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可用于改進(jìn)血管健康的熱處理可可產(chǎn)品的制作方法

文檔序號(hào):3557851閱讀:219來(lái)源:國(guó)知局

專利名稱::可用于改進(jìn)血管健康的熱處理可可產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明涉及含多酚,如黃烷-3-醇、原花青素和其衍生物的組合物,該組合物可通過(guò)熱處理含多酚產(chǎn)物、包含黃烷-3-醇和原花青素差向立體異構(gòu)體的組合物得到,和涉及使用它們治療或預(yù)防性治療NO響應(yīng)的疾病或病癥的方法。
背景技術(shù)
:多酚是一種多基團(tuán)的化合物(Femera等,Tetrahedron,48:10,1743-1803,1992)。它們廣泛地存在各種植物中,其中一些進(jìn)入食物鏈。有時(shí)它們代表人類飲食中一類重要的化合物。例如,黃烷醇和原花青素已經(jīng)顯示對(duì)氧化氮(NO)有影響(例如美國(guó)專利6,670,390)。NO已知可防止血小板凝聚、單核細(xì)胞粘附和趨藥性以及血管平滑肌組織的增生過(guò)程,這些都是動(dòng)脈粥樣化形成過(guò)程的決定性因素。當(dāng)NO的循環(huán)濃度降低,或者因?yàn)楸灰种苿┊a(chǎn)生阻滯,或者處于病理狀態(tài),如動(dòng)脈粥樣硬化,血管肌肉不能適度松弛。結(jié)果是血管收縮血壓增加,并可以引起某種形式的高血壓。高血壓是血管的疾病,包括中風(fēng)、心臟病、心力衰竭和腎衰竭的主要原因。由于許多人患有NO響應(yīng)的疾病或病癥,所以對(duì)發(fā)現(xiàn)各種各樣治療方法去預(yù)防和治療這些疾病有著相當(dāng)大的興趣。申請(qǐng)人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本文描述的某些化合物可以使用于這種應(yīng)用領(lǐng)域。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及熱處理黃烷醇(單體)和原花青素(低聚物),和/或黃烷醇和原花青素差向立體異構(gòu)體,包含這些化合物的組合物,并且治療和子貞防NO反應(yīng)的疾病或病癥的方法。在一個(gè)方面,本發(fā)明涉及一種組合物,如一種包含本發(fā)明的化合物或其衍生物的藥物、食物、食品添加劑或營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑,其量對(duì)于治療或預(yù)防性治療NO反應(yīng)的疾病或病癥是有效的。該組合物可任選地含有另外的治療劑或有利于健康的藥劑,或可以是與另一種治療劑或有利于健康的藥劑聯(lián)合給藥。含有上述組合物和標(biāo)簽和/或治療或預(yù)防NO反應(yīng)的疾病/病癥的使用說(shuō)明書的包裝產(chǎn)品,也在本發(fā)明的范疇內(nèi)。在一個(gè)方面,本發(fā)明提供一種治療或預(yù)防血管疾病或病癥的方法,讓需要的受治療對(duì)象給藥一種含(-)-兒茶素的飲料,其中,受治療對(duì)象是人類或牲畜。(_)-兒茶素可以存在于飲料中,作為單體的化合物,或如本文所定義分子式En的低聚化合物的一種組成單體單元,和/或熱處理如本文所定義的分子式An低聚化合物得到的化合物。通常,該飲料是含有可可或巧克力的飲料,或可可或巧克力風(fēng)味的飲料。另一方面,本發(fā)明涉及預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物,如人類或牲畜,NO反應(yīng)的疾病或病癥的方法,即給藥有效量的本發(fā)明的化合物。又一個(gè)方面,本發(fā)明提供制備本文所述化合物的方法。又一個(gè)方面,本發(fā)明涉及熱處理部分脫脂或完全脫脂的包含(±)-兒茶素和(±)-表兒茶素和其原花青素低聚物的高可可多酚(CP)的可可粉,其總CP含量為每一克脫脂粉末至少為15毫克,而且與沒(méi)有熱處理的高CP可可粉相比,其單體和低聚的HPLC圖譜發(fā)生了變化。也涉及熱處理高CP可可萃取物,干的或液體,其總CP含量每一克干可可萃取物至少為175毫克,與沒(méi)有熱處理的可可粉萃取物相比,圖譜也發(fā)生變化。又一個(gè)方面,本發(fā)明涉及熱處理的可可制品如可可々大津+,與沒(méi)有熱處理的可可制品相比,圖譜已經(jīng)發(fā)生變化。該產(chǎn)品包括高CP可可成分,如可可粉、液體的或干的可可粉萃取物,和/或可可漿。當(dāng)該產(chǎn)品是一種低水分的產(chǎn)品時(shí),每一克該產(chǎn)品含有至少大約6毫克的總可可多酚。優(yōu)選地,該產(chǎn)品表兒茶素與兒茶素的比率為1到大于1。當(dāng)該產(chǎn)品是高水分產(chǎn)品如飲料時(shí),每一克該產(chǎn)品含有至少約0.2毫克的總可可多酚。制備高CP可可粉、高CP可可萃取物和具有改變圖譜的高CP可可制品,是通過(guò)加熱部分或完全脫脂的可可粉的水分散體,或由未發(fā)酵的或發(fā)酵不足的可可豆制備的干可可萃取物的方法。優(yōu)選地,可可成分在大約37。C大約200。C和足以差向立體異構(gòu)化(-)-表兒茶素的pH和時(shí)間下加熱,例如大約0.5分鐘到幾天。優(yōu)選地,在大約72。C大約160。C下加熱大約1分鐘~大約6.0小時(shí)。更優(yōu)選地,它們?cè)诖蠹sIO(TC~大約140。C下加熱大約1分鐘~大約4小時(shí)。附圖筒述圖1代表可可飲料A和用于制備飲料的可可粉的NP-HPLC-MS數(shù)據(jù)。圖2代表可可飲料B和用于制備飲料的可可粉的NP-HPLC-MS數(shù)據(jù)。圖3代表用于制備可可飲料A的可可粉的RP-HPLC-MS數(shù)據(jù)和單體、二聚體和三聚體的EIC。圖4代表可可飲料A的RP-HPLC-MS數(shù)據(jù)和單體、二聚體和三聚體的EIC。圖5代表用于制備可可飲料B的可可粉的RP-HPLC-MS數(shù)據(jù)和單體、二聚體和三聚體的EIC。圖6代表可可飲料B的RP-HPLC-MS數(shù)據(jù)和單體、二聚體和三聚體的EIC。圖7代表可可飲料A的一種生物檢驗(yàn)引導(dǎo)分級(jí)的流程圖。圖8代表試驗(yàn)化合物在預(yù)收縮主動(dòng)脈環(huán)里介導(dǎo)的與劑量相關(guān)的松弛。圖9代表可可飲料A分?jǐn)?shù)對(duì)預(yù)收縮主動(dòng)脈環(huán)的影響。圖10代表未蒸煮的高CP可可粉的NP-HPLC/FLD數(shù)據(jù)。圖11代表蒸煮的高CP可可粉的NP-HPLC/FLD數(shù)據(jù)。圖12AD代表蒸煮30分鐘、7.75小時(shí)和24小時(shí)的高CP可可粉的NP-HPLC/FLD數(shù)據(jù)。圖13代表由蒸煮的高CP可可粉分離的單體級(jí)分的HPLC數(shù)據(jù)。圖14A~D代表合成差向立體異構(gòu)B2二聚體(A)、未蒸煮的高CP可可粉(B)、蒸煮的高CP可可粉(C)和摻料的蒸煮的高CP可可粉(D)的RP-HPLC數(shù)據(jù)。發(fā)明詳述本申請(qǐng)引用的所有專利、專利申請(qǐng)和參考文獻(xiàn)均在此引入作為參考。在任何不一致情況下,以本/^開為準(zhǔn)。本發(fā)明涉及熱處理黃烷醇(單體)和原花青素(低聚物),和/或黃烷醇和原花青素的差向立體異構(gòu)體,包含這些化合物的組合物,和治療和預(yù)防NO反應(yīng)的疾病或病癥的方法。根據(jù)最近的命名法,并且如本文采用,術(shù)語(yǔ)"黃烷醇"是指單體,例如兒茶素和表兒茶素。兒茶素和表兒茶素的低聚物稱為原花青素。但是,對(duì)本公開目的來(lái)說(shuō),這些術(shù)語(yǔ)可互換地使用。此外,本文論及的多酚,應(yīng)該了解,也適用于黃烷醇和原花青素(聯(lián)合或單獨(dú))。本發(fā)明涉及第一化合物,和包含有效量第一化合物的組合物,該第一化合物是通過(guò)熱處理一種具有下列分子式An的第二化合物,或其藥物上可接受的鹽或其衍生物(例如氧化產(chǎn)物、甲基化衍生物、葡糖醛酸化衍生物)得到的,或可由此得到的<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中n是218的整數(shù);R和X各自具有或者a或者p的立體化學(xué)構(gòu)型;R是OH、O-糖或O-沒(méi)食子酸鹽;C-4、C-6和C-8的取代基分別是X、Z和Y,單體單元的鍵合發(fā)生在C-4、C-6和C-8;當(dāng)任何C-4、C-6或C-8不4囊合到另一個(gè)單體單元,則各自的X、Y或Z是氫或糖;該糖任選地由酚類基團(tuán)在任何位置取代,例如經(jīng)由酯鍵。本文中,字句"通過(guò)熱處理得到的化合物","可通過(guò)熱處理得到的化合物,,或"化合物進(jìn)行熱處理",意思指該化合物在水的存在下,暴露于足夠時(shí)段的足夠加熱,使化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和/或功能發(fā)生變化。溫度越低,引起變化要求的暴露時(shí)間越長(zhǎng)。例如,升高加熱溫度從室溫直至14(TC,增加pH由大約3.8直至大約7,和/或增加加熱時(shí)間,都可以使變化最佳化。為了到達(dá)平衡,必須增加溫度和/或pH。這種溫度和時(shí)間可以至少為4(TC,更優(yōu)選至少為50。C,以及至少為10小時(shí),更優(yōu)選至少為24小時(shí),或更優(yōu)選至少為48小時(shí);或至少為6(TC,至少為70。C,至少為80。C,至少為90。C,至少為100。C,至少為110。C,或至少為120°C,且各自至少為5、或至少為10、15或20分鐘。例如,該化合物可以在12(TC處理10分鐘,或120。C處理20分鐘。另一個(gè)熱處理的例子描述在實(shí)施例l里。其它的溫度/時(shí)間/pH的組合也是有效的,技術(shù)人員采用本文提供的指導(dǎo)不需過(guò)度的實(shí)驗(yàn)就可確定。已知的一些技術(shù),如HPLC/MS分析可用來(lái)監(jiān)控化合物的變化,如例如實(shí)施例l所述。上述式子的單體單元可以是經(jīng)由4—6和4—8鏈4建合。只有(4—8)鏈結(jié)的低聚物是線性的;而當(dāng)存在至少一個(gè)(4—6)鍵則產(chǎn)生支化的低聚物。在本發(fā)明范疇內(nèi),包括熱處理包含至少一個(gè)非天然的鏈結(jié)(6—6)、(6—8)和(8—8)的低聚物。具有這種鏈結(jié)的低聚物可以如美國(guó)專利6,156,912所述方法制備,該專利在此引入作為參考。糖可以選自葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖和阿4立伯糖。糖優(yōu)選是單糖或二糖類。酚類基團(tuán)是選自咖啡酸、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、沒(méi)食子酸、羥基苯甲酸和芥子酸。衍生物的例子包括酯類、氧化產(chǎn)物、曱基化衍生物和葡糖醛酸化(glucuronidated)產(chǎn)物。氧化產(chǎn)物可以是如公開在美國(guó)專利5,554,645里的方法制備,該專利的有關(guān)的部分在此引入作為參考。酯類,例如,沒(méi)食子酸的酯類,可以采用已知的酯化反應(yīng)制備,例如美國(guó)專利6,420,572所述的方法,該專利公開在此引入作為參考。甲基化衍生物,如3,0甲基-、4'0-甲基和3,0、4,0-二甲基-衍生物,可以通過(guò)例如,Cren—Olive等在2002,J.Chem.Soc.PerkmTrans.1,821~830,所述的方法制備。葡糖醛酸化產(chǎn)物可以通過(guò)如下文獻(xiàn)所述的方法制備,Yu等,"制備葡糖醛酸新的和有效的方法",OrganicLetters,2(16)(2000)2539—41,和Spencer等,2001,F(xiàn)reeRadicalBiol.Med.31(9),1139-46。上述有關(guān)《連結(jié)、糖、酚類部分、和衍生物的公開內(nèi)容適用于此處/>開的所有化合物,為了簡(jiǎn)便起見(jiàn),不再重復(fù)。關(guān)于此處所述的分子式An或En的任何化合物,諸如,其中n是318;2~12;3~12;2~5;4~12;5~12;3~10;4~10或5~10的化合物。其中n是2的An或En化合物也在本發(fā)明的范疇內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明涉及一種第一化合物,和包含有效量第一化合物的組合物,該第一化合物是通過(guò)熱處理具有下式An的第二化合物,或其藥物上可接受的鹽或其衍生物(包括氧化產(chǎn)物、甲基化衍生物、葡糖醛酸化衍生物)得到的,或可由此得到的<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>其中n是218的整數(shù);R和X各自具有或者a或者p的立體化學(xué)構(gòu)型;R是OH;C-4、C-6和C-8的取代基分別是X、Z和Y,單體單元的鍵合發(fā)生在C-4、C-6和C-8;當(dāng)任何C-4、C-6和C-8不鍵合另一個(gè)單體單元,則X、Y和Z是氳。在某些實(shí)施方案中,該化合物是熱處理的原花青素二聚體或三聚體,即在式An里r^2或i^3。這種二聚體或三聚體的單體單元,在熱處理之前可能都是(-)-表兒茶素。這種二聚體的例子是(-)表兒茶素-(鄰—8)-(-)-表兒茶素和(-)-表兒茶素-(4P—6)-(-)-表兒茶素。被用來(lái)熱處理的二聚體或三聚體或其它的低聚物,可以是分離和純化的或照本領(lǐng)域已知的方法合成制備的,或可以是與,例如黃烷醇和/或其它的原花青素的混合物進(jìn)4于處理。這種混合物可以是,例如,一種植物浸出液(例如可可萃取物),由植物源(例如可可)分離出的二聚體或其它的低聚物級(jí)分,或可可成分如可可并分??煽奢腿∥锟梢酝ㄟ^(guò),例如,美國(guó)專利5,554,645所述的方法制備,可可粉可以照本領(lǐng)域已知的方法制備,具有黃烷醇/原花青素保存水平的可可粉可以通過(guò),例如,美國(guó)專利6,015,913所述的方法制備。當(dāng)純化的單獨(dú)二聚體、二聚體混合物或合成的化合物用于熱處理時(shí),它們的純度可以是,例如,至少大約50%,或至少大約60%,或至少大約70%,或至少大約80%,或至少大約90%,或至少大約92%,或至少大約95%,或至少大約98%,或至少大約99%。上述純度可以適用于分子式An的任何化合物,它的鹽和此處描述的衍生物。實(shí)施例1公開的二聚體,參見(jiàn)例如圖4,和包含二聚體的組合物,例如,一種飲料,如可可或巧克力飲料,也在本發(fā)明的范疇內(nèi)。關(guān)于圖4,假分子離子577m/z的分離離子色譜(EIC)代表處理飲料中檢測(cè)到的二聚體。新的二聚體的洗脫時(shí)間是12.6、14.5(最大的峰)、16.9、18.8和22.6分鐘。用于實(shí)行上述分離的高效液體色譜法如下固定相HypersilODS100x4.6mm5pm粒徑流動(dòng)相A:0.1%HOAc的水溶液流動(dòng)相B:0.1%HOAc的曱醇溶液流動(dòng)速率1.0ml/min梯度時(shí)間%B0152025307545100熱處理(+)-兒茶素和(_)-表兒茶素和它們的衍生物(除了沒(méi)食子酸鹽衍生物),和包含這種黃烷醇的組合物,例如,一種飲料如可可或巧克力飲料,也在本發(fā)明范疇內(nèi)。本發(fā)明還涉及一種化合物,和包含有效量該化合物(該化合物具有下列分子式En)或其藥物上可接受的鹽或其衍生物(包括氧化產(chǎn)物、甲基化衍生物、葡糖醛酸化衍生物)的組合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>其中n是218的整數(shù);R和X各自具有或者a或者p的立體化學(xué)構(gòu)型;R是OH,O-糖或者O-沒(méi)食子酸鹽;C-4、C-6或C-8的取代基分別是X、Z或Y,單體單元的鍵合發(fā)生在C-4、C-6和C-8;當(dāng)任何C-4、C-6或C-8不與另一個(gè)單體單元^fc合時(shí),則各自的X、Y或Z是氫或一種糖;糖任選地用一種酚類基團(tuán)在任何位置取代,例如經(jīng)由一種酯鍵;和至少一種該單體單元具有以下的分子式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>上述分子式的單體單元可以經(jīng)由如上分子式An的化合物所述的鏈結(jié)鍵合。糖,酚類基團(tuán),和衍生物同如上分子式An的化合物所述。在另一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明還涉及一種化合物,和包含有效量該化合物,該化合物具有下列分子式En,或其藥物上可接受的鹽或其衍生物(包括氧化產(chǎn)物、曱基化衍生物、葡糖醛酸化衍生物)的組合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>其中n是218的整數(shù);R和X各自具有或者a或者(3的立體化學(xué)構(gòu)型;R是OH;C-4、C-6和C-8的取代基分別是X、Z和Y,單體單元的鍵合發(fā)生在C-4、C-6和C-8;當(dāng)任何C-4、C-6和C-8不與另一個(gè)單體單元鍵合時(shí),則X、Y和Z是氛;和至少一個(gè)該單體單元具有下列的分子式分子式En化合物的例子是其中整數(shù)n是318;2~12;3~12;2~5;4~12;5~12;4~10或5~10的那些化合物。在某些實(shí)施方案中,該化合物是原花青素的二聚體或三聚體,其中至少一個(gè)單體單元以差向立體異構(gòu)體形式。在某些實(shí)施方案中,化合物En是熱處理的原花青素二聚體或三聚體,即11=2或11=3。例如,本發(fā)明涉及一種化合物,和包含有效量該化合物,(該化合物具有下列分子式En),或其藥物上可接受的鹽或其衍生物(包括氧化產(chǎn)物、甲基化衍生物、葡糖醛酸化衍生物)的組合物其中n是2;R和X各自具有或者a或者p的立體化學(xué)構(gòu)型;R是OH、O-糖或者O-沒(méi)食子酸鹽;C-4、C-6或C-8的取代基分別是X、Z或Y,單體單元的鍵合發(fā)生在C-4、C-6和C-8;當(dāng)任何C-4、C-6或C-8不能鍵合到另一個(gè)單體單元時(shí),則各自的X、Y或Z是氫或糖;糖是任選地由一種酚類基團(tuán)在任何位置取代,例如經(jīng)由一種酯鍵;和至少一個(gè)單體單元是(-)-兒茶素。在另一個(gè)例子中,本發(fā)明涉及一種化合物,和包含有效量該化合物,該化合物具有下列分子式En,或一種藥物上可接受的鹽或其衍生物(包括氧化產(chǎn)物、曱基化衍生物、葡糖醛酸化衍生物)的組合物其中n是2;R和X各自具有或者ot或者p的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)構(gòu)型;R是OH;C-4、C-6和C-8的取代基分別是X、Z和Y,單體單元的4建合發(fā)生在C-4、C-6和C-8;當(dāng)任何C-4、C-6和C-8不與另一個(gè)單體單元鍵合時(shí),則X、Y和Z是氫;和至少一個(gè)單體單元是(—)—兒茶素。本領(lǐng)域眾所周知,差向立體異構(gòu)體(epimer)是非對(duì)映異構(gòu)體,其僅僅在兩個(gè)或更多四面體立體中心的一個(gè),例如兩個(gè)或更多不對(duì)稱石友原子的一個(gè)上,具有相反的構(gòu)型。至于本文描述的化合物的類型,差向立體異構(gòu)體在不對(duì)稱碳中心C-2和C-3中的一個(gè)上已經(jīng)轉(zhuǎn)化了立體化學(xué)的構(gòu)型。此處使用的術(shù)語(yǔ)差向立體異構(gòu)體適用的化合物是,其C-2環(huán)碳原子已經(jīng)反轉(zhuǎn),以致該C-2碳原子的立體化學(xué)構(gòu)型是p。天然存在的黃烷醇和原花青素通常其C-2碳原子是a立體化學(xué)構(gòu)型。本發(fā)明也包括黃烷醇(+)-兒茶素和(-)-表兒茶素,即(+)-表兒茶素和(_)-兒茶素,和它們的衍生物(例如除沒(méi)食子酸鹽衍生物外的曱基化衍生物、葡糖醛酸化衍生物和氧化產(chǎn)物)和包含這些化合物的組合物,的碳2(C-2)差向立體異構(gòu)體。使用方法此處描述的任何化合物和/或組合物可用來(lái)實(shí)踐本申請(qǐng)所述的方法。術(shù)語(yǔ)"血管疾病或病癥,,是指影響血管系統(tǒng),包括心和腦的任何疾病或病癥。諸如此類的例子包括動(dòng)脈粥樣石更化、血一全形成、高血壓(例如原發(fā)性、繼發(fā)性和肺動(dòng)脈高血壓)、心血管疾病(CVD)、冠狀動(dòng)脈病(CAD)(包括心肌缺血、心肌梗死、穩(wěn)定和非穩(wěn)定心絞痛、急性的閉塞或再狹窄)、糖尿病(i型和n型)(例如糖尿病的血管并發(fā)癥)、認(rèn)知機(jī)能障礙或異常和/或血管循環(huán)異常(包括腦血管)、心臟病、腦血管疾病(包括中風(fēng)、起始和/或再發(fā)的短暫性缺血性發(fā)作,或局部缺血的并發(fā)癥,例如在冠狀血管成形術(shù)或經(jīng)皮冠狀介入之后)、充血性心力衰竭、腎衰竭、腎病;與周邊血管(例如位于臂腿處血管)收縮有關(guān)的疾病和/或病癥,如末梢血管病和更具體地說(shuō)Raynaud病、周邊動(dòng)脈病(PAD)、間歇性跛行、脈管炎(例如小血管的)、血管痙攣、靜脈血栓形成、靜脈機(jī)能不全、淋巴腺閉鎖不全、臨界肢局部缺血、急性肢局部擊夾血、動(dòng)脈粥4羊纟全塞和下力支局部i夾血"NO反應(yīng)的疾病或病癥"是指響應(yīng)于NO治療的健康狀況。這種狀況的例子包括,但是不限于,NO介導(dǎo)或NO-依賴的疾病和病癥,其中該疾病/病癥的病理學(xué)是起因于NO途徑的異常功能。諸如此類的例子包括高血壓(例如原發(fā)性、繼發(fā)性和肺動(dòng)脈高血壓)、心血管疾病、冠狀動(dòng)脈病、糖尿病(I型和II型)(例如糖尿病的血管并發(fā)癥)、鐮刀形紅細(xì)胞貧血病、認(rèn)知機(jī)能障礙或異常和/或血管循環(huán)病癥(包括腦血管)、心臟病、中風(fēng)、充血性心力衰竭、腎衰竭和腎病。因?yàn)楦哐獕涸黾恿诵呐K病、中風(fēng)、充血性心力衰竭和腎衰竭的危險(xiǎn),致血管舒張的上述化合物可以單獨(dú)或與其它的血管(包括心血管)保護(hù)劑聯(lián)合使用,預(yù)防這些狀況發(fā)生。特別適合的受治療者包括有高血壓伴糖尿病、肥胖癥、有害的脂肪外形(例如高膽固醇含量)和/或吸煙者,這些病人心臟病和中風(fēng)的危險(xiǎn)增加幾倍。通常,至少具有一個(gè)心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)(美國(guó)心臟協(xié)會(huì)認(rèn)可)的患者可以如此處所述方法治療。本文所用的術(shù)語(yǔ)"治療"意思是改善現(xiàn)有的醫(yī)學(xué)狀況,如心血管疾病,例如減緩疾病進(jìn)展,延長(zhǎng)存活期,降低死亡的危險(xiǎn)和/或提供一種可測(cè)量的改善疾病的指標(biāo)。術(shù)語(yǔ)"預(yù)防"意思是降低與疾病發(fā)展有關(guān)的危險(xiǎn),包括減少該疾病的發(fā)作。本文所用的術(shù)語(yǔ)"血管保護(hù)或治療藥劑"是指除了本發(fā)明的化合物外能有效的治療或保護(hù)血管系統(tǒng)的藥劑。這種藥劑的例子是抗血小板治療藥劑(例如COX抑制劑,如阿斯匹林);NO調(diào)整藥劑、膽固醇還原劑(例^口甾醇、stanol)。因此,本發(fā)明涉及(i)一種治療或預(yù)防血管疾病或病癥的方法,或(ii)一種治療或預(yù)防NO反應(yīng)的疾病或病癥的方法,或(iii)一種抗血小板治療的方法,給需要受治療者給藥有效量的本文描述的任意化合物(例如分子式An或En的化合物或其藥物上可接受的鹽或其衍生物(包括氧化產(chǎn)物、甲基化衍生物和葡糖醛酸化衍生物)。例如,上述方法可以是通過(guò)給藥分子式An(其中n是2)的任意化合物實(shí)施。所述化合物也適用與其它的心血管保護(hù)的和/或NO-調(diào)整的藥劑聯(lián)合治療。這種藥劑的例子對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的,可以包括B型原花青素以及A型原花青素。這種化合物可以與本發(fā)明的化合物混合服用,或分別服用。A型原花青素可以是天然來(lái)源的或合成制備的。例如,A型原花青素可以由花生皮分離得到,如Lou等,Phytochemistry,51:297-308(1999),或Karchesy和Hemingway,J.Agric.FoodChem.,34:966970U986)等文獻(xiàn)所述,文獻(xiàn)的各自的有關(guān)部分在此引入作為參考。上述化合物的其它來(lái)源是大果越橘,如見(jiàn)述于,例如Foo等,J.Nat.Prod.,63:1225-1228,和Prior等,J.AgriculturalFoodChem.,49(3):1270-76(2001),各文獻(xiàn)相關(guān)的部分在此引入作為參考,和EcdysantheraLie—Chwen等,J.Nat.Prod.,65:5058(2002))和馬栗樹(血織/ws/z^;ocMtowwm)(美國(guó)專利4,863,956),各文獻(xiàn)相關(guān)的部分在此引入作為參考。A型化合物也可從B型原花青素經(jīng)由氧化作用得到,采用1,1-二苯基-2pycrylhydrazyl(DPPH)自由基,在中性條件下反應(yīng),參見(jiàn)Kondo等,TetrahedronLett.,41:485(2000)所述,文獻(xiàn)的相關(guān)部分在此引入作為參考。得到天然的和合成的B型原花青素的方法為本領(lǐng)域所熟知,見(jiàn)述于,例j口,Romanczyk等的美國(guó)專利6,670,390;Romanczyk等的6,207,842;Romanczyk等的6,420,572;和Romanczyk等的6,156,912。本發(fā)明方法可以用于人類或牲畜,如狗、貓和馬。因此,以下的應(yīng)用在本發(fā)明范疇之內(nèi)。本文描述的所有化合物,或其藥物上可接受的鹽或其衍生物,在制備用于(1)治療或預(yù)防血管疾病或病癥;(ii)治療或預(yù)防NO反應(yīng)的疾??;或(iii)作為抗血小板治療的藥劑、食物、營(yíng)養(yǎng)或食物增補(bǔ)劑中的應(yīng)用。本文所述的所有特定狀況都在這種應(yīng)用的范疇之內(nèi)。上述方法中應(yīng)用的有效量,可以通過(guò)本領(lǐng)域的技術(shù)人員采用此處提供的指導(dǎo)和本領(lǐng)域的一般知識(shí)確定。例如,有效量可以達(dá)到在哺乳動(dòng)物體內(nèi)(例如血)生理學(xué)上相應(yīng)的濃度。這種生理學(xué)上相應(yīng)的濃度可以至少大約20納摩爾(nM),優(yōu)選至少大約100nM,更優(yōu)選至少為500nM。在一個(gè)實(shí)施方案中,哺乳動(dòng)物,如人類的血中的濃度達(dá)到至少大約1微摩爾。此處所定義的分子式An的化合物服用的劑量為約50mg/天大約1000mg/天,優(yōu)選為大約100150mg/天大約900mg/天,最優(yōu)選為大約300mg/天大約500mg/天。但是,也可應(yīng)用比上述更高的劑量。該化合物可以是急性給藥,或作為給藥方案(reg皿en),在一段有效時(shí)間,例如,每日、每月、每?jī)稍?、每半年、每年,持續(xù)地治療/預(yù)防性給藥,或在其它給藥方案中,通過(guò)有經(jīng)驗(yàn)的執(zhí)業(yè)醫(yī)生確定必需的服用時(shí)間。給藥可以至少持續(xù)一段時(shí)間,以顯示出治療/預(yù)防的效果。優(yōu)選地,該組合物每天服用,最優(yōu)選一天兩或三次,例如,早晚服用,以在哺乳動(dòng)物體內(nèi)保持有效的化合物水平。為得到最佳的效果,該組合物可以服用至少大約30天,或至少大約60天。這些給藥方案(regimen)可以周期性地重復(fù)?;诒疚奶峁┑闹笇?dǎo)和本領(lǐng)域的一般知識(shí),本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以選擇適合于急性和/或長(zhǎng)期給藥的化合物。例如,在單劑量給藥之后,和/或在給藥之后不久(例如給藥兩個(gè)小時(shí)后)就顯效的化合物,可以應(yīng)用作為快速、急性起效的藥物。在重復(fù)給藥之后有顯效的化合物可以據(jù)此應(yīng)用。從而,適合于這種給藥(例如急性的、長(zhǎng)期的)的劑型在本發(fā)明的范疇之內(nèi)。確定治療需要的最小劑量,或使用上述治療方法的最佳劑量也在本發(fā)明的范疇內(nèi)??梢詰?yīng)用實(shí)施例描述的方法或任何所知的其它劑量反應(yīng)方法,預(yù)測(cè)化合物治療此處所述的疾病或病癥的有效性。適合于一是供至少一種最小治療有效量,或最佳劑量的劑型在本發(fā)明的范疇之內(nèi)。纟且分和配方本發(fā)明涉及此處描述的可以配制作為藥物、食物、食品添加劑或營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑的組合物。本文所用的術(shù)語(yǔ)"藥品,,是一種醫(yī)學(xué)的藥。參見(jiàn)MerriamWebster'sCollegiateDictionary,10thEdition,1993。藥品可以同時(shí)稱為藥物。本文所用的術(shù)語(yǔ)"營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑"是一種產(chǎn)品(除了煙草制品),其目的是補(bǔ)充日常飲食,帶有或含有一種或多種以下飲食的成分維生素、礦物質(zhì)、草本的或其它的植物、氨基酸、膳食物質(zhì),人服用后可增加日攝入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)總量,它們或是一種提濃物、代謝物、組成物、提取物或這些成分的組合。"食物"是一種含有蛋白質(zhì)、碳水化合物和/或脂肪的物質(zhì),用于生物體支持發(fā)育、修復(fù)和生命過(guò)程并供給能量。食物也可能含有輔助的物質(zhì)如礦物質(zhì)、維生素和調(diào)味品。參見(jiàn)MernamWebster'sCollegiateDictionary,lOthEdition,1993。術(shù)語(yǔ)食物包括適合于人或動(dòng)物消費(fèi)的飲料。"食品添加劑"如FDA在21C.F.R.170.3(e)(1)所定義,包括直接和間接添加劑。組合物可以含有載體、稀釋劑或賦形劑。取決于應(yīng)用目的,載體、稀釋劑或賦形劑可以選擇適合于人或牲畜應(yīng)用,食品、添加劑、增補(bǔ)劑或藥品的應(yīng)用。組合物可以任選地含有另外的治癌藥劑和/或治心臟血管病的藥劑。組合物可以與另外的藥劑共同給藥或順序給藥,同時(shí)考慮這些因素,諸如年齡、性別、體重、遺傳學(xué)和特殊受治療者或病人的狀況,以及給藥途徑。本發(fā)明適合于人或牲畜應(yīng)用的組合物例子包括口服的可食組合物,i者如固體或液劑,例如月交丸、片劑、丸片等等,可咀嚼的固體或4t料制劑(例如可可或巧克力調(diào)味的固體或液體成分);適合于孔口,例如口部、鼻部、肛門、陰道等給藥的液體制劑,如懸浮液、糖漿、酏劑(包括可可或巧克力調(diào)p未的組合物);和適合于不經(jīng)腸的、皮下、皮內(nèi)、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥(例如注射給藥)如消毒的懸浮液或乳液。但是,組合物中的活性成分可以與蛋白質(zhì)絡(luò)合,以致當(dāng)進(jìn)入血流后,由于血蛋白的沉積而發(fā)生凝結(jié);才支術(shù)人員應(yīng)該注意到這些情況。這種組合物中,活性可可萃取物可以與適合的載體、稀釋劑或賦形劑,如無(wú)菌水、生理鹽水、葡萄糖、二甲基亞砜、乙醇等等混合。來(lái)源的原花青素(例如可可屬、genusHerrania)或合成制備的那些。本發(fā)明所用的原料(黃烷醇和原花青素)的制備方法是本領(lǐng)域眾所周知的(例如,美國(guó)專利5,554,645、6,420,572、6,156,912、6,476,241、和6,864,377),其中相關(guān)的部分在此引入作為參考。多酚可以是天然來(lái)源的,例如,來(lái)自可可豆或另一個(gè)多酚天然來(lái)源,或來(lái)自合成制備的多酚。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于供應(yīng)情況或成本選擇天然的或合成的多酚。黃烷醇和/或原花青素衍生物也可作為一種有用的原材料。這些包括酯類的單體和低聚物,如沒(méi)食子酸酯類(例如表兒茶素沒(méi)食子酸酯和兒茶素沒(méi)食子酸酯);衍生自糖類物如單或二糖類物(例如P-右旋葡萄糖),例如在上述分子式中X、Y和/或Z的位置上的化合物;糖基化的單體和低聚物,以及其混合物;原花青素單體和低聚物的代謝物,如硫酸鹽化、葡糖醛酸化和曱基化形式,通過(guò)結(jié)腸微生物群落新陳代謝產(chǎn)生原花青素的酶分裂產(chǎn)物除外。該衍生物可以來(lái)自天然源或合成制備。本發(fā)明的化合物可以通過(guò)熱處理(在水溶液中)黃烷醇、原花青素或其衍生物,所述衍生物在C-2原子具有oc立體化學(xué)構(gòu)型,使其圍繞C2原子轉(zhuǎn)動(dòng),在C-2原子產(chǎn)生p立體化學(xué)構(gòu)型而制備。這種方法特別適合于制備黃烷醇差向立體異構(gòu)體,例如,(-)-表兒茶素和(+)-兒茶素的差向立體異構(gòu)體。黃烷醇差向立體異構(gòu)體的制備可以根據(jù)以下原理圖1進(jìn)行(并見(jiàn)述于Freudenberg,K.andPurrmann,L.(1924)。RaumisomereCatechmIV.Liebig,sAnnalen437,472-85;Fredenberg,K.Bohme,L.andPurrmann,L.1922)。RaumisomereCatechinII.Ber.Dscht.Chem.Ges.55,1734-47,其中的公開內(nèi)容在此引入作為參考)原理圖1.水性介質(zhì)中黃烷-3醇在C-2位的差向立體異構(gòu)作用(Freudenbergetal.,1922;FreunbergandPurmann,1924)。(+)-表兒茶素,[2S,3S)(+)-兒茶素,2R,3S]*主要[ent-表兒茶素](-)-兒茶素,[2S,3R](-)-表兒茶素,2R,3R]*主要[ent-兒茶素]*已知存在于可可中溫度越低,引起差向異構(gòu)作用要求的時(shí)間越長(zhǎng)。例如,這種溫度和時(shí)間可以是至少4(TC,更優(yōu)選至少5(TC,時(shí)間至少10小時(shí),更優(yōu)選至少24小時(shí),或更優(yōu)選至少48小時(shí);或至少6(TC,至少7(TC,至少80。C,至少90°C,至少IO(TC,至少ll(TC,或至少120°C,各自的時(shí)間至少5,或至少10、15或20分鐘。例如該化合物可以在12(TC處理10分鐘,或12(TC處理20分鐘。其它的溫度/時(shí)間的組合也是有效的,技術(shù)人員采用本領(lǐng)域的一般知識(shí)和此處提供的指導(dǎo)不需過(guò)度的實(shí)驗(yàn)就可確定。已知的技術(shù),如高效液相色譜/質(zhì)譜分析法可用來(lái)監(jiān)控反應(yīng)的完成。差向立體異構(gòu)的化合物可以通過(guò)熱處理不同的來(lái)源的化合物制備,例如天然來(lái)源的原花青素(例如可可屬、genusHerrama)或合成制備的那些(用本領(lǐng)域眾所周知的方法得到,參見(jiàn)例如美國(guó)專利5,554,645、6,420,572、6,156,912、6,476,241、6,864,377)或通過(guò)購(gòu)買工業(yè)來(lái)源的黃烷醇。原花青素的差向立體異構(gòu)體可以根據(jù)美國(guó)專利6,420,572、6,156,912、6,476,241和6,864,377和國(guó)際申請(qǐng)出版物WO04/030440描述的方法制備(其中的公開內(nèi)容在此引入作為參考),采用黃烷醇差向立體異構(gòu)體作為起始結(jié)構(gòu)單元。例如,下列結(jié)構(gòu)單元可以用于原花青素差向立體異構(gòu)體的合成:具有4p-8鏈接的原花青素差向立體異構(gòu)體(如表1所述),可根據(jù)以下路線制備(苯甲基化、羥乙氧基化、偶合和脫笨曱基化的步驟如上述美國(guó)專利所述)。依起始結(jié)構(gòu)單元的不同,該方法可以制備各種各樣差向立體異構(gòu)原花青素的結(jié)合。步驟l(+)-表兒茶素四-o笨甲基-(+)-表兒茶素步驟24-鞋乙氧基四-0苯曱基-(+)-表兒茶素4-鞋乙氧基四-O笨甲基-(+)-表兒茶素步驟4四-o苯甲基-(+)-表兒茶素-(鄰,s)-(+卜表兒茶素'(鄰,s)-(-)-表兒茶素四"O苯甲基-(-)-表兒茶素本領(lǐng)域的技術(shù)人員利用本領(lǐng)域的知識(shí)和本文的指導(dǎo),便會(huì)想象出制備本發(fā)明的化合物的其它方法。包含本文所述化合物的食品,和任選地另一個(gè)心血管保護(hù)劑可以適合于人或牲畜使用,并包括寵物食品。該食品可以是一種低水分的食品如糕餅,或一種高水分的食品如可可飲料。通常,該食品包含直至25%的蛋白質(zhì),優(yōu)選5~20%,最優(yōu)選1~15%;直至60%的脂肪,優(yōu)選1~50%,最優(yōu)選5-45%;和直至70%的碳水化合物,優(yōu)選1~60%,最優(yōu)選5-50%。某些食品不能總是含有蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物。食品的水分活度大約0.2-0.95,優(yōu)選0.4~大約0.85。該食品可以是糕餅,如同一性的標(biāo)準(zhǔn)物(SOI)和非SOI的巧克力,如牛乳、糖果和低甜度的巧克力,包括深色巧克力、低脂肪巧克力和巧克力澆蓋的糖果。其它的例子包括焙烤產(chǎn)品(例如果仁巧克力餅、烘烤小吃、糕點(diǎn)、餅干)調(diào)味品、格蘭諾拉燕麥片條、乳脂糖、粗粉置換條、涂抹食品、糖漿、粉末飲料混合物、可可或巧克力調(diào)味的飲料、布丁、米粉糕、大米混合物、美味醬油等等。如果需要,食品可以是巧克力或可可調(diào)味的。食品可以是含有堅(jiān)果,例如花生、胡桃、杏仁和榛子的巧克力和纟奉糖,如才各蘭諾拉4奉。包含此處所述的(-)-兒茶素和/或二聚體的飲料,如可可飲料,也在本發(fā)明范疇內(nèi)。例如,飲料可以含(-)-兒茶素比(-)-表兒茶素更多,例如(-)-表兒茶素與(-)-兒茶素的比率可以至少l:2或至少1:3??煽沙煞譄崽幚淼目煽沙煞钟糜诟逤P食品。當(dāng)該產(chǎn)品是低水分的含量產(chǎn)品時(shí),每一克產(chǎn)品含有至少大約6毫克,優(yōu)選大約8,和更優(yōu)選大約10毫克的可可多酚,而且產(chǎn)品中表兒茶素與兒茶素的比率為1到大于1。它們每一克產(chǎn)品優(yōu)選含有至少大約10毫克,更優(yōu)選大約12,和最優(yōu)選大約14毫克的可可多酚,而且產(chǎn)品中表兒茶素與兒茶素的比率為1.0到大于0.66。它們每一克產(chǎn)品優(yōu)選含有至少大約12毫克,更優(yōu)選大約14,和最優(yōu)選大約16毫克的可可多酚,而且產(chǎn)品中表兒茶素與兒茶素的比率為1.0到大于0.54。甚至更優(yōu)選,它們每一克產(chǎn)品含有至少大約13毫克,更優(yōu)選大約15,和最優(yōu)選大約17毫克的可可多酚,和產(chǎn)品中表兒茶素與兒茶素的比率是1.0到大于0.42。高CP可可組分包括熱處理加工的部分脫脂或完全脫脂的CP可可粉,該可可粉包含(±)-兒茶素和(±)-表兒茶素,和其原花青素低聚物,每一克脫脂可可粉的總CP含量為至少大約25毫克,優(yōu)選大約12~大約25毫克的可可多酚。當(dāng)產(chǎn)品是高水分含量食品如飲料時(shí),每一克的產(chǎn)品含有至少大約0.2,優(yōu)選0.2~0.4,或更優(yōu)選0.4-0.8,或最優(yōu)選0.8~1.2毫克的總可可多酚。如同低水分的食品一樣,高水分食品的表兒茶素比兒茶素的比例取決于產(chǎn)品的可可多酚含量。通常,含有大約0.2~0.4毫克的產(chǎn)品,其比例為1~大于l;含有大約0.4~大約0.8毫克的產(chǎn)品,其比例為1~0.42;含有大約0.8~大約1.2毫克的產(chǎn)品,其比例為大約1~大約0.54;含有大約1~大于1.2毫克的產(chǎn)品,其比例為大約1~大約0.66。組分中也包含熱處理的高CP可可萃取物,干的或液體的,每一克的干的可可萃取物的總CP含量至少大約200毫克,優(yōu)選大約250~大約500,最優(yōu)選大約350~大約500毫克。與沒(méi)有熱處理的可可萃取物相比,該萃取物圖譜也發(fā)生變化。該組分也包含熱處理的可可制品,如可可飲料,該熱處理可可制品與沒(méi)有熱處理的相比,圖譜發(fā)生了變化。該產(chǎn)品含有高CP可可成分,如可可粉和/或液體的或干的可可萃取物,和/或可可漿。當(dāng)該產(chǎn)品是一種高水分含量產(chǎn)品如飲料時(shí),每一克該產(chǎn)品含有至少為大約0.2毫克的總可可多酚。該可可多酚含量?jī)?yōu)選是0.2~5毫克,更優(yōu)選大約0.6~大約2.0毫克,最優(yōu)選大約0.6大約2.0毫克。在這種高CP可可4分、可可萃取物和可可制品里,經(jīng)過(guò)熱處理的表兒茶素和兒茶素的總量基本上是不變的,但是(+)-兒茶素與(-)-兒茶素的比例是變化的,可可固體從90:10到4:96,可可萃取物從90:10到34:66。有趣地,通過(guò)熱處理后,(-)-表兒茶素與(+)-表兒茶素的比例是不變的,或僅僅輕微地變化。圖譜發(fā)生變化的高CP可可粉、高CP可可萃取物和高CP可可制品,是通過(guò)加熱部分或完全脫脂的可可粉或干的可可的水分散體制備,優(yōu)選由未發(fā)酵的或發(fā)酵不足的可可豆制備。可可組分或可可制品在足以差向立體異構(gòu)(-)-表兒茶素的pH和溫度條件下加熱一段時(shí)間。通常,該組分或產(chǎn)品在pH大約3.8~大約8,和大約37°C~大約20(TC下,加熱大約0.5分鐘幾天。優(yōu)選地,它們?cè)趐H大約5~大約7.5,和大約72°C~大約16(TC下,加熱大約1分鐘~大約6小時(shí)。最優(yōu)選地,它們?cè)趐H大約6大約7.4,和大約100°C~大約14(TC下,加熱大約1~大約4小時(shí)。該組分也包含熱處理的巧克力漿。巧克力漿含有至少大約10毫克的可可多酚(每一克脫脂可可漿),優(yōu)選大約20~大約50毫克,更優(yōu)選大約13~大約17毫克。含有本發(fā)明化合物的藥品,任選地與另一個(gè)NO調(diào)整藥劑,或心/血管的治療劑l"關(guān)用,通過(guò)各種方法l^藥,如經(jīng)口、經(jīng)頰、經(jīng)舌下、經(jīng)鼻、直腸、靜脈內(nèi)、腸外和局部給藥。本領(lǐng)域4支術(shù)人員將能確定一種適合的給藥方式,最大化地輸送分子式An的化合物,和任選地另一個(gè)心/血管的保護(hù)劑。從而,適合于每一種給藥的劑型都在本發(fā)明的范疇之內(nèi),包含固體、液體的和半固體劑型,如片劑、膠丸、膠嚢(gelcaps)、散裝或單一劑量的粉末或顆粒、乳液、懸浮液、糊劑、乳膏、凝膠劑、泡沫體或膠狀物。緩釋劑型也在本發(fā)明的范疇內(nèi)。適合的藥物上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑通常是本領(lǐng)域已知的,通過(guò)本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地確定。該片劑,例如,可以包含含有效量多酚的組合物,和任選地一種載體如山梨糖醇、乳糖、纖維素或磷酸二4丐。含有可可黃烷醇和/或原花青素,和(任選地另一種NO調(diào)節(jié)劑或心/血管治療劑)的營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑,可以利用本領(lǐng)域已知的方法制備,可以包含,例如,營(yíng)養(yǎng)物如4^酸二鈣、;更脂酸4^、硝酸鈣、維生素和無(wú)一幾物。還在本發(fā)明范疇內(nèi)是一種生產(chǎn)制品,如包含本發(fā)明組合物的包裝產(chǎn)品(例如食品、營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑、藥品),和標(biāo)明存在本發(fā)明的化合物,和/或直接使用該組合物治療心/血管問(wèn)題,或作為此處所述的預(yù)防的治療的標(biāo)簽。該標(biāo)簽和/或使用說(shuō)明書可以涉及本申請(qǐng)所述的任何使用方法。裝該組合物得到生產(chǎn)制品的方法,和指示、引導(dǎo)或推動(dòng)該組合物/生產(chǎn)制品得到本文所述的任何應(yīng)用的方法。這種指示,引導(dǎo)或推動(dòng)包括登廣告。也在本發(fā)明范疇內(nèi)是一種生產(chǎn)制品(如包裝的產(chǎn)品或套裝),該生產(chǎn)制品適合于聯(lián)合治療使用,包含至少一種本發(fā)明的化合物和至少一種另外的化學(xué)療法的和/或心/血管的藥劑(即,除了本發(fā)明的化合物),所述化學(xué)療法和/或心/血管的藥劑可以是在單獨(dú)的容器里作為一種單獨(dú)的組合物提供,或是以與本發(fā)明的化合物的混合物形式提供。以下的方法是用于制備和檢驗(yàn)高CP的產(chǎn)品。樣品制備在實(shí)施例1里,將飲料冷凍千燥并用丙酮/水/醋酸混合物(CH3COCH3:H20:HOAc,79.5:20:0.51)萃取兩次,在50。C超聲處理15分鐘,在35000rpm離心分離6分鐘。溶劑由收集的上層清液在減壓或真空下回收,并冷凍千燥。得到的材料用于相HPLC分析。在實(shí)施例3和4中,用于可可飲料的樣品制備要進(jìn)行改動(dòng),以更好適應(yīng)高水分產(chǎn)品分析。樣品制備包括取3235克飲料,定量地轉(zhuǎn)移到lOOmL量瓶中,力口入0.5mL冰醋酸,然后加入丙酮。這個(gè)方法產(chǎn)生一種溶液,可與使用另一可可樣品的抽提溶劑相當(dāng),包含丙酮水醋酸為70:29.5:0.5(v/v/v)。飲料樣品不能在分析之前脫脂。該飲料的水是用于組成抽提溶劑的含水部分。正相色譜_HPLC/MS分析-Adamson等人的方法實(shí)施例1采用Adamson等發(fā)表的正相HPLC方法(J.Agric.FoodChem.,1999,47pp.4184-4186)。條件如下a)柱PhenomenexLichrosphere二氧化娃尺寸25cmx4.6mm粒徑5微米孔徑大小100Ab)流動(dòng)相A.二氯曱烷B.甲醇C.水:醋酸(1:1)梯度條件起始82%A/14%B/4%C時(shí)間=30mms.67.6%A/28.4%B/4%C時(shí)間=50mins.53.2%A/42.8%B/4%C時(shí)間=51mms.10%A/86%B/4%C時(shí)間=56mms.82%A/14%B/4%C再平衡_7分鐘c)流速1.0ml/mmd)柱溫37°Ce)注射體積5.0微米f)檢測(cè):熒光激發(fā)波長(zhǎng)276nm:發(fā)射波長(zhǎng)316nm正相色i普法_Diol方法其它實(shí)施例采用的正相色譜法是一種無(wú)卣素方法,通常稱為DIOL法。該方法公開在M.A.Kelm等的論文"根據(jù)聚合度采用Diol固定相實(shí)施可可(TheobromacacaoL.)原花青素的高性能液相色譜的分離和提純""HighPerformanceLiquidChromatographySeparationandPurificationofCacao(7Tzec^謹(jǐn)acacao丄.)ProcyanidinsAccordingtoDegreeofPolymerizationUsingaDiolStationaryPhase"byM.A.Kelm,etal.,(J.Agr.&FoodChem.2006Mar8;54(5):1571-6)。條件如下正相高壓液相色譜法分析方法名稱CPDIOL-3.M柱IntersilDiol250x4.6mm流動(dòng)相A乙腈:醋酸98:2流動(dòng)相B曱醇:水:醋酸95:3:2流速梯度時(shí)間(分鐘)%B00354045404610050100戶斤用的4主為250x4.6-mm,內(nèi)《圣5)iimDevelosildiol(Phenomenex,Torrance,CA)。雙流動(dòng)相由(A)CH3CN:HOAc,(98:2,v/v)和(B)CH3OH:H20:HOAc(95:3:2)組成。分離是在30。C采用1.0/mm的流速,通過(guò)線性梯度洗脫法實(shí)施,具體如下0-35分鐘,0-40%B;35-45分鐘,40。/。B等濃度的;4546分鐘400。/。B,在0。/。B保持4分鐘。洗脫液通過(guò)熒光檢測(cè)監(jiān)控,熒光的激發(fā)在276nm,發(fā)射在316nm。反相高壓液相色譜-C18方法一種Agilent1100LC儀器,聯(lián)同光電二極管陣列、焚光檢測(cè)器和四極質(zhì)譜儀用于單體和原花青素的分離和檢測(cè),以及測(cè)定表兒茶素與兒茶素在未發(fā)酵的可可豆、可可萃取物、未蒸煮的和蒸煮的可可粉和可可飲料中的比例。采用HypersilODS(C18100x4.6mm,5jim)柱。流動(dòng)相由A(1%醋酸水溶液)和B(0.1%醋酸曱醇溶液)組成,采用10-25%B(v/v)20mm,隨后增加到100%B10min和直至100%B10mm的線性梯度洗脫法。流速設(shè)置到1.0mL/mm。柱溫定在20。C。UV檢測(cè)器設(shè)置在280nm記錄峰強(qiáng)度,紫外譜記錄從200~600nm。離子化方法是電噴射(ESI),質(zhì)譜數(shù)據(jù)全部以負(fù)離子模式獲得。為了定量操作,標(biāo)定曲線是采用這種色譜法和FLD檢測(cè)確定。洗脫液通過(guò)熒光檢測(cè)監(jiān)控,熒光的激發(fā)在276nm,發(fā)射在316nm。制備高壓液相色譜法(HPLC)Diol法制備高壓液相色譜法用于實(shí)施例5的單體和二聚體級(jí)分的物理分離。分離和洗脫單獨(dú)的黃烷-3-醇單體和/或原花青素低聚物的改進(jìn)方法包括步驟(A)將含有該單體和/或低聚物的液體樣品引入極性鍵合的二醇固定相充填的液相色譜柱;(B)雙流動(dòng)相A和B流經(jīng)柱子后,基于聚合度的不同,使單獨(dú)的單體和/或低聚物分離;和(C)洗脫含有單體和二聚體級(jí)分的單獨(dú)級(jí)分。固定相的粒徑為大約3~大約10)uim。使用一種制備diol柱,其條件稍微變動(dòng)如下流動(dòng)相A:乙腈:醋酸99:l流動(dòng)相B曱醇:水:醋酸95:4:1柱Devosil100DIOL-<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>實(shí)施例實(shí)施例1:可可飲料的原花青素化學(xué)的LCMS研究,和在主動(dòng)脈環(huán)試驗(yàn)時(shí)飲料級(jí)分的檢測(cè)實(shí)施例描述兩種可可飲料(根據(jù)不同的方法制備)和其相應(yīng)的可可粉的液相色譜質(zhì)譜分析(LCMS)。特別注意檢測(cè)各種樣品中的單體、二聚體和三聚體的定性差別。主動(dòng)脈環(huán)的試驗(yàn)用來(lái)鑒別功能級(jí)分/化合物,使用飲料萃取物作為原料。兩種飲料根據(jù)以下的方法制備。根據(jù)Kealey等的美國(guó)專利6,015,913所述方法制備的高多酚可可粉用于制備兩者飲料。該可可粉和其單體、二聚體和三聚體級(jí)分的典型HPLC譜圖如圖1、2、3和5所示??煽娠嬃螦制備方法如下(i)可可粉與水在80°C混合20分鐘(這個(gè)步驟是再生任何粉末里殘留的孢子,和使它們?cè)诔邷?UHT)時(shí)破壞);(ii)混合物在14(TC經(jīng)受超高溫處理,時(shí)間6~7秒;(ill)混合物裝入一85ml容器,在最高水溫115。C和最大壓力2.6巴下蒸餾10分鐘(完全處理19分鐘)。施加轉(zhuǎn)動(dòng)幫助傳熱。只要可以達(dá)到此處所述的功能和/或結(jié)構(gòu)效應(yīng),可以使用任何變動(dòng)的方法。可可飲料B制備如下。在室溫下,將高多酚可可粉、奶粉、糖、增稠劑、乳化劑、維生素混合物、香草精調(diào)料和瓶裝水(在22。C)摻混并混合,使用高壓泵勻化,超高溫處理(160。C15秒),并無(wú)菌包裝。用于制備這種飲料的示范性裝置,包括BreddoLikwifier(美國(guó)配料公司(AmericanIngredientsCo.)的部門,KansasCity,Missouri),帶有連接管線連通的Waukesha容積式泵和Silverson275/混合器(SilversonMachinesLtd.,Waterside,CheshamBucks,England)。4尋到的々大泮+含有大約170mg的黃烷醇和原花青素。兩種飲料和其相應(yīng)的可可粉的萃取物如圖7所示方法制備。總括地說(shuō),該料凈皮冷凍干燥和采用丙酮/水/醋酸混合物(CH3COCH3:H20:HOAc,79.5:20:0.5)萃取兩次,在50。C超聲處理15分鐘,在3500rpm下離心分離6分鐘,在減壓或真空下從收集的上層清液中去掉溶劑,并冷凍千燥。得到的材料用于HPLC分析。LCMS結(jié)果每一種飲料和其相應(yīng)的可可粉的萃取物都進(jìn)行正相(NP)和反相(RP)的LCMS研究。測(cè)試樣品的NP-HPLC色譜圖參見(jiàn)圖1和2。參照?qǐng)D1,可可飲料A的NP-HPLC色譜圖與從制備該飲料的可可粉觀察到的有很大的差別。盡管可可粉含有單體到十聚體的離散基團(tuán)(圖1,上圖),但可可飲料A的NP-HPLC色譜圖含有大部分單體到三聚體(圖1,下圖)。因此,可可飲料A與它的可可粉相比,表兒茶素和兒茶素的峰區(qū)域含有比兒茶素更多的表兒茶素。通常在可可粉里,(-)表兒茶素與(+)兒茶素的比例為大約9:1。相反,在可可飲料A里觀察到表兒茶素與兒茶素的比例大約是1:3,手性分離表明,大部分兒茶素是(-)兒茶素形式,(+)兒茶素與(-)兒茶素的比例大約在1:44。沒(méi)有觀察到(+)表兒茶素。參照?qǐng)D2,可可飲料B也比制備它的可可粉含有更多的兒茶素,但是,在可可飲料里觀察到表兒茶素與兒茶素的比例大約是1:1。二聚體的差別也相當(dāng)明顯。圖1和2所示的萃取離子色譜圖(EIC)證明了這種峰作為二聚體(m/z577)的同一性。用于制備可可飲料A和B的可可粉的EIC(圖3和5)顯示可可中存在典型的二聚體(B2和B5二聚體)。由圖4和6可見(jiàn),在飲料里二聚體B5的峰都幾乎消失。但是,最重要地,可可飲料A含有的大量二聚體(~4-5)在起始可可材料里未發(fā)現(xiàn)(圖4)。最值得注意的是,14.5mm的大峰,其分裂方式(不存在)與其它的B型二聚體一致??煽娠嬃螧也含有另外的二聚體峰(雖然較小)。主動(dòng)脈環(huán)(AorticRmg)試驗(yàn)的結(jié)果可可飲料A萃取物進(jìn)行生物試驗(yàn)引導(dǎo)的分級(jí),如流程l所圖示。級(jí)分96A~96E如下所述試—驗(yàn)。五個(gè)級(jí)分(9A~9E)是從生理活性級(jí)分96E使用制備RPHPLC得到并待試。級(jí)分9A、9B、9C、9D和9E已經(jīng)通過(guò)LCMS試驗(yàn)性地表征,證實(shí)分別由非原花青素/B型三聚體/A型二聚體,B型三聚體(主要)/B型四聚體(痕量),B型二聚體(主要)/B型三聚體(痕量),B型二聚體/B型三聚體,和B型三聚體組成。主動(dòng)月永環(huán)i咅養(yǎng)物的制備,^口早先Karim,McCormickK.KappagodaCT.,"可可原花青素對(duì)內(nèi)皮相關(guān)的松弛的影響",JournalofNutrition2000;130:2105S-2108S所迷。在將環(huán)插在10mL氧化的Krebs,緩沖液之后,讓其穩(wěn)定,環(huán)首先采用去甲腎上素(10—6M)預(yù)收縮,然后使用乙酰膽堿(10—6M)試驗(yàn)內(nèi)皮成活力。然后沖洗環(huán)和讓其恢復(fù)到基本的張力。一旦環(huán)在基本張力,再采用去曱腎上素(1(T6M)收縮。當(dāng)收縮到達(dá)穩(wěn)態(tài),給予環(huán)過(guò)氧化氫酶(400U/mL),在附加時(shí)間的穩(wěn)定之后,增添試驗(yàn)化合物的累積濃度(10|ag/ml~500pg/ml)。兩種單獨(dú)的環(huán)也進(jìn)行時(shí)間參照試驗(yàn)(乙酰膽堿10-9M~10—4M)和媒介參照(乙醇或二甲基亞砜)試一驗(yàn)。適當(dāng)?shù)臅r(shí)候,在過(guò)氧化氳酶和試驗(yàn)化合物加入之前,加入(10—5M)—硝基—L-精氨酸曱酉旨(L-NAME),—種NOS的抑制劑。此外,在加入試驗(yàn)化合物之前,將選擇環(huán)的內(nèi)皮剝?nèi)ィ员銠z驗(yàn)內(nèi)皮相關(guān)的松弛。主動(dòng)脈環(huán)的松弛是按張力(g)減少測(cè)定,并可以對(duì)去曱腎上素收縮響應(yīng)的百分?jǐn)?shù)表示。所有的藥物濃度以在組織浴緩沖液里的最后濃度表示。組數(shù)據(jù)以平均值土n次試驗(yàn)的SEM來(lái)表示。乙酰膽堿10-6M達(dá)到最大的松弛。二甲基亞砜在更高的濃度(800~1000ml的50%或100%二甲基亞砜)松馳響應(yīng);這濃度也就是說(shuō)與試驗(yàn)化合物400Mg/ml和500Mg/ml的劑量有關(guān)。所有的試驗(yàn)化合物在500Mg/ml(n=1)產(chǎn)生松馳響應(yīng),也就是說(shuō),與相應(yīng)的媒介參照具有類似的或較小的程度,因此采用試驗(yàn)化合物在這劑量下觀察到的松弛被認(rèn)為是不產(chǎn)生響應(yīng)。在10Mg/ml300Mg/ml的濃度范圍內(nèi),采用50%或者100%的DMSO(n=2)的J某介參照,沒(méi)有觀察到顯著的爭(zhēng)>弛響應(yīng)。在剩余的實(shí)驗(yàn)(11=2)里,試驗(yàn)化合物在50%乙醇中。當(dāng)容器以50%乙醇同等物作為媒介參照,沒(méi)有觀察到松馳反應(yīng)。以下的結(jié)果包括由在50%二甲基亞砜中的試驗(yàn)化合物的一個(gè)試驗(yàn),和50%乙醇的兩個(gè)試驗(yàn)。僅僅MK-1312-96E在200Mg/ml的最終浴濃度產(chǎn)生顯著的最大松馳響應(yīng)(33.6%±3.0,n=3;p<0.05,ANOVA,用Bonferrom校正)。MK-1312-96E的最大松馳響應(yīng)和乙酰膽堿的最大松馳響應(yīng)之間也沒(méi)有顯著差異(學(xué)生t檢驗(yàn))。MK-1312-96D在200Mg/ml浴濃度看來(lái)似乎產(chǎn)生松馳響應(yīng)(20.3%±8.7,n=3),但是這個(gè)效果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有顯著意義。MK131296A(是溶于100%二甲基亞砜的化合物)、MK-1312-96B和MK-1312-96C沒(méi)有響應(yīng)。當(dāng)該容器或者將內(nèi)皮剝?nèi)?,或者在加入試?yàn)化合物之前給予L-NAME,這些化合物的所有杠、弛響應(yīng)都消失或明顯地一皮抑制。結(jié)論是,MK-1312-96E在這個(gè)急性內(nèi)皮功能(也就是說(shuō)通過(guò)氧化氮調(diào)節(jié))的體外模式里,能產(chǎn)生內(nèi)皮相關(guān)的松弛響應(yīng)。上述生物試驗(yàn)和分級(jí)方法重復(fù)進(jìn)行直到純活性化合物或化合物被分離。核磁共振和質(zhì)i普儀可用來(lái)闡明生物活性化合物的結(jié)構(gòu)。實(shí)施例2:高CP的部分脫脂可可粉中原花青素化學(xué)的LCMS研究高CP可可粉(50g)懸浮在裝備有水冷式冷凝器的1L圓底燒瓶?jī)?nèi)500mL去離子水(pH5.3)中。用加熱套作熱源,回流混合物。分別在30分鐘、7.75小時(shí)和24小時(shí)取樣。原始的未蒸煮過(guò)的高CP可可粉的正相HPLC/FLD譜圖如圖IO所示。用diol法分離。圖ll顯示蒸煮過(guò)的高CP可可粉(Adamson等的方法)的正相HPLC譜圖。圖12AD顯示蒸煮前和蒸煮后30分鐘、7.75小時(shí)和24小時(shí)的譜圖。在任何加工之前高CP可可粉的總CP含量是~57mg/g或~6%。CP含量使用機(jī)構(gòu)內(nèi)部的標(biāo)準(zhǔn)物色譜測(cè)量系統(tǒng)測(cè)定。測(cè)定的多酚包括單體到十聚體。蒸煮后總CP含量減少到30mg/g。單體含量由此數(shù)據(jù)確定,顯示未蒸煮的高CP可可粉單體是13.79mg/g(1.4%單體,按質(zhì)量計(jì)),而且該單體量蒸煮之后未改變,其量為15.8mg/g(1.6%,按質(zhì)量計(jì))。也使用反相RPHPLC(C18)進(jìn)行定量。標(biāo)定曲線用可靠的標(biāo)準(zhǔn)物確定。未蒸煮過(guò)的高CP可可粉單體的量與在正相條件下確定的量相當(dāng)符合。作為對(duì)照物,使用制備的二醇柱將單體級(jí)分由蒸煮過(guò)的高CP可可粉中分離出來(lái)。由蒸煮過(guò)的高CP可可粉分離的純化級(jí)分的反相分析,顯示表兒茶素和兒茶素清楚的譜圖。兒茶素和表兒茶素在未蒸煮的和蒸煮過(guò)的高CP可可粉中的含量如表1所示。兩CP可可粉蒸煮過(guò)的可可粉兒茶素表兒茶素總基于樣品質(zhì)量(mg/mL)(mg/mL)單體量的單體量1.01x10-2(mg/mL)(%)1.70xIf)-31.18x10-21.14%3.13x1031.21x10-21.52x10-21.52%9.86xId33.12xlCr31.30x1CT21.27%8.18xKT34.8x10-31.30x10—21.27%,人蒸煮過(guò)—高CP0.3230.1760.50050%可"粉分離的單體份數(shù)實(shí)施例3:表兒茶素與兒茶素比例的研究表兒茶素與兒茶素的比例使用C18HPLC方法測(cè)定。試驗(yàn)的各種可可制品包括未發(fā)酵的可可豆、兩種高CP可可粉萃取物、未蒸煮和蒸煮過(guò)的高CP可可粉和可可飲料A??煽煞圯腿∥顰是通過(guò)用含水乙醇(25%水/75%乙醇,v/v)萃取未發(fā)酵的可可豆制備??煽煞圯腿∥顱是通過(guò)用含水丙酮(20%水/80%丙酮,v/v)萃取未發(fā)酵的可可豆制備。比例如表2所示。表2可可產(chǎn)品未發(fā)酵的可可豆可可萃取物A可可萃取物B未蒸煮過(guò)的高CP可可粉蒸煮過(guò)的高CP可可粉可可飲料A表兒茶素兒茶素基于IOO95:596:490:1079:2133:6735:65在沒(méi)有熱處理的產(chǎn)品里,例如可可粉萃取物,表兒茶素含量是大于兒茶素含量,這與未發(fā)酵的可可豆的觀察情況一致。對(duì)于高CP可可粉,表兒茶素與兒茶素的比例是79:21。對(duì)于深度加工的樣品,如可可飲料A和蒸煮過(guò)的高CP可可粉,表兒茶素與兒茶素的比例為~35:65??煽娠嬃螦在它制備的時(shí)候要經(jīng)受幾個(gè)高溫步驟(參見(jiàn)實(shí)施例1)。這個(gè)~35:65的表兒茶素對(duì)兒茶素的比例,是這兩個(gè)差向立體異構(gòu)化反應(yīng)非對(duì)映體的熱力學(xué)平衡(兒茶素是天然產(chǎn)品,具有更穩(wěn)定的構(gòu)型)。從而,加工深度對(duì)表兒茶素與兒茶素的轉(zhuǎn)化度提供了某些參照。如稍有或沒(méi)有加工,表兒茶素對(duì)于兒茶素的比例是95:5。如進(jìn)一步進(jìn)行加工,特別是高溫處理,該比例轉(zhuǎn)變到~80:20,如同未蒸煮過(guò)的高CP可可粉一樣。對(duì)于深度加工,該比例達(dá)到平tf點(diǎn)。實(shí)施例4:手性含量的研究為了確定差向立體異構(gòu)體的比例,進(jìn)行手性色譜法研究。在一組色譜分析條件下得到(+/_)-兒茶素的比例,在另一組色譜分析條件下得到(+/-)-表兒茶素的比例。對(duì)各種可可樣品中觀察到的表兒茶素和兒茶素,還進(jìn)4亍立體化學(xué)組成分析。T手性含量提供于表3??煽僧a(chǎn)品未發(fā)酵的可可豆可可萃取物A可可萃取物B未蒸煮過(guò)的高CP可可粉蒸煮過(guò)的高CP可可粉可可飲料A(冷凍干燥)表3(-)/(+>表兒茶素(+)/(-)-兒茶素100:0卯:IO100:039:61100:034:66纖013:8795:54:9694:63:97兒茶素在可可豆里是一種微量組分,天然存在的(+)-兒茶素對(duì)(一)-兒茶素的比例是90:10。對(duì)于兒茶素,在可可豆里主要的形式是(+)-兒茶素。在兩種可可提取物里,(+/_)-兒茶素的比例變?yōu)榇蠹s40:60,這與可可豆的數(shù)據(jù)不同,(-)-差向立體異構(gòu)體的量增大。大概,(-)-兒茶素的來(lái)源是(_)-表兒茶素轉(zhuǎn)化為(_)-兒茶素,因?yàn)樵撧D(zhuǎn)化是立體特異的。更進(jìn)一步的加工提高了轉(zhuǎn)化率,直到主要的結(jié)構(gòu)是(_)-兒茶素。在深度加工的可可樣品如可可飲料A里,加工提高了(_)-兒茶素的含量,直到它變成主要的立體異構(gòu)體。這與期待的轉(zhuǎn)化反應(yīng)一致,因?yàn)?-)-兒茶素是通過(guò)(-)_表兒茶素在用于制備可可飲料A的熱處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的。(-)-表兒茶素是在輕度加工的材料中觀察到的僅有異構(gòu)體。在深度加工的可可樣品里,觀察到的(+)-表兒茶素立體異構(gòu)體的量非常小。這與預(yù)計(jì)(+)-表兒茶素是從(+)-兒茶素產(chǎn)生的事實(shí)一致,而且(+)-表兒茶素是穩(wěn)定性更小的立體異構(gòu)體。為了確定立體異構(gòu)體的比例,進(jìn)行了手性色譜法研究。在一組色譜分析條件下得到(+/_)-兒茶素的比例,在另一組色i普分析條件下得到(+/_)-表兒茶素的比例。結(jié)果表明,在已加工材料,即蒸煮過(guò)的高CP可可粉和可可飲料A里,所有四個(gè)立體異構(gòu)體存在有不同的量。實(shí)施例5:單體和二聚體的分離將總共1.02g的高CP可可粉溶于15mL的75:25(99:1的乙腈:醋酸)(95:4:1的曱醇:水:醋酸)中,在3500rpm離心分離5分鐘,用0.45|Lim過(guò)濾器過(guò)濾。進(jìn)行幾批次HPLC試驗(yàn)以純化蒸煮過(guò)的可可粉(批次l:2.0mL注射,批次2:5.0mL注射,批次3:5.0mL注射和批次4:4.0mL注射)。在~12.4分鐘洗脫的所有單體峰和在~27.5分鐘洗脫的二聚體峰合并,在減壓下蒸發(fā),和冷凍干燥。得到的單體和二聚體分別是6毫克和4毫克。樣品溶于適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)相以便隨后的分析分離。圖13顯示由蒸煮過(guò)的高CP可可粉分離的單體級(jí)分的譜圖。實(shí)施例6:未蒸煮過(guò)的高CP可可粉、蒸煮過(guò)的高CP可可粉和合成的(-)-表兒茶素(4p,8)-(-)-兒茶素二聚體的對(duì)比小于l毫克的合成的(-)-表兒茶素-(4p,8)-(-)-兒茶素二聚體,溶于含有10%乙醇和0.1%醋酸在去離子水中的混合物中。該二聚體是一種天然存在的B2二聚體的差向立體異構(gòu)體二聚體,即(-)-表兒茶素-(4p,8)-(-)-表兒茶素??偣?.3g的蒸煮過(guò)的高CP可可粉溶于2mL的含有10%乙醇和0.1%醋酸在去離子水里的混合物中,超聲處理5分鐘,在4500rpm離心分離5分鐘,用45fim過(guò)濾器過(guò)濾。然后取200fil樣品進(jìn)行LC/MS分析??偣?.3g的蒸煮過(guò)高CP可可粉溶于2mL的含有10%乙醇和0.1%醋酸在去離子水里的混合物中,在4500卬m離心分離5分鐘,用45一m過(guò)濾器過(guò)濾。取200jil樣品并加入〈毫克的合成的(-)-表兒茶素-(4p,8)-(_)-兒茶素??偣?.33g的未蒸煮過(guò)的高CP可可粉溶于2mL的含有10%乙醇和0.1%醋酸在去離子水里的混合物中,超聲處理5分鐘,在4500rpm離心分離5分鐘,用45jim過(guò)濾器過(guò)濾。取200W樣品進(jìn)行LC/MS分析。MSD設(shè)置是離子模式API-ES,模式掃描,極性負(fù)性,質(zhì)量范圍100-1500,Fragmetnor:70,閾值150,步長(zhǎng)0.20,毛細(xì)管電壓3000,干氣101/mm,噴霧器壓力50磅/平方英寸(psig),干氣溫度345°C。HPLC分析表明,二聚體發(fā)生顯著變化。參見(jiàn)圖14A到14D。B2二聚體在這個(gè)條件下的保留時(shí)間是12.7分鐘,B5二聚體是24.5分鐘,差向立體異構(gòu)的B2二聚體是6.8分鐘。圖14AD顯示合成的差向立體異構(gòu)B2二聚體(A)、未蒸煮過(guò)的高CP可可粉(B)、蒸煮過(guò)的高CP可可粉(C)和摻料的蒸煮過(guò)高的CP可可粉(D)的反相分離i普?qǐng)D。蒸煮過(guò)的高可可粉表明,其二聚體B5幾乎沒(méi)有,二聚體B2仍然存在,而且存在一種保留時(shí)間為~6.8分鐘的新二聚體。用合成的差向立體異構(gòu)的B2二聚體摻料的樣品顯示,前述峰的區(qū)域增大(參見(jiàn)圖14D)。二聚體級(jí)分使用制備二醇(diol)柱由蒸煮過(guò)的高CP可可粉中分離出來(lái)。這個(gè)純化級(jí)分的RP-HPLC/FLD和質(zhì)譜儀(單一的離子監(jiān)控器模式m/z二577)譜圖顯示,正如所料,不存在單體。但是清楚地顯示新的二聚體。新的二聚體在此色譜分析條件之下的保留時(shí)間與B2、B5和差向立體異構(gòu)B2的二聚體不同??紤]到B2和B5二聚體可能的差向立體異構(gòu)體包括總共六個(gè)另外的異構(gòu)體,新的二聚體可能是通常存在于可可中的B2和B5二聚體的差向立體異構(gòu)體。盡管本發(fā)明已經(jīng)通過(guò)某些特定的實(shí)施方案進(jìn)4亍描述,應(yīng)當(dāng)理解,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以實(shí)施許多不偏離本發(fā)明的修改和變動(dòng)。所以附加的#又利要求打算覆蓋所有這類修改和變動(dòng),并可屬于本發(fā)明的真實(shí)精神和范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1.一種熱處理的部分脫脂或完全脫脂的可可粉,其每一克脫脂可可粉具有總可可多酚的含量為至少大約25毫克,其中該可可多酚包含(±)-兒茶素、(±)-表兒茶素和其原花青Z素的低聚物,其特征在于單體的圖譜發(fā)生改變,其中表兒茶素對(duì)兒茶素的比例為大約1~大于大約1。2.權(quán)利要求1的可可粉,其中總可可多酚含量為大約20~大約50毫克每克,和其中所述比例是大于大約1~大約0.42。3.—種熱處理的巧克力漿,其每克具有總可可多酚含量為至少大約10毫克,基于脫脂的可可固體,其中所述可可多酚包含(±)-兒茶素、(±)-表兒茶素和其原花青素低聚物,其特征在于,單體的圖譜發(fā)生改變,其中表兒茶素對(duì)兒茶素的比例為大約1~大于大約1。4.權(quán)利要求3的巧克力漿,其中總可可多酚含量為大約12~大約25,和其中所述比例為大約1~大于大約0.42。5.—種熱處理的可可萃取物,其中該萃取物的總多酚含量是每克干萃取物至少大約200毫克的可可多酚;其中該可可多酚包含(±)_兒茶素、(±)-表兒茶素和其原花青素低聚物,其特征在于單體的圖譜發(fā)生改變,其中表兒茶素對(duì)兒茶素的比例為大約1~大于大約1。6.權(quán)利要求5的萃取物,其中總可可多酚含量為大約250~大約500,和所述比例大約1~大約0.42。7.—種熱處理的低水分含量的可可制品,其含有選自高CP可可粉、液體的或干的高CP可可萃取物、高CP巧克力漿和其混合物的可可組分,所述產(chǎn)品具有的總可可多酚含量為每克產(chǎn)品至少大約6.0毫克,其中可可多酚包含(±)-兒茶素、(±)-表兒茶素和其原花青素低聚物,其特征在于單體的圖譜發(fā)生改變,其中表兒茶素對(duì)兒茶素的比例是1~大于1。8.權(quán)利要求7的可可制品,其中該制品具有的總可可多酚含量為至多49毫克。9.一種熱處理的高水分含量可可制品,其含有選自高CP可可粉、液體的或干的高CP可可萃取物、高CP巧克力漿和其混合物,該產(chǎn)品具有總可可多酚含量為每克產(chǎn)品至少大約0.2毫克,其中該可可多酚包含(±)-兒茶素、(±)-表兒茶素和其原花青素低聚物,其特征在于單體的圖譜發(fā)生改變,其中表兒茶素對(duì)兒茶素的比例是1大于1。10.權(quán)利要求9的產(chǎn)品,其中該產(chǎn)品具有的總可可多酚含量為至多大約5毫克。11.權(quán)利要求l的可可粉,權(quán)利要求3的巧克力漿,權(quán)利要求5的可可萃取物,或權(quán)利要求7或9的可可制品,其中表兒茶素和兒茶素的總量與最初存在于該可可粉、可可萃取物、巧克力漿或可可制品中的總量基本上未改變。12.權(quán)利要求1的可可粉、權(quán)利要求3的巧克力漿、權(quán)利要求5的可可萃取物或權(quán)利要求7或9的可可制品,其特征在于,存在的四個(gè)另外的二聚體,在同樣的色譜分析條件下,具有與已知的二聚體B2和B5不同的洗脫時(shí)間。13.權(quán)利要求1的可可粉,它是在大約37°~大約190。C和在足以差向立體異構(gòu)(-)表兒茶素的時(shí)間和pH下,通過(guò)加熱從未發(fā)酵或發(fā)酵不足的可可豆制備的可可粉而得到。14.權(quán)利要求3的巧克力漿,它是在大約37。大約190。C和足以差向立體異構(gòu)(-)表兒茶素的時(shí)間和pH下,通過(guò)加熱從未發(fā)酵或發(fā)酵不足的可可豆制備的巧克力漿而得到。15.權(quán)利要求5的可可萃取物,它是通過(guò)溶解干的可可萃取物在水或含水有機(jī)溶劑中,并在大約37°~大約190。C和pH大約4.0~大約8.0下,加熱溶液大約0.5分鐘幾天制備。16.—種基本上由水和可可粉組成的可可飲料,所述飲料與制備它的可可粉對(duì)比,含有比表兒茶素更多的兒茶素,和其中表兒茶素對(duì)兒茶素的比例在飲料里大約是1:3。17.權(quán)利要求16的可可飲料,其中在飲料里大部分兒茶素是(-)-兒茶素。18.—種治療或預(yù)防血管疾病或病癥的方法,該方法是通過(guò)纟合人或牲畜給藥包含(-)-兒茶素和在同樣的色譜分析條件下洗脫時(shí)間不同于二聚體B2和B5的二聚體的可可飲料,和其中該血管的疾病或病癥是選自動(dòng)脈粥樣硬化、血栓形成、高血壓(例如原發(fā)性、繼發(fā)性和肺動(dòng)脈高血壓)、心血管疾病(CVD)、冠狀動(dòng)脈病(CAD)(包括心肌缺血、心肌梗死、穩(wěn)定和非穩(wěn)定心絞痛、急性的閉塞或再狹窄)、糖尿病(I型和II型)(例如糖尿病的血管并發(fā)癥)、認(rèn)知機(jī)能障礙或異常和/或血管循環(huán)異常(包括腦血管)、心臟病、腦血管疾病(包括中風(fēng)、起始和/或再發(fā)的短暫性缺血性發(fā)作,或局部缺血的并發(fā)癥,例如在冠狀血管成形術(shù)或經(jīng)皮冠狀介入之后)、充血性心力衰竭、腎衰竭、腎??;與周邊血管(例如位于臂腿處血管)收縮有關(guān)的疾病和/或病癥,如末梢血管病和更具體地說(shuō)Raynaud病、周邊動(dòng)脈病(PAD)、間歇性跛行、脈管炎(例如小血管的)、血管痙攣、靜脈血栓形成、靜脈機(jī)能不全、臨界肢局部缺血、急性肢局部缺血、動(dòng)脈粥樣栓塞和下肢局部缺血。19.權(quán)利要求18的方法,其中飲料是可可飲料。20.權(quán)利要求19的方法,其中該飲料是可可飲料,和其中該血管的疾病或病癥是選自動(dòng)脈粥樣石更化、血纟全形成、高血壓(例如原發(fā)性、繼發(fā)性和肺動(dòng)脈高血壓)、心血管疾病(CVD)、冠狀動(dòng)脈病(CAD)(包括心肌缺血、心肌梗死、穩(wěn)定和非穩(wěn)定心絞痛、急性的閉塞或再狹窄)、糖尿病(I型和II型)(例如糖尿病的血管并發(fā)癥)、認(rèn)知機(jī)能障礙或異常和/或血管循環(huán)異常(包括腦血管)、心臟病、腦血管疾病(包括中風(fēng)、起始和/或再發(fā)的短暫性缺血性發(fā)作,或局部缺血的并發(fā)癥,例如在冠狀血管成形術(shù)或經(jīng)皮冠狀介入之后)、充血性心力衰竭、腎衰竭、腎??;與周邊血管(例如位于臂腿處血管)收縮有關(guān)的疾病和/或病癥,如末梢血管病和更具體地說(shuō)Raynaud病、周邊動(dòng)脈病(PAD)、間歇性跛行、脈管炎(例如小血管的)、血管痙攣、靜脈血栓形成、靜脈機(jī)能不全、臨界肢局部缺血、急性肢局部缺血、動(dòng)脈粥樣4全塞和下肢局部缺血。全文摘要本發(fā)明涉及含有多酚如黃烷醇、原花青素和其衍生物的組合物,該組合物可通過(guò)在水溶液中熱處理多酚得到,和包含黃烷醇、原花青素和其衍生物的差向立體異構(gòu)體,和使用其治療或預(yù)防性治療NO反應(yīng)的疾病或病癥的方法。本發(fā)明還涉及熱處理的可可粉和可可萃取物,其特征在于單體和低聚物的圖譜發(fā)生改變,其中表兒茶素和兒茶素的總量無(wú)變化,其中存在新的二聚體,和其中缺乏比三聚體更高的低聚物。文檔編號(hào)C07D311/00GK101228148SQ200680023666公開日2008年7月23日申請(qǐng)日期2006年6月29日優(yōu)先權(quán)日2005年6月29日發(fā)明者C·L·奎克-烏里貝,H·H·施米茨,J·F·哈默斯通,M·A·凱爾姆,R·J·羅賓斯申請(qǐng)人:馬爾斯公司
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