp.15-69闡明了各種技術(shù)。動(dòng)物細(xì)胞系來(lái)源于祖細(xì)胞是來(lái)源于多細(xì)胞動(dòng)物的細(xì)胞。一種動(dòng)物細(xì)胞系為哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。適于在培養(yǎng)中生長(zhǎng)的多種多樣的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)種質(zhì)保存中心(Manassas，Va.)和商業(yè)供應(yīng)商。工業(yè)中常用的細(xì)胞系的實(shí)例包括VERO、BHK、HeLa、CV1(包括Cos)、MDCK、293、3T3、骨髓瘤細(xì)胞系(例如，NSO、NS1)、PC12、WI38細(xì)胞和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。CHO細(xì)胞廣泛用于生產(chǎn)復(fù)合重組蛋白，例如，細(xì)胞因子、凝血因子和抗體(Brasel等(1996)，Blood88：2004-2012；Kaufman等(1988)，J.BiolChem263：6352-6362；McKinnon等(1991)，JMolEndocrinol6：231-239；Wood等(1990)，J.Immunol.145：3011-3016)。二氫葉酸還原酶(DHFR)缺陷型突變細(xì)胞系(Urlaub等(1980)，ProcNatlAcadSciUSA77：4216-4220)、DXB11和DG-44是合意的CHO宿主細(xì)胞系，因?yàn)橛行У腄HFR可選擇和可擴(kuò)增基因表達(dá)系統(tǒng)允許這些細(xì)胞中的高水平重組蛋白表達(dá)(KaufmanR.J.(1990)，MethEnzymol185：537-566)。此外，這些細(xì)胞易于操控作為貼壁培養(yǎng)物或懸浮培養(yǎng)物并且顯示出相對(duì)良好的遺傳穩(wěn)定性。CHO細(xì)胞和在它們中重組表達(dá)的蛋白已被廣泛表征并且已被監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于臨床商業(yè)生產(chǎn)中。在另一方面，本發(fā)明提供已引入重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可為任何原核細(xì)胞(例如大腸桿菌(E.coli))或真核細(xì)胞(例如酵母、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例加，CHO細(xì)胞))。可通過(guò)常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)柒技術(shù)將載體DNA引入原核或真核細(xì)胞中。很多轉(zhuǎn)染方法是本領(lǐng)域已知的，并且包括了使用脂質(zhì)(例如，)、磷酸鈣、陽(yáng)離子聚合物、DEAE-葡聚糖、活化的樹(shù)狀聚合物和磁珠。另外的轉(zhuǎn)染方法利用基于儀器的技術(shù)。實(shí)例包括電穿孔、生物射彈技術(shù)、顯微注射和激光轉(zhuǎn)染/光注射，所述激光轉(zhuǎn)染/光注射使用光(例如，激光)以將核酸引入宿主細(xì)胞中。對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，眾所周知，根據(jù)使用的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，僅一小部分細(xì)胞可將外源DNA整合至它們的基因組中。為了鑒定和選擇這些整合體，通常將編碼選擇標(biāo)記(例加，對(duì)于對(duì)抗生素的抗性)的基因連同目標(biāo)基因一起引入宿主細(xì)胞中。優(yōu)選的選擇標(biāo)記包括賦予對(duì)藥物諸如G418、潮霉素和氨甲蝶呤的抗性的那些選擇標(biāo)記。在其他方法中，可通過(guò)藥物選擇鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了引入的核酸的細(xì)胞(例加，已并入選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞將存活，而其它細(xì)胞死亡)。目標(biāo)蛋白本發(fā)明的方法可用來(lái)培養(yǎng)表達(dá)目標(biāo)重組蛋白的細(xì)胞。表達(dá)的重組蛋白可分泌至培養(yǎng)基中，可從所述培養(yǎng)基中回收和/或收集它們。此外，可利用已知的方法和從商業(yè)供應(yīng)商獲得的產(chǎn)品來(lái)純化或部分地純化來(lái)自此類培養(yǎng)物或組分(例如，來(lái)自培養(yǎng)基)的蛋白質(zhì)。然后可將純化的蛋白質(zhì)“配制”(意指緩沖液交換)、滅菌、成批包裝和/或包裝以用于最終用戶。用于藥物組合物的適合制劑包括在Remington′sPharmaceuticalSciences，第18版.1995，MackPublishingCompany，Easton，PA中描述的那些制劑?？捎帽景l(fā)明方法來(lái)生產(chǎn)的多肽的實(shí)例包括了包含與以下蛋白質(zhì)之一的全部或部分相同或基本相似的氨基酸序列的蛋白質(zhì)：腫瘤壞死因子(TNF)、flt3配體(WO94/28391)、促紅細(xì)胞生成素(erythropoeitin)、促血小板生成素(thrombopoeitin)、降鈣素、IL-2、血管生成素-2(Maisonpierre等(1997)，Science277(5322)：55-60)、NF-κB的受體激活物的配體(RANKL，WO01/36637)、腫瘤壞死因子(TNF)相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL，WO97/01633)、胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF，澳大利亞專利號(hào)588819)、肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(美國(guó)專利號(hào)6,204,363)、表皮生長(zhǎng)因子、角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子、巨核細(xì)胞(megakaryote)生長(zhǎng)和發(fā)育因子、RANTES、人纖維蛋白原樣2蛋白(FGL2；NCBI登錄號(hào)NM_00682；Rüegg和Pytela(1995)，Gene160：257-62)、生長(zhǎng)激素、胰島素、促胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子、甲狀旁腺素、包括α-干擾素、γ-干擾素和共有序列干擾素(consensusinterferon)的干擾素(美國(guó)專利號(hào)4,695,623和4,897471)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、突觸結(jié)合蛋白樣蛋白(SLP1-5)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3、胰高血糖素、白細(xì)胞介素、集落刺激因子、淋巴毒素-B、白血病抑制因子和制瘤素-M。對(duì)可根據(jù)本發(fā)明方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的描述可見(jiàn)于例如HumanCytokines：HandbookforBasicandClinicalResearch，全冊(cè)(Aggarwal和Gutterman，編BlackwellSciences，Cambridge，MA，1998)；GrowthFactors：APracticalApproach(McKay和Leigh，編，OxfordUniversityPressInc.，NewYork，1993)；以及TheCytokineHandbook，第1冊(cè)和第2冊(cè)(Thompson和Lotze編，AcademicPress，SanDiego，CA，2003)中。此外，本發(fā)明的方法將用來(lái)生產(chǎn)包含任何上述蛋白質(zhì)的受體的全部或部分氨基酸序列的蛋白質(zhì)、此類受體或任何上述蛋白質(zhì)的拮抗劑和/或基本類似于此類受體或拮抗劑的蛋白質(zhì)。這些受體和拮抗劑包括：兩種形式的腫瘤壞死因子受體(TNFR，也稱為p55和p75，美國(guó)專利號(hào)5,395,760和美國(guó)專利號(hào)5,610,279)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)受體(I型和II型；歐洲專利號(hào)0460846、美國(guó)專利號(hào)4,968,607和美國(guó)專利號(hào)5,767,064,)、IL-1受體拮抗劑(美國(guó)專利號(hào)6,337,072)、IL-1拮抗劑或抑制劑(美國(guó)專利號(hào)5,981,713、6,096,728和5,075,222)、IL-2受體、IL-4受體(歐洲專利號(hào)0367566和美國(guó)專利號(hào)5,856,296)、IL-15受體、IL-17受體、IL-18受體、Fc受體、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體、粒細(xì)胞集落刺激因子受體、制瘤素-M的受體和白血病抑制因子的受體、NF-κB的受體激活物(RANK，WO01/36637和美國(guó)專利號(hào)6,271,349)、骨保護(hù)素(美國(guó)專利號(hào)6,015,938)、TRAIL的受體(包括TRAIL受體1、2、3和4)以及包含死亡結(jié)構(gòu)域的受體，諸如Fas或凋亡誘導(dǎo)受體(AIR)?？衫帽景l(fā)明來(lái)生產(chǎn)的其他蛋白質(zhì)包括包含分化抗原(也稱為CD蛋白)或它們的配體或基本類似于這兩者之一的蛋白質(zhì)的全部或部分氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在LeukocyteTypingVI(ProceedingsoftheVIthInternationalWorkshopandConference，Kishimoto，Kikutani等人，編，Kobe，Japan，1996)中公開(kāi)了此類抗原。在后續(xù)的研討會(huì)中公開(kāi)了類似的CD蛋白。此類抗原的實(shí)例包括CD22、CD27、CD30、CD39、CD40和另外配體(CD27配體、CD30配體等)。若干CD抗原是TNF受體家族的成員，所述TNF家族還包括41BB和OX40。配體通常是TNF家族的成員，41BB配體和OX40配體也是。也可利用本發(fā)明生產(chǎn)酶促活性蛋白或它們的配體。實(shí)例包括包含以下蛋白質(zhì)或它們的配體或基本類似于這兩者之一的蛋白質(zhì)中的一個(gè)的全部或部分的蛋白質(zhì)：包括TNF-α轉(zhuǎn)化酶的解聯(lián)蛋白和金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域家族成員、各種激酶、葡糖腦苷脂酶、超氧化物歧化酶、組織纖溶酶原激活物、因子VIII、因子IX、載脂蛋白E、載脂蛋白A-I、珠蛋白、IL-2拮抗劑、α-1抗胰蛋白酶、任何上述酶類的配體和為數(shù)眾多的其他酶類和它們的配體?？缮a(chǎn)的抗體的實(shí)例包括但不限于識(shí)別包括但不限于上述蛋白質(zhì)和/或以下抗原的蛋白質(zhì)中的任何一種或組合的那些抗體：CD2、CD3、CD4、CD8、CD11a、CD14、CD18、CD20、CD22、CD23、CD25、CD33、CD40、CD44、CD52、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD147、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-7、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-1受體、IL-2受體、IL-4受體、IL-6受體、IL-13受體、IL-18受體亞基、FGL2、PDGF-β及其類似物(參見(jiàn)，美國(guó)專利號(hào)5,272,064和5,149,792)、VEGF、TGF、TGF-β2、TGF-β1、EGF受體(參見(jiàn)，美國(guó)專利號(hào)6,235,883)、VEGF受體、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、骨保護(hù)素配體、干擾素γ、B淋巴細(xì)胞刺激物(BlyS，也稱為BAFF、THANK、TALL-1和zTNF4；參見(jiàn)，Do和Chen-Kiang(2002)，CytokineGrowthFactorRev.13(1)：19-25)、C5補(bǔ)體、IgE、腫瘤抗原CA125、腫瘤抗原MUC1、PEM抗原、LCG(其是表達(dá)的與肺癌相關(guān)的基因產(chǎn)物)、HER-2、HER-3、腫瘤相關(guān)糖蛋白TAG-72、SK-1抗原、在結(jié)腸癌和/或胰腺癌患者血清中以升高的水平存在的腫瘤相關(guān)表位、在乳腺、結(jié)腸、鱗狀細(xì)胞、前列腺、胰腺、肺和/或腎癌細(xì)胞和/或黑色素瘤、膠質(zhì)瘤或成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞上表達(dá)的癌癥相關(guān)表位或蛋白、腫瘤壞死中心、整聯(lián)蛋白α4β7、整聯(lián)蛋白VLA-4、整聯(lián)蛋白(包括包含了α4β7的整聯(lián)蛋白)、TRAIL受體1、2、3和4、RANK、RANK配體、TNF-α、黏附分子VAP-1、上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)、細(xì)胞間黏附分子-3(ICAM-3)、白細(xì)胞整聯(lián)蛋白粘附素、血小板糖蛋白gpIIb/IIIa、心肌肌球蛋白重鏈、甲狀旁腺素、rNAPc2(其是因子VIIa組織因子的抑制劑)、MHCI、癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、腫瘤壞死因子(TNF)、CTLA-4(其是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原)、Fc-γ-1受體、HLA-DR10β、HLA-DR抗原、硬化蛋白、L-選擇素、呼吸融合病毒、人類免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、變異鏈球菌(Streptococcusmutans)和金黃色葡萄球菌(Staphlycoccusaureus)。可利用本發(fā)明方法來(lái)生產(chǎn)的已知抗體的具體實(shí)例包括但不限于阿達(dá)木單抗、貝伐單抗、英夫利昔單抗、阿昔單抗、阿侖單抗、巴匹珠單抗、巴利昔單抗、貝利木單抗、布雷奴單抗、布羅達(dá)單抗(brodalumab)、康納單抗、培舍珠單抗、西妥昔單抗、可那木單抗(conatumumab)、地諾單抗(denosumab)、依庫(kù)珠單抗、etrolizumab、evolocumab、吉妥珠單抗奧唑米星、戈利木單抗(golimumab)、替伊莫單抗、拉貝珠單抗、馬帕木單抗、馬妥珠單抗、美泊利單抗、莫他珠單抗、莫羅單抗-CD3、那他珠單抗、帕利珠單抗、奧法木單抗、奧馬珠單抗、奧戈伏單抗(oregovomab)、帕利珠單抗、帕尼單抗、pemtumomab、培妥珠單抗、蘭尼單抗、利妥昔單抗、羅維珠單抗、塔西單抗、托西莫單抗、曲妥珠單抗、優(yōu)特克單抗、維多珠單抗(vedolizomab)、扎蘆木單抗和扎木單抗。本發(fā)明還可用來(lái)生產(chǎn)包含例如任何上述蛋白質(zhì)的重組融合蛋白。例如，可利用本發(fā)明的方法來(lái)生產(chǎn)包含上述蛋白質(zhì)之一加上多聚化結(jié)構(gòu)域諸如亮氨酸拉鏈、卷曲螺旋、免疫球蛋白或基本類似的蛋白質(zhì)的Fc部分的重組融合蛋白。參見(jiàn)，例如，WO94/10308；Lovejoy等(1993)，Science259：1288-1293；Harbury等(1993)，Science262：1401-05；Harbury等(1994)，Nature371：80-83；等(1999)，Structure7：255-64。明確地包括在此類重組融合蛋白中的是受體的部分融合到抗體諸如依那西普(p75TNFR：Fc)、阿巴西普和貝拉西普(CTLA4：Fc)的Fc部分的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的范圍不受本文所述的具體實(shí)施方案限制，所述具體實(shí)施方案意欲作為本發(fā)明的個(gè)別方面的說(shuō)明，并且功能上等同的方法和組分構(gòu)成本發(fā)明的方面。確實(shí)，除了本文示出和描述的那些之外，根據(jù)以上描述和所附附圖，本發(fā)明的各種修改將對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言變得顯而易見(jiàn)。此類修改旨在處于所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。實(shí)施例實(shí)施例1將表達(dá)以往顯示出低水平高甘露糖(HM)表達(dá)的重組人抗體(MAbA)的產(chǎn)生單克隆抗體的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系用于siRNA實(shí)驗(yàn)。使用基于DHFR的選擇克隆獲得所述細(xì)胞系；對(duì)于常規(guī)培養(yǎng)，將細(xì)胞懸浮培養(yǎng)于含有氨甲蝶呤(MTX)的選擇培養(yǎng)基中。在36℃、5％CO2和85％相對(duì)濕度下，將培養(yǎng)物維持在放空的125mL或250mL錐形搖瓶(CorningLifeSciences，Lowell，MA)或50mL放空的自旋試管(TPP，Trasadingen，Switzerland)中。將錐形瓶以120rpm用25mm軌道直徑在大容量自動(dòng)CO2培養(yǎng)箱(ThermoFisherScientific，Waltham，MA)中振蕩，并且將自旋試管以225rpm、50mm軌道直徑在大容量ISF4-X培養(yǎng)箱(KuhnerAG，Basel，Switzerland)中振蕩。檢測(cè)八種不同的19聚體siRNA的Mgat1、Mgat2和Slc35a2。根據(jù)制造商的方案使用RNAiMAX(Invitrogen；LifeTechnologies；一種基于脂質(zhì)的轉(zhuǎn)染試劑，其與核酸復(fù)合并促進(jìn)細(xì)胞與核酸的轉(zhuǎn)染)將siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至MAbA細(xì)胞系中。簡(jiǎn)言之，在轉(zhuǎn)染日用500微升培養(yǎng)基將細(xì)胞以每孔2×105個(gè)接種在Corning公司的六孔板上。對(duì)于轉(zhuǎn)染，使10pmolsiRNA在100微升Opti-MemI培養(yǎng)基中與1.5微升LipofectamineRNAiMAX復(fù)合，并在室溫下孵育10分鐘。將RNAi-LipofectamineRNAiMax試劑復(fù)合物添加至各孔中。將板在36℃下于CO2培養(yǎng)箱中孵育3天。使用1X裂解緩沖液(AffymetrixInc.，SanataClara，CA)在50℃下將細(xì)胞裂解1小時(shí)。通過(guò)多路復(fù)用測(cè)定使用FLEXMAP系統(tǒng)(Luminex，AustinTX；蛋白質(zhì)和基因組多路復(fù)用珠陣列測(cè)定)來(lái)將裂解物用于mRNA表達(dá)分析。對(duì)于mRNA表達(dá)分析，利用QuantiGenePlex2.0試劑系統(tǒng)(AffymetrixInc.，SantaClara，CA)。簡(jiǎn)言之，使用增補(bǔ)有蛋白激酶K(儲(chǔ)備濃度50mg/mL)的1X裂解緩沖液(QS0100)(AffymetrixInc.，SantaClara，CA)將來(lái)自5x105個(gè)活細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)裂解并在50℃下孵育1小時(shí)。將細(xì)胞裂解物在-80℃下儲(chǔ)存直至準(zhǔn)備使用。使用靶向Mgat1、Mgat2和Slc35a3以及歸一化基因的定制的基因特異性探針組(Affymetrix，Inc.SantaClara，CA)。將冷凍的裂解物解凍并使用Affymetrix公司的標(biāo)準(zhǔn)方案處理而用于mRNA表達(dá)水平分析。將來(lái)源于測(cè)量來(lái)自每基因每孔100珠的中值報(bào)告基因熒光的數(shù)據(jù)測(cè)定并表示為中值熒光強(qiáng)度(MFI)。將本底信號(hào)在缺乏來(lái)自空白樣品的靶mRNA的情況下測(cè)定并從在靶mRNA存在下獲得的信號(hào)中減去。針對(duì)兩種持家基因：GusB和TBP將目標(biāo)基因的熒光強(qiáng)度歸一化。將各靶RNA的測(cè)定強(qiáng)度通過(guò)測(cè)定檢測(cè)極限(LOD)來(lái)評(píng)估，定義為信號(hào)是三個(gè)高于本底的標(biāo)準(zhǔn)差的靶濃度。變異系數(shù)(CV)測(cè)量試驗(yàn)精密度，并且是標(biāo)準(zhǔn)差與平均數(shù)的比率。將所有樣品重復(fù)操作三次，并且將裂解緩沖液用作空白。使用Luminex公司的Bio-Plex3D酶標(biāo)儀分析樣品，并且使用Bio-Plex數(shù)據(jù)管理器5.0(Bio-RadLaboratories，Hercules，CA)獲得數(shù)據(jù)。對(duì)于各基因，選擇達(dá)到＞85％敲除而沒(méi)有任何顯著脫靶效應(yīng)的兩種siRNA。然后將所選的siRNA轉(zhuǎn)染至MAbA細(xì)胞系中，并且進(jìn)行10天的補(bǔ)料分批抗體生產(chǎn)操作。在補(bǔ)料分批生產(chǎn)研究中，將細(xì)胞以3.5x105個(gè)細(xì)胞/mL接種至生產(chǎn)培養(yǎng)基中。將3mL工作容積用于24深孔板(AxygenScientific，UnionCity，CA)中，或者將25mL工作容積用于125mL放空的搖瓶中。在第3天、第6天和第8天將培養(yǎng)物補(bǔ)料7％的最初培養(yǎng)容積的快速灌注補(bǔ)料。在第3天、第6天和第8天將葡萄糖補(bǔ)料至10g/L的目標(biāo)。在生產(chǎn)操作的第10天收獲離心的條件培養(yǎng)基。還在第3天、第6天、第8天和第10天獲取樣品的生長(zhǎng)、活力和代謝數(shù)據(jù)，并且在第6天、第8天和第10天獲取樣品的效價(jià)和HM分析。在第3天、第6天、第8天和第10天將細(xì)胞團(tuán)樣品從培養(yǎng)物中取出以用于mRNA表達(dá)分析；下表1示出了結(jié)果。表1：通過(guò)siRNA處理的Mgat1、Mgat2和Slc35a2的水平的減少mRNA表達(dá)分析顯示在10天培養(yǎng)操作中Mgat1和Mgat2轉(zhuǎn)錄物水平減少＞50％。Slc35a2的表達(dá)水平從第3天至第6天減少＞50％，而到第8天和第10天只看到7％-14％的減少。在補(bǔ)料分批的第十天測(cè)定抗體效價(jià)和％HM。由親和蛋白APOROSPAID傳感器盒通過(guò)使用WatersUPLC來(lái)測(cè)量效價(jià)。使用CaliperGXIIHM試驗(yàn)(CaliperLifeSciencesInc.，PerkinElmer公司)或使用UPLCHILIC(親水相互作用色譜)(裝備有與AcquityUPLCBEHGlycanColumn一起使用的UPLCFluorescence(FLR)檢測(cè)器的WatersAcquityUPLC)來(lái)測(cè)量高甘露糖含量。下表2示出了結(jié)果(結(jié)果表示為平均值加/減標(biāo)準(zhǔn)差)。表2：用siRNA處理的細(xì)胞系的效價(jià)和％HM樣品效價(jià)(g/L)％HM無(wú)siRNA0.75±0.090.81±0.07siRNAMGAT10.73±0.0572.42±3.28siRNAMGAT20.87±0.271.98±0.31siRNASlc35A20.57±0.361.56±0.29這些結(jié)果的分析表明在用MgatlsiRNA處理的細(xì)胞中，HM的水平降低70％，然而Mgat2或Slc35a2的敲除不顯著影響HM。然而到第10天，Slc35a2的水平已恢復(fù)至對(duì)照值的90％，因此對(duì)于此實(shí)驗(yàn)，不可能排除這種基因在調(diào)節(jié)HM中的作用。用siRNA處理未觀察到產(chǎn)生的抗體的效價(jià)的顯著變化。此外，siRNA處理似乎不影響生產(chǎn)率或細(xì)胞活力，表明了在減少的Mgat1mRNA表達(dá)的情況下觀察到的升高的HM水平很可能直接與減少的Mgat1活性有關(guān)。實(shí)施例2將表達(dá)以往顯示出高水平(即，＞10％)高甘露糖型聚糖的重組人抗體(MAbB)的產(chǎn)生單克隆抗體的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系用于轉(zhuǎn)柒實(shí)驗(yàn)。使用基于DHFR的選擇克隆獲得所述細(xì)胞系；對(duì)于常規(guī)培養(yǎng)，將細(xì)胞懸浮培養(yǎng)于含有MTX的選擇培養(yǎng)基中?；救缦惹八觯瑢⑴囵B(yǎng)物維持在放空的125mL或250mL錐形搖瓶(CorningLifeSciences，Lowell，MA)或50mL放空的自旋試管(TPP，Trasadingen，Switzerland)中。將MAbB細(xì)胞用任一以下載體來(lái)轉(zhuǎn)染：零表達(dá)載體對(duì)照、含有用弗林蛋白酶pep2A連接的Mgat1和Mgat2的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體(M1M2)、含有Slc35a2的載體(S)或共轉(zhuǎn)染的Mgat1、Mgat2和Slc35a2載體(M1M2S)。這些細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中恢復(fù)至大于80％活力后，使用流式細(xì)胞術(shù)將它們單細(xì)胞克隆。對(duì)于來(lái)源于單細(xì)胞的那些細(xì)胞系，分析目標(biāo)基因的表達(dá)水平。對(duì)于四種不同載體中的每個(gè)，分析大于40個(gè)克隆的構(gòu)型的目標(biāo)基因的表達(dá)并且基于此分析而選擇二十種過(guò)表達(dá)細(xì)胞系和十種對(duì)照細(xì)胞系以用于基本如先前所述進(jìn)行的兩個(gè)獨(dú)立10天補(bǔ)料分批生產(chǎn)操作中的進(jìn)一步表征。在第一補(bǔ)料分批生產(chǎn)開(kāi)始時(shí)，平均來(lái)說(shuō)，過(guò)表達(dá)細(xì)胞系的倍增時(shí)間較高(＞25小時(shí))，并且與具有較高PDL的對(duì)照(＜25小時(shí))相比，PDL較低(圖1)。因此，為全部顯示出相似倍增時(shí)間的較小克隆亞組進(jìn)行第二10天補(bǔ)料分批實(shí)驗(yàn)(圖2)。來(lái)自第二補(bǔ)料分批實(shí)驗(yàn)的所選克隆中的mRNA表達(dá)的統(tǒng)計(jì)分析確認(rèn)了與對(duì)照相比過(guò)表達(dá)的倍數(shù)變化較為顯著。與Mgat1基因相比，Mgat2基因具有較大的表達(dá)增加倍數(shù)。下表3示出了結(jié)果。表3：三組過(guò)表達(dá)克隆的Mgat1、Mgat2和Slc35a2轉(zhuǎn)錄物水平的平均增加倍數(shù)。樣品Mgat1Mgat2Slc35A2M1M26.2426.290.99M1M2S1.457.7637.28S0.830.9927.1為了進(jìn)一步研究誘導(dǎo)的過(guò)表達(dá)水平，使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)量化Mgat1和Mgat2的蛋白質(zhì)水平。分析用空載體(EV)轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞系以及過(guò)表達(dá)Mgat1和Mgat2的兩種系(B1和B2)。下表4示出了結(jié)果。以百萬(wàn)分率(ppm)測(cè)量相對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)。表4：第10天對(duì)照細(xì)胞系和過(guò)表達(dá)Mgat1和Mgat2的兩種細(xì)胞系中的歸一化mRNA和蛋白質(zhì)水平如表4所示，EV展現(xiàn)出Mgat1和Mgat2的基礎(chǔ)表達(dá)水平，然而在B1和B2細(xì)胞系中這些蛋白質(zhì)的表達(dá)水平顯著升高。此外，在B1和B2細(xì)胞系中，與Mgat1相比，Mgat2顯示了升高的表達(dá)水平。這些數(shù)據(jù)與對(duì)于第10天Mgat1和Mgat2的mRNA表達(dá)水平所觀察到的那些數(shù)據(jù)密切相關(guān)。相比之下，在第8天和第10天(分析蛋白質(zhì)表達(dá)的兩天)對(duì)于這三種細(xì)胞系，持家對(duì)照蛋白的表達(dá)水平(GAPDH；數(shù)據(jù)未示出)保持恒定。圖3、4和5示出了生長(zhǎng)和比生產(chǎn)率在所述組之間相似；然而，與另外兩組相比，對(duì)于過(guò)表達(dá)Mgat1和2的克隆，效價(jià)顯著增加。與對(duì)照細(xì)胞(分別為70％和29％)相比，過(guò)表達(dá)Mgat1和Mgat2的細(xì)胞系(M1M2)以及過(guò)表達(dá)全部三種基因的那些克隆(M1M2S)顯示了高甘露糖水平的減少(圖6)。然而，當(dāng)與對(duì)照相比時(shí)過(guò)表達(dá)Slc35a2的細(xì)胞系(S)沒(méi)有顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的變化(圖6)。因?yàn)閁DP-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(由Slc35A2編碼的蛋白質(zhì))的作用是將核苷酸糖底物(包括UDP-GlcNAc)轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體腔中，所以如果UDP-GlcNAc水平是限制性的，則升高的Slc35a2水平將不會(huì)影響隨后的聚糖加工。為每種過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系(M1M2、M1M2S和S)評(píng)估分泌的重組MAbB的糖型特性。與對(duì)照細(xì)胞系相比，M1M2細(xì)胞系顯示了所有HM類諸如M5、M6、M7和M8b的顯著減少。結(jié)果展示于下表5中。表5：在補(bǔ)料分批的第10天過(guò)表達(dá)Mgat1、Mgat2和/或Slc35a2的細(xì)胞系中產(chǎn)生的抗體的糖基化特性在對(duì)照空載體細(xì)胞系中，A2G0F是評(píng)估的八種復(fù)合聚糖種類之中的優(yōu)勢(shì)種類(49.17％)，其次是A2G1F(16.46％)和其他復(fù)合糖型。對(duì)于M1M2和M1M2S，看到相對(duì)于不同種類百分比的相似趨勢(shì)。然而，在M1M2細(xì)胞系的情況下，與對(duì)照相比，A2G0F糖型的量顯著增加27％(顯著性值p＝0.0076)。這暗示隨著Mgat2的表達(dá)存在著雜合聚糖(A1G0M5)至A2G0的有效轉(zhuǎn)化，并且因此與對(duì)照細(xì)胞系相比，更多底物可用于巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶8(Fut8)以制造更多A2G0F產(chǎn)物。雖然在此實(shí)驗(yàn)中Slc35a2的過(guò)表達(dá)似乎不引起復(fù)合聚糖水平的顯著升高，但是這些結(jié)果表明Mgat1和Mgat2的過(guò)表達(dá)可增加HM聚糖至復(fù)合糖型的轉(zhuǎn)化，因此降低HM水平。實(shí)施例3將CHO宿主細(xì)胞系單獨(dú)用Mgat1或Mgat2轉(zhuǎn)柒，或用Mgat1和Mgat2表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染。這些細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中恢復(fù)至大于80％活力后，使用流式細(xì)胞術(shù)將它們單細(xì)胞克隆。分析總計(jì)291個(gè)克隆的Mgat1和Mgat2基因的表達(dá)。其中，基于良好生長(zhǎng)和活力而選擇表達(dá)了高于重組CHO細(xì)胞系中檢測(cè)的水平的Mgat1和Mgat2水平的48個(gè)克隆，所述重組CHO細(xì)胞系表達(dá)具有以往低水平(即，＜5％)高甘露糖類型聚糖的人單克隆抗體(MAbA)。使全部48個(gè)克隆生長(zhǎng)至少60個(gè)PDL(群體倍增水平)，并且在此時(shí)間過(guò)程期間在三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)處分析Mgat1和Mgat2的mRNA表達(dá)水平?；诟髯詍RNA的穩(wěn)定表達(dá)水平而選擇十六個(gè)克隆?；救鏡emy和Michnick(1999)，Proc.Natl.Acad.Sci.，96：5394-5399所述，為了進(jìn)一步評(píng)估這些克隆的轉(zhuǎn)柒能力，將全部48個(gè)克隆用含有綠色熒光蛋白(GFP)的載體在蛋白質(zhì)片斷互補(bǔ)測(cè)定中進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。選擇展現(xiàn)出最高轉(zhuǎn)染率的七個(gè)克隆以用于進(jìn)一步分析。表6示出前七個(gè)克隆相對(duì)于對(duì)照CHO的Mgat1和Mgat2mRNA倍數(shù)變化。表6：Mgat1和Mgat2的轉(zhuǎn)錄物水平的平均增加倍數(shù)將以往展示出高水平(即，＞15％)高甘露糖類型聚糖的單克隆抗體(MAbC)用于過(guò)表達(dá)Mgat1和/或Mgat2的改造的宿主細(xì)胞或者對(duì)照非改造的CHO宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)柒。如先前所述，創(chuàng)建穩(wěn)定細(xì)胞群并選擇以用于10天補(bǔ)料分批生產(chǎn)操作中的進(jìn)一步表征。為每種過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系評(píng)估分泌的重組MAbC的糖型特性和效價(jià)。與對(duì)照宿主相比，對(duì)于MAbC，在宿主38C2中檢測(cè)到顯著較低水平的高甘露聚糖，而沒(méi)有影響生產(chǎn)率(即，效價(jià))。表7示出了結(jié)果；數(shù)值反映出從補(bǔ)料分批生產(chǎn)試驗(yàn)獲得的第10天效價(jià)和聚糖水平。表7：表達(dá)MAbC的非擴(kuò)增克隆的效價(jià)和糖基化特性類似地，使150nM和300nM擴(kuò)增群形成并在10天補(bǔ)料分批生產(chǎn)試驗(yàn)中分析。在150nM群的情況下，與對(duì)照宿主細(xì)胞相比，所有過(guò)表達(dá)的宿主細(xì)胞展示出顯著降低的高甘露糖％，而沒(méi)有影響效價(jià)。表8和9示出了結(jié)果。表8：表達(dá)MAbC的150nM擴(kuò)增克隆的效價(jià)和糖基化特性表8續(xù)*表示P值顯著如表9所示，隨著300nM擴(kuò)增，對(duì)于五種群(61A9、45F2、63C5、38C2和2B8)檢測(cè)到顯著減小水平的高甘露聚糖水平。表9：300nM擴(kuò)增MAbC的效價(jià)和糖基化特性表9續(xù)*表示P值顯著這些結(jié)果表明了經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化以過(guò)表達(dá)Mgat1和/或Mgat2的宿主細(xì)胞可用來(lái)制備HM聚糖至復(fù)合糖型的轉(zhuǎn)化增加的重組蛋白，并且因此降低HM水平。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3