水解酶酶底物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明基于所述水解酶的新底物提供用于檢測樣品中水解酶的存在或總量的新方法，也提供了高靈敏度的用于檢測這類水解酶的新的構(gòu)思和方法。
【專利說明】水解酶酶底物及其應(yīng)用
交叉引用相關(guān)申請
[0001]該申請要求2011車I月18日提交的申請?zhí)枮镹0.61/433,909的美國臨時申請的優(yōu)先權(quán)，該臨時申請的內(nèi)容全部被引用包含于該申請中。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明主要涉及某種水解酶酶底物及其應(yīng)用。特別地，本發(fā)明提供了作為一些水解酶底物的新化合物，借所述水解酶將水解酶底物轉(zhuǎn)變成容易檢測到的水解產(chǎn)物，例如，通過這里所述的酶催化方法。
【背景技術(shù)】
[0003]在許多生物化學(xué)系統(tǒng)中，酶被廣泛用作靈敏的標(biāo)簽，包括免疫測定，例如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)系統(tǒng)，以及核酸分析，例如PCR和測序系統(tǒng)。酶經(jīng)常被間接地檢測到，基于它們的活性，通常基于它們的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)換，或輔因子之間的轉(zhuǎn)換，例如氧化態(tài)和還原態(tài)之間。
[0004]在一些實例中，待檢測的酶連接在高度特異的絡(luò)合或結(jié)合劑上，例如抗體。當(dāng)抗體結(jié)合在待檢測的目標(biāo)分子上時，抗體復(fù)合體可以通過觀察連接著它的酶標(biāo)的存在而被檢測到；基于其活性，所述酶容易被檢測到。在其它系統(tǒng)中，待表達(dá)的寡核苷酸通過連接編碼可以作為標(biāo)簽的酶的核酸來被標(biāo)記。當(dāng)寡核苷酸被表達(dá)時，包含利于檢測酶標(biāo)的蛋白產(chǎn)物，又是基于酶的活性。
[0005]酶活性的檢測提供了非常有效的信號放大。目前并非檢測通常小量的酶(或目標(biāo)化合物)，而是尋找酶的活性，即它對已知的可以加入相對大量的底物的作用。單獨(dú)的酶分子可以催化大量的底物分子的轉(zhuǎn)化(例如，酶每分鐘可以催化IO7個反應(yīng):THE ImmlmoassayHandbook，3rded.by David Wild, Elsevier Press, pgl94 (2005)免疫測定指南，第 3 版，大衛(wèi).懷爾德(David Wild)主編，愛思唯爾出版社(Elsevier)出版，194頁(2005))，因此實際檢測到的形式可以是酶形成的產(chǎn)物，或底物的消失，或酶消耗的輔因子，而不是酶本身。固在觀察酶活性時，人們檢測大量的底物或產(chǎn)物分子而非酶本身，這提供了高度放大的信號。
[0006]許多這樣的酶標(biāo)是已知的:包括辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶在內(nèi)的大部分通常用于免疫測定(例如:ELISA)的酶標(biāo)。其它已經(jīng)使用的酶標(biāo)包括乙酸激酶、熒火蟲熒光素酶、黃嘌呤氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶、以及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。識別號194-195(Id.atl94-195)。
[0007]然而，仍然需要新的方法來標(biāo)記生物化學(xué)種類從而有利于極小量的檢測，因此需要新的酶標(biāo)系統(tǒng)。也仍然需要方法來檢測痕量水解酶，該酶在其它體系中不只是作為標(biāo)簽。本發(fā)明提供了這樣的方法以及在這些方法和條件中使用的化合物和成分。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]—方面，本發(fā)明提供了某些水解酶的底物、包含這些底物的成分，以及用這些底物來確定水解酶的存在的方法，該水解酶能夠水解所述底物。在一些實施例中，水解酶可以用作試驗系統(tǒng)的標(biāo)記例如ELISA，例如，或者編碼水解酶的核酸可以連接在待表達(dá)的寡核苷酸上，在這種情況下所述寡核苷酸的表達(dá)產(chǎn)生包含所述功能水解酶的多肽:這里描述的成分和方法有助于在這些或其它系統(tǒng)中檢測所述水解酶。
[0009]一方面，本發(fā)明提供下述化學(xué)式的化合物，所述化合物是目標(biāo)水解酶的底物。
【權(quán)利要求】
1.一種水解酶底物，是表達(dá)式(I)所示的化合物:
2.權(quán)利要求1中的水解酶底物，其中A是任意取代的芳香族基團(tuán)或雜芳族基團(tuán)。
3.權(quán)利要求2中的水解酶底物，其中A是任意取代的苯基或萘酚；
4.權(quán)利要求1中的水解酶底物，其中A是表達(dá)式(IV)所示的1-烯烴:
5.權(quán)利要求1中的水解酶底物，其中A是表達(dá)式(V)所示的1-炔烴:
6.權(quán)利要求1中的水解酶底物，其中R是氫原子、甲基或苯基。
7.權(quán)利要求1中的水解酶底物，其中X包括糖類。
8.權(quán)利要求7中的水解酶底物，其中所述化合物如表達(dá)式(VIa)或(VIb)所表示:
9.權(quán)利要求1中的水解酶底物，其中所述化合物是表達(dá)式(VII)所示的酯類:
10.權(quán) 利要求9中的水解酶底物，其中R3是選自甲基、乙基和苯基組成的組的基團(tuán)，或者其中的HO2C-R3是α氨基酸。
11.權(quán)利要求1中的水解酶底物，其中的復(fù)合物是表達(dá)式(VIII)所示的化合物:
12.權(quán)利要求1中的水解酶底物，其中X包括磷酸基團(tuán)。
13.權(quán)利要求12中的水解酶底物，其中所述復(fù)合物是表達(dá)式(IX)所示的化合物:
14.權(quán)利要求1-3或6-13所述任一水解酶底物，其中A是可被任意取代的苯基基團(tuán)。
15.權(quán)利要求14中的水解酶底物，其中所述苯基基團(tuán)是不可被替代的，或者可被選自halo、氫氧根、CN、NO2, COORj、CONRj 2、NR’ 2、0R’的I~3個基團(tuán)取代、性地被C1-4烷基、SR，、SO2R，或 SO2NR’ 2 替代，其中每個R’是獨(dú)立的氫原子或可被任意取代的C1-4烷基，并且在相同或相鄰的原子上的兩個R’可被同時取代從而形成任意取代的C3-C8雜環(huán)。
16.上述權(quán)利要求所述的任一水解酶底物，其中烷基和雜環(huán)基團(tuán)的取代物選自halo、0X0、CN、N02、COOR”、CONR” 2、NR” 2、OR”、任意取代 C1-4 烷基、SO2R” 或 S02NR” 2，其中每個 R”都是獨(dú)立的氫原子或C1-4烷基。
17.權(quán)利要求1中的水解酶底物，其中A是表達(dá)式(X)所示的基團(tuán):
18.前述權(quán)利要求中所述的任一水解酶底物，其中R是氫原子。
19.前述權(quán)利要求中所述的任一水解酶底物，其中η是I。
20.權(quán)利要求1中的水解酶底物，其中X包括糖苷酶底物成分。
21.權(quán)利要求20中的水解酶底物，其中所述糖苷酶是β-半乳糖甘酶。
22.權(quán)利要求1中的水解酶底物，其中X包括酯酶底物成分。
23.權(quán)利要求22中的水解酶底物，其中所述酯酶選自羧酸酯酶、乙酰酯酶和α-氨基酸酯酶組成的組。
24.權(quán)利要求1中的水 解酶底物，其中X包括磷酸酶底物成分。
25.權(quán)利要求24中的水解酶底物，其中所述磷酸酶是堿性磷酸酶。
26.組合物,包括: a)權(quán)利要求1-25所述任一水解酶底物；和 b)可分解所述水解酶底物并生成由所述水解酶催化的所述裂解反應(yīng)的產(chǎn)物的芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子的水解酶，其中所述的芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子具有有下列表達(dá)式(II)的結(jié)構(gòu):

27.權(quán)利要求26中的組合物，其中所述水解酶是酯酶，磷酸酶或糖苷酶。
28.權(quán)利要求27中的組合物，其中所述水解酶來自乙酰酯酶、氨基酸酯酶、羧酸酯酶、核酸酶、磷酸二酯酶、脂肪酶和磷酸酶組成的組。
29.權(quán)利要求27中的組合物，其中所述水解酶是堿性磷酸酶。
30.權(quán)利要求28中的組合物，其中所述水解酶是α-氨基酸酯酶。
31.權(quán)利要求27中的組合物， 其中所述水解酶是β-半乳糖甘酶。
32.權(quán)利要求27中的組合物，其中所述水解酶是β-糖甘酶。
33.權(quán)利要求26中的組合物，還包括可氧化由所述水解酶催化的裂解反應(yīng)的產(chǎn)物-芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子的氧化劑。
34.權(quán)利要求33中的組合物，其中所述氧化劑是在有氧條件下可氧化芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子并生成芳基乙醛分子或不飽和脂肪族醛分子和H2O2的芳基醇氧化酶或不飽和脂肪族醇氧化酶。
35.權(quán)利要求34中的組合物，進(jìn)一步包括用于測定H2O2的試劑。
36.權(quán)利要求35中的組合物，其中所述用于測定H2O2的試劑包括過氧化物酶、4-AA和/或苯胺類似物。
37.權(quán)利要求33中的組合物，其中所述氧化劑是在NAD+orNADP+存在下可氧化芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子并生成NADH或NADPH的芳基醇脫氫酶或乙醇脫氫酶。
38.權(quán)利要求37中的組合物，進(jìn)一步包括NAD+或NADP+。
39.權(quán)利要求38中的組合物，進(jìn)一步包括用于測定NADH或NADPH的試劑。
40.權(quán)利要求34中的組合物，進(jìn)一步包括NADH或NADPH以及在NADH或NADPH存在下可還原芳基乙醛分子或不飽和脂肪族醛分子的芳基醇脫氫酶或乙醇脫氫酶。
41.權(quán)利要求40中的組合物，進(jìn)一步包括用于測量H2O2的試劑。
42.權(quán)利要求41中的組合物，其中所述用于測量H2O2`的試劑包括過氧化物酶、安替比林、苯酚和/或苯胺類似物中的至少一種。
43.權(quán)利要求26中的組合物，其中所述水解酶底物至少包括β-糖苷酶底物分子的一部分，并且所述水解酶是β -糖苷酶或β -半乳糖苷酶。
44.權(quán)利要求43中的組`合物，進(jìn)一步包括: a)在有氧條件下可氧化芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子并生成芳基乙醛分子或不飽和脂肪族醛分子和H2O2的芳基醇氧化酶或脂肪族醇氧化鎂；
b)NADH 或 NADPH c)在NADH或NADPH存在下還原芳基乙醛分子或不飽和脂肪族醛分子的芳基醇脫氫酶或乙醇脫氫酶。
45.權(quán)利要求44中的組合物，進(jìn)一步包括用于測量H2O2的試劑。
46.權(quán)利要求26中的組合物，其中所述水解酶底物至少包括堿性磷酸酶底物分子的一部分，且水解酶是堿性磷酸酶。
47.權(quán)利要求46中的組合物，進(jìn)一步包括: a)在有氧條件下可氧化芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子并生成氧化的芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子和H2O2的芳基醇氧化酶或脂肪族醇氧化酶；
b)NADH 或 NADPH ； c)在NADH或NADPH存在下可還原氧化的芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子的芳基醇脫氫酶或乙醇脫氫酶。
48.權(quán)利要求47中的組合，至少還包括一種用于測定H2O2的試劑。
49.權(quán)利要求26-48所述任一組合物，其中所述組合物的成分包含于試劑盒中。
50.權(quán)利要求26-49所述任一組合物，其中的組合物包括于針對靶標(biāo)物的的分析、分離和/或制備系統(tǒng)中。
51.權(quán)利要求50中的組合，其中所述靶標(biāo)物是無機(jī)分子、有機(jī)分子和/或它們的化合物。
52.權(quán)利要求51中的組合，其中所述靶標(biāo)物是選自氨基酸、肽、蛋白、核苷、核苷酸、寡聚核苷酸、核酸、維生素、單糖、寡糖、碳水化合物、脂類和它們的復(fù)合物組成的組中的有機(jī)分子。
53.權(quán)利要求52中的組合，其中所述系統(tǒng)是用于免疫分析、蛋白測序、核酸擴(kuò)增、雜交和/或測序的系統(tǒng)。
54.用于評估樣品中水解酶活性和/或總量的方法，包括: a)將實施例1-25中任一水解酶底物與包含或疑似包含所述水解酶的樣品接觸，所述水解酶底物具有表達(dá)式(I)中的結(jié)構(gòu):

55.權(quán)利要求54中的方法，其中所述水解酶是酯酶，β-半乳糖苷酶或糖苷酶。
56.權(quán)利要求55中的方法，其中所述水解酶是選自乙酰膽堿酯酶、氨基酸酯酶、羧基酯酶、核酸酶、磷酸二酯酶、脂肪酶和磷酸酶組成的組中的酯酶。
57.權(quán)利要求56中的方法，其中所述水解酶是堿性磷酸酶。
58.權(quán)利要求56中的方法，其中所述水解酶是α-氨基酸酯酶。
59.權(quán)利要求55中的方法，其中所述水解酶是β-半乳糖苷酶。
60.權(quán)利要求55中的方法，其中所述水解酶是β-糖苷酶。
61.權(quán)利要求54中的方法，其中評估芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子的存在和/或總量的步驟包括用氧化反應(yīng)物氧化芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子。
62.權(quán)利要求61中的方法，其中芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子的存在和/或總量通過使用芳基醇氧化酶或脂肪族醇氧化酶在有氧條件下氧化芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子生成H2O2以及并評估所述H2O2的存在和/或總量來評估。
63.權(quán)利要求62中的方法，其中所述所述H2O2的存在和/或總量通過將H2O2與過氧化物酶、苯酚、安替比林和/或苯胺類似物接觸來評估。
64.權(quán)利要求54中的方法，其中芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子的存在和/或總量通過使用芳基醇脫氫酶或乙醇脫氫酶在NAD+或NADP+存在下氧化芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子生成NADH或NADPH，并評估NAD+、NADP+、NADH或NADPH的存在和/或總量來評估。
65.權(quán)利要求54中的方法，其中芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子的存在和/或總量通過下述方法評估: a)使用芳基醇氧化酶或脂肪族醇氧化酶在有氧條件下氧化芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子生成芳基乙醛分子或不飽和脂肪族醛分子和H2O2 ； b)使用芳基醇脫氫酶或乙醇脫氫酶在NADH或NADPH存在下還原芳基乙醛分子或不飽和脂肪族醛分子形成反應(yīng)循環(huán)，其中被還原的芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子被芳基醇氧化酶脂肪族醇氧化酶在有氧條件下氧化生成額外的芳基乙醛分子或不飽和脂肪族醛分子和H2O2 ;同時 c)評估H2O2的存在和/或總量或NADH、NADPH、NAD+或NADP+的總量。
66.權(quán)利要求65中的方法，其中所述H2O2的存在和/或總量通過將H2O2與過氧化物酶、安替比林、苯酚和/或苯胺類似物進(jìn)行接觸來評估。
67.權(quán)利要求54 中的方法，其中所述水解酶底物至少包括β-糖苷酶底物分子的一部分，并且所述水解酶是β -糖苷酶或β -半乳糖苷酶。
68.權(quán)利要求67中的方法，其中評估芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子的存在和/或總量的步驟包括使用氧化劑氧化芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子。
69.權(quán)利要求67中的方法，其中芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子的存在和/或總量通過使用芳基醇氧化酶或脂肪族醇氧化酶在有氧條件下氧化芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子生成被氧化的芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子和H2O2并評估H2O2的存在和/或總量來評估。
70.權(quán)利要求69中的方法，其中所述H2O2的存在和/或總量通過將H2O2與過氧化物酶、4-ΑΑ和/或苯胺類似物進(jìn)行接觸來評估。
71.權(quán)利要求67中的方法，其中芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子的存在和/或總量通過使用芳基醇脫氫酶或乙醇脫氫酶在NAD+或NADP+存在下氧化芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子生成NADH或NADPH并評估NAD+、NADP+、NADH或NADPH的存在和/或總量來評估。
72.權(quán)利要求67中的方法，其中所述芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子存在和/或總量通過下述方法評估: a)使用芳基醇氧化酶或脂肪族醇氧化酶在有氧條件下氧化芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子生成被氧化的芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子和H2O2 ； b)使用芳基醇脫氫酶或乙醇脫氫酶在NADH或NADPH存在下還原被氧化的芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子形成反應(yīng)循環(huán)，其中被還原的芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子被芳基醇氧化酶或脂肪族醇氧化酶在有氧條件下氧化生成額外的被氧化的芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子和H2O2 ;同時 c)評估H2O2的存在和/或總量。
73.權(quán)利要求72中的方法，其中所述H2O2的存在和/或總量通過將H2O2與過氧化物酶、苯酚、安替比林和/或苯胺類似物進(jìn)行接觸來評估。
74.權(quán)利要求54中的方法，其中所述水解酶底物至少包括堿性磷酸酶底物分子的一部分，且水解酶是堿性磷酸酶。
75.權(quán)利要求74中的方法，其中評估芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子的存在和/或總量的步驟包括使用氧化劑氧化芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子。
76.權(quán)利要求74中的方法，其中芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子的存在和/或總量通過使用芳基醇氧化酶或脂肪族醇氧化酶在有氧條件下氧化芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子生成被氧化的芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子和H2O2并評估H2O2的存在和/或總量來評估。
77.權(quán)利要求76中的方法，其中H2O2的存在和/或總量通過將H2O2與過氧化物酶、苯酚、安替比林、和/或苯胺類似物接觸來評估。
78.權(quán)利要求74中的方法，其中芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子的存在和/或總量通過使用芳基醇脫氫酶或乙醇脫氫酶在NAD+或NADP+存在下氧化芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子并生成NADH或NADPH并評估NAD+、NADP+、NADH或NADPH的存在和/或總量來評估。
79.權(quán)利要求74中的方法，其中芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子的存在和/或總量通過如下方法評估: a)用所述芳基醇氧化酶或不飽和脂肪族醇氧化膜在有氧條件下氧化芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子并生成氧化的芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子和H2O2 ； b)用所述芳基醇脫氫酶或乙醇脫氫酶在NADH或NADPH存在下還原氧化的芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子以形成反應(yīng)循環(huán)，其中還原的芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子被芳基醇氧化酶或不飽和脂肪族醇氧化膜在有氧條件下氧化并生成額外的氧化的芳基醇分子或不飽和脂肪族醇分子和H2O2 ;并且 c)評估H2O2的存在和總量。
80.權(quán)利要求79中的方法，其中H2O2的存在和/或總量通過將H2O2與過氧化物酶、苯酚、安替比林和/或苯胺類似物進(jìn)行接觸來評估。
81.權(quán)利要求54-80所述任一方法，作為針對靶標(biāo)物的分析、分離和/或制備的一部分來進(jìn)行。
82.權(quán)利要求81中的方法，其中所述靶標(biāo)物是無機(jī)分子、有機(jī)分子和/化合物或它們的復(fù)合物。
83.權(quán)利要求82中的方法，其中的有機(jī)分子選自氨基酸、肽、蛋白、核苷、核苷酸、寡聚核苷酸、核酸、維生素、單糖、寡糖、碳水化合物、化合物脂類和它們的復(fù)合物組成的組。
84.權(quán)利要求82中的方法，作為免疫分析、蛋白測序、核酸擴(kuò)增、雜交或測序的一部分來進(jìn)行。
85.權(quán)利要求84中的方法，用于監(jiān)控RNA或DNA測序。
86.權(quán)利要求85中的方法，其中所述水解酶是堿性磷酸酶。
【文檔編號】C07H15/18GK103889997SQ201280005787
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月18日
【發(fā)明者】袁崇生, 陳小茹 申請人:通用原子公司