蛋白多糖的大量制備方法
【專利摘要】本發(fā)明以高效地從水生動(dòng)物組織中提取蛋白多糖為課題。本發(fā)明涉及從魚類軟骨中提取蛋白多糖的方法，只要是包括在水中加熱冷凍魚類軟骨小片的工序的蛋白多糖提取方法，就可以簡(jiǎn)便并且非常高效地從魚類軟骨中提取蛋白多糖。特別是，就該方法而言，可以提取高分子量的蛋白多糖。而且，就該方法而言，由于可以僅使用水進(jìn)行提取，因此與現(xiàn)有的使用有機(jī)溶劑或者酸·堿的提取方法相比，提取作業(yè)及所得的蛋白多糖是安全的，也不需要除去有機(jī)溶劑的煩雜工序。
【專利說(shuō)明】蛋白多糖的大量制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及蛋白多糖的制備方法。更具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明特別是涉及能夠大量地制備高分子量的蛋白多糖的、高效率的蛋白多糖的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白多糖是與膠原蛋白等一起形成結(jié)締組織的細(xì)胞外基質(zhì)中的基質(zhì)的主要生物高分子。以往，蛋白多糖是將哺乳動(dòng)物(特別是牛)的軟骨中所含的物質(zhì)提取分離而得到，然而，由于報(bào)告過(guò)牛腦海綿狀癥(BSE)的發(fā)病，因此希望避免從哺乳動(dòng)物軟骨中提取，需要將其取而代之的蛋白多糖供給源。此外，以往的蛋白多糖提取工序煩雜且產(chǎn)量不高，因此制造成本非常高，不能充分地實(shí)現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用，因此需要一種更加簡(jiǎn)便且產(chǎn)量高的制造方法。
[0003]水生動(dòng)物組織是有力的蛋白多糖供給源替代候選。嘗試過(guò)提取作為水生動(dòng)物的鯨、鯊魚的軟骨中所含的蛋白多糖。但是，這些水生動(dòng)物的捕獲量存在限制，很難制造大量的蛋白多糖。此外，提取分離操作也很煩雜，提取所用的溶劑等中存在有毒性不低的物質(zhì)
[0004]為了解決這些問(wèn)題，嘗試過(guò)從大量廢棄的水生動(dòng)物組織(例如鮭魚鼻軟骨)中提取蛋白多糖。專利文獻(xiàn)I中記載有由鯊魚的鼻軟骨來(lái)制造含有蛋白多糖的組合物(鼻軟骨粉末)的方法。特別給出了以下啟示，即，源自鮭魚鼻軟骨的蛋白多糖對(duì)炎癥性腸疾病具有治療以及預(yù)防效果，蛋白多糖的需求正在提高。然而，就專利文獻(xiàn)I的方法而言，其蛋白多糖的制造效率并非很高，在效率方面還存在著改善余地。
[0005]在先技術(shù)文獻(xiàn)
[0006]專利文獻(xiàn)
[0007]專利文獻(xiàn)1:日本特開2009 - 173702號(hào)公報(bào)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]發(fā)明所要解決的課題
[0009]本發(fā)明的課題在于，高效率地從水生動(dòng)物組織中提取蛋白多糖。
[0010]用于解決課題的方法
[0011]本發(fā)明人等驚奇地發(fā)現(xiàn)，在將魚類軟骨冷凍并將其小片化后，在水中進(jìn)行加熱，可以高效率地提取蛋白多糖，從而進(jìn)一步改良并完成本發(fā)明。
[0012]S卩，本發(fā)明包含例如以下項(xiàng)目I?11所述的蛋白多糖提取方法(也可以稱為蛋白多糖制造方法)、以及提聞蛋白多糖提取效率的方法。
[0013]項(xiàng)目1.[0014]一種蛋白多糖提取方法，其為從魚類軟骨中提取蛋白多糖的方法，包含:(A)在水中加熱冷凍魚類軟骨小片的工序。
[0015]項(xiàng)目2.[0016]根據(jù)項(xiàng)目I所述的蛋白多糖提取方法，其中，每I小片的冷凍魚類軟骨小片為0.0Ol ?0.5g。
[0017]項(xiàng)目3.[0018]根據(jù)項(xiàng)目I或2所述的蛋白多糖提取方法，其中，冷凍魚類軟骨小片是將魚類軟骨冷凍后小片化而成。
[0019]項(xiàng)目4.[0020]根據(jù)項(xiàng)目3所述的蛋白多糖提取方法，其中，魚類軟骨是經(jīng)脫脂處理的魚類鼻軟骨。
[0021]項(xiàng)目5.[0022]根據(jù)項(xiàng)目I?4中任意一項(xiàng)所述的蛋白多糖提取方法，其中，提取的蛋白多糖中包含分子量為90萬(wàn)以上的蛋白多糖。
[0023]項(xiàng)目6.[0024]根據(jù)項(xiàng)目I?5中任意一項(xiàng)所述的蛋白多糖提取方法，其中，在水中進(jìn)行長(zhǎng)于3小時(shí)的加熱。
[0025]項(xiàng)目7.[0026]根據(jù)項(xiàng)目I?6中任意一項(xiàng)所述的蛋白多糖提取方法，其中，加熱時(shí)的水的溫度在80°C以上。
[0027]項(xiàng)目8.[0028]根據(jù)項(xiàng)目I?7中任意一項(xiàng)所述的蛋白多糖提取方法，其中，供于加熱的冷凍魚類軟骨小片總體的質(zhì)量與水的質(zhì)量之比為1:1?1:10。
[0029]項(xiàng)目9.[0030]根據(jù)項(xiàng)目I?8中任意一項(xiàng)所述的蛋白多糖提取方法，其特征在于，一直加熱到加熱后回收的殘?jiān)|(zhì)量達(dá)到供于加熱的冷凍魚類軟骨小片的質(zhì)量以下為止。
[0031]項(xiàng)目10.[0032]根據(jù)項(xiàng)目9所述的蛋白多糖提取方法，其中，加熱后回收的殘?jiān)羌訜岷笤?000rpm、20分鐘、4°C下通過(guò)離心分離處理而得到的沉淀。
[0033]項(xiàng)目11.[0034] 一種提高來(lái)自魚類軟骨的蛋白多糖的提取效率的方法，其包含在水中加熱冷凍魚類軟骨小片的工序。
[0035]發(fā)明的效果
[0036]根據(jù)本發(fā)明的蛋白多糖提取方法，可以簡(jiǎn)便并且非常高效地從魚類軟骨提取蛋白多糖。特別是，就本發(fā)明的提取方法而言，可以提取高分子量的蛋白多糖。而且，就本發(fā)明的提取方法而言，由于可以僅使用水進(jìn)行提取，因此與現(xiàn)有的使用有機(jī)溶劑或者酸?堿的提取方法相比，提取作業(yè)以及所得到的蛋白多糖是安全的，也不需要除去有機(jī)溶劑的煩雜工序。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0037]圖1a為置于托盤中的冷凍鮭魚鼻軟骨塊的照片。
[0038]圖1b為置于塑料袋中的冷凍鮭魚鼻軟骨小片的照片。
[0039]圖1c為置于塑料袋中的脫脂冷凍鮭魚鼻軟骨粉末的照片。
[0040]圖2為表示在冷凍的鮭魚鼻軟骨小片中加入水并在100°C下提取時(shí)的、蛋白多糖產(chǎn)量隨時(shí)間的變化的圖表。
[0041]圖3為對(duì)由脫脂鮭魚鼻軟骨粉末(粉末)，冷凍鮭魚鼻軟骨塊(塊)或者冷凍鮭魚鼻軟骨小片(小片)提取蛋白多糖時(shí)的、糖醛酸量(以葡萄糖醛酸的簡(jiǎn)寫GlcA表示)及蛋白質(zhì)(以Protein表示)的產(chǎn)量進(jìn)行比較圖表。將GlcA及Protein的產(chǎn)量值換算為由每IOOg冷凍鮭魚鼻軟骨塊提取的情形。需要說(shuō)明的是，糖醛酸量反映蛋白多糖量。
[0042]圖4為使用凝膠過(guò)濾色譜法將包含提取自冷凍鮭魚鼻軟骨小片的蛋白多糖的回收上清液分離，測(cè)定各餾分中的糖醛酸量(GlcA)及280nm的吸光度，并根據(jù)所得到的測(cè)定值繪制成的色譜圖。
[0043]圖5為使用陰離子交換色譜法將包含提取自冷凍鮭魚鼻軟骨小片的蛋白多糖的回收上清液分離，測(cè)定各餾分中的糖醛酸量(GlcA)及280nm的吸光度，并根據(jù)所得到的測(cè)定值繪制成的色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0044]以下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)地進(jìn)行說(shuō)明。需要說(shuō)明的是，“質(zhì)量”與“重量”可以替換。
[0045]本發(fā)明的蛋白多糖提取方法是從魚類軟骨提取蛋白多糖的方法，包含:(A)在水中加熱冷凍魚類軟骨小片的工序。
[0046]魚類軟骨是魚類的軟骨。作為魚類，優(yōu)選鮭魚科鮭魚屬的魚，具體而言優(yōu)選例示出鱒魚(細(xì)鱗大馬哈魚、櫻鱒魚、五月鱒等)、鮭魚(白鮭、紅鮭、銀鮭、大鱗大馬哈魚、虹鱒等)、鯊魚、鱈魚等。特別優(yōu)選鮭魚或者鱒魚 。此外，作為軟骨，沒(méi)有特別限制，但是優(yōu)選頭部軟骨，尤其是鼻軟骨。此外，因?yàn)樵趯Ⅳ~類加工成食品產(chǎn)品等時(shí)通常將頭部廢棄，所以具有頭部軟骨的獲得成本低，可以大量且穩(wěn)定供給的優(yōu)點(diǎn)。
[0047]冷凍魚類軟骨小片可以通過(guò)下述方法得到:(i)冷凍魚類軟骨后將其小片化，或者(i i )將魚類軟骨小片化后冷凍。此外，也可以是(i i i )冷凍魚類軟骨后的魚類軟骨本身。在本發(fā)明中特別優(yōu)選通過(guò)(i)得到的冷凍魚類軟骨小片。本發(fā)明還包含蛋白多糖的提取方法，其中，所述蛋白多糖的提取方法在(A)工序之前，還包括(a )將魚類軟骨冷凍的工序、和/或(P )將冷凍魚類軟骨小片化的工序。
[0048]冷凍方法沒(méi)有特別限定，可以使用公知的冷凍方法。例如，可以例示出使用冷凍機(jī)，在一 20?一 80°C左右將魚類軟骨保存24?72小時(shí)左右的方法。
[0049]小片化可以利用公知的方法進(jìn)行。例如，可以使用公知的攪拌器或研磨機(jī)等，將魚類軟骨(優(yōu)選冷凍魚類軟骨)小片化。優(yōu)選盡可能在低溫(例如4°C以下)下進(jìn)行小片化操作。
[0050]優(yōu)選每I小片的冷凍魚類軟骨小片為0.001?0.5g左右，更優(yōu)選為0.005?0.3g左右，進(jìn)一步優(yōu)選為0.001?0.1g左右。優(yōu)選以能夠得到這樣的冷凍魚類軟骨小片的方式進(jìn)行小片化操作。此外，在將魚類軟骨冷凍后即已得到前述程度重量的小片的情況下，也可以不特別地進(jìn)行小片化操作。此外，雖然沒(méi)有特別限制，但是在供于加熱的全部冷凍魚類軟骨小片中，優(yōu)選具有上述質(zhì)量的小片在50質(zhì)量％以上，更優(yōu)選在70質(zhì)量％以上，進(jìn)一步優(yōu)選在90質(zhì)量％以上。該比例以如下方式求出:從供于加熱的冷凍魚類軟骨小片整體中隨機(jī)選取20小片，分別測(cè)定該20小片的質(zhì)量，計(jì)算出上述的質(zhì)量小片在20小片中所占的百分t匕。此外，“小片整體”表示各小片的集合。即表示多個(gè)小片集合而成的集合體。
[0051]雖然沒(méi)有特別限定，但是作為魚類軟骨，優(yōu)選使用經(jīng)脫脂處理的魚類軟骨。其原因在于，通過(guò)使用脫脂處理后的魚類軟骨，可以得到脂質(zhì)的混入較少的提純度高的含有蛋白多糖的提取物。脫脂處理可以使用公知的方法進(jìn)行。例如，可以例示出將魚類軟骨用流水(例如來(lái)自自來(lái)水水龍頭的流水)漂洗I?24小時(shí)左右的方法。需要說(shuō)明的是，魚類軟骨的獲取可以通過(guò)公知的方法進(jìn)行，例如可以例示出如下方法:將魚類組織(優(yōu)選魚類頭部)在水中浸潰I?24小時(shí)左右使其膨脹，除去軟骨(優(yōu)選鼻軟骨)之外的組織的方法；或者，將冷凍鮭魚頭部解凍后，立刻取出鼻軟骨，然后用流水漂洗I?24小時(shí)左右來(lái)進(jìn)行洗滌及脫脂的方法。需要說(shuō)明的是，殘存有肉片等的情況下，優(yōu)選使用鑷子等將殘存的肉片等除去。
[0052]通過(guò)本發(fā)明的蛋白多糖提取方法所提取出的蛋白多糖包含高分子量的蛋白多糖。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，就蛋白多糖所具有的對(duì)炎癥性腸疾病的治療及預(yù)防效果而言，越是高分子量的蛋白多糖其效果越高。因此，可以說(shuō)能夠得到高分子量的蛋白多糖的本發(fā)明在這一點(diǎn)上是有利的。這里的高分子量蛋白多糖，具體而言是指分子量為90萬(wàn)以上的蛋白多糖，優(yōu)選分子量為100萬(wàn)以上的，更優(yōu)選分子量為120萬(wàn)以上。此外，認(rèn)為就本發(fā)明的方法而言，能夠得到分子量為250萬(wàn)以上、甚至分子量為500萬(wàn)以上的蛋白多糖。需要說(shuō)明的是，該優(yōu)選的高分子量蛋白多糖是指，通過(guò)下述條件的凝膠過(guò)濾色譜法，對(duì)通過(guò)本發(fā)明的蛋白多糖的提取方法得到的含有蛋白多糖的提取物進(jìn)行處理，用咔唑硫酸法對(duì)所得的各餾分中包含的糖醛酸量(反映蛋白多糖量)進(jìn)行定量，基于該糖醛酸量的色譜圖的峰位置為上述的分子量(90萬(wàn)、優(yōu)選為100萬(wàn)、更優(yōu)選為120萬(wàn))以上。以下，將以這種方式操作而得到的色譜圖稱為“蛋白多糖糖醛酸量色譜圖”。此外，對(duì)各餾分的280nm處的吸光度進(jìn)行測(cè)定，使所含的蛋白質(zhì)量相對(duì)值化(即，成為反映所含蛋白質(zhì)量的值)，從而能夠繪制出基于該吸光度的色譜圖(反映蛋白質(zhì)量)。以下，將該色譜圖稱為“蛋白多糖蛋白質(zhì)量色譜圖”。
[0053]〔凝膠過(guò)濾色譜法〕
[0054]色譜柱:Sepharose CL 一 4B填充色譜柱(以Sepharose CL 一 4B作為載體而填充到Φ IcmX 38.5cm的色譜柱 中而成。Sepharose CL — 4B例如可從GE Healthcare公司等 獲得。
[0055]Sepharose CL 一 4B為4%交聯(lián)瓊脂糖,粒徑為40 — 165 μ m (由激光衍射散射法得到)，CAS注冊(cè)號(hào)為61970 — 08 — 9。)
[0056]緩沖液:0.1M磷酸緩沖液(ρΗ7.0，含有(λ 2Μ的NaCl)
[0057]餾分量:ImL/試管
[0058]分子量校正曲線:使用如下制作出的校正曲線，即，對(duì)于下述的各種葡聚糖分子量標(biāo)記物，在與上述同樣的條件下進(jìn)行凝膠過(guò)濾色譜法處理，利用用于檢測(cè)糖鏈的公知方法即苯酚.硫酸法，測(cè)定各餾分的吸光度(反映葡聚糖量)，制作出的校正曲線。
[0059]<葡聚糖分子量標(biāo)記物>
[0060]Dextran Standard (葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品)1400000 (SIGMA)...1400kDa
[0061]Dextran Standard 670000 (SIGMA)...670kDa
[0062]Dextran Standard 410000 (SIGMA)...410kDa
[0063]Dextran Standard 270000 (SIGMA)...270kDa
[0064]按照Hodge,J.E.and Hofreiter, B.T., Method in Carbohydrate Chemistry, 1338(1962)中記載的方法，如下所述進(jìn)行葡聚糖的定量(吸光度測(cè)定)。
[0065]〔I〕在105 X 15mm的試管中加入500 的試樣水溶液或標(biāo)準(zhǔn)單糖(甘露糖)水溶液。
[0066]〔2〕加入500 U I的苯酚試劑(5v/v%苯酚水溶液)，并進(jìn)行攪拌。
[0067]〔3〕加入2.5mL的濃硫酸，立即劇烈攪拌10秒鐘。
[0068]〔4〕在室溫下放置20分鐘以上。
[0069]〔5〕使用分光光度計(jì)測(cè)定490nm的吸收。
[0070]需要說(shuō)明的是，咔唑硫酸法是將作為糖醛酸(葡萄糖醛酸(GlcA)、艾杜糖醛酸等)的顯色色素的咔唑溶液 添加至測(cè)定檢體中，使用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度的公知的方法。使用規(guī)定濃度的葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液制作出校正曲線，求出檢體中的葡萄糖醛酸含量。更具體而言，按下述方法進(jìn)行。將0.95g硼酸鈉? 10水合物溶解在IOOmL的濃硫酸中得到試劑，用試管取2.5mL該試劑，進(jìn)行冰冷。接著在其上輕輕地重疊0.5mL被檢物(包含2?20 y g糖醛酸)。在水冷的同時(shí)充分進(jìn)行攪拌，以使其溫度不會(huì)達(dá)到室溫以上。用玻璃球?qū)⑵渖w上后，在沸水浴中加熱10分鐘，水冷至室溫。在其中加入將125mg咔唑溶解于IOOmL無(wú)水甲醇中而得的試劑0.1mL并進(jìn)行混合，然后在沸水浴中加熱15分鐘。之后，水冷至室溫，測(cè)定530nm的吸光度。使用0.5mL的蒸餾水作為空白對(duì)照。同時(shí)，使用葡萄糖醛酸制作出校正曲線。
[0071]以可發(fā)揮本發(fā)明的效果的程度進(jìn)行(A)工序的加熱。只要可以發(fā)揮本發(fā)明的效果，則沒(méi)有特別限制，具體而言可以例示出以下這樣的加熱條件。加熱時(shí)間由加熱溫度決定，但優(yōu)選長(zhǎng)于3小時(shí)，更優(yōu)選為3.5小時(shí)以上，進(jìn)一步優(yōu)選為4小時(shí)以上。加熱溫度由加熱時(shí)間決定，但優(yōu)選水的溫度在80°C以上，更優(yōu)選在90°C以上，進(jìn)一步優(yōu)選沸騰狀態(tài)下的溫度(在I個(gè)大氣壓下為100°C或以上)。
[0072]此外，供于加熱的冷凍魚類軟骨小片的量及水量可以適宜設(shè)定，但是優(yōu)選該小片整體浸潰在水中，更具體而言，優(yōu)選該小片整體的質(zhì)量與水的質(zhì)量之比(小片整體:水)為1:1?1:10左右。
[0073]如果將冷凍魚類軟骨小片浸潰在水中，則水浸潤(rùn)該小片而增量。而且，通過(guò)加熱慢慢地使該膨脹的魚類軟骨小片變軟，其形狀逐漸崩壞，最后成為糊狀且溶解于水中的部分也出現(xiàn)。因此，也可以根據(jù)加熱后的該膨潤(rùn)魚類軟骨小片(即，加熱后存在的殘?jiān)?的質(zhì)量來(lái)規(guī)定優(yōu)選的加熱程度。即，在本發(fā)明中，優(yōu)選加熱至加熱后的膨潤(rùn)魚類軟骨小片整體(即殘?jiān)?的質(zhì)量，達(dá)到供于加熱的冷凍魚類軟骨小片整體的質(zhì)量以下為止，更優(yōu)選加熱至達(dá)到供于加熱的冷凍魚類軟骨小片整體的質(zhì)量的70%以下為止，進(jìn)一步優(yōu)選加熱至達(dá)到50質(zhì)量％以下為止。
[0074]需要說(shuō)明的是，此處的加熱后的膨潤(rùn)魚類軟骨小片整體(即殘?jiān)?是指，在5000rpm、20分鐘、4°C下對(duì)加熱后的液體進(jìn)行離心分離而得到的沉淀。(是指在該離心分離處理后將溶液部分除去后的沉淀)。
[0075]經(jīng)由(A)工序，液體部分(即水部分)中包含大量的蛋白多糖。因此，通過(guò)將液體部分回收，可以得到含有蛋白多糖的提取物。液體部分的回收，例如可以通過(guò)進(jìn)行離心分離(優(yōu)選上述條件下的離心分離)處理、并回收上清液來(lái)實(shí)施。該液體(上清液)可以直接使用，也可以通過(guò)公知方法進(jìn)一步精制?；蛘?，也可以通過(guò)蒸餾法或冷凍干燥法等進(jìn)行濃縮。也可以通過(guò)冷凍干燥法、噴霧干燥法進(jìn)行粉末化。只要不損害本發(fā)明的效果，則也可以實(shí)施此處例示以外的其他的操作。以這種方式操作而得到的蛋白多糖優(yōu)選作為例如食品、化妝品、醫(yī)藥品等的原材料來(lái)使用。
[0076]就通過(guò)本發(fā)明的方法得到的蛋白多糖而言，其使用方式?jīng)]有特別限制。由于蛋白多糖例如具有上述效果，因此適宜用作外用組合物或口服組合物。即，優(yōu)選以包含通過(guò)本發(fā)明的方法得到的蛋白多糖的外用組合物或口服組合物的形式來(lái)使用。此外，外用組合物或口服組合物可以以醫(yī)藥組合物、準(zhǔn)藥品組合物、化妝組合物、食品組合物等的形式來(lái)使用。它們可以通過(guò)使用由本發(fā)明的方法得到的蛋白多糖、利用常用方法來(lái)制造。特別是，這些組合物可以優(yōu)選用于口腔護(hù)理領(lǐng)域、化妝品領(lǐng)域及飲食品領(lǐng)域。
[0077]就口腔護(hù)理領(lǐng)域中所使用的口腔用組合物(以下，有時(shí)記為“本發(fā)明所涉及的口腔用組合物”)而言，其中所述口腔用組合物包含由本發(fā)明的方法得到的含有蛋白多糖的提取物，該口腔用組合物既可以是該含有蛋白多糖的提取物本身，也可以是將該提取物與口腔用組合物所使用的其他成分(例如研磨劑、發(fā)泡劑、洗滌劑、表面活性劑、濕潤(rùn)劑、PH調(diào)節(jié)劑、增稠劑、香味劑等)適宜配合制造而得的組合物。例如，可以通過(guò)常用方法制造成糊劑、軟膏劑、凝膠劑、涂敷劑、噴霧劑、填補(bǔ)劑、液態(tài)劑、漱口水、貼劑、口嚼劑、含片、片劑等形態(tài)。
[0078]優(yōu)選將這樣的本發(fā)明所涉及的口腔用組合物用作口腔組織的炎癥改善用、抗老化用。即，本發(fā)明所涉及的口腔用組合物包括炎癥改善用的口腔用組合物、抗老化用的口腔用組合物。
[0079]就化妝品領(lǐng)域中所使用的化妝品組合物而言(以下，有時(shí)記為“本發(fā)明涉及的化妝品組合物”)，其中所述化妝品組合物包含由本發(fā)明的方法得到的含有蛋白多糖的提取物，該化妝品組合物既可以是該含有蛋白多糖的提取物本身，也可以是將該提取物與容許用于化妝品的介質(zhì)、基劑、載體、添加劑、其他容許用于化妝品的成分、材料適宜配合，通過(guò)常用方法制造而得的組合物。具體而言，可以列舉出包含本發(fā)明的魚類軟骨水提取物而制造的乳液、化妝水、乳霜、美容液、粉底霜、肌底液、防曬霜等。這樣的本發(fā)明所涉及的化妝品組合物，可以優(yōu)選用于炎癥改善或抗老化，更具體而言，例如可以優(yōu)選用于防曬、曬后修復(fù)、保濕以及抗皮膚老化(例如，用于預(yù)防 或改善干燥皮膚、皮膚粗糙、皮膚褶皺.松弛等)。
[0080]就飲食品(飲料以及食品)領(lǐng)域中所使用的飲食品組合物(以下，有時(shí)記為“本發(fā)明所涉及的化妝品組合物”)而言，其中所述飲食品組合物包含由本發(fā)明的方法得到的含有蛋白多糖的提取物，該飲食品組合物既可以是該含有蛋白多糖的提取物本身，也可以是將該提取物與食品衛(wèi)生學(xué)上所容許的基劑、載體、添加劑、其他可用于食品的成分.材料等適宜配合而得的組合物。例如可以例示出:包含該含有蛋白多糖的提取物的用于保濕以及抗皮膚老化(例如，用于預(yù)防或改善干燥皮膚、皮膚粗糙、皮膚褶皺.松弛等)的加工食品、飲料、健康食品(營(yíng)養(yǎng)功能食品、特定保健用食品等)、補(bǔ)充劑、美容食品、患者用食品等。而且，這樣的包含本發(fā)明所涉及的飲食品組合物的保濕劑、抗皮膚老化劑也包含在本發(fā)明中。該保濕劑、抗皮膚老化劑可以以美容用或抗皮膚老化用(例如，用于預(yù)防或改善干燥皮膚、皮膚粗糙、皮膚褶皺.松弛等)的飲用劑、錠劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、膠凍劑、糖錠劑等形態(tài)提供。
[0081 ] 在本發(fā)明所涉及的口腔用組合物、化妝品組合物、或飲食品組合物中，雖然沒(méi)有特別限制，但這些組合物中所包含的該含有蛋白多糖的提取物的量，例如相對(duì)于組合物整體通常為0.0Ol?100質(zhì)量％，優(yōu)選為0.01?95質(zhì)量％。
[0082]在通過(guò)本發(fā)明的蛋白多糖提取方法而得到的、含有蛋白多糖的提取物中，蛋白多糖被非常高效地提取出來(lái)。具體而言，以糖醛酸換算(即，利用咔唑硫酸法進(jìn)行測(cè)定值換算)計(jì)，可提取出所使用的冷凍魚類軟骨小片中包含的蛋白多糖量的60質(zhì)量％以上、優(yōu)選為70質(zhì)量％以上、更優(yōu)選為80質(zhì)量％以上、進(jìn)一步優(yōu)選為90質(zhì)量％以上的蛋白多糖。而且,如上所述，通過(guò)本發(fā)明的蛋白多糖提取方法得到的蛋白多糖為高分子量的蛋白多糖。具體而言，在通過(guò)本發(fā)明的蛋白多糖提取方法而得到的含有蛋白多糖的提取物中，優(yōu)選包含分子量為90萬(wàn)以上(更優(yōu)選分子量為100萬(wàn)以上的，進(jìn)一步優(yōu)選分子量為120萬(wàn)以上的)的蛋白多糖。該分子量以上的蛋白多糖，優(yōu)選為所提取的蛋白多糖整體的60質(zhì)量％以上，更優(yōu)選為70質(zhì)量％以上，進(jìn)一步優(yōu)選80質(zhì)量％以上，更進(jìn)一步優(yōu)選為90質(zhì)量％以上。在上述的蛋白多糖糖醛酸量色譜圖中，可由峰面積進(jìn)行推導(dǎo)來(lái)確定上述分子量以上的蛋白多糖以何種程度的比例存在。即，通過(guò)求出上述分子量以上的蛋白多糖所占的面積在該色譜圖的全部峰面積中為何種程度的比例來(lái)確定。
[0083]此外，本發(fā)明還包含提高來(lái)自魚類軟骨的蛋白多糖的提取效率的方法，其中該方法包含在水中加熱冷凍魚類軟骨小片的工序。關(guān)于該方法中的冷凍魚類軟骨小片的制備、加熱條件、蛋白多糖的提取效率的測(cè)定等，均可以使用如上所述的方法及條件。
[0084]通過(guò)上述方法，可以簡(jiǎn)便且非常高效地從魚類軟骨中提取蛋白多糖，此外，還可以提高來(lái)自魚類軟骨的蛋白多糖的提取效率。特別是就本發(fā)明的提取方法而言，可以提取高分子量的蛋白多糖。以下并非是對(duì)本發(fā)明的限定解釋，但認(rèn)為能夠這樣高效率地提取蛋白多糖(特別是高分子量的蛋白多糖)的原因在于，雖然有使魚類軟骨小片化再使用的原因，但還可能是由于小片化時(shí)其被冷凍，因此骨 組織中包含的酶(特別是分解蛋白多糖的酶)的活性受到抑制，而且可通過(guò)加熱處理使該酶失活的原因。從該觀點(diǎn)出發(fā)，認(rèn)為優(yōu)選盡可能在低溫下進(jìn)行魚類軟骨的處理，而在加入冷凍魚類軟骨小片時(shí)盡可能處于高溫。
[0085]實(shí)施例
[0086]以下，對(duì)本發(fā)明具體地進(jìn)行說(shuō)明，但是本發(fā)明并不限定于下述的示例。
[0087]來(lái)自鮭魚鼻軟骨的蛋白多糖的提取研究
[0088]<提取所使用的試樣>
[0089]將以下3種((I)?(3 ))的源自鮭魚鼻軟骨的試樣用于蛋白多糖的提取研究。需要說(shuō)明的是，作為鮭魚鼻軟骨，使用如下得到的鮭魚鼻軟骨:將冷凍鮭魚頭部解凍后，立刻取出鼻軟骨，然后用流水漂洗6小時(shí)來(lái)進(jìn)行洗滌及脫脂，之后，用鑷子除去肉片等再用手水洗而得到。
[0090]( I)冷凍的鮭魚鼻軟骨塊
[0091]將鮭魚鼻軟骨保存在冷凍機(jī)中并使其冷凍，將其用作冷凍鮭魚鼻軟骨塊。需要說(shuō)明的是，雖然冷凍鮭魚鼻軟骨塊的大小和重量與所使用的鮭魚頭部的大小有關(guān)，但冷凍鮭魚鼻軟骨塊大致是大小為2.5 X 1.5?4.5 X 2cm、重量為1.71?6.91g塊體(每7個(gè)的平均重量為3.701g)。將冷凍鮭魚鼻軟骨塊的照片示于圖la。
[0092](2)冷凍鮭魚鼻軟骨小片
[0093]將(I)的冷凍鮭魚鼻軟骨塊置于攪拌器中粉碎10秒鐘，得到冷凍鮭魚鼻軟骨小片。將冷凍鮭魚鼻軟骨小片的照片示于圖lb。需要說(shuō)明的是，隨機(jī)選取20小片，檢查各小片的大小及重量，其大小大致為0.2?0.7cm，重量約為0.0890?0.0116g(20個(gè)的平均重量為0.033g)。此外，由IOOg冷凍鮭魚鼻軟骨塊得到95.6g冷凍鮭魚鼻軟骨小片。
[0094]( 3 )脫脂鮭魚鼻軟骨粉末
[0095]使用(I)的冷凍鮭魚鼻軟骨，利用專利文獻(xiàn)I (日本特開2009 — 173702號(hào)公報(bào))的實(shí)施例1中記載的方法，得到蛋白多糖組合物粉末。將該粉末用作脫脂鮭魚鼻軟骨粉末。由IOOg冷凍鮭魚鼻軟骨塊，得到5.83g脫脂鮭魚鼻軟骨粉末。將脫脂鮭魚鼻軟骨粉末的照片示于圖lc。
[0096]需要說(shuō)明的是，將專利文獻(xiàn)I的實(shí)施例1的記載摘錄如下。“粉碎IOOg冷凍鮭魚鼻軟骨，向其中加入等容量的15°C的自來(lái)水，緩慢攪拌使其充分混合，并使所得混合物維持在5°C左右，立即使用離心分離器在9000rpm、30分鐘、4°C下對(duì)該混合物進(jìn)行離心分離，將脂質(zhì)與包括蛋白多糖在內(nèi)的其他組合物分開。離心分離層分為3層，除去最上部的脂質(zhì)層和中間層的水層，回收沉淀物。將沉淀物冷凍干燥后，使用離心式粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，得到水脫脂微粉。在該階段，取一部分并使用醚萃取測(cè)定脂質(zhì)，結(jié)果為脂質(zhì)殘存8.8%，如果將脫脂前的脂質(zhì)設(shè)為100%，則除去率達(dá)到75.0%，有輕微的異味。接著，在水脫脂微粉中加入10倍容量的乙醇，
[0097]溶解提取含有異味的脂質(zhì)。將本操作重復(fù)2次并將乙醇溶液過(guò)濾除去，使溶劑蒸發(fā)得到微黃褐色無(wú)味的蛋白多糖組合物粉末。相對(duì)于鮭魚鼻軟骨的收率為58.7% (干基)，蛋白多糖含有率為77.7%。蛋白多糖組合物粉末的異味完全消失?！睂＠墨I(xiàn)I的實(shí)施例1的“冷凍鮭魚鼻軟骨”相當(dāng)于上述的“冷凍鮭魚鼻軟骨塊”。此外，“干基”是指干燥質(zhì)量換
笪
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[0098]<使用冷凍 鮭魚鼻 軟骨的蛋白多糖的提取研究>
[0099]在以上述方式操作而得到的(2)冷凍鮭魚鼻軟骨小片中加入水，通過(guò)在100°C下加熱來(lái)嘗試蛋白多糖的提取。具體而言，如下操作而進(jìn)行了研究。相對(duì)于約12g冷凍鮭魚鼻軟骨小片加入60ml的蒸餾水，配制出4份樣品，在100°C下將他們分別加熱I小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)，然后通過(guò)離心分離機(jī)在5000rpm、20分鐘，4°C下對(duì)它們進(jìn)行離心分離，除去不溶物(殘?jiān)?回收上清液。測(cè)定回收上清液的量后，利用咔唑硫酸法測(cè)定回收上清液中的蛋白多糖量作為糖醛酸(在圖表中，以葡萄糖醛酸的簡(jiǎn)記“GlcA”表示)的相當(dāng)量。此外，利用Bradford法測(cè)定回收上清液中的蛋白質(zhì)量。將結(jié)果示于表I。此外，將使表I圖表化而成的圖示于圖2。
[0100][表 I]
[0101]
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白多糖提取方法，其為從魚類軟骨中提取蛋白多糖的方法，包含: (A)在水中加熱冷凍魚類軟骨小片的工序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白多糖提取方法，其中，每I小片的冷凍魚類軟骨小片為0.001 ?0.5g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的蛋白多糖提取方法，其中，冷凍魚類軟骨小片是將魚類軟骨冷凍后小片化而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白多糖提取方法，其中，魚類軟骨是經(jīng)脫脂處理的魚類鼻軟骨。
5.根據(jù)權(quán)利要求1?4中任意一項(xiàng)所述的蛋白多糖提取方法，其中，提取的蛋白多糖中包含分子量為90萬(wàn)以上的蛋白多糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求1?5中任意一項(xiàng)所述的蛋白多糖提取方法，其中，在水中進(jìn)行長(zhǎng)于3小時(shí)的加熱。
7.根據(jù)權(quán)利要求1?6中任一項(xiàng)所述的蛋白多糖提取方法，加熱時(shí)的水的溫度在80°C以上。
8.根據(jù)權(quán)利要求1?7中任意一項(xiàng)所 述的蛋白多糖提取方法，供于加熱的冷凍魚類軟骨小片總體的質(zhì)量與水的質(zhì)量之比為1:1?1:10。
9.根據(jù)權(quán)利要求1?8中任意一項(xiàng)所述的蛋白多糖提取方法，其特征在于，一直加熱至加熱后回收的殘?jiān)|(zhì)量達(dá)到供于加熱的冷凍魚類軟骨小片的質(zhì)量以下為止。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的蛋白多糖提取方法，其中，加熱后回收的殘?jiān)羌訜岷笤?000rpm、20分鐘、4°C下通過(guò)離心分離處理而得到的沉淀。
11.一種提高來(lái)自魚類軟骨的蛋白多糖的提取效率的方法，其包含在水中加熱冷凍魚類軟骨小片的工序。
【文檔編號(hào)】C07K1/14GK103429608SQ201280005928
【公開日】2013年12月4日 申請(qǐng)日期:2012年1月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月19日
【發(fā)明者】加藤陽(yáng)治 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人弘前大學(xué)