專利名稱：制備補骨脂素和異補骨脂素或包含它們的提取物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥提取分離技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及補骨脂中有效成分補骨脂素和異補骨脂素或者包含它們的提取物的分離制備方法。
背景技術(shù)：
補骨脂為豆科植物補骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果實，首見于《開寶本草》，分布于山西、陜西、安徽等 地，具有溫腎助陽、納氣平喘、溫脾止瀉的功效。現(xiàn)代化學(xué)研究表明補骨脂主要含有糖苷、香豆素、黃酮、單萜酚類成分，具有抑菌、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、增強免疫等活性。目前，補骨脂的開發(fā)利用受到了藥學(xué)工作者的重視，補骨脂滴鼻液、補骨脂滴丸、用于治療白癜風(fēng)的復(fù)方補骨脂酊等均有報道。臨床上含補骨脂的中成藥應(yīng)用也相當(dāng)普遍，如四神丸、生發(fā)酊、白癜風(fēng)膠囊、壯骨關(guān)節(jié)丸、青蛾丸等。補骨脂素和異補骨脂素是補骨脂藥材中的主要活性成分，《中華人民共和國藥典》2010年版一部對補骨脂素和異補骨脂素的總量限度作出明確規(guī)定，補骨脂藥材中補骨脂素和異補骨脂素的總量不得少于O. 70%。補骨脂素與異補骨脂素具有多種藥理活性。研究表明，補骨脂素和異補骨脂素能明顯提高酪氨酸酶的活性，促進皮膚黑色素合成，能夠治療白癜風(fēng)等疾?。谎a骨脂素、異補骨脂素還具有雌激素樣活性。另外，補骨脂素還可使血清肌酐濃度明顯降低，腎小球濾過率增加，從而加快以腎臟排泄為主要清除途徑的藥物在體內(nèi)的清除過程。補骨脂還具有抗癌活性，實驗表明補骨脂素對KB細胞、Hela細胞、小鼠肉瘤、艾氏腹水癌等均有抑制作用。臨床應(yīng)用及現(xiàn)代藥理研究結(jié)果都表明補骨脂有防治骨質(zhì)疏松的作用，能夠促進骨再生和重建。有報道補骨脂素有望成為治療前列腺增生的比較理想的藥物之一。已有報道，補骨脂素對化療藥物耐藥的急性白血病(AL)患者有明確增敏作用。補骨脂素對多種細菌有抑制和殺滅作用，在加黑光和長波紫外線照射下，抗菌譜更廣；平碟培養(yǎng)法實驗證實補骨脂素及異補骨脂素對某些細菌加小孢子菌、石膏樣小孢子菌、紅色毛癬菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、乙型鏈球菌、大腸桿菌、綠膿球菌等均有較好的抵抗作用。如何快速大量的制備補骨脂素與異補骨脂素是工業(yè)生產(chǎn)中密切關(guān)注的問題。目前關(guān)于補骨脂素和異補骨脂素的制備方法有乙醇等有機溶劑提取法、超臨界C02萃取法、超聲法、高速逆流色譜法等。例如，乙醇等有機溶劑提取法是比較傳統(tǒng)的提取方法，將補骨脂藥材經(jīng)醇提取三次，合并提取液，減壓濃縮回收乙醇，得到浸膏，加適量水溶解分散，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓濃縮回收溶劑后得到各部分萃取物，利用硅膠柱、凝膠柱等柱層析技術(shù)對各部分萃取物進行分離，最后得到補骨脂素和異補骨脂素的單體。然而此法存在著有效成分損失大，周期長、工序多，提取效率不聞，廣品提取不純等缺點。黃芳等在《超臨界C02流體從補骨脂中提取分離補骨脂素、異補骨脂素及脂肪油的工藝研究》中介紹了制備補骨脂素和異補骨脂素的超臨界C02萃取方法。將適量已粉碎的補骨脂生藥投人萃取釜，按預(yù)定溫度、壓力萃取，萃取時間為3小時。將萃取所得的油狀物靜置后析出結(jié)晶物，抽濾后得到補骨脂脂肪油和補骨脂素晶體，用石油醚洗滌結(jié)晶得到補骨脂素。油層繼續(xù)加適量石油醚-乙醚(1:3)析晶得到異補骨脂素粗品。此法與傳統(tǒng)工藝相比，在得到補骨脂素晶體的同時也獲得異補骨脂素粗品，工藝簡單，周期短，但是粉碎藥材所需時間長，得到純品量有限。本領(lǐng)域需要有能夠快速和/或大量地制備補骨脂素和異補骨脂素或者包含它們的提取物的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有制備補骨脂素和異補骨脂素或者包含它們的提取物技術(shù)中存在的不足，提供一種能夠快速和/或大量地制備補骨脂素和異補骨脂素或者包含它們的提取物的方法。本發(fā)明令人意外地發(fā)現(xiàn)，利用補骨脂大量存在的補骨脂素和異補骨脂
素的糖苷，即補骨脂苷、異補骨脂苷，通過酸水解反應(yīng)得到補骨脂素和異補骨脂素粗品，經(jīng)簡單處理后得到大量補骨脂素和異補骨脂素純品。本發(fā)明基于以上發(fā)現(xiàn)而得以完成。為此，本發(fā)明第一方面提供了一種制備補骨脂素和異補骨脂素或者包含它們的提取物的方法，其包括以下步驟i)使補骨脂藥材用水回流提取，將合并提取液濃縮，得到濃縮液；ii)向所得濃縮液中加入酸，加熱水解；iii)使水解液在大孔吸附樹脂柱上用水洗脫除去雜質(zhì)，然后用濃度大于50%的乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮或者任選地進一步干燥，得到含有補骨脂素和異補骨脂素的提取物；iv)任選地，使步驟iii)所得提取物在硅膠柱上用有機溶劑進行洗脫，收集補骨脂素流分和異補骨脂素流分，除去溶劑，分別得到補骨脂素和異補骨脂素。根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟i)中提取1-4次，優(yōu)選1-3次，優(yōu)選2次。根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟i)中每次提取O. 5-5小時，優(yōu)選1-3小時，優(yōu)選1-2小時，優(yōu)選約I. 5小時。根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟i)中每次提取所用的水量為藥材重量的5-15倍，優(yōu)選5-12倍，優(yōu)選5-10倍。例如可以在第一次提取中使用約6-10倍量的水，在此后的各次提取中(如果進行提取)使用約5-8倍量的水。根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟i)中的濃縮是將合并提取液濃縮至與藥材重量1:1 ;根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟ii)中所述酸是鹽酸、硫酸、硝酸或磷酸，優(yōu)選鹽酸。在一個實施方案中，所述酸的加入量是使酸的濃度(以氫離子計)為O. 5 3mol/L，優(yōu)選l 2mol/L,優(yōu)選約I. 5mol/Lo例如可以使用3mol/L鹽酸水溶液進行水解,使該3mol/L鹽酸與濃縮液的體積比為1:1，由此使待水解的混合液中酸的濃度(以氫離子計)為O. 5^3mol/L0根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟ii)中加熱水解是在9(T10(TC的溫度下水解，優(yōu)選是在95 10(TC的溫度下水解。水解的時間是可以根據(jù)具體條件而作適當(dāng)調(diào)整的，這些具體條件例如但不限于酸的類型、酸的濃度、水解溫度等。一般而言，水解的時間可以是1(Γ100分鐘，優(yōu)選15 60分鐘，優(yōu)選15 45分鐘，優(yōu)選約30分鐘。
根據(jù)本發(fā)明的方法，其中步驟iii)中，所述的大孔吸附樹脂選自D101型、AB-8、NKA、XDA-5、HP-10、LSI-004、CAD40、LSA-40。根據(jù)本發(fā)明的方法，在步驟iii)中，所述的乙醇水溶液的乙醇濃度為509Γ無水乙醇，優(yōu)選6(Γ無水乙醇，優(yōu)選75、8%，優(yōu)選85、8%，優(yōu)選9(Γ無水乙醇，優(yōu)選約95%。根據(jù)本發(fā)明的方法，在步驟iii)中，每種洗脫液的用量是本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)已有知識和經(jīng)驗而可以容易地確定。在一個實施方案中，水洗脫是使用5 30倍柱體積的水進行洗脫，優(yōu)選用1(Γ20倍柱體積的水進行洗脫。在一個實施方案中，乙醇洗脫是使用5 30倍柱體積的乙醇水溶液進行洗脫，優(yōu)選 用1(Γ20倍柱體積的乙醇水溶液進行洗脫。根據(jù)本發(fā)明的方法，在步驟iv)中，所述有機溶劑為石油醚與乙酸乙酯的混合物。在一個實施方案中，所述有機溶劑為石油醚與乙酸乙酯體積比84:16 95:5的混合物，優(yōu)選體積比84:16 90:10的混合物，優(yōu)選體積比約87:13的混合物。在用有機溶劑進行洗脫時，收集補骨脂素流分和異補骨脂素流分的過程中可用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進行檢測流分組成的變化，例如使用紫外檢測儀進行監(jiān)測，在富含補骨脂素的流分或者富含異補骨脂素的流分洗脫出來時，收集這些流分，合并富含補骨脂素的流分或者富含異補骨脂素的流分，分別將它們濃縮除去溶劑，即可得到純度較高的補骨脂素或者異補骨脂素。根據(jù)本發(fā)明的方法，其基本上包括以下步驟i)使補骨脂藥材用熱水回流提取2次，每次使用6-8倍藥材量的水，每次O. 5^3h,水提物減壓濃縮至與藥材量1:1后，得到濃縮液；ii)向所得濃縮液中加入稀HCl溶液，使酸的濃度(以氫離子計)為f2mol/L，在9(Tl00°C下水解 O. 25 Ih ；iii)使水解液在大孔吸附樹脂柱上用水洗脫除去雜質(zhì)，然后用85、8%的乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮或者任選地進一步干燥，得到提取物，為含有補骨脂素和異補骨脂素的混合物；iv)任選地，使步驟iii)步驟所得提取物在硅膠柱上用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑進行洗脫，收集補骨脂素流分和異補骨脂素流分，除去溶劑，分別得到補骨脂素和異補骨月旨素。在本發(fā)明方法的一個實施方案中，所述方法基本上包括以下步驟使補骨脂藥材用熱水回流提取2次(8倍量、6倍量)，每次I. 5h，水提物I: I減壓濃縮后，得到含有大量補骨脂苷和異補骨脂苷的濃縮液，加入稀HCl溶液，在95 10(TC下水解I. 5h，水解液上大孔吸附樹脂柱，蒸餾水洗脫除去水溶性雜質(zhì)，再用95%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，制得含有補骨脂素和異補骨脂素浸膏，通過硅膠柱層析，采用石油醚-乙酸乙酯溶劑系統(tǒng)等度洗脫，收集流分，分別得到高純度的補骨脂素和異補骨脂素。本發(fā)明第二方面提供了一種補骨脂的提取物，其中包含補骨脂素和異補骨脂素。根據(jù)本發(fā)明第二方面的提取物，其中補骨脂素和異補骨脂素二者的重量比為I :
O.01 100，例如 I 0. 01 10，例如 I 0. I 10，例如 I 0. I 100，例如 I 0. 2 5。根據(jù)本發(fā)明第二方面的提取物，其中補骨脂素和異補骨脂素總量占提取物總重量的10%以上，例如10 80%，例如10 60%，例如10 50%，例如15 50%，例如20 50%。根據(jù)本發(fā)明第二方面的提取物，其基本上是由本發(fā)明第一方面任一實施方案所述方法制備。
本發(fā)明第三方面提供了一種組合物，包含本發(fā)明第二方面所述提取物，以及任選的生理學(xué)可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明任一方面的任一實施方案所具有的任一技術(shù)特征同樣適用于該方面的其它任一實施方案，本發(fā)明任一方面或其任一實施方案所具有的任一技術(shù)特征同樣適用于其它任一方面或該其它任一方面的任一實施方案，只要它們不會相互矛盾；當(dāng)然在相互之間適用時，必要的話可對相應(yīng)特征作適當(dāng)修飾。下面對本發(fā)明的各個方面和特點作進一步的描述。本發(fā)明所引述的所有文獻，它們的全部內(nèi)容通過引用并入本文，并且如果這些文獻所表達的含義與本發(fā)明不一致時，以本發(fā)明的表述為準。此外，本發(fā)明使用的各種術(shù)語和短語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一般含義，即便如此，本發(fā)明仍然希望在此對這些術(shù)語和
短語作更詳盡的說明和解釋，提及的術(shù)語和短語如有與公知含義不一致的，以本發(fā)明所表述的含義為準。在本發(fā)明中，任一數(shù)值范圍均包括該數(shù)值范圍的任一子范圍或該數(shù)值范圍內(nèi)的任一具體數(shù)值。例如在提及“步驟i)中提取1-4次”時，所述I 4次包括該數(shù)值范圍內(nèi)的任一子集或任一具體數(shù)值，例如廣4次包括但不限于廣2次、f 3次、2 4次、2 3次等。如本發(fā)明使用的，短語“制備補骨脂素和異補骨脂素或者包含它們的提取物的方法”，是指本發(fā)明的方法，該方法可以制備補骨脂素單體、異補骨脂素單體，還可以制備包含補骨脂素和異補骨脂素兩者的提取物。本文所用的術(shù)語“單體”，是指主要成分含量在90%以上(例如92%以上、95%以上、98%以上)的物質(zhì)，例如提及補骨脂素單體時，其中補骨脂素的含量在90%以上(例如92%以上、95%以上、98%以上)。如本發(fā)明使用的，術(shù)語“兩素”，是指補骨脂素和異補骨脂素；術(shù)語“兩苷”，是指補骨脂苷和異補骨脂苷。本發(fā)明人針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，采用一種簡易方法即可得到大量補骨脂素和異補骨脂素純品。該方法主要使用的溶劑有水、乙醇、低濃度的鹽酸、石油醚、乙酸乙酯等，基本未使用有毒試劑，符合國際綠色化學(xué)的理念。此外，該法能夠在短時間內(nèi)得到大量的補骨脂素與異補骨脂素混合物及高純度的單體，可以為相關(guān)中成藥的生產(chǎn)提供大量的原料，也可以為補骨脂的質(zhì)量控制提供大量高純度的標準品。在一個實施方案中，本發(fā)明提供的可以快速大量制備補骨脂素和異補骨脂素或者包含它們的提取物的方法，其特征是補骨脂水提物為符合中國藥典質(zhì)量要求的補骨脂熱水回流提取兩次(8倍量、6倍量)，每次I. 5h，得到水提液。在一個實施方案中，本發(fā)明提供的可以快速大量制備補骨脂素和異補骨脂素或者包含它們的提取物的方法，其特征是鹽酸的濃度是3mol/L，使用體積為1:1(相對于濃縮液的體積)，另外類似酸濃度的硫酸、磷酸、硝酸等中強酸均可使用。在一個實施方案中，本發(fā)明提供的可以快速大量制備補骨脂素和異補骨脂素或者包含它們的提取物的方法，其特征是水解反應(yīng)溫度95 100°C，反應(yīng)時間O. 5小時。在一個實施方案中，本發(fā)明提供的可以快速大量制備補骨脂素和異補骨脂素或者包含它們的提取物的方法，其特征是進行硅膠柱層析是采用的流動相是石油醚乙酸乙酯=87:13。本發(fā)明方法具有至少一個以下的優(yōu)點本發(fā)明方法制備周期短，3-5天即可完成一個周期；本發(fā)明方法能夠得到補骨脂素和異補骨脂素的提取物(補骨脂素和異補骨脂素的含量大于20%)及純度90%以上的單體；本發(fā)明方法工藝簡單、成本低；本發(fā)明方法符合綠色化學(xué)的理念，整個工藝流程中使用有機試劑少且未使用有毒試劑。


圖I是在不加入鹽酸時于95 100°C反應(yīng)30min后反應(yīng)液中兩苷和兩素的含量。圖2是在加入lmol/L HCl于95 100°C反應(yīng)30min后反應(yīng)液中兩苷和兩素的含量。圖3是在加入2mol/L HCl于95 100°C反應(yīng)30min后反應(yīng)液中兩苷和兩素的含量。圖4是在加入3mol/L HCl于95 100°C反應(yīng)30min后反應(yīng)液中兩苷和兩素的含量。圖5是在加入4mol/L HCl于95 100°C反應(yīng)30min后反應(yīng)液中兩苷和兩素的含量。圖6是在加入3mol/L HCl于室溫下反應(yīng)液中兩苷和兩素的含量。圖7是在加入3mol/L HCl于95 100°C反應(yīng)IOmin后反應(yīng)液中兩苷和兩素的含量。圖8是在加入3mol/L HCl于95 100°C反應(yīng)20min后反應(yīng)液中兩苷和兩素的含量。附圖中的標號I代表補骨脂苷，標號2代表異補骨脂苷，標號3代表補骨脂素，標號4代表異補骨脂素。
具體實施例方式通過下面的實施例可以對本發(fā)明進行進一步的描述，然而，本發(fā)明的范圍并不限于下述實施例。本領(lǐng)域的專業(yè)人員能夠理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以對本發(fā)明進行各種變化和修飾。本發(fā)明對試驗中所使用到的材料以及試驗方法進行一般性和/或具體的描述。雖然為實現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的，但是本發(fā)明仍然在此作盡可能詳細描述。在本發(fā)明中，如未特別注明，檢測提取物或單體成分所使用的HPLC方法見下表所示色譜柱AgilentEclipse XDB-C18 (4· 6 X 150mm, 5 μ m);流動相乙腈-O. 1%甲酸水梯度洗脫流速lmL/min;柱溫50°C；檢測波長246nm
時間Cmm)I A% (乙腈)I B% (0.丨％甲酸水)一
O1090
1864362180 20
258020
261090
36_[10_[_90_試驗例本發(fā)明一種方法的制備條件考察制備濃縮液使補骨脂藥材Ikg用熱水回流提取2次(第一次的水用量為藥材的8倍量、第二次為6倍量)，每次I. 5h，提取液I: I減壓濃縮后，得到含有大量補骨脂苷和異補骨脂苷的濃縮液1L。以下試驗分別使用該濃縮液。試驗I :量取上述濃縮液IOml置于50ml具塞三角瓶中，在三角瓶中加入等體積的蒸懼水，加入后搖勻置于95 100°C水浴鍋中，反應(yīng)30min,反應(yīng)完畢后取出放冷,取樣,用HPLC進行檢測。以上樣品平行處理兩份。經(jīng)HPLC檢測后，反應(yīng)液中補骨脂苷、異補骨脂苷和補骨脂素、異補骨脂素的含量均無變化，見圖I。試驗2 :量取上述濃縮液IOml置于50ml具塞三角瓶中，在三角瓶中加入等體積的lmol/LHCl，加入后搖勻置于95 100°C水浴鍋中，反應(yīng)30min，反應(yīng)完畢后取出放冷，取樣，用HPLC進行檢測。以上樣品平行處理兩份。經(jīng)HPLC檢測后，反應(yīng)液中補骨脂苷的含量減小40%，異補骨脂苷的含量減小65% ;補骨脂素的含量增大4倍，異補骨脂素的含量增大6倍，見圖2。試驗3 :量取上述濃 縮液IOml置于50ml具塞三角瓶中，在三角瓶中加入等體積的2mol/LHCl，加入后搖勻置于95 100°C水浴鍋中，反應(yīng)30min，反應(yīng)完畢后取出放冷，取樣，用HPLC進行檢測。以上樣品平行處理兩份。經(jīng)HPLC檢測后，反應(yīng)液中補骨脂苷的含量減小93%，異補骨脂苷的含量減小98. 7% ;補骨脂素的含量增大7倍，異補骨脂素的含量增大7. 5倍，見圖3。試驗4 :量取上述濃縮液IOml置于50ml具塞三角瓶中，在三角瓶中加入等體積的3mol/LHCl，加入后搖勻置于95 100°C水浴鍋中，反應(yīng)30min，反應(yīng)完畢后取出放冷，取樣，用HPLC進行檢測。以上樣品平行處理兩份。經(jīng)HPLC檢測后，反應(yīng)液中基本不含補骨脂苷、異補骨脂苷，補骨脂苷、異補骨脂苷幾乎完全轉(zhuǎn)化成補骨脂素和異補骨脂素，見圖4。試驗5 :量取上述濃縮液IOml置于50ml具塞三角瓶中，在三角瓶中加入等體積的4mol/LHCl，加入后搖勻置于95 100°C水浴鍋中，反應(yīng)30min，反應(yīng)完畢后取出放冷，取樣，用HPLC進行檢測。以上樣品平行處理兩份。經(jīng)HPLC檢測后，反應(yīng)液中不含補骨脂苷、異補骨脂苷，補骨脂苷、異補骨脂苷全部轉(zhuǎn)化成補骨脂素和異補骨脂素，結(jié)果與試驗4基本無差另O，見圖5。試驗6 :量取上述濃縮液IOml置于50ml具塞三角瓶中，在三角瓶中分別加入等體積的3mol/L HC1，在室溫下反應(yīng)30min，反應(yīng)完畢后取出放冷，取樣，用HPLC進行檢測。以上樣品平行處理兩份。經(jīng)HPLC檢測后，反應(yīng)液中補骨脂苷、異補骨脂苷的含量和補骨脂素、異補骨脂素的含量與試驗I中的相比基本一致，見圖6。試驗7 :量取上述濃縮液IOml置于50ml具塞三角瓶中，在三角瓶中加入等體積的3mol/LHCl，加入后搖勻置于95 100°C水浴鍋中，反應(yīng)lOmin，反應(yīng)完畢后取出放冷，取樣，用HPLC進行檢測。以上樣品平行處理兩份。經(jīng)HPLC檢測后，反應(yīng)液中補骨脂苷的含量減小48%，異補骨脂苷的含量減小76% ;補骨脂素的含量增大4. 4倍，異補骨脂素的含量增大6. 4倍，見圖7。試驗8 :量取上述濃縮液IOml置于50ml具塞三角瓶中，在三角瓶中加入等體積的3mol/LHCl，加入后搖勻置于95 100°C水浴鍋中，反應(yīng)20min，反應(yīng)完畢后取出放冷，取樣，用HPLC進行檢測。以上樣品平行處理兩份。經(jīng)HPLC檢測后，反應(yīng)液中補骨脂苷的含量減小87%，異補骨脂苷的含量減小98% ;補骨脂素的含量增大7. 2倍，異補骨脂素的含量增大8倍，見圖8。由以上試驗可以得到本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中本發(fā)明方法中使用的酸的量是使體系中酸的濃度(以氫離子計)為約1.5mol/L，水解溫度約95 100°C，水解時間約30分鐘。
實施例I、制備包含補骨脂素和異補骨脂素的提取物及各單體制備步驟步驟i):取補骨脂藥材1kg，用水回流提取2次，第一次用水量為藥材量的8倍，第二次用水量為藥材量的6倍，每次I. 5小時，將合并提取液濃縮至與藥材重量1:1，即為1L，得到濃縮液；步驟ii):向所得濃縮液中加入酸(鹽酸)，使酸的濃度(以氫離子計)達到I. 5mol/L，在95 100°C下加熱水解30分鐘；步驟iii):使水解液在大孔吸附樹脂柱(DlOl)上用水洗脫除去雜質(zhì)，然后用濃度95%的乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮，干燥，得到含有補骨脂素和異補骨脂素的本
實施例提取物63g ；步驟iv):取步驟iii)所得提取物IOg用乙醇溶解/混懸，然后加于硅膠柱上，用石油醚-乙酸乙酯(87 13)進行洗脫，紫外檢測器監(jiān)測目標流份，分別收集補骨脂素流分和異補骨脂素流分，減壓除去溶劑，分別得到補骨脂素單體I. 24g和異補骨脂素單體I. 04g。經(jīng)檢測，本實施例提取物中，補骨脂素含量為15. 6%，異補骨脂素含量為14. 1%，二者總含量為29. 7% ;補骨脂素單體的純度為99. 5%，異補骨脂素單體的純度為98. 7%。實施例2、制備包含補骨脂素和異補骨脂素的提取物及各單體參考實施例I的方法進行。其中步驟i)中水回流提取I次5小時，用水量為藥材量的10倍，將合并提取液濃縮至與藥材重量1:1;步驟ii)中所用酸為硫酸，使酸的濃度(以氫離子計)達到3mol/L，在9(TlO(TC下加熱水解15分鐘；步驟iii)中使水解液在大孔吸附樹脂柱(AB-8)上用水洗脫除去雜質(zhì)，然后用無水乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮，干燥，得到含有補骨脂素和異補骨脂素的本實施例提取物IlOg;iv)取步驟iii)所得提取物IOg用乙醇溶解/混懸，然后加于硅膠柱上，用石油醚-乙酸乙酯(88 12)進行洗脫，紫外檢測器監(jiān)測目標流份，分別收集補骨脂素流分和異補骨脂素流分，減壓除去溶劑，分別得到補骨脂素單體O. 002g和異補骨脂素單體O. 027g。經(jīng)檢測，本實施例提取物中，補骨脂素含量為O. 02%，異補骨脂素含量為O. 27%，二者總含量為O. 29% ;補骨脂素單體的含量為98. 3%，異補骨脂素單體的含量為98. 5%。實施例3、制備包含補骨脂素和異補骨脂素的提取物及各單體參考實施例I的方法進行。其中步驟i)中水回流提取4次，每次O. 5小時，每次用水量為藥材量的8倍，將合并提取液濃縮至與藥材重量1:1;步驟ii)中所用酸為硝酸，使酸的濃度(以氫離子計)達到O. 5mol/L，在9(Tl00°C下加熱水解60分鐘；步驟iii)中使水解液在大孔吸附樹脂柱(NKA)上用水洗脫除去雜質(zhì)，然后用濃度90%的乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮，干燥，得到含有補骨脂素和異補骨脂素的本實施例提取物83. 3g ；iv)取步驟iii)所得提取物IOg用乙醇溶解/混懸，然后加于硅膠柱上，用石油醚-乙酸乙酯(86:14)進行洗脫，紫外檢測器監(jiān)測目標流份，分別收集補骨脂素流分和異補骨脂素流分，減壓除去溶劑，分別得到補骨脂素單體O. 164g和異補骨脂素單體O. 152g。經(jīng)檢測，本實施例提取物中，補骨脂素含量為I. 64%，異補骨脂素含量為I. 52%，二者總含量為3. 16% ;補骨脂素單體的含量為99. 3%，異補骨脂素單體的含量為98. 3%實施例4、制備包含補骨脂素和異補骨脂素的提取物及各單體參考實施例I的方法進行。其中步驟i)中水回流提取3次，每次I小時，每次用水量為藥材量的5倍，將合并提取液濃縮至與藥材重量1:1;步驟ii)中所用酸為磷酸，使酸的濃度(以氫離子計)達到3mol/L，在95 100°C下加熱水解45分鐘；步驟iii)中使水解液在大孔吸附樹脂柱(XDA-5)上用水洗脫除去雜質(zhì)，然后用濃度85%的乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮，干燥，得到含有補骨脂素和異補骨脂素的本實施例提取物170g ；iv)取步驟iii)所得提取物IOg用乙醇溶解/混懸，然后加于硅膠柱上，用石油醚-乙酸乙酯(85 15)進行洗脫，紫外檢測器監(jiān)測目標流份，分別收集補骨脂素流分和異補骨脂素流分，減壓除去溶劑，分別得到補骨脂素單體O. 121g和異補骨脂素單體O. 123g。經(jīng)檢測，本實施例提取物中，補骨脂素含量為I. 21%，異補骨脂素含量為I. 23%，二者總含量為2. 44% ;補骨脂素單體的含量為98. 3%，異補骨脂素單體的含量為99%。實施例5、制備包含補骨脂素和異補骨脂素的提取物及各單體參考實施例I的方法進行。其中步驟i)中水回流提取2次，每次3小時，每次用水量為藥材量的6倍，將合并提取液濃縮至與藥材重量1:1;步驟ii)中所用酸為鹽酸，使酸的濃度(以氫離子計)達到2mol/L，在95 100°C下加熱水解40分鐘；步驟iii)中使水解液在大孔吸附樹脂柱(HP-10)上用水洗脫除去雜質(zhì)，然后用濃度80%的乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮，干燥，得到含有補骨脂素和異補骨脂素的本實施例提取物76. 7g ；iv)取步驟iii)所得提取物IOg用乙醇溶解/混懸，然后加于硅膠柱上，用石油醚-乙酸乙酯(84 16)進行洗脫，紫外檢測器監(jiān)測目標流份，分別收集補骨脂素流分和異補骨脂素流分，減壓除去溶劑，分別得到補骨脂素單體O. 189g和異補骨脂素單體O. Hg。經(jīng)檢測，本實施例提取物中，補骨脂素含量為I. 89%，異補骨脂素含量為1.4%，二者總含量為3. 29% ;補骨脂素單體的含量為99. 3%，異補骨脂素單體的含量為98. 3%。實施例6、制備包含補骨脂素和異補骨脂素的提取物及各單體參考實施例I的方法進行。其中步驟i)中水回流提取I次4小時，用水量為藥材量的15倍，將合并提取液濃縮至與藥材重量1:1;步驟ii)中所用酸為硫酸，使酸的濃度(以氫離子計)達到lmol/L，在95 100°C下加熱水解50分鐘；步驟iii)中使水解液在大孔吸附樹脂柱(LSI-004)上用水洗脫除去雜質(zhì)，然后用濃度75%的乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮，干燥，得到含有補骨脂素和異補骨脂素的本實施例提取物70g ；iv)取步驟iii)所得提取物IOg用乙醇溶解/混懸，然后加于硅膠柱上，用石油醚-乙酸乙酯(84 16)進行洗脫，紫外檢測器監(jiān)測目標流份，分別收集補骨脂素流分和異補骨脂素流分，減壓除去溶劑，分別得到補骨脂素單體O. 136g和異補骨脂素單體O. 119g。經(jīng)檢測，本實施例提取物中，補骨脂素含量為I. 36%，異補骨脂素含量為I. 19%，二者總含量為2. 55% ;補骨脂素單體 的含量為98. 8%，異補骨脂素單體的含量為99. 3%。實施例7、制備包含補骨脂素和異補骨脂素的提取物及各單體參考實施例I的方法進行。其中步驟i)中水回流提取3次，每次2小時，每次用水量為藥材量的9倍，將合并提取液濃縮至與藥材重量1:1;步驟ii)中所用酸為磷酸，使酸的濃度(以氫離子計)達到I. 5mol/L，在95 100°C下加熱水解20分鐘；步驟iii)中使水解液在大孔吸附樹脂柱(LSI-004)上用水洗脫除去雜質(zhì)，然后用濃度65%的乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮，干燥，得到含有補骨脂素和異補骨脂素的本實施例提取物86. 7g ；iv)取步驟iii)所得提取物IOg用乙醇溶解/混懸，然后加于硅膠柱上，用石油醚-乙酸乙酯(85:15)進行洗脫，紫外檢測器監(jiān)測目標流份，分別收集補骨脂素流分和異補骨脂素流分，減壓除去溶劑，分別得到補骨脂素單體O. 015g和異補骨脂素單體O. OlSg0經(jīng)檢測，本實施例提取物中，補骨脂素含量為O. 15%，異補骨脂素含量為O. 18%，二者總含量為O. 33% ;補骨脂素單體的含量為99. 4%，異補骨脂素單體的含量為98. 8%。實施例8、制備包含補骨脂素和異補骨脂素的提取物及單體參考實施例I的方法進行。其中步驟i)中水回流提取2次，每次3. 5小時，每次用水量為藥材量的10倍，將合并提取液濃縮至與藥材重量1:1;步驟ii)中所用酸為鹽酸，使酸的濃度(以氫離子計)達到3mol/L，在95 100°C下加熱水解25分鐘；步驟iii)中使水解液在大孔吸附樹脂柱(DlOl)上用水洗脫除去雜質(zhì)，然后用濃度60%的乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮，干燥，得到含有補骨脂素和異補骨脂素的本實施例提取物IOOg ；iv)取步驟iii)所得提取物IOg用乙醇溶解/混懸，然后加于硅膠柱上，用石油醚-乙酸乙酯(88:12)進行洗脫，紫外檢測器監(jiān)測目標流分，分別收集補骨脂素流分和異補骨脂素流分，減壓除去溶劑，分別得到補骨脂素單體O. 151g和異補骨脂素單體O. 112g。經(jīng)檢測，本實施例提取物中，補骨脂素含量為I. 51%，異補骨脂素含量為I. 12%，二者總含量為2. 63% ;補骨脂素單體的含量為98. 3%，異補骨脂素單體的含量為98. 5%。實施例9、制備包含補骨脂素和異補骨脂素的提取物及各單體參考實施例I的方法進行。其中步驟i)中水回流提取I次3. 5小時，用水量為藥材量的10倍，將合并提取液濃縮至與藥材重量1:1;
步驟ii)中所用酸為硫酸，使酸的濃度(以氫離子計)達到3mol/L，在95 100°C下加熱水解70分鐘；步驟iii)中使水解液在大孔吸附樹脂柱(AB-8)上用水洗脫除去雜質(zhì)，然后用濃度55%的乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮，干燥，得到含有補骨脂素和異補骨脂素的本實施例提取物160g ；iv)取步驟iii)所得提取物IOg用乙醇溶解/混懸，然后加于硅膠柱上，用石油醚-乙酸乙酯(86:14)進行洗脫，紫外檢測器監(jiān)測目標流分，分別收集補骨脂素流分和異補骨脂素流分，減壓除去溶劑，分別得到補骨脂素單體O. OOSg和異補骨脂素單體O. 044g。經(jīng)檢測，本實施例提取物中，補骨脂素含量為O. 08%，異補骨脂素含量為O. 44%，二者總含量為O. 52% ;補骨脂素單體的含量為99. 5%，異補骨脂素單體的含量為99. 3%。參考制各例:參考CN03115689. 4，CN1446814A實施例的方法。取補骨脂1000克粉碎后，過60目篩，用氯仿在室溫下浸提3次，每次I升，合并浸提液，在60°C溫度和O. IMPa壓力真空減壓回收溶劑，得氯仿浸膏78克，將氯仿提取物加硅膠130g拌勻，低溫烘干后研細、上色譜柱(硅膠1300g、200-300目)。用石油醚-乙酸乙酯(8 2)洗脫，分離得化合物補骨脂素493mg (HPLC 純度 96. 3%)和異補骨脂素 1020mg(HPLC 純度 95. 6%)。
權(quán)利要求
1.制備補骨脂素和異補骨脂素或者包含它們的提取物的方法，其包括以下步驟 i)使補骨脂藥材用水回流提取，將合并提取液濃縮，得到濃縮液； ii)向所得濃縮液中加入酸，加熱水解； iii)使水解液在大孔吸附樹脂柱上用水洗脫除去雜質(zhì)，然后用濃度大于50%的乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮或者任選地進一步干燥，得到含有補骨脂素和異補骨脂素的提取物； iv)任選地，使步驟iii)所得提取物在硅膠柱上用有機溶劑進行洗脫，收集補骨脂素流分和異補骨脂素流分，除去溶劑，分別得到補骨脂素和異補骨脂素。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中步驟i)中的濃縮是使提取液濃縮至原體積的3/10 7/10。
3.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中步驟ii)中所述酸是鹽酸、硫酸、硝酸或磷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中步驟ii)中所述酸的加入量是使酸的濃度以氫離子計為 O.5 3mol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中步驟ii)中加熱水解是在9(noo°c的溫度下水解。
6.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中步驟iii)中，所述的大孔吸附樹脂選自D101型、AB-8、NKA。
7.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，在步驟iii)中，所述的乙醇水溶液的乙醇濃度為5(Γ99%。
8.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其包括以下步驟 i)使補骨脂藥材用熱水回流提取2次，每次使用6-8倍藥材量的水，每次O.5^3h,水提物減壓濃縮至原體積的4/1(Γ6/10后，得到濃縮液； ii)向所得濃縮液中加入稀HCl溶液，使酸的濃度以氫離子計為f2mol/L，在9(Tl00°C下水解O. 25 Ih ； iii)使水解液在大孔吸附樹脂柱上用水洗脫除去雜質(zhì)，然后用85、8%的乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮或者任選地進一步干燥，得到提取物，為含有補骨脂素和異補骨脂素的混合物； iv)任選地，使步驟iii)步驟所得提取物在硅膠柱上用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑進行洗脫，收集補骨脂素流分和異補骨脂素流分，除去溶劑，分別得到補骨脂素和異補骨脂素。
9.一種補骨脂的提取物，其中包含補骨脂素和異補骨脂素。
10.權(quán)利要求9的提取物，其中補骨脂素和異補骨脂素二者的重量比為I:0. Of 100。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備補骨脂素和異補骨脂素或包含它們的提取物的方法。具體地說，本發(fā)明方法其包括以下步驟i)使補骨脂藥材用水回流提取，將合并提取液濃縮，得到濃縮液；ii)向所得濃縮液中加入酸，加熱水解；iii)使水解液在大孔吸附樹脂柱上用水洗脫除去雜質(zhì)，然后用濃度大于50%的乙醇水溶液洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮或者任選地進一步干燥，得到含有補骨脂素和異補骨脂素的提取物；iv)任選地，使步驟iii)所得提取物在硅膠柱上用有機溶劑進行洗脫，收集補骨脂素流分和異補骨脂素流分，除去溶劑，分別得到補骨脂素和異補骨脂素。本發(fā)明方法不僅操作簡單、生產(chǎn)周期短、而且得率高，污染少，適用于工業(yè)化大生產(chǎn)。
文檔編號C07D493/04GK102875562SQ20121026404
公開日2013年1月16日 申請日期2012年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月27日
發(fā)明者高秀梅, 王躍飛, 彭四威, 劉二偉, 熊文, 朱彥, 楊靜 申請人:天津中醫(yī)藥大學(xué)