專利名稱：取代的4－聯(lián)芳基丁酸和5－聯(lián)芳基戊酸衍生物作為治療呼吸疾病的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制 ...的制作方法
領(lǐng)域本發(fā)明涉及酶抑制劑的用途，更具體而言，涉及新的和已知的抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的4-聯(lián)芳基丁酸和5-聯(lián)芳基戊酸及其衍生物用于預(yù)防和治療呼吸疾病的用途。
背景在WO96/1 5096、WO97/43237、WO97/43238、WO97/43239、WO97/43240、WO97/43245、WO97/43247和WO98/22436中描述了取代的4-聯(lián)芳基丁酸和5-聯(lián)芳基戊酸衍生物用作基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑。
基質(zhì)金屬蛋白酶(metrix metallo proteases)(基質(zhì)金屬內(nèi)切-蛋白酶或MMP)是一類鋅內(nèi)切蛋白酶，其包括但不限于間質(zhì)膠原酶(MMP-1)、溶基質(zhì)素(蛋白聚糖酶、transin或MMP-3)、明膠酶A(72kDa明膠酶或MMP-2)、嗜中性膠原酶(MMP-8)、明膠酶B(95kDa明膠酶或MMP-9)、巨噬細(xì)胞彈性蛋白酶(MMP-12)和人膠原酶3(MMP13)。這些MMP與已知的TIMP(金屬蛋白酶的組織抑制劑)的天然蛋白酶抑制劑一起由多種包括成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌。
所有這些MMP都可以破壞關(guān)節(jié)軟骨或基膜的結(jié)締組織成分以及大量胞外基質(zhì)蛋白。各種MMP以非活性酶原被分泌，該酶原在其能夠顯示其蛋白水解活性之前，必須在后續(xù)步驟中裂解。除了基質(zhì)的破壞作用之外，這些MMP如MMP-3已被用作其它MMP如MMP-1和MMP-9的體內(nèi)活化劑(A.Ho，H.Nagase，Arch.Biochem.Biophys.，267，211-16(1998)；Y.Ogata，J.J.Enghild，H.Nagase，J.Biol.Chem.，267，3581-84(1992))。因此，一系列蛋白水解活性可以由過量的MMP-3引發(fā)。這意味著特定的MMP-3抑制劑將限制那些不直接由這類抑制劑抑制的其它MMP的活性。
除了其能夠降解胞外基質(zhì)蛋白之外，MMP-12也顯示可水解彈性蛋白(R.P.Mecham，T.J.Broekelmann，C.J.Fliszar，S.D.Shapiro，H.G.Welgus，R.M.Senior，J.Biol.Chem.，272，18071-18076(1997))。該活性是其它MMP酶特別是MMP-2和MMP-9所共有的。
也已報導(dǎo)MMP-3、MMP-9和MMP-12可以裂解從而使其它蛋白酶如彈性蛋白酶的內(nèi)源性抑制劑失活(P.G.Winyard，Z.Zhang，K.Chidwick，D.R.Blake，R.W.Carrell，G.Murphy，F(xiàn)EBS Letts.，279，1，91-94(1991)；T.J.Gronski，R.L.Martin，D.K.Kobayashi，B.C.Wal sh，M.C.Holman，M.Huber，H.E.Van Wart，S.D.Shapiro，J.Biol.Chem.，272，12189-12194(1997))。因此這些MMP酶抑制劑可以通過改變其內(nèi)源抑制劑的水平而影響其它破壞性蛋白酶的活性。
沒有MMP-12的小鼠的巨噬細(xì)胞在體外和體內(nèi)均具有減少的降解胞外基質(zhì)組分以及穿過重組基膜的能力(J.M.Shipley，R.L.Wesselschmidt，D.K.Kobayashi，T.J.Ley，S.D.Shapiro，PNAS，93，3942-3946(1996))。這些結(jié)果支持了一種假設(shè)，即需要MMP-12進(jìn)行巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的胞外蛋白水解和組織侵入。此外，相對于吸煙，沒有MMP-12的小鼠并沒有形成肺氣腫或顯示升高的巨噬細(xì)胞水平，而野生小鼠卻存在這種現(xiàn)象(R.D.Hautamaki，D.K.Kobayashi，R.M.Senior，S.D.Shapiro，Science，277，2002-2004(1997))。因此存在很強的證據(jù)支持由活化的塵細(xì)胞分泌的MMP-12在形成肺氣腫的作用。在具有肺氣腫的病人和吸煙者中，活化的塵細(xì)胞和嗜中性細(xì)胞釋放的MMP-1、-8、-9和-12也被包含在COPD的發(fā)病機理中。
通過其蛋白水解活性，基質(zhì)金屬蛋白酶被牽涉于大量呼吸疾病中，例如如下哮喘；慢性阻塞肺疾病包括慢性支氣管炎和肺氣腫；囊性纖維化；支氣管擴(kuò)張；成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS)；過敏性呼吸疾病包括過敏性鼻炎；與TNF α產(chǎn)生有關(guān)的疾病包括急性肺纖維變性疾病、肺結(jié)節(jié)病、矽肺；煤礦工人的塵肺病、肺泡病。
通過下列參考文獻(xiàn)提供在多種呼吸疾病中涉及基質(zhì)金屬蛋白酶的證據(jù)
除了慢性肺疾病之外，大量其它條件被認(rèn)為是由過量或不希望的破壞基質(zhì)金屬蛋白酶活性，或通過MMP與TIMP的比率失調(diào)，或通過TNF釋放的作用所介導(dǎo)的。
MMP抑制劑也可用于抑制其它哺乳動物的金屬蛋白酶，如adamalysin族(或ADAM)，其成員包括TNFα轉(zhuǎn)化酶(TACE)和ACAM-10，其可引起細(xì)胞中TNF的釋放。
概述本發(fā)明涉及具有基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑活性的通式(I)的新的和已知的化合物用于預(yù)防和治療呼吸疾病的用途(T)xA-B-D-E-CO2H(I)在上述通式(I)中，(T)xA代表取代的或未取代的芳族6元環(huán)或含有1-2個N、O或S原子的雜芳族5-6元環(huán)。T代表一種或多種取代基，下標(biāo)x代表這種取代基的數(shù)目，以及A代表芳環(huán)或雜芳環(huán)，稱為A環(huán)或A單元。當(dāng)在A環(huán)中N與S或與O一起使用時，這些雜原子被至少一個碳原子所分開。
取代基T獨立地選自鹵素；烷基、鹵代烷基；鹵代烷氧基；鏈烯基；鏈炔基；-(CH2)pQ其中p為0或1-4的整數(shù)；-鏈烯基-Q其中鏈烯基部分含有2-4個碳原子；以及鏈炔基-Q其中鏈炔基部分含有2-7個碳原子。后三種基團(tuán)中的Q選自芳基、雜芳基、-CN、-CHO、-NO2、-CO2R2、-OCOR2、-SOR3、-SO2R3、-CON(R4)2、-SO2N(R4)2、-COR2、-N(R4)2、-N(R2)COR2、-N(R2)CO2R3、-N(R2)CON(R4)2、-CHN4、-OR4和-SR4。
在這些式中，R2代表H；烷基；芳基；雜芳基；芳烷基或雜芳烷基。R3代表烷基；芳基；雜芳基；芳烷基或雜芳烷基。R4代表H；烷基；芳基；雜芳基；芳烷基；雜芳烷基；鏈烯基；鏈炔基；末端為H、烷基或苯基的亞烷基氧基、多亞烷基氧基、亞烷基硫基或亞烷基氨基；鹵代烷基；低級烷氧基羰基或?；?。當(dāng)兩個R4基團(tuán)位于氮上時，它們可由鍵連接在一起形成雜環(huán)，如嗎啉、硫代嗎啉、吡咯烷或哌啶環(huán)。
與Q相連的部分中或是Q的部分的不飽和部位被至少一個碳原子與Q的任何N、O或S相隔。A環(huán)可為未取代或可帶有至多2個取代基T。因此下標(biāo)x為0、1或2。
在通式(I)中，B代表一個鍵或任選取代的芳族6元環(huán)或含有1-2個N、O或S的雜芳5-6元環(huán)。當(dāng)B為環(huán)時，優(yōu)選作為B環(huán)或B單元。B環(huán)中，當(dāng)N與S或O一起使用時，這些雜原子被至少一個碳原子分開。在環(huán)B中可有0-2個取代基T。
通式(I)中，D代表 其中R2如上定義，且各個R2可相同或不同。
通式(I)中，E代表帶有m個取代基R6的n個碳原子的鏈，其中R6基團(tuán)為獨立的取代基，或構(gòu)成螺環(huán)或非螺環(huán)。可以以兩種方式成環(huán)a)兩個R6基團(tuán)相連，且同與兩個R6基團(tuán)連接的鏈原子，以及任何插入的鏈原子共同構(gòu)成3-7元環(huán)，或b)一個R6基團(tuán)連接到該基團(tuán)R6所在的鏈上，和與R6基團(tuán)相連的鏈原子，以及任何插入的鏈原子共同構(gòu)成3-7元環(huán)。鏈中的碳原子數(shù)為2-4，R6取代基的數(shù)目m為1-3的整數(shù)。
各個R6基團(tuán)獨立地選自下列*氟；*羥基，條件是單個碳原子可帶有不大于一個羥基；
*烷基；*芳基；*雜芳基；*芳烷基；*雜芳烷基；*鏈烯基；*芳基取代的鏈烯基；*雜芳基取代的鏈烯基；*鏈炔基；*芳基取代的鏈炔基；*雜芳基取代的鏈炔基；*-(CH2)tR7，其中t為0或1-5的整數(shù)，以及R7選自下列基團(tuán)*N-苯二甲酰亞氨基(phthal imidoyl)；N-(1，2-萘二酰亞氨基)(naphthalenedicarboximidoyl)；*N-(2，3-萘二酰亞氨基)；*N-(1，8-萘二酰亞氨基)；*N-吲哚基(indoloyl)；*N-(2-吡咯烷酰基)(pyrrolodinonyl)*N-琥珀酰亞氨基；*N-馬來酰亞氨基；*3-乙內(nèi)酰脲基；*1，2，4-尿唑基(urazolyl)*酰氨基；*尿烷；*脲；*非芳族取代的或未取代的雜環(huán)，含有N原子并通過N原子連接，并含有一個或兩個另外的N、O、S、SO或SO2，以及含有0、1或2個羰基，任選帶有稠合或吡啶環(huán)；*氨基；*相應(yīng)的雜芳基部分，其中含芳基的R7中的芳基部分包含4-9個碳原子和至少一個N、O或S雜原子；*-(CH2)vZR8，其中v為0或1-4的整數(shù)，其中Z代表 以及R8選自下列基團(tuán)*烷基；*芳基；*雜芳基；*芳烷基；*雜芳烷基，以及*-C(O)R9，其中R9代表至少兩個碳的烷基、芳基、雜芳基、芳烷基或雜芳烷基；條件是-當(dāng)R8為-C(O)R9時，Z為S或O；-當(dāng)Z為O時，R8也可為亞烷基氧基或多亞烷基氧基，其末端為H、烷基或苯基；*三烷基甲硅烷基取代的烷基。
此外，任何T或R6基團(tuán)的芳基或雜芳基部分可任選帶有至多兩個取代基，所述取代基選自-(CH2)yC(R4)(R3)OH、-(CH2)yOR4、-(CH2)ySR4、-(CH2)yS(O)R4、-(CH2)yS(O)2R4、-(CH2)ySO2N(R4)2、-(CH2)yN(R4)2、-(CH2)yN(R4)COR12、-OC(R4)2O-，其中兩個氧原子連接到芳環(huán)上、(CH2)yCOR4、-(CH2)yCON(R4)2、-(CH2)yCO2R4、-(CH2)yOCOR4、-鹵素、-CHO、-CF3、-NO2、-CN和-R3，其中y為0-4。R3和R4如上定義；此外，任何兩個連接到一個氮上的R4可連接在一起形成雜環(huán)，如嗎啉、硫代嗎啉、吡咯烷或哌啶環(huán)。
這些化合物的藥學(xué)可接受的鹽以及這些化合物的常用前體藥物，如含有羥基的本發(fā)明化合物的O-?；苌镆苍诒景l(fā)明的范圍之內(nèi)。
在現(xiàn)有技術(shù)最相關(guān)的化合物中，分子中的聯(lián)苯部分為未取代的，丙酸或丁酸部分或為未取代的，或帶有一個甲基或苯基。已經(jīng)報導(dǎo)由于較大的苯基基團(tuán)的存在使得現(xiàn)有技術(shù)的化合物作為消炎止痛劑失活。參見例如R.G.Child等，J.Pharm.Sci.，66，466-476(1977)。相反，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)顯示潛在MMP抑制劑活性的化合物在分子的丙酸或丁酸部分中含有較大的取代基。最佳的MMP抑制劑的聯(lián)苯部分也優(yōu)選在4’位上含有取代基，盡管當(dāng)丙酸或丁酸部分被最優(yōu)取代時，本發(fā)明未取代的聯(lián)苯化合物充分的活性從而被看作是實際藥物的候選。
較之其它MMP如MMP-1和MMP-7，本發(fā)明的化合物對于MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-12和MMP-13具有良好的活性，且對于這些MMP具有良好的選擇性。
除了上述化合物之外，本發(fā)明也涉及具有基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑活性的藥物組合物，該組合物含有上述并在下面詳述中更詳細(xì)地描述的本發(fā)明化合物，以及藥學(xué)上可接受的載體。
作為上述選擇性方式的結(jié)果，本發(fā)明的化合物特別適于治療呼吸疾病。
因此，本發(fā)明也涉及治療哺乳動物如人類、農(nóng)場動物或家庭寵物以得到效果的方法，其中該效果是治療和預(yù)防哮喘；慢性阻塞肺疾病包括慢性支氣管炎和肺氣腫；囊性纖維化；支氣管擴(kuò)張；成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS)；過敏性呼吸疾病包括過敏性鼻炎；與TNFα產(chǎn)生有關(guān)的疾病包括急性肺纖維變性疾病、肺結(jié)節(jié)病、矽肺；煤礦工人的塵肺病、肺泡病。該方法包括服用一定量的上述本發(fā)明化合物，并在下面詳述中更詳細(xì)地描述，其有效地抑制了至少一種基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，從而得到所希望的效果。詳述更特別優(yōu)選用于預(yù)防和治療呼吸疾病的是具有下列通式的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑活性的化合物(T)xA-B-D-E-CO2H(I)其中，(T)xA代表取代的或未取代的芳族部分或雜芳族部分，選自下列基團(tuán) 其中R1代表H或1-3個碳的烷基。
在這些結(jié)構(gòu)中，芳環(huán)稱為A環(huán)或A單元，且各個T代表取代基，稱為T基團(tuán)或T單元。取代基T獨立地選自鹵素-F、-Cl、-Br和-I；1-10個碳的烷基；1-10個碳的鹵代烷基；1-10個碳的鹵代烷氧基；2-10個碳的鏈烯基；2-10個碳的鏈炔基；-(CH2)pQ其中p為0或1-4的整數(shù)；-鏈烯基-Q其中鏈烯基部分含有2-4個碳；以及-鏈炔基-Q其中鏈炔基部分含有2-7個碳。后三種基團(tuán)中的Q選自6-10個碳的芳基、含有4-9個碳和至少一個N、O或S雜原子的雜芳基、-CN、-CHO、-NO2、-CO2R2、-OCOR2、-SOR3、-SO2R3、-CON(R4)2、-SO2N(R4)2、-C(O)R2、-N(R4)2、-N(R2)COR2、-N(R2)CO2R3、-N(R2)CON(R4)2、-CHN4、-OR4和-SR4。基團(tuán)R2、R3和R4如下定義。
R2代表H；1-6個碳的烷基；6-10個碳的芳基；含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子的雜芳基；芳基部分含6-10個碳且烷基部分含1-4個碳的芳烷基；或雜芳基部分含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子，且烷基部分含1-4個碳的雜芳烷基。
R3代表1-4個碳的烷基；6-10個碳的芳基；含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子的雜芳基；芳基部分含6-10個碳且烷基部分含1-4個碳的芳烷基；或雜芳基部分含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子，且烷基部分含1-4個碳的雜芳烷基。
R4代表H；1-12個碳的烷基；6-10個碳的芳基；含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子的雜芳基；芳基部分含6-10個碳且烷基部分含1-4個碳的芳烷基；雜芳基部分含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子，且烷基部分含1-4個碳的雜芳烷基；2-12個碳的鏈烯基；2-12個碳的鏈炔基；-(CqH2qO)rR5其中q為1-3，r為1-3，以及R5為H，只要q大于1，或R5為1-4個碳的烷基或苯基；末端為H、1-4個碳的烷基或苯基的亞烷基硫基；末端為H、1-4個碳的烷基或苯基的亞烷基氨基；-(CH2)sX其中s為1-3，X為鹵素；-C(O)OR2或-C(O)R2。
當(dāng)兩個R4基團(tuán)位于氮上時，它們可通過鍵連接形成雜環(huán)，例如嗎啉、硫代嗎啉、吡咯烷或哌啶環(huán)。
與Q相連的部分或是Q部分中的不飽和部位被至少一個碳原子與Q的任一N、O或S相隔。取代基的數(shù)目，稱為x，為0、1或2。
在通式(I)中，B代表單鍵或任選取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，選自下列基團(tuán) 其中R1如上定義。這些環(huán)稱為B環(huán)或B單元。在B環(huán)上可有0-2個取代基T，T如上定義。
通式(I)中，D代表下列部分 其中R2如上定義，且各個R2可相同或不同。
通式(I)中，E代表帶有m個取代基R6的碳原子鏈，稱為R6基團(tuán)或R6單元。其中R6基團(tuán)為獨立的取代基，或構(gòu)成螺環(huán)或非螺環(huán)?？梢砸詢煞N方式形成環(huán)a)兩個R6基團(tuán)相連，且同與兩個R6基團(tuán)連接的鏈原子，以及任何插入的鏈原子共同構(gòu)成3-7元環(huán)，或b)一個R6基團(tuán)連接到該基團(tuán)R6所在的鏈上，和與R6基團(tuán)相連的鏈原子，以及任何插入的鏈原子共同構(gòu)成3-7元環(huán)。鏈中的碳原子數(shù)n為2或3，R6取代基的數(shù)目為1-3的整數(shù)。
各個R6基團(tuán)獨立地選自下列1)～16)所列的取代基1)氟；2)羥基，條件是單個碳原子可帶有不超過一個羥基；3)1-10個碳的烷基；4)6-10個碳的芳基；5)含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子的雜芳基；6)芳基部分含6-10個碳且烷基部分含1-8個碳的芳烷基；7)雜芳基部分含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子，且烷基部分含1-8個碳的雜芳烷基；8)2-10個碳的鏈烯基；9)芳基部分含6-10個碳且鏈烯基部分含2-5個碳的芳基-鏈烯基；10)雜芳基部分含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子，且鏈烯基部分含2-5個碳的雜芳基-鏈烯基；11)2-10個碳的鏈炔基；12)芳基部分含6-10個碳鏈且炔基部分含2-5個碳的芳基-鏈炔基；13)雜芳基部分含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子，且鏈炔基部分含2-5個碳的雜芳基-鏈炔基；14)-(CH2)tR7，其中t為0或1-5的整數(shù)，R7選自下列基團(tuán) 以及相應(yīng)的雜芳基部分，其中含芳基R7基團(tuán)的芳基部分含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子。在這樣的R7基團(tuán)中，Y代表O或S；R1、R2和R3如上定義，u為0、1或2。
15)-(CH2)vZR8，其中v為0或1-4的整數(shù)，其中Z代表-S-、-S(O)-、-SO2-、-O-、羰基或-CH(OH)-；以及R8選自下列基團(tuán)1-12個碳的烷基；6-10個碳的芳基；含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子的雜芳基；芳基部分含6-12個碳且烷基部分含1-4個碳的芳烷基；芳基部分含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子，且烷基部分含1-4個碳的雜芳烷基；-C(O)R9，其中R9代表2-6碳的烷基、6-10個碳的芳基、含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子的雜芳基、或芳基部分含6-10個碳的芳烷基或是含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子雜芳基，且烷基部分含1-4個碳的芳烷基，條件是-當(dāng)R8為-C(O)R9時，Z為-S-或-O-；-當(dāng)Z為-O-時，R8也可為-(CqH2qO)rR5，其中q、r和R5如上所定義；16)-(CH2)wSi(R10)3，其中w為1-3的整數(shù)，R10代表1-4個碳的烷基。
此外，任何T或R6基團(tuán)的芳基或雜芳基部分可任選帶有至多兩個取代基，所述取代基選自-(CH2)yC(R4)(R3)OH、-(CH2)yOR4、-(CH2)ySR4、-(CH2)yS(O)2R4、-(CH2)yS(O)2R4、-(CH2)ySO2N(R4)2、-(CH2)yN(R4)2、-(CH2)yN(R4)COR3、-OC(R4)2O-其中兩個氧原子連接到芳環(huán)上、(CH2)yCOR4、-(CH2)yCON(R4)2、-(CH2)yCO2R4、-(CH2)yOCOR4、-鹵素、-CHO、-CF3、-NO2、-CN和-R3，其中y為0-4。R3如上定義；R4如上定義；此外，任何兩個連接到一個氮上的R4可連接在一起形成雜環(huán)，如嗎啉、硫代嗎啉、吡咯烷或哌啶環(huán)。
這些化合物的藥物上可接受的鹽以及這些化合物的常用前體藥物，如這些化合物的O-酰基衍生物也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在本發(fā)明的化合物，優(yōu)選下列取代基T，當(dāng)其在A環(huán)上時，優(yōu)選為鹵素、1-鏈炔基-Q或為醚OR4其中R4優(yōu)選為1-12個碳的烷基，或為芳烷基，其中芳基部分為6-10個碳，烷基部分含1-4個碳。最優(yōu)選T為鹵素，或-C≡C-(CH2)tOH其中t為1-5的整數(shù)，當(dāng)T為OR4時，R4為1-6個碳的烷基或苯基。
下標(biāo)x，定義為T取代基的數(shù)目，優(yōu)選為1或2，最優(yōu)選為1，且該取代基T優(yōu)選在A環(huán)的4位上。
A環(huán)優(yōu)選為苯基或噻吩環(huán)，最優(yōu)選苯基。A環(huán)優(yōu)選帶有至少一個取代基T，優(yōu)選位于連接B環(huán)的A環(huán)位置的最遠(yuǎn)處。
通式(I)的B部分為鍵或取代的或未取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，其中任何取代基是不能引起分子無法適應(yīng)靶物酶的活性位點的基團(tuán)，或斷裂A和B環(huán)的相對構(gòu)形使之成為有害的基團(tuán)。這種基團(tuán)可為，但不限于例如低級烷基、低級烷氧基、CN、NO2、鹵素等部分。B部分優(yōu)選為1，4-亞苯基或2，5-噻吩環(huán)，最優(yōu)選1，4-亞苯基。
D單元最優(yōu)選為羰基或-CHOH-基團(tuán)。
基團(tuán)R6優(yōu)選為1)芳烷基，其中芳基部分含6-10個碳，烷基部分含1-8個碳；2)-(CH2)tR7，其中t為0或1-5的整數(shù)，R7為稠合到芳基殘基上的亞氯基(imidoyl)，或1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮-3-基基團(tuán)；或3)-(CH2)vZR8，其中v為0或1-4的整數(shù)，Z為S或O，R8為6-10個碳的芳基或其中芳基部分含6-12個碳且烷基部分含1-4個碳的芳烷基。
基團(tuán)R6最優(yōu)選為下列之一，其中，任何芳族部分為優(yōu)選被取代的1)其中芳基部分為苯基，烷基部分含1-4個碳的芳烷基；2)-(CH2)tR7，其中t為1-3的整數(shù)，R7為N-苯二甲酰亞氨基、1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮-3-基、N-(1，2-萘二酰亞氨基)；N-(2，3-萘二酰亞氨基)或N-(1，8-萘二酰亞氨基)；或2)-(CH2)vZR8，其中v為1-3的整數(shù)，Z為S，R8為苯基。
應(yīng)當(dāng)理解此處所用的術(shù)語“烷基”指直鏈、支鏈、環(huán)和多環(huán)的物質(zhì)。術(shù)語“鹵代烷基”指部分或全部鹵代的烷基，如-(CH2)2Cl、-CF3和-C6F13。
在一實施方案中，本發(fā)明涉及通式(I)化合物，其中至少一個單元A、B、T和R6含有雜芳環(huán)。優(yōu)選的含雜芳環(huán)的化合物為那些其中雜芳基為含有4-9個碳的5-6元雜芳環(huán)的雜芳基，當(dāng)環(huán)為5元環(huán)時含有O、S或NR1，當(dāng)所述環(huán)為6元環(huán)時含有N。特別優(yōu)選的含雜芳環(huán)化合物為那些其中至少一個A和B單元含有噻吩環(huán)的化合物。當(dāng)A單元為噻吩時，優(yōu)選連接到B環(huán)的2位位置，并在5位上帶有一個取代基T。當(dāng)B單元為噻吩時，優(yōu)選通過2位和5位分別連接到D和A單元上。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及通式(I)化合物，其中的E單元中，n為2，m為1。從而這些化合物在D單元和羧基之間具有2個碳原子，并在該兩個碳鏈上帶有一個取代基。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及通式(I)化合物，其中A環(huán)為取代的和未取代的苯基，B環(huán)為對亞苯基，任何含芳基的T的芳基部分和T的R6部分在環(huán)中僅含有碳。從而這些化合物不含有雜芳環(huán)。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及通式(I)化合物，其中m為1，R6為獨立的取代基。這些化合物為那些在E單元上僅含有一個單獨的取代基R6且該取代基不包含在環(huán)中的物質(zhì)。
優(yōu)選其中R6為-(CH2)tR7的通式(I)化合物，其t為1-5的整數(shù)。優(yōu)選其中R6為-(CH2)vZR8的通式(I)化合物，其v為1-4的整數(shù)，Z為-S-或-O-。優(yōu)選其中R6為烷基的通式(I)化合物，其在所述烷基中含有4個或更多碳的烷基，以及其中R6為芳烷基的通式(I)化合物，其在所述芳烷基的烷基部分中含2-3個碳。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及其中E單元上取代基的數(shù)目m為2或3的通式(I)化合物。當(dāng)m為2時，兩個R6基團(tuán)為獨立的取代基，或一起構(gòu)成螺環(huán)，或一個R6基團(tuán)為獨立的取代基，另一個構(gòu)成螺環(huán)；當(dāng)m為3時，兩個R6基團(tuán)為獨立的取代基，且一個R6基團(tuán)構(gòu)成環(huán)，或兩個R6基團(tuán)構(gòu)成環(huán)，以及一個R6基團(tuán)為獨立的取代基，或三個R6基團(tuán)為獨立的取代基。因此該子集包括其中E單元為二或三取代的化合物，在二取代的情況下，一個或兩個R6基團(tuán)形成的任何環(huán)為螺環(huán)，在三取代情況下，R6基團(tuán)可形成螺環(huán)或非螺環(huán)。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及其中E單元上取代基的數(shù)目m為1或2的通式(I)化合物。當(dāng)m為1時，R6基團(tuán)構(gòu)成非螺環(huán)；當(dāng)m為2時，兩個R6基團(tuán)一起構(gòu)成非螺環(huán)，或一個R6基團(tuán)為獨立的取代基，另一個構(gòu)成非螺環(huán)。因此該子集包括其中E單元帶有一個或兩個取代基R6的化合物，且至少一個這種取代基被包含在非螺環(huán)中。
更具體而言，其中一個或多個取代基R6參與非螺環(huán)形成的通式(I)代表性的化合物具有下列結(jié)構(gòu)的E單元 其中a為0、1或2；b為0或1；c為0或1；d為0或1；c+d為0或1；e為1-5；f為1-4；g為3-5；h為2-4；i為0-4；j為0-3；k為0-2；R6基團(tuán)的總數(shù)為0、1或2；U代表O、S或NR1；以及z為1或2；各個R14基團(tuán)獨立地選自下列基團(tuán)1-9個碳的烷基；其中烷基部分含有1-7個碳，芳基部分含有6-10個碳的芳烷基；2-9個碳的鏈烯基；鏈烯基部分含有2-4碳，芳基部分含有6-10個碳的芳基取代的鏈烯基；2-9個碳的鏈炔基；鏈炔基部分含有2-4碳，芳基部分含有6-10個碳的芳基取代的鏈炔基；6-10個碳的芳基；-COR3；-CH(OH)R2；-CO2R3；-CON(R2)2；-(CH2)tR7其中t為0或1-4的整數(shù)；以及-(CH2)yZR8其中v為0或1-3的整數(shù)，Z代表-S-、S(O)、SO2或-O-。R1、R7和R8如上定義。
其中一個或多個取代基R6參與形成非螺環(huán)的其它優(yōu)選的通式(I)化合物具有下列結(jié)構(gòu)的E單元 其中a、b、c、d、(c+d)、e、g、i、k、R6基團(tuán)的總數(shù)、U和R14如上定義。
其中一個或多個取代基R6參與形成非螺環(huán)，用于預(yù)防和治療呼吸疾病的其它優(yōu)選的通式(I)化合物具有下式 其中下標(biāo)x為1或2；相對于A和B環(huán)之間的連接點，一個取代基T位于A環(huán)的4位；e為2或3；R14如上定義。
更優(yōu)選的化合物為那些如表1所示的化合物 表1在上述結(jié)構(gòu)中，環(huán)戊烷衍生物情況下的術(shù)語“外消旋體”指反，反-非對映體，即，例如C-VII、C-XI、C-XVI相對于C-XVIII和C-XXIX相對于C-XXXV，是1S/R、2S/R、5R/s關(guān)系。
特別優(yōu)選使用下列化合物
(+)-4-(4’-氯[1，1’-聯(lián)苯]-4-基)-2-[2-(1，3-二氧-1，3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]-4-氧代丁酸 在本發(fā)明的另一方面，提供了通式(I’)的下列新化合物 其中CO-E-CO2H代表3-羧基-5-R7-戊-1-酮-1-基-殘基，取代基T和R7具有下表所指出的意義 表2特別優(yōu)選下列化合物(+)-2-[2-(1，3-二氧-1，3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基-4-(4’-乙氧基[1，1’-聯(lián)苯]-4-基)-4-氧代丁酸] 在本發(fā)明的另一方面，優(yōu)選的實施方案是使用通式(I’)的化合物及其鹽 其中T為(C1-C4)烷氧基、氯、溴、氟、乙酰氧基、羥基、氰基、三氟甲基或三氟甲氧基，CO-E-CO2H代表3-羧基-5-R7-戊-1-酮-1-基-或2-羧基-3-(R7-甲基)-環(huán)戊-1-基)羰基-殘基，以及R7代表下式所示的基團(tuán) 特別優(yōu)選使用下列化合物(+)-2-[2-(1，3-二氧-1，3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]-4-(4’-乙氧基[1，1，’-聯(lián)苯]-4-基)-4-氧代丁酸，
常用制備方法本發(fā)明化合物可以通過使用在WO96/1 5096、WO97/43237、WO97/43238、WO97/43239、WO97/43240、WO97/43245、WO97/43247和WO98/22436中詳細(xì)描述的已知化學(xué)反應(yīng)和工藝來制備。然而，下列一般制備方法用于幫助讀者合成該抑制劑。常用方法A～K可用于制備合適取代的4-聯(lián)芳基-4-氧代丁酸、4-芳基-4-氧代丁酸、5-聯(lián)芳基-5-氧代戊酸或5-芳基-5-氧代戊酸。這些常用方法以及酮酸代表性的制備方法也在WO9615096(1996年5月23日)中發(fā)現(xiàn)。提出了具體的合成方法的選擇，只要所用的條件不影響在制備的化合物的T或R6部分中不希望的改變。
如果沒有在下面特別指出，則這些方法的所有可變基團(tuán)都如一般性說明中所述。對于各種方法，可變的下標(biāo)n獨立地定義。當(dāng)帶有給出符號的可變基團(tuán)(即R6或T)在給出結(jié)構(gòu)中多次使用時，則應(yīng)當(dāng)理解這些基團(tuán)的各個基團(tuán)可以獨立地在該符號所定義的范圍內(nèi)變化。如上定義，本發(fā)明的化合物含有帶1-3個不定義為H的取代基R6的2或3個碳的鏈的E單元。相反，應(yīng)當(dāng)注意地是在下述常用的方法圖解中，采用R6基團(tuán)如果其定義包括H，以表明這種R6基團(tuán)可存在于結(jié)構(gòu)的何處，并使圖解簡便。但是，該非標(biāo)準(zhǔn)化的使用，并不試圖改變R6定義。因此，僅僅是為了下述常用方法圖解，除了R6定義中所描述的部分，R6可為H。最終的化合物含有1-3個非氫基團(tuán)R6。
常用方法A-其中環(huán)A和B分別為取代的苯基和亞苯基的關(guān)鍵的中間體可以用取代的聯(lián)苯II與含酰基的活化中間體如丁二酸酐或戊二酸酐衍生物III或?；菼V，在路易斯酸催化劑如三氯化鋁的存在下，在非質(zhì)子溶劑如1，1，2，2-四氯乙烷中的Friedel-Crafts反應(yīng)方便地制備。公知的Friedel-Crafts反應(yīng)可以用E.Berliner，Org.React.，5.229(1949)和H.Heaney，Comp.Org.Synth，2，733(1991)中所述的許多其它溶劑和酸催化劑來完成。
方法A 如果酸酐III是以不對稱方式單取代或多取代，則通過進(jìn)攻兩個羰基的任一個酸酐，初產(chǎn)物I-A常常以異構(gòu)體混合物的形式存在。得到的異構(gòu)體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)晶或?qū)游龆蛛x為純的形式。
當(dāng)它們不能購買到時，則丁二酸酐III可通過丁二酸二烷基酯與醛或酮的Stobbe縮合(導(dǎo)致側(cè)鏈R6)，然后催化氫化，水解半酯中間體至二酸，隨后通過與乙酰氯或乙酸酐反應(yīng)轉(zhuǎn)化為酸酐III。或者，半酯中間體通過用亞硫酰氯或草酰氯處理轉(zhuǎn)化為酰基氯IV，其中R12為低級烷基。關(guān)于Stobbe縮合的綜述，包括合適的溶劑和堿參見W.S.Johnson和G.H.Daub，Org.React.，6，1(1951)。用于制備III(R6＝H、異丁基和H、正戊基)的方法已描述在D.Wolanin等，美國專利4,771,038，1998年9月13日中。
方法A特別利于制備環(huán)狀關(guān)鍵的中間體如I-A-3，其中兩個R6基團(tuán)結(jié)合亞甲基鏈形成4-7元環(huán)。小環(huán)(3-5元)酸酐容易以產(chǎn)生本發(fā)明化合物I-A-3的順式異構(gòu)體形式得到。然后用諸如DBU的堿在THF中處理而制備反式化合物I-A-4。
取代的四元環(huán)原料酸酐如III-A-1以如下所示光化學(xué)2+2反應(yīng)形成。該方法特別有利于制備其中R14為乙酰氧基或乙酰氧基-亞甲基的化合物。Friedel-Crafts反應(yīng)之后，可通過堿性水解而去除乙酸酯，而羧基通過將其轉(zhuǎn)化為2-(三甲基甲硅烷基)乙基酯來保護(hù)。產(chǎn)生的R14＝CH2OH的中間體可以通過采用常規(guī)方法K中所述的工藝轉(zhuǎn)化為其它R14基團(tuán)的關(guān)鍵的中間體。 當(dāng)雙鍵在丁二?；?例如馬來酸酐或1-環(huán)戊烯-1，2-二羧酸酐)的C-2和C-3之間，或雙鍵在側(cè)鏈上時，F(xiàn)riedel Crafts法也是有用的，如用于衣康酸酐作為原料以得到其中兩個R6基團(tuán)在一個鏈的碳原子上一起形成外亞甲基(exo-methylene)(＝CH2)的產(chǎn)物。這些化合物的后續(xù)應(yīng)用在方法D和E中敘述。
常用方法B-或者關(guān)鍵的中間體也可通過下列系列反應(yīng)制備丙二酸二烷基酯VI與烷基鹵的單烷基化反應(yīng)以形成中間體VII，然后用鹵代甲基聯(lián)苯基酮VIII烷基化得到中間體IX。然后結(jié)構(gòu)IX的化合物用堿水溶液水解并加熱，使丙二酸中間體脫羧基，產(chǎn)生I-B-2(方法B-1)。通過用一當(dāng)量的堿水溶液，得到R12為烷基的酯I-B-2，用多于兩當(dāng)量的堿則得到酸化合物(R12＝H)。任選地，不進(jìn)行加熱，得到二酸或酸-酯I-B-1?；蛘撸ブ虚g體IX可以與強酸如濃鹽酸在乙酸中，封管內(nèi)，約110℃加熱約24小時產(chǎn)生I-B-2(R12＝H)。
或者，VI與VIII的反應(yīng)在其與烷基鹵化物反應(yīng)之前進(jìn)行，產(chǎn)生相同的IX(方法B-2)。
從聯(lián)苯II與鹵代乙酰鹵例如溴乙酰溴或氯乙酰氯的Friedel-Craft反應(yīng)，形成中間體VIII?；蛘撸?lián)苯可與乙酰氯或乙酸酐反應(yīng)，產(chǎn)生的產(chǎn)物用例如溴鹵化以得到中間體VIII(X＝Br)。
當(dāng)方法A產(chǎn)生混合物時，方法B具有產(chǎn)生單個區(qū)域異構(gòu)體的優(yōu)點。當(dāng)側(cè)鏈R6含有芳環(huán)或雜芳環(huán)，如果使用方法A時，其可參與分子內(nèi)的?；磻?yīng)從而得到副產(chǎn)物，因此方法B是特別有用的。當(dāng)與最終化合物的羧基相鄰的R6基團(tuán)含有雜原子如氧、硫或氮，或更復(fù)雜的官能團(tuán)如酰亞胺環(huán)時，該方法也是非常有用的。
方法B 常用方法C-特別有用的是使用手性HPLC分離外消旋關(guān)鍵的中間體混合物的對映異構(gòu)體(參見例如D.Arlt，B.Boemer，R Grosser和W.Lange，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.30(1991)第12期)。通過采用手性助劑路徑以純的對映異構(gòu)體制備關(guān)鍵的中間體，參見例如D.A.Evans，Aldrichimica Acta，15(2)，23(1982)和其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的類似參考文獻(xiàn)。
C-1.酰基鹵X與手性助劑XI(R常常為異丙基或芐基)的鋰鹽反應(yīng)以得到中間體XII，其隨在低溫(通常低于-50℃)用鹵代叔丁基乙?；衔颴III烷基化得到純的異構(gòu)體XIV。使用相反的手性XI得到相反的手性XIV。通過在THF/水中用氫氧化鋰/過氧化氫，然后用酸如三氟乙酸處理來實現(xiàn)XIV轉(zhuǎn)化至對映異構(gòu)純的二酸XV。然后化合物XV用乙酰氯處理轉(zhuǎn)化為對映異構(gòu)純的酸酐III-A。如方法A使用Friedel-Crafts反應(yīng)然后將III-A轉(zhuǎn)化為I-C-1。
C-2.聯(lián)苯原料II也可首先按先前所述的Friedel-Crafts反應(yīng)與琥珀酸酐反應(yīng)，然后在強酸如硫酸的存在下與低級醇如甲醇進(jìn)行Fisher酯化形成?；苌颕-C-2。然后該物質(zhì)的羰基以縮酮形式被封端，例如在合適的溶劑中，催化劑如三甲基-甲硅烷基三氟甲磺酸酯的存在下，用1，2-雙三甲基-甲硅氧基乙烷處理形成。許多其它本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的縮酮衍生物和反應(yīng)條件也可用于該步驟。堿水解該酯，然后產(chǎn)物I-C-3與XI在酰胺偶聯(lián)劑如1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基羧二酰亞胺的存在下反應(yīng)得到酰胺I-C-4，。該手性酰胺與烷基化試劑如烷基或芳烷基三氟甲磺酸酯(triflate)或鹵化物反應(yīng)得到富對映異構(gòu)體的產(chǎn)物I-C-5，其可用弱堿如氫氧化鋰/過氧化氫處理轉(zhuǎn)化為縮酮酸I-C-6，然后用酸處理轉(zhuǎn)化為酮酸I-C-7。這些解封閉步驟可以以任一次序進(jìn)行。方法C-1 方法C-2 常用方法D-其中R6為烷基或芳基或雜芳基或?；螂s芳基羰基-硫代亞甲基的關(guān)鍵的中間體可通過類似于專利公開WO90/05719中所述的方法制備。因此取代的衣康酸酐XVI(n＝1)在Friedel-Crafts條件下反應(yīng)得到酸I-D-1，其可通過色譜或結(jié)晶與少量異構(gòu)體I-D-5中分離?；蛘?，I-D-5可通過關(guān)鍵的中間體I-D-4(由方法A～C的任何一種獲得)與甲醛在堿存在下反應(yīng)得到。
化合物I-D-1和I-D-5然后與巰基衍生物XVII或XVIII在催化劑如碳酸鉀、乙基二異丁基胺、四丁基銨氟化物或游離基引發(fā)劑如偶氮二異丁腈(AIBN)的存在下，在溶劑如二甲基甲酰胺或四氫呋喃中反應(yīng)得到關(guān)鍵的中間體I-D-2、I-D-3、I-D-6或I-D-7。
方法D 常用方法E-任選取代的馬來酸酐XIX在Friedel-Crafts條件下與II反應(yīng)得到關(guān)鍵的中間體I-E-1，其隨后與巰基衍生物XVII或與XVIII反應(yīng)得到關(guān)鍵的中間體I-E-2或I-E-3，或與取代的胺XX反應(yīng)得到關(guān)鍵的中間體I-E-4。用CH3I/DBU，然后用試劑XXI和AgF以CH3I/PBU酯化I-E-1(R6＝H)，隨后堿水解得到吡咯烷關(guān)鍵的中間體I-E-5。R14可為多種烷基或芳烷基，包括芐基。中間體酯(由步驟2得到)與芐氧基羰基氯在THF中回流下反應(yīng)，然后水解得到其中R14為芐氧基羰基的關(guān)鍵的中間體。
方法E 常用方法F-如本申請的關(guān)鍵的聯(lián)芳基中間體也可通過其中金屬為鋅、錫、鎂、鋰、硼、硅、銅、鎘等的芳基或雜芳基金屬化合物，與芳基或雜芳基鹵化物或三氟甲磺酸酯(三氟甲烷-磺酸酯)等的Suzuki或Stille交叉偶聯(lián)反應(yīng)制備。在下列方程中，Met或X之一為金屬，另一為鹵化物或三氟甲磺酸酯。Pd(com)為鈀的可溶性配合物如四(三苯基膦)-鈀(0)或雙(三苯基膦)-鈀(II)氯化物。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如參見A.Suzuki，PureAppl.Chem.，66，213-222(1994)；A.Suzuki，Pure Appl.Chem.，63，419-422(1991)；以及V.Farina和G.Roth，“金屬有機化學(xué)”第5卷(第1章)，1994。
原料XXIII(B＝1，4-亞苯基)可采用類似于方法A、B或C的那些方法但用鹵代苯而不是聯(lián)苯作原料而容易地形成。需要時，其中X為鹵素的原料可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法轉(zhuǎn)化為其中X為金屬的物質(zhì)，例如在甲苯中回流下用六甲基二錫和四(三苯基膦)合鈀處理溴代中間體以得到三甲基錫中間體。原料XXIII(B＝雜芳基)通過方法C最便利地制備，但用容易得到的雜芳基而不是聯(lián)苯原料制備。中間體XXII既可以購買，也可以按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法從購買的原料容易地制備。
這些一般方法利于制備關(guān)鍵的中間體，其中諸如方法A、B、C、D或E的Friedel-Crafts反應(yīng)會得到多種聯(lián)芳基?；问降幕旌衔?。方法F也特別利于制備關(guān)鍵的中間體，其中芳基A或B含有一個或多個雜原子(雜芳基)的產(chǎn)物，例如那些含有噻吩、呋喃、吡啶、吡咯、噁唑、噻唑、嘧啶或吡嗪環(huán)等代替苯基的化合物。
方法F T、x、A、B、E和D如結(jié)構(gòu)1所定義Met＝金屬，以及x＝鹵化物或三氟甲磺酸酯或Met＝鹵化物或三氟甲磺酸酯，以及x＝金屬常用方法G-當(dāng)方法F的R6基團(tuán)一起形成諸如下列中間體XXV的4-7元碳環(huán)時，雙鍵可以用兩當(dāng)量的強堿如二異丙基氨化鋰或六甲基甲硅烷基氨化鋰等處理，接著用酸淬滅，去除雙鍵與酮基的共軛以得到結(jié)構(gòu)XXVI化合物。XXVI與巰基衍生物用類似于那些常用方法D的方法反應(yīng)，然后得到關(guān)鍵的中間體I-G-1或I-G-2。
方法G 常用方法H-根據(jù)方法H制備其中兩個R6基團(tuán)形成4-7元碳環(huán)的關(guān)鍵的中間體，如下I-H所示且R14為烷基或芳烷基。原料XXVII與兩當(dāng)量的強堿如二異丙基氨化鋰(LDA)反應(yīng)，然后與烷基或芳烷基鹵化物(R14X)反應(yīng)得到中間體XXVIII。隨后用能夠選擇性還原酮的還原劑如硼氫化鈉將該物質(zhì)還原至醇，進(jìn)而在合適的溶劑如THF中，回流下用三苯基膦/偶氮二羧酸二乙酯(DEAD)脫水得到XXIX。用堿水溶液水解該酯，然后在偶聯(lián)劑如二環(huán)己基二亞胺(dicyclohexyl diimide)(DCC)的存在下，與R12ONHR12(R為(C1-C4)烷基，但常常為CH3)形成酰胺得到XXX。其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的?；罨瘎┤珲；然蚧旌系乃狒捎糜诖鎄XX。取代的聯(lián)苯鹵化物XXXI與烷基鋰如兩當(dāng)量的叔丁基鋰反應(yīng)得到鋰化的聯(lián)苯XXXII，其然后與活化的酰基化合物XXX反應(yīng)。得到的中間體XXXIII隨后用二乙基氰化鋁處理得到中間體XXXIV，其隨與用酸水溶液水解得到關(guān)鍵的中間體I-H，該中間體通過色譜在硅膠上純化得到純的異構(gòu)體。 常用方法I-根據(jù)方法1制備其中兩個R6基團(tuán)一起形成吡咯烷環(huán)的關(guān)鍵中間體。在酸催化劑下，原料XXXV(L-焦谷氨醇(pyroglutaminol))與苯甲醛XXXVI(可為取代的)反應(yīng)得到雙環(huán)衍生物XXXVII。然后用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的phenylselenenyl引入雙鍵得到XXXVIII，其隨后與乙烯基銅(I)配合物反應(yīng)得到共軛的加成產(chǎn)物XXXIX。其中Lig可為例如乙烯基或鹵化物的其它等價物的這類反應(yīng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。XXXIX進(jìn)行氫化物還原(氫化鋁鋰等)，然后用例如叔丁基二甲基氯化甲硅烷進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的封閉，得到XXXX，其隨后與任選取代的芳基氯甲酸酯XXXXI反應(yīng)得到XXXXII。該中間體臭氧解，然后進(jìn)行還原處理(二甲基硫化物、鋅/乙酸等)得到醛XXXXIII。該醛與聯(lián)苯有機金屬如XXXII反應(yīng)產(chǎn)生醇XXXXIV。用例如四丁基氟化銨解封閉甲硅烷基，然后用例如重鉻酸吡啶鎓等氧化得到其中R14為苯甲氧甲?；年P(guān)鍵的中間體1-I-1。
或者，通過與氫和催化劑如在碳上的鈀反應(yīng)得到未取代的關(guān)鍵中間體1-I-2來去除苯甲氧甲?；S后任選通過N-烷基化得到關(guān)鍵中間體1-I-3。這些最終的步驟是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的?；蛘咧虚g體XXXX可直接用臭氧處理，然后通過該方法的其它步驟得到1-I-3，其中R14為任選取代的芐基而不是如I-I-1所示。
該方法特別利于制備單一的對映體，因為原料XXXV可以附圖
的異構(gòu)體如以D焦谷氨醇提供以得到對映異構(gòu)體產(chǎn)物。 常用方法J-通過方法J可制備其中E代表取代的3個碳的鏈的關(guān)鍵中間體。如果中間體XXXXVII不能購得，其可通過下列方法制備將活化的聯(lián)苯基羧酸衍生物XXXXV與已用兩當(dāng)量的強堿如LDA轉(zhuǎn)化為其雙陰離子的取代的乙酸XXXXVI反應(yīng)，然后加熱脫羧酸該中間體酮酸。產(chǎn)物XXXXVII然后用亞甲基丙二酸酯衍生物XXXXVIII在強堿如氫化鈉的存在下處理以得到取代的丙二酸酯XXXXIX。該丙二酸酯還可在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的類似條件下進(jìn)行烷基化得到L，其隨后用酸處理，然后加熱，產(chǎn)生關(guān)鍵的中間體1-J-1。或者可省略最終的烷基化以得到其中與羧基相鄰的R6為H的產(chǎn)物?；蛘遆XXXVII可在堿如LDA的存在下用鹵代丙酸酯進(jìn)行烷基化得到酯1-J-2，其隨后可用堿水溶液水解，用酸處理得到關(guān)鍵的中間體1-J-3。如果任何R6基團(tuán)含有芳族殘基，則該方法特別是有利的。方法J 方法K-通過方法K最便利地制備其中兩個R6基團(tuán)連接形成取代的5元環(huán)的關(guān)鍵的中間體。在該方法中，用Tetrahedron，37卷，Suppl.，1981，411所述的方案制備酸LII(R＝H)。通過采用偶聯(lián)劑如鹽酸1-(3-二甲酯氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的步驟以酯的形式(R＝芐基或2-(三甲基甲硅烷基)乙基)保護(hù)該酸。取代的溴代聯(lián)苯LIII用鎂處理將其轉(zhuǎn)化為格利雅試劑，然后與LII反應(yīng)得到醇LIV。通過采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的條件，經(jīng)其甲磺酸鹽的堿處理來消除醇LIV?；蛘?，在低溫(-78℃)下，通過用正丁基鋰進(jìn)行溴化物的最初金屬化，將LIII轉(zhuǎn)化為三甲基錫中間體，然后用氯化三甲基錫處理，在強的惰性堿的存在下，通過與2-[N，N-雙(三氟甲基磺?；?-氨基]-5-氯代吡啶反應(yīng)將LII轉(zhuǎn)化為烯醇三氟甲磺酸酯(enoltriflate)。然后在PdO催化劑、CuI和AsPh3的存在下，錫和烯醇三氟甲磺酸酯中間體偶聯(lián)直接得到中間體LV。LV的臭氧解(用甲基硫化物處理)得到醛LVI。或者用OsO4，再用HIO4處理將LV轉(zhuǎn)化為LVI。
根據(jù)側(cè)鏈官能團(tuán)X的特性以幾種方式將中間體LVI轉(zhuǎn)化為關(guān)鍵的中間體I-K。LVI與Wittig試劑反應(yīng)，然后氫化得到其中X為烷基、芳基或芳烷基的產(chǎn)物。將醛LVI用LAH進(jìn)行還原得到醇I-K(X＝OH)。通過采用合適的原料和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的Mitsunobu條件將該醇轉(zhuǎn)化為苯基醚或N-苯二酰亞氨基化合物，參見O.Mitsunobu，合成，1(1981)。或者通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的條件將I-K的醇(X＝OH)轉(zhuǎn)化為離去基團(tuán)如甲苯磺酸酯(X＝OT)，然后該離去基團(tuán)用硫或疊氮親核試劑置換以得到X＝硫醚或疊氮化物的產(chǎn)物，其隨后被還原并?；玫锦ｕ?X＝NHAcyl)。醇I-K(X＝OH)直接?；玫狡渲蠿＝OAcyl的關(guān)鍵中間體，醇與各種烷基鹵在堿的存在下的反應(yīng)產(chǎn)生烷基醚(X＝OR2)。在每種情況下，最后一步都是用取決于R和X的穩(wěn)定性，但在各種情況下都是本專業(yè)技術(shù)人員公知的條件，脫除酸封閉基團(tuán)R，如通過堿水解脫除芐基，或用氟化四丁基銨處理，脫除2-(三甲基甲硅烷基)乙基，產(chǎn)生酸(R＝H)。
方法K 含有酸性部分的本發(fā)明化合物的合適的藥學(xué)上可接受的鹽包括與有機或無機堿形成的加成鹽。從這種堿衍生的成鹽離子可以是金屬離子，例如鋁、堿金屬離子如鈉或鉀、堿土金屬離子如鈣或鎂、或胺鹽離子，其中許多是已知用于此目的的。例子包括銨鹽；芳基烷基胺如二芐基胺和N，N-二芐基亞乙基二胺；低級烷基胺如甲基胺，叔丁基胺，普魯卡因；低級烷基哌啶如N-乙基哌啶；環(huán)烷基胺如環(huán)己胺或二環(huán)己胺、1-金剛烷基胺、benzathine；或從氨基酸如精氨酸、賴氨酸等衍生的鹽。生理上可接受的鹽如鈉鹽或鉀鹽和氨基酸鹽可以以如下所述在醫(yī)藥上應(yīng)用，并且是優(yōu)選的。
含有堿性部分本發(fā)明化合物的合適的藥學(xué)上可接受的鹽包括與有機或無機酸形成的加成鹽。從這種酸衍生的成鹽離子可以是鹵離子或天然或非天然的羧酸或磺酸的離子，其中許多是已知用于此目的的。例子包括氯化物、乙酸酯、酒石酸酯或從氨基酸如甘氨酸等衍生的鹽。生理上可接受的鹽如氯化物鹽和氨基酸鹽可以以如下所述在醫(yī)藥上應(yīng)用，并且是優(yōu)選的。
這些和其它不需要生理上可接受的鹽在分離或純化在下述目的中可接受的產(chǎn)物時是有用的。
該鹽通過本發(fā)明化合物的酸形式與等當(dāng)量的，在介質(zhì)中提供所希望的堿離子的堿反應(yīng)，或本發(fā)明化合物的堿形式與等當(dāng)量的，在介質(zhì)中提供所希望的酸離子的酸反應(yīng)而制備，其中該鹽沉淀或在含水介質(zhì)中，然后凍干。本發(fā)明化合物游離的酸或堿形式可從鹽，通過常用的中和技術(shù)例如用硫酸氫鉀、鹽酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉等而得到。
本發(fā)明化合物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-12、MMP-13和相關(guān)的蛋白酶TACE，并在體內(nèi)釋放TNFα，因此可以用于治療或預(yù)防背景部分中提及的病癥。由于沒有在上面列舉的其它MMP與那些上面所列出的MMP具有很高程度的同源性，尤其是在催化位點上，因此，可以認(rèn)為本發(fā)明化合物應(yīng)該也在不同程度上抑制這類其它的MMP。改變分子中聯(lián)芳基部分上的取代基，以及所要求化合物的那些R6基團(tuán)，已經(jīng)證明能影響所列出的MMP的相對抑制。因此，這一般類型的化合物可以通過選擇特定的取代基而“調(diào)節(jié)”，從而使與特定病理狀況有關(guān)的特定的MMP的抑制被加強，而使未參與病理狀況的MMP少受影響。
本發(fā)明化合物對于MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-12和MMP-13具有良好的活性，且相對于其它MMP如MMP-1和MMP-7，對這些MMP具有良好的選擇性。
作為上述選擇性分布(profile)的結(jié)果，本發(fā)明的化合物特別適于治療呼吸疾病。
治療基質(zhì)金屬蛋白酶-介導(dǎo)的或TNFα釋放介導(dǎo)的病癥的方法可以在患有這類病癥的哺乳動物，包括人體內(nèi)實施。
本發(fā)明的抑制劑被期望用于獸藥和人體給藥。因此，它們被用于藥物組合物中，該藥物組合物含有活性成分加一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、填充劑、粘合劑和其它賦形劑，這取決于給藥方式和期望的劑量形式。
抑制劑的給藥可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的方式。合適的腸胃外給藥的例子包括靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、皮下和肌內(nèi)途徑。靜脈內(nèi)給藥可以被用于獲得藥物的峰血漿濃度的急性調(diào)節(jié)。改進(jìn)的半衰期和藥物對關(guān)節(jié)腔的靶向瞄準(zhǔn)可以通過將藥物捕集在脂質(zhì)體內(nèi)而加強。通過將配位體摻入結(jié)合在滑液特異性大分子上的脂質(zhì)體的外圍，可以改善脂質(zhì)體向關(guān)節(jié)腔靶向瞄準(zhǔn)的選擇性。另外，在有或沒有藥物膠囊化的情況下，肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)或皮下貯存注射到可降解的微球，例如包含聚(DL-丙交酯-co-乙交酯)的微球，可被用于獲得藥物緩釋。對于劑量形式改善的便利，可以采用i.p.植入的貯器和間隔，如從Pharmacia得到的Percuseal系統(tǒng)。改善的便利和患者的依從也可以通過用注射筆(例如Novo Pin或Q-筆)或無針噴射注射器(例如從Bioject、Mediject或Becton Dickinson得到的)實現(xiàn)。延緩的零-階或其它精確的控制釋放如pulsatile釋放也可以根據(jù)需要，用可植入的泵，將藥物通過套管輸送到滑液空間而實現(xiàn)。其例子包括皮下植入從ALZA得到的滲透泵，如ALZET滲透泵。
鼻腔輸送可以通過將藥物摻入生物粘性的顆粒載體(＜200μm)如包含纖維素、聚丙烯酯或polycarbophil的載體，與合適的吸收增強劑如磷脂或酰基肉堿結(jié)合而實現(xiàn)，可購買的系統(tǒng)包括DanBiosys和Scios Nova開發(fā)的那些。
口服輸送可以通過將藥物摻入片劑、包衣片劑、糖衣丸、硬或軟膠囊、溶液、乳化液或懸浮液中而實現(xiàn)。口服輸送也可以通過將藥物摻入設(shè)計為將藥物釋放到消化蛋白酶活性很低的結(jié)腸中的包有腸溶衣的膠囊內(nèi)而實現(xiàn)。其例子包括分別從ALZA和Scherer DrugDel ivery Systems得到的OROS-CT/OsmetTM和PULSINCAPTM系統(tǒng)。其它系統(tǒng)使用通過結(jié)腸特殊細(xì)菌偶氮還原酶降解的偶氮-交聯(lián)的聚合物，或pH敏感的，通過升高結(jié)腸內(nèi)pH而活化的聚丙烯酸酯聚合物。上述系統(tǒng)可以與廣泛的吸收增強劑聯(lián)合使用。
直腸輸送可以通過將藥物摻入栓劑而實現(xiàn)。
本發(fā)明化合物可以通過加入本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種治療惰性的無機或有機載體，制成上述制劑。這些例子包括，但不限于，乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蠟、脂肪、多元醇如聚乙二醇、水、蔗糖、醇類、甘油等。各種防腐劑、乳化劑、分散劑、調(diào)味劑、濕潤劑、抗氧化劑、甜味劑、著色劑、穩(wěn)定劑、鹽、緩沖劑等也根據(jù)需要被加入，幫助穩(wěn)定制劑，或幫助增加活性成分的生物利用度，產(chǎn)生在口服劑型情況下可接受味道或氣味的制劑。
所應(yīng)用的藥物組合物的量將取決于接受者和被治療的病癥。所需的量不需要過度的實驗，由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。另外，所需的量可以以測定必需被抑制而治療病癥的靶酶的量為基礎(chǔ)進(jìn)行計算。希望本發(fā)明化合物通常以每天每kg人0.01～100mg的劑量服用。
本發(fā)明的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑不僅可以用于治療上面討論的病癥，而且可以用于金屬蛋白酶的純化，基質(zhì)金屬蛋白酶活性的試驗。這類活性試驗既可以用天然或合成的酶制劑體外進(jìn)行，也可以用，例如，其中異常破壞性酶水平被自然發(fā)現(xiàn)(用基因突變或轉(zhuǎn)基因動物)或通過施用外源性藥劑或通過破壞關(guān)節(jié)穩(wěn)定性的手術(shù)而誘導(dǎo)的動物模型體內(nèi)進(jìn)行。
生物試驗本發(fā)明化合物抗基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制劑活性以及TNFα的制備可通過如下所述的方法而測定。
MMP抑制劑的P218熒光淬滅試驗該試驗是由Knight等，F(xiàn)EBS Letters，296.263-266(1992)所述的對于MMP-3和相關(guān)的底物的修改。采用340nm的激發(fā)波長和395nm的發(fā)射波長，在存在或不存在測試化合物下熒光監(jiān)測合成底物H-MCA-Pro-Lys-Pro-Leu-Ala-Leu-DPA-Ala-Arg-NH2(P218)的水解速率。該底物最初由100％DMSO中，濃度為1×10-2M組成，然后在試驗緩沖液中稀釋至最終濃度20μM。測試化合物(在DMSO中10mM)在試驗緩沖液中稀釋至初始濃度0.3～1000nM。它們被稀釋至在試驗中濃度為0.03nM～100nM。通過加入底物至最終濃度20μM來引發(fā)反應(yīng)。在96孔微滴板的總試驗體積為150μl。Leu-Ala之間底物的裂解使得用340nm激發(fā)和395nm發(fā)射的熒光計(CytofluorII)可檢測到MCA基團(tuán)的熒光。連續(xù)40分鐘監(jiān)測熒光中的變化。
用Wiliaams和Morrison所述的方法計算Ki’。Enzymology，63，437-467(1997)的方法用于測定緊密鍵合的抑制劑的Kj表現(xiàn)，綜述如下[I]0/(1-vi/vo)＝Kj表現(xiàn)×vi/vo+[E]0[I]0和[E]0是抑制劑和酶的濃度，vi/vo是有/無抑制劑的反應(yīng)速率， vI為一半vo時，[I]0等于IC50，因此IC50＝0.5×[E]0+Kj表現(xiàn)用Xlfit軟件測定各種酶濃度的IC50。然后根據(jù)MMP濃度1 IC50的點圖表測定Kj表現(xiàn)，采用截距估算Kj表現(xiàn)。因此，IC50＝0和[E]0＝0時的截距值分別等于-2×Kj表現(xiàn)和Kj表現(xiàn)。用％抑制劑值計算各種酶濃度的IC50值，確使數(shù)據(jù)從反應(yīng)速率曲線的線性部分得到。Kj可用下列等式計算Kj＝Kj表現(xiàn)/(1+S)/Km其中S＝底物的濃度，Km＝離解常數(shù)。
對于所用的各種MMP，按如下修改試驗條件MMP-1(人類齦成纖維細(xì)胞間質(zhì)膠原酶)由Jack windsor[Windsor等，生物化學(xué)雜志269(42)，26201-26207(1994)]提供Pro-MMP-1。將酶原在25℃，120的Trypsin/1mMAEBSF中培養(yǎng)10分鐘以活化。
Km值30μM試驗緩沖液在含50mM HEPES，10mM CaCl2，pH7.0的緩沖液中進(jìn)行試驗。
IC50測定的酶濃度0.1μg/mlKj測定的酶濃度0.1～0.8μg/ml。
MMP-2(明膠酶A)根據(jù)R.Fridman等，生物化學(xué)雜志，267，15398(1992)的方法，用痘苗表達(dá)系統(tǒng)制備明膠酶A(MMP-2)。
試驗緩沖液在含50mM Tris，150mM NaCl，10mM CaCl2，0.005％Brij-35，pH7.0的緩沖液中進(jìn)行試驗。
IC50測定的酶濃度0.078μg/mlMMP-3(溶基質(zhì)素(stromelysin))制備重組截短的Pro-溶基質(zhì)素(MMP-3)根據(jù)Marcy等，生物化學(xué)，30，6476-6483，1991(參見CancerTreat.Res.61，21-41(1992))所述，以E.coli可溶形式表達(dá)截短的Pro-溶基質(zhì)素-257。按Housley等，J.Biol.Chem.，268，4481-87，1993所述的單克隆抗體親和色譜法的修改來純化可溶的截短的Pro-溶基質(zhì)素。
試驗緩沖液在含50mM HEPES，10mM CaCl2，pH7.0的緩沖液中進(jìn)行試驗。
IC50測定的酶濃度0.8μg/mlMMP-7(matrilysin)Dr Steve Shapiro，在Washington University Medical Center，St.Louis，Missouri，USA所提供的PET14載體，以E.coil表達(dá)催化域。
試驗緩沖液在含50mM HEPES，10mM CaCl2，pH7.0的緩沖液中進(jìn)行試驗。
IC50測定的酶濃度0.3μg/mlMMP-8(嗜中性白細(xì)胞膠原酶)根據(jù)Knauper，Eur.J.Biochem.189，296-300(1990)的方案得到活化的重組截短的形式(met80-gly242)試驗緩沖液在含50mM HEPES，10mM CaCl2，pH 7.0的緩沖液中進(jìn)行試驗。
IC50測定的酶濃度9.4μg/mlMMP-9(明膠酶B)改良Hibbs等(生物化學(xué)雜志，260，2493-2500，1984)和Wilhelm等(生物化學(xué)雜志，264，17213-17221，1989)所述的工藝來分離MMP-9。簡而言之，從新鮮抽取的3或更多單位的全部血液中分離多形核白細(xì)胞(PMN)制品。細(xì)胞再于37℃，在50mM氟磷酸二異丙酯(DEP)、1μg/ml亮抑蛋白酶肽及抑肽酶，與1mg/ml過氧化氫酶的存在下，在含有100ng/ml佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)的磷酸鹽緩沖食鹽水(PBS)中懸浮1小時。離心(300×g)收集上清液，樣品于-70℃下冷凍。所有層析法均于4℃下進(jìn)行。解凍的樣品使用加裝YM-10膜的Amicon槽濃縮5倍。濃縮物相對于0.02M Tris-HCl，0.1MNaCl，1mM CaCl2，1μM ZnCl2，0.001％Brij-35，0.02％疊氮化鈉(NaN3)，pH7.5下加壓透析，并依0.4ml/min的流速，加至已先經(jīng)相同緩沖劑平衡的DEAE離子交換層析樹脂中。用相同緩沖劑完全洗柱，并用0.02M Tris-HCl，0.5M NaCl，1mM CaCl2，1μM ZnCl2，0.001％Brij-35，0.02％NaN3，pH 7.5自柱中洗脫出4ml明膠酶洗脫份。由明膠酶譜分析法(見下文)觀察到含明膠酶的洗脫份，然后加至明膠瓊脂糖親和性樹脂上，用相同緩沖劑洗滌。以含10％二甲亞砜(DMSO)的0.02M Tris-HCl，1M NaCl，1mM CaCl2，1μM ZnCl2，0.001％Brij-35，0.02％NaN3，pH7.5，以1ml/min的流速分成1ml的洗脫份，自柱中洗脫出明膠酶活性。收集含有明膠酶活性的洗脫份，相對于0.05M Tris-HCl，5mM NaCl，0.5mM CaCl2，0.1μM ZnCl2，0.001％Brij-35，pH7.4下進(jìn)行透析，以微-BCA分析法測定物質(zhì)的蛋白質(zhì)含量(Pierce，Rockford，IL)，冷凍干燥，再配成所需的操作濃度(100μg/ml)。也以桿狀病毒表達(dá)重組人pro-MMP-9。
Km值22μM試驗緩沖液在含50mM HEPES，150mM NaCl，10mM CaCl2，0.005％Brij-35，pH7.0的緩沖液中進(jìn)行試驗。
IC50測定的酶濃度0.38μg/mlKj測定的酶濃度0.38-1.00μg/mlMMP-12(巨噬細(xì)胞彈性蛋白酶)根據(jù)下列工藝分離MMP-9從Invitrogen(Groningen，荷蘭)得到人的肺、脾和腦的人基因庫cDNA庫。從BioTez(柏林，德國)購買HPLC-純化的寡核苷酸，從Life Technologies(海德堡，德國)得到E.coil株DH5α，從Novagen(海德堡，德國)得到株BL21(DE3)。從Stratagene(海德堡，德國)得到Pfu DNA-聚合酶和pBlueScriptII-KS(+)。從Qiagen(Hilden，德國)購得DNA質(zhì)粒和DANN凝膠分離裝置。從New England Biolabs(Schwalbach，德國)訂購所有的限制酶和DNA修飾酶。從Pharmacia Biotech(Freiburg，德國)得到HiTrapQ(5ml)。從Promochem(Wesel，德國)得到VydacC4-RP HPLC柱(214TP54300A，5μm，4.6×250mm；214TP1022；300A，10μm，22×250mm)。從Polypeptide Laboratories(Wolfenbuttel，德國)購得熒光底物P218。從SchwarzMann(Cleveland，OH)購得超純脲。從Novex(Frankfurt/Main，德國)得到預(yù)使用的NuPAGE 10％Bis-Tris聚丙烯酰胺SDSPAGE凝膠和NuPAGE 20×MOPS操作緩沖液。從Sigma(Deisenhofen，德國)得到10％AMPA和所有其它的化合物。
MMP-12的分子克隆通過具有基因特異性引物Oligo-428(劃線的為BamH1-位的正向引物5'-aaa ttt aaa gga tcc gcc acc atg aagttt ctt cta ata ctg ctc ctg-3’)和Oligo-431(劃線的為EcoR1-位的反向引物5'-aaa ttt aaa gaa ttc att aac aac caa acc agctat tgc ttt tca-3’)的人正常脾cDNA庫PCR克隆人MMP-12的CDS(GenBank登記號L23808；SwissProt登記號P39900)。用具有Oligo-434的PCR-誘變進(jìn)行內(nèi)EcoRl-位的去除(劃線的為突變堿基5’-gcc tcc tga atg tgt agt cca gaa ctc gtc ctc atc gaa atgtgc atc-3')。在Perkin Elmer GeneAmp2400PCR體系中，用25次變性循環(huán)(94℃，1min)，退火(60℃，1min)并延伸(72℃，2min)，用Pfu DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)(100μl體積)。PCR產(chǎn)物在0.8％瓊脂糖/EthBr凝膠上通過電泳來凝膠純化，用QiaEx2 DNA-分離裝置從瓊脂糖凝膠中分離，用限制酶BamH1/EcoR1裂解，并再次純化。該物質(zhì)連接到克隆載體pBlueScriptII-KS(+)中，其已先用BamH1和EcoR1-消化，并用牛小腸堿性磷酸酶去磷酸化。該重組質(zhì)粒(pMYZ180)轉(zhuǎn)化E.coli株DH5α中。用Qiagen質(zhì)粒制備裝置分離幾種克隆的質(zhì)粒DNA并用限制酶切消化分析。通過用染料終止化學(xué)的雙脫氧測序在ABI377測序儀上測定MMP-12完全CDS的DNA序列。用DNA Star(Madison，WI)的軟件包Lasergene進(jìn)行序列分析和所有的后續(xù)生物信息學(xué)。pMYZ 180(4369bp)結(jié)構(gòu)的序列分析證明了在MMP-12的CDS在802(G-＞A)、1402(T-＞C)、1429(C-＞T)和2002(T-＞C)位中的沉默突變，其中蛋白質(zhì)的氨基酸序列未受影響。
表達(dá)載體結(jié)構(gòu)為了測試蛋白質(zhì)表達(dá)和蛋白質(zhì)純化的最佳策略，通過PCR產(chǎn)生MMP-12基因的全部長度或部分序列加上多種用于純化的親和標(biāo)記物的數(shù)種不同的表達(dá)結(jié)構(gòu)。制備下列結(jié)構(gòu)pMYZ187通過pMYZ180的BamH1/EcoR1消化來裂解全部長度的人MMP-12的編碼序列，連接到BamH1/EcoR1裂解的pET-28a上，并用雙標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列證實最終結(jié)構(gòu)的完全編碼序列。
pMYZ188通過pMYZ180的BamH1/EcoR1消化來裂解全部長度的人MMP-12的編碼序列，連接到BamH1/EcoR1裂解的pET-32a上，并用雙標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列證實最終結(jié)構(gòu)的完全編碼序列。
pMYZ189通過pMYZ180的BamH1/EcoR1消化來裂解全部長度的人MMP-12的編碼序列，連接到BamH1/EcoR1裂解的pMYZ173(帶有GB1域的氨基末端標(biāo)記的pET28a的衍生物)上，并用雙標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列證實最終結(jié)構(gòu)的完全編碼序列。
pMYZ194通過pMYZ180以引物Oligo-428(劃線的為BamH1-位的正向引物5’-aaa ttt aaa gga tcc gcc acc atg aag ttt ctt ctaata ctg ctc ctg-3')和Oligo-486(劃線的為EcoR1-位的反向引物5’-ttt aaa ttt gaa ttc att atg gtt ctg aat tgt cag gat ttggca-3’)的PCR來擴(kuò)增人MMP-12的氨基酸1-279的編碼序列，用BamH1/EcoR1裂解，連接到BamH1/EcoR1裂解的pET-28a上，并用雙標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列證實最終結(jié)構(gòu)的完全編碼序列。
pMYZ195通過pMYZ180以引物Oligo-428(劃線的為BamH1-位的正向引物5’-aaa ttt aaa ttt gga tcc gcc acc atg aag ttt cttcta ata ctg ctc ctg-3’)和Oligo-487(劃線的為EcoR1-位的反向引物5’-ttt aaa ttt gaa ttc att agt ctc cat aca ggg act gaatgc cac-3')的PCR來擴(kuò)增人MMP-12的氨基酸1-264的編碼序列，用BamH1/EcoR1裂解，連接到BamH1/EcoR1裂解的pET-28a上，并用雙標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列證實最終結(jié)構(gòu)的完全編碼序列。
pMYZ198通過pMYZ180以引物Oligo-428(劃線的為BamH1-位的正向引物5’-aaa ttt aaa gga tcc gcc acc atg aag ttt ctt ctaata ctg ctc ctg-3’)和Oligo-486(劃線的為EcoR1-位的反向引物5’-ttt aaa ttt gaa ttc att atg gtt ctg aat tgt cag gat ttggca-3')的PCR來擴(kuò)增人MMP-12的氨基酸1-279的編碼序列，用BamH1/EcoR1裂解，連接到BamH1/EcoR1裂解的pET-32a上，并用雙標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列證實最終結(jié)構(gòu)的完全編碼序列。
pMYZ199通過pMYZ180以引物Oligo-428(劃線的為BamH1-位的正向引物5’-aaa ttt aaa gga tcc gcc acc atg aag ttt ctt ctaata ctg ctc ctg-3’)和Oligo-487(劃線的為EcoR1-位的反向引物5’-ttt aaa ttt gaa ttc att agt ctc cat aca ggg act gaa tgccac-3')的PCR來擴(kuò)增人MMP-12的氨基酸1-264的編碼序列，用BamH1/EcoR1裂解，連接到BamH1/EcoR1裂解的pET-32a上，并用雙標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列證實最終結(jié)構(gòu)的完全編碼序列。
PMYZ200通過pMYZ180以引物Oligo-428(劃線的為BamH1-位的正向引物5’-aaa ttt aaa gga tcc gcc acc atg aag ttt ctt ctaata ctg ctc ctg-3’)和Oligo-486(劃線的為EcoR1-位的反向引物5’-ttt aaa ttt gaa ttc att atg gtt ctg aat tgt cag gat ttggca-3')的PCR來擴(kuò)增人MMP-12的氨基酸1-279的編碼序列，用BamH1/EcoR1裂解，連接到BamH1/EcoR1裂解的pMYZ173上，并用雙標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列證實最終結(jié)構(gòu)的完全編碼序列。
PMYZ201通過pMYZ180以引物Oligo-428(劃線的為BamH1-位的正向引物5’-aaa ttt aaa gga tcc gcc acc atg aag ttt ctt ctaata ctg ctc ctg-3’)和Oligo-487(劃線的為EcoR1-位的反向引物5’-ttt aaa ttt gaa ttc att agt ctc cat aca ggg act gaa tgccac-3’)的PCR來擴(kuò)增人MMP-12的氨基酸1-264的編碼序列，用BamH1/EcoR1裂解，連接到BamH1/EcoR1裂解的pMYZ173上，并用雙標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列證實最終結(jié)構(gòu)的完全編碼序列。
PMYZ215通過pMYZ180以引物Oligo-513(劃線的為Ndc1-位的正向引物5’-aaa ttt aaa cat atg ctt ccc ctg aac agc tct acaagc ctg-3’)和Oligo-486(劃線的為EcoR1-位的反向引物5’-tttaaa ttt gga ttc att atg gtt ctg aat tgt cag gat ttg gca-3’)的PCR來擴(kuò)增人MMP-12的氨基酸17-279的編碼序列，用Nde1/EcoR1裂解，連接到Nde1/EcoR1裂解的pET-28a上，并用雙標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列證實最終結(jié)構(gòu)的完全編碼序列。
PMYZ216通過pMYZ180以引物Oligo-51 3(劃線的為Nde 1-位的正向引物5’-aaa ttt aaa cat atg ctt ccc ctg aac agc tct acaagc ctg-3’)和Oligo-487(劃線的為EcoR1-位的反向引物5’-tttaaa ttt gaa ttc att agt ctc cat aca ggg act gaa tgc cac-3’)的PCR來擴(kuò)增人MMP-12的氨基酸17-264的編碼序列，用Nde1/EcoR1裂解，連接到Ndel/EcoR1裂解的pET-28a上，并用雙標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列證實最終結(jié)構(gòu)的完全編碼序列。
PMYZ217通過pMYZ180以引物Oligo-514(劃線的為Nco 1-位的正向引物5’-aaa ttt aaa gcc atg gct ctt ccc ctg aac agc tctaca agc ctg-3’)和Oligo-486(劃線的為EcoR1-位的反向引物5’-tttaaa ttt gaa ttc att atg gtt ctg aat tgt cag gat ttg gca-3’)的PCR來擴(kuò)增人MMP-12的氨基酸17-279的編碼序列，用Nde1/EcoR1裂解，連接到Nco1/EcoR1裂解的pET-32a上，并用雙標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列證實最終結(jié)構(gòu)的完全編碼序列。
PMYZ218通過pMYZ180以引物Oligo-514(劃線的為Nco1-位的正向引物5’-aaa ttt aaa gcc atg gct ctt ccc ctg aac agc tctaca agc ctg-3’)和Oligo-48 7(劃線的為EcoR1-位的反向引物5’-tttaaa ttt gaa ttc att agt ctc cat aca ggg act gaa tgc cac-3’)的PCR來擴(kuò)增人MMP-12的氨基酸17-264的編碼序列，用Nco1/EcoR1裂解，連接到Ncol/EcoR1裂解的pET-32a上，并用雙標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列證實最終結(jié)構(gòu)的完全編碼序列。
PMYZ219通過pMYZ180以引物Oligo-515(劃線的為BamH1-位的正向引物5’-aaa ttt aaa gga tcc ctt ccc ctg aac agc tct acaagc ctg-3’)和Oligo-486(劃線的為EcoR1-位的反向引物5’-tttaaa ttt gga ttc att atg gtt ctg aat tgt cag gat ttg gca-3’)的PCR來擴(kuò)增人MMP-12的氨基酸17-279的編碼序列，用BamH1/EcoR1裂解，連接到BamH1/EcoR1裂解的pMYZ173上，并用雙標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列證實最終結(jié)構(gòu)的完全編碼序列。
PMYZ220通過pMYZ180以引物Oligo-515(劃線的為BamH1-位的正向引物5’-aaa ttt aaa gga tcc ctt ccc ctg aac agc tct acaagc ctg-3’)和Oligo-487(劃線的為EcoR1-位的反向引物5’-tttaaa ttt gaa ttc att agt ctc cat aca ggg act gaa tgc cac-3’)的PCR來擴(kuò)增人MMP-12的氨基酸17-264的編碼序列，用BamH1/EcoR1裂解，連接到Nde1/EcoR1裂解的pMYZ173上，并用雙標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列證實最終結(jié)構(gòu)的完全編碼序列。
PMYZ227通過pMYZ180以引物Oligo-533(劃線的為Nde1-位的正向引物5’-aaa ttt aaa cat atg ttc agg gaa atg cca ggg gggccc gta tgg-3’)和Oligo-486(劃線的為EcoR1-位的反向引物5’-tttaaa ttt gaa ttc att agt gtt ctg aat tgt cag gat ttg gca-3’)的PCR來擴(kuò)增人MMP-12的氨基酸100-279的編碼序列，用Nde1/EcoR1裂解，連接到Nde1/EcoR1裂解的pET-28a上，并用雙標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列證實最終結(jié)構(gòu)的完全編碼序列。
PMYZ228通過pMYZ180以引物Oligo-533(劃線的為Nde1-位的正向引物5’-aaa ttt aaa cat atg ttc agg gaa atg cca ggg gggccc gta tgg-3’)和Oligo-48 7(劃線的為EcoR1-位的反向引物5’-tttaaa ttt gaa ttc att agt ctc cat aca ggg act gaa tgc cac-3’)的PCR來擴(kuò)增人MMP-12的氨基酸100-264的編碼序列，用Nde1/EcoR1裂解，連接到Nde1/EcoR1裂解的pET-28a上，并用雙標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列證實最終結(jié)構(gòu)的完全編碼序列。
細(xì)菌表達(dá)一升含氨芐青霉素(200μg/ml)或卡那霉素(100μg/ml)的LB介質(zhì)(10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl)的批料每次用20ml帶有合適的表達(dá)載體的E.coli BL21(DE3)細(xì)胞培養(yǎng)物過夜來接種。細(xì)胞在37℃培養(yǎng)以得到約0.8的OD600，然后用IPTG(1mM最終濃度)來誘導(dǎo)。在37℃連續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)4小時，然后離心收集。立即冷凍細(xì)胞粒，并保存在-20℃直至使用。從各種細(xì)胞培養(yǎng)物中取出等分物(100μl)并在10％SDS-PAGE凝膠上分析蛋白質(zhì)表達(dá)。
蛋白質(zhì)純化融化1升批量細(xì)胞中冷凍的細(xì)胞粒，溶解在50ml含15％甘油的Tris/HCl，pH8.0中，用4脈沖超聲處理10秒，并用JA-20轉(zhuǎn)子以20,000rpm離心30min。去除上清液后，粒中的包涵體在輕微搖晃下，用50ml 8M脲，50mM Tris/HCl，pH8.0室溫下溶解過夜。第二天，用JA-20轉(zhuǎn)子以20,000rpm離心該溶液30min，上清液用于進(jìn)一步純化。5-10ml應(yīng)用于以8 M脲，50mM Tris/HCl，pH8.0(緩沖液A)操作的5ml HiTrapQ離子交換柱。裝入樣品后，洗滌柱子，通過在40倍柱體積內(nèi)以線性梯度0-50％緩沖液B增加8M脲，50mlTris/HCl，pH8.0+1.0M NaCl(緩沖液B)溶液的鹽濃度來洗脫蛋白質(zhì)。具有約30％緩沖液B的蛋白質(zhì)洗脫液的餾分通過變性SDS-PAGE和質(zhì)譜來測定其純度，且一起收集含有MMP-12的洗脫份。從該溶液中，取出5-10ml，酸化至最終濃度為10％乙酸，并以10ml/min的流速注入到Waters HPLC色譜工作站上制備的C4-RP-HPLC柱(Vydac214TP1022300A，10μm，22×250mm)中。開始的緩沖液為H2O/0.1％TFA(緩沖液A)，洗脫緩沖液為90％CH3CN/10％H2O/0.1％TFA(緩沖液B)。通過變性SDS-PAGE和質(zhì)譜再次分析含約30％緩沖液B的，以單峰洗脫的純的蛋白質(zhì)洗脫份。合并的MMP-12洗脫份在液N2中冷凍，并凍干3～5天。凍干的蛋白質(zhì)貯存在-20℃。
Km值5.4μm試驗緩沖液在含50mM HEPES和10mM CaCl2，pH7.0的緩沖液中進(jìn)行試驗。
IC50測定的酶濃度0.3μg/mlKj測定的酶濃度0.044-0.98μg/mlMMP-13(人膠原酶3)
根據(jù)Roswit，Arch．Biochem．Biophys，225，285-295(1983)的方案得到大鼠-pro-MMP-13，并在1∶10的胰蛋白酶中培養(yǎng)而活化。
試驗緩沖液在含20mM Tris pH7.5，250mMNaCl，5mM CaCl2，0.05％NaN3，0.005％Brij的緩沖液中進(jìn)行試驗。
IC50測定的酶濃度0.3μg/ml選定化合物的IC50值如下表3所示。化合物序號指表1中所指的化會物
表3下列數(shù)據(jù)闡明本發(fā)明實施例對于MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-12和MMP-13的選擇性。實施例號指在實驗部分所述的實施例
*IC50[nM]表4體外機能試驗1.人的肺泡巨噬細(xì)胞通過健康的吸煙志愿者的支氣管鏡檢查得到人的肺泡巨噬細(xì)胞。細(xì)胞被離心的并以2×106/ml再懸浮。用人MCP-1(5ng/ml)經(jīng)48-98h來誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞(+或-脂多糖2.5μg.ml)穿過人工基膜(Matrigel)的運輸。(1α，2β，5β)-2-{[4’-氯(1，1’-聯(lián)苯)-4-基]羰基}-5-[(1，3-二氫-1，3-二氧-2H-異吲哚-2-基)甲基]-環(huán)戊烷羧酸抑制了MCP-1誘導(dǎo)的人的肺泡巨噬細(xì)胞穿過該人工基膜的運輸(IC50＜1μm)。2.小鼠腹膜巨噬細(xì)胞腹膜內(nèi)注射巰基乙酸酯5天后，從小鼠中得到鼠的巨噬細(xì)胞。細(xì)胞被離心并以2×106/ml再懸浮。用小鼠的MCP-1(5ng/ml)經(jīng)48-98h來誘導(dǎo)腹膜巨噬細(xì)胞穿過人工基膜(Matrigel)的運輸。(1α，2β，5β)-2-{[4’-氯(1，1’-聯(lián)苯)-4-基]羰基}-5-[(1，3-二氫-1，3-二氧-2H-異吲哚-2-基)甲基]-環(huán)戊烷羧酸抑制了小鼠的腹膜巨噬細(xì)胞穿過該人工基膜的運輸(IC50＜1μm)。小鼠中LPS誘導(dǎo)的TNFα產(chǎn)生采用小鼠的LPS誘導(dǎo)的TNFα在體內(nèi)的產(chǎn)生模型測定選定化合物在體內(nèi)的抑制劑性質(zhì)。十個BALB/c小鼠(Charles River BreedingLaboratories；Kingston，NY)一組用載體或化合物來處理。一小時后，腹膜內(nèi)注入(i.p.)內(nèi)毒素(E.coli脂多糖(LPS)100mg)。90分鐘后，通過二氧化碳窒息使動物死去，將心刺穿至肝素管而從各個動物中得到血漿。在4℃以12，500×g離心5分鐘使樣品澄清。傾析上清液至新的試管，按所需的貯存在-20℃。用市售的小鼠TNF ELISA裝置(Genzyme)測定血清中TNFα濃度。
從在此公開的本發(fā)明的說明書或?qū)嵤景l(fā)明的其它實施方案對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的?？梢詫⒄f明書和實施例僅作為示例性的，本發(fā)明真正的范圍和精神將在下列權(quán)利要求中指明。
縮寫DMFN，N-二甲基甲酰胺RT室溫THF四氫呋喃制備實施例實施例12-[2-(1，3-二氧-1，3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]-4-(4’-乙氧基[1，1’-聯(lián)苯]-4-基)-4-氧代丁酸 中間體1A4-乙氧基-1，1’-聯(lián)苯 將碘代乙烷(68.7g，35.57ml，440.6mmol)加入到50g(170.2mmol)4-羥基-1，1’-聯(lián)苯和40.6g(293.75mmol)K2CO3在600mL丙酮中的懸浮液中。得到的反應(yīng)混合物在回流下攪拌16小時。冷卻至室溫后，在減壓下去除丙酮，殘余物溶解在乙酸乙酯中并用水萃取。水層用乙酸乙酯萃取3次，干燥(Na2SO4)合并的有機相并蒸發(fā)得到56g所需的無色油狀固體化合物。
產(chǎn)率56g(96％)1H-NMR(d6-DMSO)7.55-7.65(m，4H)，7.42(t，J＝8Hz，2H)，7.3(t，J＝8Hz，1H)，6.95-7.05(m，2H)，4.07(q，J＝7Hz，2 H)，1.35(t，J＝7Hz，3H)中間體1B2-溴-1-(4’-乙氧基[1，1’-聯(lián)苯]-4-基)-1-乙酮 將在1.5L CH2Cl2中的56g(282mmol)的中間體1A的溶液冷卻至0℃并放置在氬氣中。加入溴乙酰溴(85.5g，36.8mL，423mmol)，然后經(jīng)60分鐘分批加入AlCl3(37.41g，280.53mmol)。加入完畢后，混合物攪拌20h，加熱至RT。然后將混合物慢慢倒入到攪拌的2kg冰/500ml濃HCl的混合物中。分離有機層，用2N HCl和水洗滌，干燥(Na2SO4)并蒸發(fā)。經(jīng)重結(jié)晶(乙腈)純化粗產(chǎn)物得到49.3g(54％)白色固體。
1H-NMR(d6-DMSO)8.08(d，J＝8Hz，2H)，7.81(d，J＝8Hz，2H)，7.73(d，J＝8Hz，2Hz)，7.06(d，J＝8Hz，2H)，4.95(s，2H)，4.1(q，J＝7Hz，2H)，1.36(t，J＝7Hz，3H)中間體1C2-[2-(1，3-二氧-1，3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]-2-[2-(4’-乙氧基-[1，1’-聯(lián)苯]-4-基)-2-氧代乙基]丙二酸二(叔丁基)酯 將在50mL DMF中的中間體5F(3.2g，10mmol)溶液滴加到在20mLDMF中的NaH(500mg，12.5mmol)懸浮液中，并在RT下攪拌30分鐘。慢慢加入在30mL DMF中的中間體1B(3.9g，10mmol)，得到的混合物在RT下攪拌4h。用飽和NH4Cl溶液淬滅反應(yīng)，用乙醚萃取兩次，飽和的NaHCO3、水和鹽水洗滌，干燥(Na2SO4)并蒸發(fā)。粗產(chǎn)物用快速色譜純化(己烷/乙酸乙酯1/1)。
產(chǎn)率4.96g(71％)1H-NMR(d6-DMSO)8.02(d，J＝8Hz，2H)，7.68-7.81(m，8H)，7.05(d，J＝8Hz，2H)，4.1(q，J＝7Hz，2H)，3，72(s，2H)，3.55-3.65(m，2H)，2.26-2.87(m，2H)，1.33-1.4(m，18H)實施例12-[2-(1，3-二氧-1，3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]-4-(4’-乙氧基[1，1’-聯(lián)苯]-4-基)-4-氧代丁酸
將2.2g(3.51mmol)中間體1C一次加入到冷卻的(0℃)1∶1的CH2Cl2和三氟乙酸的混合物中。反應(yīng)混合物在RT下攪拌過夜，蒸發(fā)并在真空下干燥。殘余物溶解在5mL二噁烷中并在回流下加熱5h。反應(yīng)混合物蒸發(fā)，殘余物用乙醚研制，攪拌15分鐘并過濾。剩余的固體在真空下干燥。
產(chǎn)率1.21g(73％)1H-NMR(d6-DMSO)12.28(s，1H)，8.02(d，J＝8Hz，2H)，7.67-7.9(m，8H)，7.05(d，J＝8Hz，2H)，4.1(q，J＝7Hz，2H)，3.72(t，J＝7.5Hz，2H)，3.49(dd，J＝17.5Hz，J＝8Hz，2H)，3.28(dd，J＝17.5Hz，J＝5Hz，2H)，2.78-2.95(m，1H)，1.76-2.13(m，2H)，1.38(t，J＝7Hz，3H)實施例1的外消旋體用市售的5μm Kromasil KR 100-5-CHI-DMB相經(jīng)手性HPLC分離為其純的對映異構(gòu)體。以恒定流速25ml/min采用由50％異己烷和50％叔丁基甲基醚/二氯甲烷/冰乙酸混合物(480∶40∶1)組成的溶劑混合物。實施例2(+)-2-[2-(1，3-二氧-1，3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]-4-(4’-乙氧基[1，1’-聯(lián)苯]-4-基)-4-氧代丁酸較快洗脫的對映異構(gòu)體產(chǎn)率374mg(42％)[α]23D+6.33°(在THF中c＝0.47)實施例3(-)-2-[2-(1，3-二氧-1，3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]-4-(4’-乙氧基[1，1’-聯(lián)苯]-4-基)-4-氧代丁酸較慢洗脫的對映異構(gòu)體產(chǎn)率321mg(36％)[α]23D-5.6°(在THF中c＝0.5)實施例4(+)-4-(4’-氯[1，1’-聯(lián)苯]-4-基)-2-[2-(1，3-二氧-1，3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]-4-氧代丁酸 按WO96/15096實施例268所述的步驟制備實施例4的化合物[α]23D+5.55°(在THF中c＝0.525)實施例5(外消旋)-4-[4’-(乙酰氧基)[1，1’-聯(lián)苯]-4-基]-2-[2-(1，3-二氧-1，3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]-4-氧代丁酸中間體5A4’-(2-溴乙酰基)[1，1’-聯(lián)苯]-4-基乙酸酯 50g(236mmol)[1，1’-聯(lián)苯]-4-基乙酸酯在500ml二氯甲烷中的溶液放置在氬氣中，并冷卻到0℃。加入溴乙酰溴(31.6ml，363mmol)，然后在劇烈攪拌下，經(jīng)30分鐘分批加入氯化鋁(94.3g，707mmol)。得到的混合物在0℃再攪拌30分鐘，并在室溫下過夜。然后混合物慢慢倒入到500ml冷的10％HCl中，并用二氯甲烷萃取三次。有機層用Na2SO4干燥，過濾并蒸發(fā)。殘余物用1∶1二異丙基醚/異丙醇研制，過濾并將剩余的固體在真空下干燥。
產(chǎn)率73.3g(93.4％)1H-NMR(CDCl3)δ＝2.34(s，3 H)，4.48(s，2 H)，7.21(m，2 H)，7.66(m，4H)，8.08(m，2H).中間體5B2-(芐氧基)-1-乙醇 將乙二醇(742.5g，11.96mol)加入到保持在80℃的氫氧化鈉顆粒(475.2g，11.88mol)的450ml水溶液中。然后在65℃加入芐基氯(302.8g，2.39mol)，得到的懸浮液在120℃劇烈攪拌過夜。冷卻至室溫后，將混合物倒入冰水中，并用乙醚萃取五次。合并的有機層用鹽水洗滌，Na2SO4干燥，過濾并蒸發(fā)。然后剩余的殘余物在真空下蒸餾，收集相對餾分(在0.1-1mbar，沸點95-125℃)。
產(chǎn)率175g(48.1％)無色液體1H-NMR(CDCl3)δ＝2.09(tr，1H)，3.60(m，2H)，3.77(m，2H)，4.56(s，2H)，7.35(m，5H).中間體5C芐基2-氯乙醚 將亞硫酰氯(41.2ml，567.6mmol)慢慢加入到中間體5B(90g，80％純度，473.1mmol)和N，N-二甲基苯胺(76.5ml，597.5mmol)的混合物中，同時通過冰水冷卻保持反應(yīng)溫度在50℃。在50℃攪拌1小時后，再加入批量的N，N-二甲基苯胺(15.3ml，119.5mmol)和亞硫酰氯(8.2ml，113.5mmol)，混合物再在50℃攪拌2小時，并在室溫下過夜。然后溶液倒入到冰水(200ml)和濃HCl(100ml)的混合物中，并用二氯甲烷萃取三次。合并的有機層用10％HCl洗滌兩次，并用水洗滌兩次，經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并蒸發(fā)。然后剩余的殘余物在真空下(水泵)蒸餾，收集相對餾分。
產(chǎn)率69.1g(85.6％)無色液體1H-NMR(CDCl3)δ＝3.69(m，4H)，4.59(s，2H)，7.35(m，5H).中間體5D2-[2-(芐氧基)乙基]丙二酸二(叔丁基)酯 在50℃將丙二酸二叔丁基酯(151.4g，686mmol)滴加至叔丁酸鉀(77g，686mmol)在500ml叔丁醇的懸浮液中。然后加入碘化鈉(10.33g)，再在40-50℃滴加中間體5C(117.1g，686mmol)。得到的濃的懸浮液在70℃攪拌兩天。在該期間，再加入兩批量的叔丁酸鉀(分別15.4g，70mmol)。然后混合物倒入到冰水中，并用乙醚萃取三次。有機層經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并蒸發(fā)。最后粗產(chǎn)物用環(huán)己烷/乙酸乙酯梯度(70∶1→15∶1)的柱色譜純化。
產(chǎn)率134g(55.8％)無色油1H-NMR(DMSO-d6)δ＝1.38(s，18H)，1.96(q，2H)，3.31(tr，1H)，3.41(tr，2H)，4.43(s，2H)，7.31(m，5H).中間體5E2-(2-羥乙基)丙二酸二叔丁基酯 將中間體5D(46.58g，132.9mmol)在300ml乙醇中的溶液在大氣壓下，10％在碳(2.0g)上的鈀的存在下氫化。在室溫下攪拌3小時后，再加入1.0g批量的鈀催化劑，在室溫下繼續(xù)攪拌過夜。然后混合物經(jīng)C鹽過濾，蒸發(fā)，粗產(chǎn)物用二氯甲烷/甲醇梯度(70∶1-＞30∶1)的柱色譜純化。
產(chǎn)率23.3g(67.2％)淺灰色油1H-NMR(CDCl3)δ＝1.47(s，18H)，1.96(tr，1H)，2.08(q，2H)，3.36(tr，1H)，3.72(q，1H)。中間體5F2-[2-(1，3-二氧-1，3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]丙二酸二叔丁基酯 向攪拌的中間體5E(30.0g，115.2mmol)在255ml干THF的溶液中連續(xù)加入鄰苯甲酰亞胺(21.4g，144.1mmol)、三苯基膦(35.1g，132.5mmol)，并在0℃加入偶氮二羧酸二乙酯(22.1g，126.8mmol)。得到的溶液攪拌過夜，同時保熱至室溫，然后用乙酸乙酯稀釋并用水和鹽水洗滌兩次。有機相經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并蒸發(fā)。最后粗產(chǎn)物用環(huán)己烷/二氯甲烷/乙酸乙酯梯度(7∶1∶1→5∶1∶1)的柱色譜純化。
產(chǎn)率10.02g(22.3％)白色固體1H-NMR(DMSO-d6)δ＝1.37(s，18H)，2.03(q，2H)，3.30(tr，1H)，3.63(tr，2H)，7.85(m，4H).中間體5G2-{2-[4’-(乙酰氧基)[1，1’-聯(lián)苯]-4-基]-2-氧代乙基}-2-[2-(1，3-二氧-1，3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]丙二酸二叔丁基酯 在氬氣下，將中間體5F(6.5g，16.69mmol)在60ml干THF中的溶液在0℃滴加到氫化鈉(0.51g，80％在無機油中的懸浮液，16.86mmol)在30ml干THF中的懸浮液中。在30-40℃攪拌30分鐘后，混合物再冷卻至0℃，并滴加中間體5A(5.6g，16.86mmol)在60ml干THF中的溶液。然后混合物攪拌過夜，同時保溫至室溫。再在0℃加入批量的氫化鈉(0.1g，3.4mmol)和中間體5A(1.12g，3.4mmol)，在室溫下繼續(xù)攪拌3小時。加入飽和的氯化銨溶液(100ml)和鹽水(200ml)以淬滅反應(yīng)混合物，并用乙酸乙酯萃取兩次。有機相經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并蒸發(fā)。最后粗產(chǎn)物用二氯甲烷/乙酸乙酯梯度(50∶1→30∶1)的柱色譜純化。
產(chǎn)率4.41g(41.2％)米白色固體1H-NMR(DMSO-d6)δ＝1.38(s，18H)，2.32(m，5H)，3.61(tr，2H)，3.73(s，2H)，7.28(d，2H)，7.81(m，8H)，8.04(d，2H).實施例5(外消旋)-4-[4’-(乙酰氧基)[1，1’-聯(lián)苯]-4-基]-2-[2-(1，3-二氧-1，3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]-4-氧代丁酸 在0℃，將中間體5G(400mg，0.62mmol)溶解在二氯甲烷(5ml)和三氟乙酸(5ml)的混合物中。在室溫下攪拌1.5小時后，加入10ml甲苯，并蒸發(fā)反應(yīng)混合物。殘余物在真空下干燥，然后再溶解在20ml二噁烷中，在回流下加熱溶液6小時?；旌衔镎舾?，殘余物用乙醚研制，過濾，并將剩余的固體在真空下干燥得到終產(chǎn)物。
產(chǎn)率261mg(86.2％)米白色固體1H-NMR(DMSO-d6)δ＝1.95(m，2H)，2.31(s，3H)，2.89(m，1 H)，3.38(m，2H)，3.72(tr，2H)，7.28(d，2H)，7.84(m，8H)，8.07(d，2H)，12.33(br s，1H).實施例6(外消旋)-2-[2-(1，3-二氧-1，3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]-4-(4’-羥基[1，1’-聯(lián)苯]-4-基)-4-氧代丁酸中間體6A2-[2-(1，3-二氧-1，3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]-2-[2-(4’-羥基[1，1’-聯(lián)苯]-4-基)-2-氧代乙基]丙二酸二叔丁基酯 將細(xì)粉末狀的無水碳酸鉀(2.15g，15.58mmol)加入到中間體5G(2.0g，3.12mmol)在90ml THF/甲醇/乙醇混合物(30∶50∶10)的溶液中。得到的懸浮液在室溫下劇烈攪拌45分鐘，然后用乙酸乙酯稀釋并過濾。濾液在真空下濃縮至其原始體積的一半，再用乙酸乙酯稀釋，然后倒入到冰冷的pH 4的緩沖溶液中。水相用乙酸乙酯萃取兩次，合并的有機相經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并蒸發(fā)。真空干燥后，700mg(約1.1mmol)殘余物(含有開環(huán)的物質(zhì))溶解在20ml二氯甲烷中，在0℃加入1-羥基-1H-苯并三唑氫化物(189mg，1.23mmol)和N’-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳的亞氨基鹽酸鹽(229mg，1.18mmol)。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌3天，然后用二氯甲烷稀釋，并用pH 4的緩沖溶液和飽和的碳酸氫鈉溶液洗滌兩次。有機相經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并蒸發(fā)。最后粗產(chǎn)物用二氯甲烷/甲醇梯度(100∶1→80∶1)的柱色譜純化。
產(chǎn)率494mg(71％)白色固體1H-NMR(DMSO-d6)δ＝138(s，18H)，2.31(m，2H)，3.60(m，2H)，3.70(s，2H)，6.90(d，2H)，7.61(d，2H)，7.78(m，6H)，8.00(d，2H)，9.76(s，1H).實施例6(外消旋)-2-[2-(1，3-二氧-1，3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]-4-(4’-羥基[1，1’-聯(lián)苯]-4-基)-4-氧代丁酸 在0℃將中間體6A(490mg，0.82mmol)溶解在二氯甲烷(7.5ml)和三氟乙酸(7.5ml)的混合物中。在室溫下攪拌30分鐘后，加入7ml甲苯，并蒸發(fā)反應(yīng)混合物。殘余物在真空下干燥，然后再溶解在15ml二噁烷中，溶液在回流下加熱4.5小時。冷卻至室溫后，向反應(yīng)混合物中加入乙醚(15ml)，經(jīng)過濾收集沉淀的產(chǎn)物。濾液蒸干，殘余物用含有幾滴甲醇的乙醚研制，并再次過濾得到第二份獲得的終產(chǎn)物。
產(chǎn)率299mg(82.6％)白色固體1H-NMR(DMSO-d6)δ＝1.94(m，2H)，2.87(m，1H)，3.38(m，2H)，3.70(tr，2H)，6.89(d，2H)，7.61(d，2H)，7.75(d，2H)，7.85(m，4H)，8.01(d，2H)，9.76(brs，1H)，12.30(brs，1H).實施例7(外消旋)-4-(4’-氯[1，1’-聯(lián)苯]-4-基)-2-[2-(4，6-二甲氧基-1，3-二氧-1，3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]-4-氧代丁酸中間體7A2-溴-1-(4’-氯[1，1’-聯(lián)苯]-4-基)-1-乙酮 按WO96/15096所述方法制備該中間體。中間體7B2-[2-(4，6-二甲氧基-1，3-二氧-1，3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]丙二酸二叔丁基酯 向攪拌的中間體5E(8.4g，32.2mmol)在100ml干THF中的溶液中連續(xù)加入3，5-二甲氧基鄰苯二甲酰亞胺(10.0g，48.3mmol)、三苯基膦(1.1g，41.8mmol)，并在0℃加入偶氮二羧酸二乙酯(6.7g，38.6mmol)。得到的溶液攪拌過夜，同時保溫至室溫。過濾后，濾液用乙酸乙酯稀釋并用水和鹽水洗滌兩次。有機相經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并蒸發(fā)。最后粗產(chǎn)物用二氯甲烷/乙酸乙酯梯度(70∶1→30∶1)的柱色譜純化。
產(chǎn)率2.69g(18.6％)白色固體1H-NMR(DMSO-d6)δ＝1.38(s，18H)，1.97(q，2H)，3.23(tr，1H)，3.54(tr，2H)，3.92(s，6H)，6.89(d，1H)，6.97(d，1H).中間體7C2-[2-(4’-氯[1，1’-聯(lián)苯]-4-基)-2-氧代乙基]-2-[2-(4，6-二甲氧基-1，3-二氧-1，3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]丙二酸二叔丁基酯 在氬氣下，將中間體7B(2.69g，5.98mmol)在30ml干THF中的溶液在0℃滴加到氫化鈉(0.18g，80％在無機油中的懸浮液，6.04mmol)在20ml干THF中的懸浮液中。在30-40℃攪拌30分鐘后，混合物再冷卻至0℃，并滴加中間體3A(1.87g，6.04mmol)在20ml干THF中的溶液。然后混合物攪拌過夜，同時保溫至室溫。再在0℃加入批量的氫化鈉(36mg，1.2mmol)和中間體7A(374mg，1.2mmol)，在室溫下繼續(xù)攪拌3天。加入飽和的氯化銨溶液(40ml)和鹽水(80ml)以淬滅反應(yīng)混合物，并用乙酸乙酯萃取兩次。有機相經(jīng)Na2SO4干燥，過濾并蒸發(fā)。最后粗產(chǎn)物用二氯甲烷至二氯甲烷/乙酸乙酯梯度(20∶1)的柱色譜純化。
產(chǎn)率1.51g(37.2％)白色固體RF＝0.51(二氯甲烷/乙酸乙酯梯度20∶1)＝0.59(環(huán)己烷/乙酸乙酯梯度1∶1)ESI-MSm/z＝678[M+H]+，622([M+H]+-C4H8)，566([M+H]+-2xC4H8)，548([M+H]+-2xC4Hg/-H2O).實施例74-(4’-氯[1，1’-聯(lián)苯]-4-基)-2-[2-(4，6-二甲氧基-1，3-二氧-1，3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]-4-氧代丁酸 在0℃，將中間體7C(1.5g，2.2mmol)溶解在二氯甲烷(10ml)和三氟乙酸(10ml)的混合物中。在室溫下攪拌45分鐘后，加入10ml甲苯，蒸發(fā)反應(yīng)混合物。殘余物在真空下干燥，然后再溶解在20ml二噁烷中，溶液在回流下加熱6小時。混合物蒸干，殘余物用乙醚研制，過濾，剩余的固體在真空下干燥得到終產(chǎn)物。
產(chǎn)率1.07g(92.1％)米白色固體1H-NMR(DMSO-d6)δ＝1.89(m，2H)，2.84(m，1H)，3.39(m，2H)，3.63(tr，2H)，3.92(s，6H)，6.88(d，1H)，6.97(d，1H)，7.58(d，2H)，7.82(m，4H)，8.07(d，2H)，12.30(brs，1H).實施例8和9(+)-和(-)-4-(4’-溴[1，1-聯(lián)苯]-4-基)-2-[2-(1，3-二氧-1，3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]-4-氧代丁酸 基本上按WO96/15096所述的方法制備外消旋的4-(4’-溴[1，1-聯(lián)苯]-4-基)-2-[2-(1，3-二氧-1，3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]-4-氧代丁酸。
1H-NMR(DMSO-d6)δ＝1.95(m，2H)，2.88(m，1H)，3.38(m，2H)，3.72(tr，2H)，7.72(m，4H)，7.85(m，6H)，8.08(d，2H)，12.33(brs，1H).
1.0g(1.97mmol)該物質(zhì)用市售的5μm Kromasil KR 100-5-CHI-DMB相經(jīng)手性HPLC分離。以恒定流速25ml/min采用由40％異己烷和60％叔丁基甲基醚/二氯甲烷/冰乙酸混合物(480∶40∶1)組成的溶劑混合物。實施例8第一次洗脫的對映異構(gòu)體A產(chǎn)率309mg(31％)[α]23D＝+3.87°(在THF中c＝0.458g/100ml)實施例9第二次洗脫的對映異構(gòu)體B產(chǎn)率240mg(24％)[α]23D＝-5.98°(在THF中c＝0.482g/ml)實施例10和11(+)-和(-)-4-(4’-氯[1，1-聯(lián)苯]-4-基)-2-[2-(5，7-二氧-5，7-二氫-6H-[1，3]-dioxolo[4，5-f]異吲哚-6-基)乙基]-4-氧代丁酸 基本上按WO96/15096所述的方法制備外消旋的4-(4’-氯[1，1-聯(lián)苯]-4-基)-2-[2-(5，7-二氧-5，7-二氫-6H-[1，3]-dioxolo[4，5-f]異吲哚-6-基)乙基]-4-氧代丁酸.1H-NMR(DMSO-d6)δ＝1.91(m，2H)，2.85(m，1H)，3.38(m，2H)，3.66(tr，2H)，6.26(s，2H)，7.39(s，2H)，7.58(d，2H)，7.82(m，4H)，8.06(d，2H)，12.31(brs，1H).
0.70g(1.38mmol)該物質(zhì)用市售的5μm Kromasil KR 100-5-CHI-DMB相經(jīng)手性HPLC分離。以恒定流速25ml/min采用由40％異己烷和60％叔丁基甲基醚/二氯甲烷/冰乙酸混合物(480∶40∶1)組成的溶劑混合物。實施例10第一次洗脫的對映異構(gòu)體A產(chǎn)率261mg(37.3％)[α]23D＝+13.99°(在THF中c＝0.955g/100ml)實施例11第二次洗脫的對映異構(gòu)體B產(chǎn)率228mg(32.6％)[α]23D＝-15.15°(在THF中c＝0.991g/100ml)實施例124-(4’-氰基[1，1’-聯(lián)苯]-4-基)-4-氧代-2-{2-[4-氧代-1，2，3-苯并三嗪-3(4H)-基]乙基}丁酸中間體12A4'-(2-溴乙酰基)[1，1’-聯(lián)苯]-4-腈 在0℃將4.68g氯化鋁(35.15mmol)溶解在45ml二氯甲烷中，并通過滴加3.38g(16.74mmol)溴乙酰溴來處理。30分鐘后，滴加3g(16.74mmol)溶解在15ml二氯甲烷中的4-氰基聯(lián)苯。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜，加到冰水中并用二氯甲烷萃取2次。有機相用水和鹽水洗滌，干燥并蒸發(fā)。殘余物用石油醚研制，過濾并干燥。產(chǎn)率4.24g(83％)。
200MHz1H-NMR(CDCl3)4.49，s，2H；7.73，m，6H；8.11，d，2H.中間體12B2-[2-(4’-氰基[1，1’-聯(lián)苯]-4-基)-2-氧代乙基]-2-{2-[4-氧代-1，2，3-苯并三嗪-3(4H)-基]乙基}丙二酸 將2.59g(6.67mmol)中間體1 3C在20mlDMF中的溶液滴加到0.333gNaH(60％在無機油中)在20mlDMF中的懸浮液中?；旌衔飻嚢?0分鐘并加入2g(6.67mmol)中間體12A在20ml干DMF中的溶液?；旌衔镌赗T下攪拌2.5小時，倒入到150mlNH4Cl溶液中，并用乙酸乙酯萃取。有機相用水和鹽水洗滌，經(jīng)MgSO4干燥并蒸發(fā)。殘余物用色譜純化得到0.62g(15％)。200MHz1H-NMR(CDCl3)2.71，s，2H；3.81，s，2H；4.53，m，2H；7.75，m，7H；7.91，m，1H；8.10，m，3H；8.30，m，1H.實施例124-(4’-氰基[1，1’-聯(lián)苯]-4-基)-4-氧代-2-{2-[4-氧代-1，2，3-苯并三嗪-3(4H)-基]乙基}丁酸 在0℃，將0.61g(1mmol)中間體12B溶解在10ml二氯甲烷/三氟乙酸(1∶1)中，混合物在RT下攪拌2小時。加入甲苯后，反應(yīng)混合物蒸干，殘余物倒入10ml二噁烷中。溶液回流下攪拌6小時并在RT下過夜。在真空中除去溶劑，殘余物用HPLC純化得到96mg(21％)。200MHz1H-NMR(CDCl3)2.28，m，2H；2.49，m，2H；3.26，m，1H；4.58，m，2H，7.72，m，10H；8.18，m，1H；8.38，m，lH.實施例134-氧代-2-{2-(4-氧代-1，2，3-苯并三嗪-3(4H)-基)乙基}-4-[4’-(三氟甲氧基)[1，1’-聯(lián)苯]-4-基]丁酸中間體13A1-[4’-(三氟甲氧基)[1，1’-聯(lián)苯]-4-基]-1-乙酮 在低于20℃的溫度下，向30g(126mmol)4-(三氟甲氧基)-1，1’-聯(lián)苯和21g三氯化鋁(157mmol)在120ml硝基苯的混合物中加入9.87g(126mmol)乙酰氯。反應(yīng)混合物在0℃攪拌2小時，加入到240ml冰水和42ml濃HCl中，并用乙酸乙酯萃取。有機相用水和鹽水洗滌，在真空中去除溶劑。殘余物用石油醚研制，過濾并干燥。結(jié)晶后在4℃從另一批量的濾液中得到總共23.5g(66％)。200MHz1H-NMR(CDCl3)2.65，s，3H；7.33，d，2H；7.58，m，4H；8.06，d，2H.中間體13B2-溴-1-[4’-(三氟甲氧基)[1，1’-聯(lián)苯]-4-基]-1-乙酮 溫和加熱下，將12.27g(43.8mmol)中間體13A溶解在150ml甲醇、150ml乙醇和50ml乙醚的混合物中。在RT下加入5.914g(56.9mmol)硼酸三甲基酯，并滴加7.35g(45.9mmol)溴。攪拌反應(yīng)混合物直至紅褐色消失。在真空中去除溶劑，殘余物用色譜(環(huán)己烷/乙酸乙酯)純化得到6.2g(39％)。200MHz1H-NMR(CDCl3)4.49，s，2H；7.33，d，2H；7.68，dd，4H；8.10，d，2H.中間體13C2-{2-[4-氧代-1，2，3-苯并三嗪-3(4H)-基]乙基}丙二酸二叔丁基酯 將46.2g(177mmol)中間體5E溶解在600mlTHF中。加入69.8g(266mmol)三苯基膦和39.2g(266mmol)1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮。滴加46.4g(266mmol)DEAD。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜。在真空中去除溶劑，經(jīng)色譜得到產(chǎn)物(環(huán)己烷/乙酸乙酯6∶1)。
產(chǎn)率51.8g(63％)200MHz1H-NMR(CDCl3)1.43，s，18H；2.43，quar.，2H；3.30，t，1H；4.57，t，2H；7.80，m，1H；7.94，m，1H；8.16，dd，1H；8.36，dd，1H.中間體13D2-{2-[4-氧代-1，2，3-苯并三嗪-3(4H)-基]乙基}-2-{2-氧代-2-[4’-(三氟甲氧基)[1，1’-聯(lián)苯]-4基]乙基}丙二酸二叔丁基酯 向0.52g(12.9mmol)氫化鈉(在無機油中60％懸浮液)在20mlDMF的懸浮液中滴加4.04g(10.37mmol)中間體13C在30mlDMF的溶液。在RT下攪拌30分鐘后，滴加3.73g(10.37mmol)中間體13B在30mlDMF的溶液，反應(yīng)混合物在RT下攪拌2小時。將反應(yīng)混合物倒入到NH4Cl溶液中，用乙酸乙酯萃取，有機相用水和鹽水洗滌。干燥和蒸發(fā)溶劑后，產(chǎn)物用色譜純化得到2.09g(30％)。200MHz1H-NMR(CDCl3)2.70，m，2H；3.82，s，2H；4.54，m，2H；7.32，d，2H；7，62，m，5H；8.07，m，4H；8.30，m，1H.實施例134-氧代-2-{2-[4-氧代-1，2，3-苯并三嗪-3(4H)-基]乙基}-4-[4’-(三氟甲氧基)[1，1’-聯(lián)苯]-4-基]丁酸 在15ml二氯甲烷中2.09g(3.13mmol)中間體13C和1 5ml三氟乙酸的溶液在RT下攪拌2小時。加入甲苯后，在真空中去除溶劑。殘余物溶解在30ml二噁烷中，溶液回流6小時并在RT下攪拌過夜。在真空中去除溶劑，殘余物用乙醚研制，經(jīng)過濾收集沉淀，并干燥得到0.51g(32％)。200MHz1H-NMR(DMSO-d6)2.18，m，2H；2.98，m，1H；3.51，m，2H；4.52，m，2H；7.52，d，2H；7.89，m，5H；8.10，m，3H；8.24，m，2H；12.39，s，1H.實施例14和15(+)-和(-)-(1S*，2S*，5R*)-2-[(4'-氯[1，1’-聯(lián)苯]-4-基)羰基]-5-[(1，3-氧-1，3-二氫-2H-異吲哚-2-基)甲基]環(huán)戊羧酸 基本上按WO96/15096實施例360的步驟制備外消旋化合物。
4.20g(8.61mmol)該物質(zhì)用市售的5μm Kromasil KR 100-5-CHI-DMB相經(jīng)手性HPLC分離為純的對映異構(gòu)體形式。以恒定流速25ml/min采用由30％異己烷和70％叔丁基甲基醚/二氯甲烷/冰乙酸混合物(480∶40∶1)組成的溶劑混合物。實施例14第一次洗脫的對映異構(gòu)體A產(chǎn)率1.72g(41.0％)[α]21D＝+44.26°(在THF中c＝0.464g/100ml)實施例15第二次洗脫的對映異構(gòu)體B產(chǎn)率1.59g(37.9％)[α]21D＝-43.70°(在THF中c＝0.575g/ml)
權(quán)利要求
1.具有基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑活性，以及下列通式的化合物和藥物上可接受的鹽及其前體藥物用于制備用于治療和預(yù)防呼吸疾病的藥物的用途(T)xA-B-D-E-CO2H其中，(a)(T)xA代表取代的和未取代的芳族或雜芳族部分，選自下列基團(tuán) 其中R1代表H或1-3個碳的烷基；以及各個T代表取代基，獨立地選自下列基團(tuán)*鹵素-F、-Cl、-Br和-I；*1-10個碳的烷基；*1-10個碳的鹵代烷基；*1-10個碳的鹵代烷氧基；*2-10個碳的鏈烯基；*2-10個碳的鏈炔基；*-(CH2)pQ，其中p為0或1-4的整數(shù)；*-鏈烯基-Q，其中所述鏈烯基部分含有2-4個碳；以及*-鏈炔基-Q，其中所述鏈炔基部分含有2-7個碳；以及Q選自6-10個碳的芳基、含有4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子的雜芳基、-CN、-CHO、-NO2、-CO2R2、-OCOR2、-SOR3、-SO2R3、-CON(R4)2、-SO2N(R4)2、-C(O)R2、-N(R4)2、-N(R2)COR2、-N(R2)CO2R3、-N(R2)CON(R4)2、-CHN4、-OR4和-SR4；其中R2代表H；1-6個碳的烷基；6-10個碳的芳基；含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子的雜芳基；或芳基部分含6-10個碳且烷基部分含1-4個碳的芳烷基；或雜芳基部分含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子，且烷基部分含1-4個碳的雜芳烷基；R3代表1-4個碳的烷基；6-10個碳的芳基；含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子的雜芳基；芳基部分含6-10個碳且烷基部分含1-4個碳的芳烷基；或雜芳基部分含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子，且烷基部分含1-4個碳的雜芳烷基；R4代表H；1-12個碳的烷基；6-10個碳的芳基；含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子的雜芳基；芳基部分含6-10個碳且烷基部分含1-4個碳的芳烷基；雜芳基部分含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子，且烷基部分含1-4個碳的雜芳烷基；1-12個碳的鏈烯基；2-12個碳的鏈炔基；-(CqH2qO)rR5，其中q為1-3，r為1-3，以及R5為H，條件是q大于1，或為1-4個碳的烷基，或苯基；末端為H、1-4個碳的烷基、或苯基的亞烷基硫基；末端為H、1-4個碳的烷基、或苯基的亞烷基氨基；-(CH2)sX其中s為1-3，X為鹵素；-C(O)OR2；或-C(O)R2；條件是a)當(dāng)兩個R4基團(tuán)位于氮上時，它們可通過鍵連接形成雜環(huán)，以及b)與Q相連的部分或是Q部分中的不飽和部位被至少一個碳原子與Q的任一N、O或S相隔，以及，x為0、1或2；(b)B代表單鍵或含0-2個取代基T的任選取代的芳環(huán)或雜芳環(huán)，該取代基T可獨立地具有(a)中所說明的意義，B環(huán)選自下列基團(tuán) 其中R1如上定義；(c)D代表 其中R2如上定義，且各個R2可相同或不同；(d)E代表帶有m個取代基R6的n個碳原子的鏈，其中所述的R6基團(tuán)為獨立的取代基，或構(gòu)成螺環(huán)或非螺環(huán)，其中a)兩個R6基團(tuán)相連，且同與兩個R6基團(tuán)連接的鏈原子，以及任何插入的鏈原子共同構(gòu)成3-7元環(huán)，或b)一個R6基團(tuán)連接到該基團(tuán)R6所在的鏈上，和與R6基團(tuán)相應(yīng)的鏈原子，以及任何插入的鏈原子共同構(gòu)成3-7元環(huán)；以及其中n為2或3；m為1-3的整數(shù)；各個R6基團(tuán)獨立地選自下列基團(tuán)*氟；*羥基，條件是單個碳原子可帶有不超過一個羥基取代基；*1-10個碳的烷基；*6-10個碳的芳基；*含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子的雜芳基；*芳基部分含6-10個碳且烷基部分含1-8個碳的芳烷基；*雜芳基部分含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子，且烷基部分含1-8個碳的雜芳烷基；*2-10個碳的鏈烯基；*芳基部分含6-10個碳且鏈烯基部分含2-5個碳的芳基-鏈烯基；*雜芳基部分含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子，且鏈烯基部分含2-5個碳的雜芳基-鏈烯基；*2-10個碳的鏈炔基；*芳基部分含6-10個碳且鏈炔基部分含2-5個碳的芳基-鏈炔基；*雜芳基部分含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子，且鏈炔基部分含2-5個碳的雜芳基-鏈炔基；*-(CH2)tR7，其中t為0或1-5的整數(shù)；以及R7選自下列基團(tuán) 以及相應(yīng)的雜芳基部分，其中含芳基的R7基團(tuán)的芳基部分含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子；其中，Y代表O或S；R1、R2和R3如上定義；以及u為0、1或2；以及*-(CH2)vZR8，其中v為0或1-4的整數(shù)；以及Z代表 R8選自下列基團(tuán)1-12個碳的烷基；6-10個碳的芳基；含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子的雜芳基；芳基部分含6-12個碳且烷基部分含1-4個碳的芳烷基；芳基部分含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子，且烷基部分含1-4個碳的雜芳烷基；-C(O)R9，其中R9代表2-6碳的烷基、6-10個碳的芳基、含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子的雜芳基、或芳基部分含6-10個碳或為含4-9個碳，以及至少一個N、O或S雜原子的雜芳基，且烷基部分含1-4個碳的芳烷基，條件是-當(dāng)R8為-C(O)R9，Z為S或O；-當(dāng)Z為0時，R8也可為-(CqH2qO)rR5，其中q、r和R5如上所定義；以及*-(CH2)wSiR103，其中w為1-3的整數(shù)；以及R10代表1-2個碳的烷基；條件是-任何所述T或R6基團(tuán)的芳基或雜芳基部分可任選帶有至多兩個取代基，所述取代基選自-(CH2)yC(R4)(R3)OH、-(CH2)yOR4、-(CH2)ySR4、-(CH2)yS(O)R4、-(CH2)yS(O)2R4、-(CH2)ySO2N(R4)2、-(CH2)yN(R4)2、-(CH2)yN(R4)COR3、-OC(R4)2O-，其中兩個氧原子均連接到芳環(huán)上、-(CH2)yCOR4、-(CH2)yCON(R4)2、-(CH2)yCO2R4、-(CH2)yOCOR4、-鹵素、-CHO、-CF3、-NO2、-CN和-R3，其中y為0-4；以及R3和R4如上定義；且任何兩個連接到一個氮上的R4可連接在一起以形成雜環(huán)。
2.具有基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑活性，以及下列通式的化合物和藥物上可接受的鹽及其前體藥物用于制備用于治療和預(yù)防呼吸疾病的藥物的用途(T)xA-B-D-E-CO2H(I)其中，(a)(T)xA代表取代的和未取代的芳族或雜芳族部分，選自下列基團(tuán) 其中各個T代表取代基，獨立地選自下列基團(tuán)*鹵素-F、-Cl、-Br和-I；*1-10個碳的烷基；*1-10個碳的鹵代烷基；*2-10個碳的鏈烯基；*2-10個碳的鏈炔基；*-(CH2)pQ，其中p為0或1-4的整數(shù)；*-鏈烯基-Q，其中所述鏈烯基部分含有2-4個碳；以及*-鏈炔基-Q，其中所述鏈炔基部分含有2-7個碳；以及Q選自-OR4和-SR4；其中R4代表H；1-12個碳的烷基；6-10個碳的芳基；含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子的雜芳基；芳基部分含6-10個碳且烷基部分含1-4個碳的芳烷基；雜芳基部分含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子，且烷基部分含1-4個碳的雜芳烷基；-C(O)OR2；或-C(O)R2；條件是與Q相連或是Q的一部分的部分中的不飽和部位被至少一個碳原子與Q的任一N、O或S相隔，以及，x為0、1或2；b)B代表含0-2個取代基T的任選取代的苯基或噻吩基環(huán)，其中取代基T可獨立地具有(a)中描述的意義，(c)D代表 (d)E代表帶有m個取代基R6的n個碳原子的鏈，其中所述的R6基團(tuán)為獨立的取代基，或構(gòu)成非螺環(huán)，其中兩個R6基團(tuán)相連，且與同所述兩個R6基團(tuán)所連接的鏈原子，以及任何插入的鏈原子共同構(gòu)成5或6元環(huán)；以及其中n為2或3；m為1或2的整數(shù)；各個R6基團(tuán)獨立地選自下列基團(tuán)*芳基部分含6-10個碳且烷基部分含1-8個碳的芳烷基；*-(CH2)tR7，其中t為0或1-5的整數(shù)；以及R7選自下列基團(tuán) 其中R2獨立地選自H、6-10個碳的芳基*-(CH2)vZR8，其中v為0或1-4的整數(shù)；以及Z代表 R8選自下列基團(tuán)1-12個碳的烷基；6-10個碳的芳基；含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子的雜芳基；芳基部分含6-12個碳且烷基部分含1-4個碳的芳烷基；芳基部分含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子，且烷基部分含1-4個碳的雜芳烷基；-C(O)R9，其中R9代表2-6碳的烷基、6-10個碳的芳基、含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子的雜芳基、或其中芳基部分含6-10個碳或是含4-9個碳以及至少一個N、O或S雜原子的雜芳基，且烷基部分含1-4個碳的芳烷基，條件是-當(dāng)R8為-C(O)R9，Z為S或O；-當(dāng)Z為0時，R8也可為-(CqH2qO)rR5，其中q、r和R5如上所定義；以及*-(CH2)wSiR103，其中w為1-3的整數(shù)；以及R10代表1-2個碳的烷基；條件是-任何所述T或R6基團(tuán)的芳基或雜芳基部分可任選帶有多至兩個取代基，所述取代基選自O(shè)R4、N(R4)2、-OC(R4)2O-，其中兩個氧原子均連接到芳環(huán)上、CON(R4)2、OCOR4、-鹵素、-NO2和至多6個碳原子的烷基；其中R4如上定義。
3.權(quán)利要求1或2的化合物用于制備用于治療和預(yù)防呼吸疾病的藥物的用途，其中至少一個單元A、B、T和R6含有雜芳環(huán)。
4.權(quán)利要求1或2的化合物用于制備用于治療和預(yù)防呼吸疾病的藥物的用途，其中所述E單元，n為2以及m為1。
5.權(quán)利要求1或2的化合物用于制備用于治療和預(yù)防呼吸疾病的藥物的用途，其中A為 B為對亞苯基，D為羰基。
6.權(quán)利要求1或2的化合物用于制備用于治療和預(yù)防呼吸疾病的藥物的用途，其中化合物選自下列
7.通式(I’)的化合物 其中CO-E-CO2H代表3-羧基-5-R7-戊-1-酮-1-基殘基，取代基T和R7具有下表所給出的意義
8.化合物(+)-2-[2-(1，3-二氧-1，3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]-4-(4’-乙氧基[1，1’-聯(lián)苯]-4-基)-4-氧代丁酸
9.通式(I’)化合物及其鹽用于制備用于治療和預(yù)防呼吸疾病的藥物的用途， 其中T為(C1-C4)烷氧基、氯、溴、氟、乙酰氧基、羥基、氰基、三氟甲基或三氟甲氧基，CO-E-CO2H代表3-羰基-5-R7-戊-1-酮-1-基或2-羧基-3-(R7-甲基)-環(huán)戊-1-基)羰基-殘基，以及R7代表下式的基團(tuán)
10.化合物(+)-2-[2-(1，3-二氧-1，3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]-4-(4’-乙氧基[1，1’-聯(lián)苯]-4-基)-4-氧代丁酸用于制備用于治療和預(yù)防呼吸疾病的藥物的用途
11.化合物(+)-4-(4’-氯[1，1’-聯(lián)苯]-4-基)-2-[2-(1，3-二氧-1，3-二氫-2H-異吲哚-2-基)乙基]-4-氧代丁酸用于制備用于治療和預(yù)防呼吸疾病的藥物用途
12.根據(jù)權(quán)利要求1-6或9-11任一項所述的化合物在制備用于治療由MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-12和/或MMP-13所介導(dǎo)的病癥的藥物中的用途。
13.一種治療或預(yù)防由MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-12和/或MMP-13所介導(dǎo)的情況的方法，其包括服用有效量的權(quán)利要求1-6或9-11任一項所述的物質(zhì)。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-6或9-11任一項所述的化合物在治療或預(yù)防在哺乳動物例如人類、農(nóng)場動物或家庭寵物中的哮喘；慢性阻塞肺疾病包括慢性支氣管炎和肺氣腫；囊性纖維化；支氣管擴(kuò)張；成人呼吸窘迫綜合癥(ARDS)；過敏性呼吸疾病包括過敏性鼻炎；與TNFα產(chǎn)生有關(guān)的疾病包括急性肺纖維變性疾病、肺結(jié)節(jié)病、矽肺；煤礦工人的塵肺病、肺泡病的用途。
15.具有基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑活性的組合物用于制備治療或預(yù)防呼吸疾病的藥物的用途，所述組合物含有權(quán)利要求1-12任一項所述的化合物及其藥物上可接受的載體。
16.含有權(quán)利要求7或8的化合物的組合物。
17.用于治療或預(yù)防急性或慢性炎癥的權(quán)利要求16的組合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了新的4－聯(lián)芳基丁酸和5－聯(lián)芳基戊酸衍生物,取代的4－聯(lián)芳基丁酸和5－聯(lián)芳基戊酸衍生物作為基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑用于治療呼吸疾病的用途,含它們的藥物組合物,及其使用方法。本發(fā)明的化合物具有通式(I)(T)
文檔編號C07D275/06GK1337932SQ99816404
公開日2002年2月27日 申請日期1999年12月20日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月30日
發(fā)明者M·F·菲茨格拉德, P·J·加蒂納, K·納施, G·斯圖爾頓, G·本茨, R·亨寧, K·-H·施萊默, B·里德爾, H·哈寧 申請人:拜爾公司