一種聚乙烯醚醇胺雙水相萃取螺旋藻藻藍(lán)蛋白的分離技術(shù)的制作方法
【專利摘要】一種聚乙烯醚醇胺雙水相萃取螺旋藻藻藍(lán)蛋白的分離技術(shù)，屬于生化分離工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明步驟為：聚乙烯醚醇胺的制備；雙水相萃取藻藍(lán)蛋白；藻藍(lán)蛋白水溶液經(jīng)濃縮和冷凍干燥后獲得藻藍(lán)蛋白粉；蛋白回收率可達(dá)75～87％。該方法簡單，對(duì)螺旋藻破壁液直接使用聚乙烯醚醇胺進(jìn)行富集分離，簡化了純化過程的步驟，選擇性高，分離得到的藻藍(lán)蛋白的光譜純度達(dá)到A620/A280>2.4。原料可采用螺旋藻鮮藻或干藻粉，從而提供了一種解決螺旋藻資源高值規(guī)?；玫募夹g(shù)方法。
【專利說明】一種聚乙烯醚醇胺雙水相萃取螺旋藻藻藍(lán)蛋白的分離技術(shù)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供一種聚乙烯醚醇胺的制備方法，用于從螺旋藻破壁液中雙水相萃取藻藍(lán)蛋白。屬于生化分離工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]螺旋藻藻藍(lán)蛋白存在于螺旋藻的藻膽體中。藻膽體是紅藻和藍(lán)藻所特有的一種超分子捕光色素復(fù)合體。藻藍(lán)蛋白色澤呈明亮的藍(lán)色，顏色鮮艷，是食品、高級(jí)眼影、唇膏的首選純天然色素。藻藍(lán)蛋白還可以調(diào)節(jié)和合成人體代謝所需要的多種重要酶，具有明顯的抗氧化、抗炎癥作用，調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能。高純度的藻藍(lán)蛋白帶有很強(qiáng)的熒光，制成的純天然熒光試劑，用于臨床醫(yī)學(xué)診斷，免疫化學(xué)及生物醫(yī)學(xué)工程等研究領(lǐng)域。
[0003]在我國，每年的螺旋藻全國總產(chǎn)量已達(dá)到7000噸。螺旋藻產(chǎn)量的三分之一用于直接出口，其它螺旋藻多以藻粉、微藻藻片和灌注膠囊的形式當(dāng)作保健品使用。螺旋藻的規(guī)?；_發(fā)和利用處于初級(jí)加工階段，還沒有深加工產(chǎn)品。螺旋藻中藻藍(lán)蛋白的提取還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，沒有適合于工業(yè)化生產(chǎn)的好的工藝方法。目前，市場(chǎng)上銷售的高純度的藻藍(lán)蛋白商品都是從國外進(jìn)口，價(jià)格昂貴，在應(yīng)用上受到限制。
[0004]因此，開發(fā)簡便、快速的螺旋藻藻藍(lán)蛋白的提取過程，提高螺旋藻藻藍(lán)蛋白產(chǎn)品純度是目前螺旋藻藻藍(lán)蛋白的規(guī)模化開發(fā)利用中亟待解決的關(guān)鍵問題。聚合物雙水相分離蛋白質(zhì)具有生物相容性高，操作條件溫和，易于進(jìn)行連續(xù)化操作等優(yōu)點(diǎn)。已報(bào)道的有關(guān)制備藻類藻藍(lán)蛋白的雙水相萃取分離藻藍(lán)蛋白的專利技術(shù)，例如中國專利CN103880950A采用價(jià)格昂貴的離子液體組成聚合物-水相，增加生產(chǎn)成本，CN102993297A.CN101891809A等采用市售的PEG組成聚合物-水相，分離藻藍(lán)蛋白的選擇性差，需要與鹽析等其它提取手段聯(lián)合使用才能得到高純度產(chǎn)品，過程繁瑣。
[0005]本發(fā)明提供一種對(duì)藻藍(lán)蛋白具有特異性萃取能力的聚乙烯醚醇胺，可通過雙水相萃取方式從螺旋藻破壁液中直接分離純化藻藍(lán)蛋白，無需與鹽析等其它提取手段聯(lián)合使用，就能得到高純度藻藍(lán)蛋白。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種聚乙烯醚醇胺的制備方法，用于雙水相萃取分離螺旋藻藻藍(lán)蛋白，獲得高純度的藻藍(lán)蛋白，應(yīng)用于天然色素、保健食品和新藥的研究開發(fā)。
[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種聚乙烯醚醇胺的制備方法，用于從螺旋藻破壁液中萃取分離藻藍(lán)蛋白。其方法簡單，快捷，成本低，分離藻藍(lán)蛋白具有較高的純度，原料既可采用新鮮螺旋藻也可采用螺旋藻干粉，從而提供了一種解決螺旋藻藻藍(lán)蛋白資源規(guī)模化利用的方法。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種聚乙烯醚醇胺雙水相萃取螺旋藻藻藍(lán)蛋白的分離技術(shù)，步驟為:
[0009](I)聚乙烯醚醇胺的制備；(2)從螺旋藻破壁清液兩相萃取藻藍(lán)蛋白；⑶藻藍(lán)蛋白水溶液經(jīng)濃縮和冷凍干燥后獲得藻藍(lán)蛋白粉。
[0010]所述的方案，步驟I中，在圓底燒瓶中放入聚乙二醇，恒壓漏斗中裝入三溴化磷，三溴化磷與聚乙二醇的重量比為1:2?3，在磁力攪拌下將三溴化磷緩慢滴入圓底燒瓶中，滴加時(shí)間為0.5小時(shí)，滴加完畢后，升溫至60?90°C反應(yīng)5?8小時(shí)，在反應(yīng)混合物中緩慢滴入去離子水，直至燒瓶中的黃色蒸氣消除，然后在反應(yīng)混合物中加入500?100ml 二氯甲烷，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用250ml的25%碳酸鈉水溶液洗滌三次，收集下層液體，將下層溶液蒸餾去除二氯甲烷后得到溴代聚乙烯醚。在溴代聚乙烯醚中，加入醇胺，醇胺與溴代聚乙烯醚之間重量比為1:2?5，在70?90°C下反應(yīng)4?6小時(shí)，然后升溫至120?140°C反應(yīng)12?16小時(shí)，將反應(yīng)物中在80?100°C下真空蒸餾I小時(shí)，加入500?100ml無水乙醇，過濾獲得聚乙烯醚醇胺。
[0011]所述的方案，步驟2中，螺旋藻破壁清液的制備:采用水或磷酸緩沖液作提取劑，磷酸緩沖液的濃度為25?100mmol/L，藻粉或鮮藻與提取液的固液比為1:50?1:150，攪拌均勻后，置于-10°C?_20°C下冷凍一定時(shí)間后，37°C溶解，如此反復(fù)凍融4-6次，融化后離心獲得的破壁清液，破壁清液中蛋白質(zhì)濃度為1.0?5.6mg/ml，藻藍(lán)蛋白純度為0.5?
0.72。
[0012]所述的方案，步驟2中，在螺旋藻破壁清液中加入聚乙烯醚醇胺和無機(jī)鹽，聚乙烯醚醇胺:無機(jī)鹽:破壁清液的重量比為0.05?0.35:0.25?0.4:1，震蕩混合2分鐘，靜置分相，藻藍(lán)蛋白富集于上相；將含藻藍(lán)蛋白的上相經(jīng)截留分子量為30000道爾頓的超濾膜過濾，去除聚乙烯醚醇胺和無機(jī)鹽，獲得藻藍(lán)蛋白水溶液，純度為2.4?4.2，蛋白濃度為
4.15 ?6.6mg/ml。
[0013]所述的方案，步驟3中，將藻藍(lán)蛋白水溶液在60°C下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍干燥后得到藻藍(lán)蛋白粉末。
[0014]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，主要具有以下優(yōu)點(diǎn):1.聚乙烯醚醇胺對(duì)藻藍(lán)蛋白的選擇性高，適合不同規(guī)模和場(chǎng)地的工業(yè)化生產(chǎn)要求；2.聚乙烯醚醇胺可直接從螺旋藻破壁清液中萃取獲得高純度的藻藍(lán)蛋白，無需其它提取手段配合，生產(chǎn)成本低；3.制備藻藍(lán)蛋白的原料可以是螺旋藻鮮藻或者干藻粉，有效地解決螺旋藻資料的利用和高值化問題。

【具體實(shí)施方式】
[0015]實(shí)施實(shí)例I
[0016](I)螺旋藻破壁清液的制備
[0017]取產(chǎn)于江蘇東臺(tái)市賜百年生物工程有限公司的鈍頂螺旋藻干粉，用去離子水作提取劑，藻粉與去離子水的固液比為1:55，置于-20°c下冷凍3小時(shí)后，37°C融解，如此反復(fù)凍融4次，融化后的藍(lán)藻破壁液用離心機(jī)在6000轉(zhuǎn)/min下離心10分鐘，取上清液為破壁清液，清液中蛋白質(zhì)濃度為1.2mg/ml，藻藍(lán)蛋白純度A620ZA280為0.75mg/ml。
[0018](2)聚乙烯醚醇胺的制備
[0019]在100ml的圓底燒瓶中放入10g聚乙二醇PEG-500 (購自海安石油化工廠)，PEG-500的平均分子量為500，恒壓漏斗中裝入50g三溴化磷(購自淮安市鑫鑫化工有限公司)，在磁力攪拌下將三溴化磷緩慢滴入圓底燒瓶中，滴加時(shí)間為0.5小時(shí)，滴加完畢后，升溫至60°C反應(yīng)5小時(shí)，在反應(yīng)混合物中緩慢滴入去離子水，直至燒瓶中的黃色蒸氣消除，力口Λ500ml 二氯甲烷(購自淄博市臨淄天德精細(xì)化工研究所)，將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用250ml的25%碳酸鈉(購自協(xié)成化工原料)水溶液洗滌三次，收集下層液體蒸餾去除二氯甲烷，獲得溴代聚乙烯醚。在溴代聚乙烯醚中，加入一乙醇胺(購自蘇州凱奇化工)，一乙醇胺與溴代聚乙烯醚之間重量比為1:2，在70°C下反應(yīng)4小時(shí)，然后升溫至120°C反應(yīng)12小時(shí)，將反應(yīng)物中在80°C下真空蒸餾I小時(shí)，加入500ml無水乙醇，過濾獲得聚乙烯醚醇胺。
[0020](3)兩相萃取
[0021]在1g螺旋藻破壁清液中加入1.2g聚乙烯醚醇胺和2.5g無水硫酸鈉(購自南京大唐化工有限責(zé)任公司)，震蕩混合2分鐘，靜置分相，藻藍(lán)蛋白富集于上相，上相經(jīng)截留分子量為30000道爾頓的超濾膜(頗爾過濾器有限公司)過濾，去除聚乙烯醚醇胺和硫酸鈉，獲得藻藍(lán)蛋白水溶液，純度為2.5，蛋白濃度為4.15mg/ml。
[0022](4)冷凍干燥獲得藻藍(lán)蛋白粉
[0023]將前述步驟(3)中獲得的藻藍(lán)蛋白水溶液在60°C下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍干燥后得到藻藍(lán)蛋白粉產(chǎn)品。產(chǎn)品中藻藍(lán)蛋白純度A62tlA28tl為2.5，蛋白回收率為80%。
[0024]實(shí)施例2
[0025](I)螺旋藻破壁液的制備
[0026]取產(chǎn)于江蘇大豐賜百年生物科技有限公司的新鮮螺旋藻，用lOOmmol/L磷酸緩沖液作提取劑，螺旋藻與去離子水的固液比為1:80，置于-10°C下冷凍4小時(shí)后，37°C融解，如此反復(fù)凍融5次。融化后的藍(lán)藻破壁液用離心機(jī)在6000轉(zhuǎn)/min下離心10分鐘，取上清液為破壁清液，清液中蛋白質(zhì)濃度為3.lmg/ml，藻藍(lán)蛋白純度A62(l/A28(l為0.55。
[0027](2)聚乙烯醚醇胺的制備
[0028]在100ml的圓底燒瓶中放入10g聚乙二醇PEG-2000 (購自海安石油化工廠)，PEG-3000的平均分子量為2000，恒壓漏斗中裝入35g三溴化磷(購自淮安市鑫鑫化工有限公司)，在磁力攪拌下將三溴化磷緩慢滴入圓底燒瓶中，滴加時(shí)間為0.5小時(shí)，滴加完畢后，升溫至80°C反應(yīng)7小時(shí)，在反應(yīng)混合物中緩慢滴入去離子水，直至燒瓶中的黃色蒸氣消除，然后在反應(yīng)混合物中加入800ml 二氯甲烷(購自淄博市臨淄天德精細(xì)化工研究所)，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用250ml的25%碳酸鈉(購自協(xié)成化工原料)水溶液洗滌三次，收集下層液體，將下層溶液蒸餾去除二氯甲烷后得到溴代聚乙烯醚。在溴代聚乙烯醚中，加入二乙醇胺(購自蘇州凱奇化工)，醇胺與溴代聚乙烯醚之間重量比為1: 4，在80°C下反應(yīng)5小時(shí)，然后升溫至130°C反應(yīng)14小時(shí)，將反應(yīng)物中在90°C下真空蒸餾I小時(shí)，加入800ml無水乙醇，過濾獲得聚乙烯醚醇胺。
[0029](3)兩相萃取
[0030]在1g螺旋藻破壁清液中加入2g聚乙烯醚醇胺和2.5g無水硫酸鎂(購自南京大唐化工有限責(zé)任公司)，震蕩混合2分鐘，靜置分相，藻藍(lán)蛋白富集于上相，將上相經(jīng)截留分子量為30000道爾頓的超濾膜(頗爾過濾器有限公司)過濾，去除聚乙烯醚醇胺和硫酸鎂，獲得藻藍(lán)蛋白水溶液，純度為4.1，蛋白濃度為5.8mg/ml。
[0031](5)冷凍干燥獲得藻藍(lán)蛋白粉
[0032]將前述步驟(3)中獲得的藻藍(lán)蛋白水溶液在60°C下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍干燥后得到藻藍(lán)蛋白粉產(chǎn)品。產(chǎn)品中藻藍(lán)蛋白純度A62tlA28tl為4.2，蛋白回收率75 %。
[0033]實(shí)施例3
[0034](I)螺旋藻破壁液的制備
[0035]取產(chǎn)于云南麗江程海源螺旋藻基地的螺旋藻粉，用50mmol/L磷酸緩沖液作提取齊U，螺旋藻與去離子水的固液比為1:100，置于-201:下冷凍5小時(shí)后，371:融解，如此反復(fù)凍融5次。融化后的藍(lán)藻破壁液用離心機(jī)在6000轉(zhuǎn)/min下離心10分鐘，取上清液為破壁清液，清液中的藻藍(lán)蛋白純度A62Q/A28Q為0.72，破壁液蛋白質(zhì)濃度為4.6mg/ml mg/ml。
[0036](2)聚乙烯醚醇胺的制備
[0037]在2000ml的圓底燒瓶中，放入10g聚乙二醇PEG-4000 (購自海安石油化工廠)，PEG-4000的平均分子量為4000g每摩爾，恒壓漏斗中裝入35g三溴化磷(購自淮安市鑫鑫化工有限公司)，在磁力攪拌下將三溴化磷緩慢滴入圓底燒瓶中，滴加時(shí)間為0.5小時(shí)，滴加完畢后，升溫至90°C反應(yīng)8小時(shí)，在反應(yīng)混合物中緩慢滴入去離子水，直至燒瓶中的黃色蒸氣消除，然后在反應(yīng)混合物中加入100ml 二氯甲烷(購自淄博市臨淄天德精細(xì)化工研究所)，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用250ml的25 %碳酸鈉水溶液洗滌三次，收集下層液體，將下層溶液蒸餾去除二氯甲烷后得到溴代聚乙烯醚。在溴代聚乙烯醚中，加入一乙醇胺(購自蘇州凱奇化工)，一乙醇胺與溴代聚乙烯醚之間重量比為1: 5，在90°C下反應(yīng)6小時(shí)，然后升溫至140°C反應(yīng)16小時(shí)，將反應(yīng)物中在100°C下真空蒸餾I小時(shí)，加入100ml無水乙醇，過濾獲得聚乙烯醚醇胺。
[0038](3)雙水相萃取
[0039]在1g螺旋藻破壁清液中加入3.5g聚乙烯醚醇胺和4g無水硫酸銨(購自南京大唐化工有限責(zé)任公司)，震蕩混合2分鐘，靜置分相，藻藍(lán)蛋白富集于上相，將上相經(jīng)截留分子量為30000道爾頓的超濾膜(頗爾過濾器有限公司)過濾，去除聚乙烯醚醇胺和硫酸銨，獲得藻藍(lán)蛋白水溶液，純度為3.5，蛋白濃度為6.6mg/ml。
[0040](4)冷凍干燥獲得藻藍(lán)蛋白粉
[0041]將前述步驟(3)中獲得的藻藍(lán)蛋白水溶液在60°C下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍干燥后得到藻藍(lán)蛋白粉產(chǎn)品。產(chǎn)品中藻藍(lán)蛋白純度A62tlA28tl為3.5，蛋白回收率85%。
【權(quán)利要求】
1.一種聚乙烯醚醇胺雙水相萃取螺旋藻藻藍(lán)蛋白的分離技術(shù)，其特征在于步驟為--聚乙烯醚醇胺的制備；雙水相萃取藻藍(lán)蛋白；藻藍(lán)蛋白水溶液經(jīng)濃縮和冷凍干燥后獲得藻藍(lán)蛋白粉。 (1)聚乙烯醚醇胺的制備:在圓底燒瓶中放入聚乙二醇，恒壓漏斗中裝入三溴化磷，三溴化磷與聚乙二醇的重量比為1:2?3，在磁力攪拌下將三溴化磷緩慢滴入圓底燒瓶中，滴加時(shí)間為0.5小時(shí)，滴加完畢后，升溫至60?90°C反應(yīng)5?8小時(shí)，在反應(yīng)混合物中緩慢滴入去離子水，直至燒瓶中的黃色蒸氣消除，然后在反應(yīng)混合物中加入500?100ml 二氯甲烷，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用250ml的25%碳酸鈉水溶液洗滌三次，收集下層液體，將下層溶液蒸餾去除二氯甲烷后得到溴代聚乙烯醚。在溴代聚乙烯醚中，加入醇胺，醇胺與溴代聚乙烯醚之間重量比為1:2?5，在70?90°C下反應(yīng)4?6小時(shí)，然后升溫至120?140°C反應(yīng)12?16小時(shí)，將反應(yīng)物中在80?100°C下真空蒸餾I小時(shí)，加入500?100ml無水乙醇，過濾獲得聚乙烯醚醇胺。 (2)雙水相萃取:在螺旋藻破壁清液中加入聚乙烯醚醇胺和無機(jī)鹽，聚乙烯醚醇胺:無機(jī)鹽:破壁清液的重量比為0.05?0.35:0.25?0.4:1，震蕩混合2分鐘，靜置分相，藻藍(lán)蛋白富集于上相。 (3)將上述含藻藍(lán)蛋白的上相經(jīng)截留分子量為30000道爾頓的超濾膜過濾，去除聚乙烯醚醇胺和無機(jī)鹽，獲得藻藍(lán)蛋白水溶液，純度為2.4?4.2，蛋白濃度為4.15?6.6mg/ml ο (4)將藻藍(lán)蛋白水溶液在60°C下真空濃縮至原體積三分之一，冷凍干燥后得到藻藍(lán)蛋白粉末。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙烯醚醇胺的制備方法，其特征在于采用的聚乙二醇的平均分子量可以為 500、1000、2000、3000、4000。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚乙烯醚醇胺的制備方法，其特征在于采用的醇胺可以為一乙醇胺、二乙醇胺。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的兩相萃取方法，其特征在于，用于成相的無機(jī)鹽可以為無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、無水硫酸銨、無水氯化鈉、無水磷酸鉀。
【文檔編號(hào)】C08G65/00GK104387468SQ201410683114
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月24日
【發(fā)明者】宋佳玉, 張杜炎, 石敏, 覃曉雨, 韓震, 王峰 申請(qǐng)人:江南大學(xué)