專利名稱：組合物和用于制備穩(wěn)定的高分子量淀粉狀蛋白β低聚物的方法
組合物和用于制備穩(wěn)定的高分子量淀粉狀蛋白卩低聚物的方法 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種制備穩(wěn)定的淀粉狀蛋白P低聚物的方法及其組合 物，其用作抗原或篩選試劑，其中所述抗原或篩選試劑用于產(chǎn)生治療或 診斷阿爾茨海默氏病和其它與淀粉狀蛋白卩的異常聚集有關(guān)的病癥的抗體。發(fā)明背景目前對于阿爾茨海默氏病只有有限的治療方法，該疾病已成為多方 面的全球公共健康問題。該疾病的特征在于與神經(jīng)纖維纏結(jié)和淀粉狀蛋白斑的聚集有關(guān)的漸進性癡呆，所述后者含有淀粉狀蛋白P(AP), —種 包含39-43個由膜蛋白前體、淀粉狀蛋白前體蛋白(APP)發(fā)生蛋白質(zhì)水解 衍生來的氨基酸的兩親性肽(綜述參見Lee, V.M.等人，Annu. Rev. Ne腦sci. ， 24: 1121-1159(2001), Klein, W丄.，Molecular Mechanisms of Neurodegradative Diseases。 Chesselet, M.F,, Ed. ， (2000), 1-49頁，Humana Press, Inc. Totowa, New Jersey)。在細胞培養(yǎng)中A(3的自身結(jié)合是對神經(jīng)細胞產(chǎn)生毒性所必須的(Pike, C. J.等人，Brain Res. 563: 311-314 (1991), Lorenzo, A.和Yankner, B.A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 12243-12247 (1994), Howlett, D.R.等人， Neurodegeneration4: 23-32 (1995))。最初，人們認為原纖維形式的物質(zhì) 為毒性物質(zhì)。但是，在培養(yǎng)中用以殺死神經(jīng)細胞所需的纖維狀A卩的劑 量非常大(Seubert,P.等人，Nature〖倫敦)359: 325-327 (1992))。之后的 研究顯示神經(jīng)機能障礙和變性可能歸因于較小的、可溶的A卩集合，其 被稱作可溶性低聚物(淀粉狀蛋白-衍生的擴散性配體，ADDLs) (Lambert, M.P.等人，Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 6448-6453 (1998)， Hartley, D.M. 等人，J. Neu腦i. 19: 8876-8884(1999), Walsh, D.M.等人，J. Biol.Chem. 274: 25945-25952 (1999))。對于由可溶性低聚物誘導的選擇性神經(jīng)元變 性進行了特別闡述(Kim,H, J.等人，F(xiàn)aseb J. 17(1): 118-20 (2003))。本申請人開發(fā)了 一種以高產(chǎn)率并且在使所述可溶性低聚物保持穩(wěn) 定的條件下制備可溶性低聚物的方法。發(fā)明概述本發(fā)明是一種制備穩(wěn)定和可溶的AP低聚物制劑的方法及其組合物和制劑。所述方法使用高濃度的A卩肽、高于7.5的pH和多價陰離子， 例如具有二價陰離子的緩沖液，來促進A(3低聚物的制劑。在進一步的 實施方案中，所述方法還使用附加的添加劑，例如三氟乙醇和甘油來提 高低聚物的穩(wěn)定性。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述方法的產(chǎn)物是穩(wěn)定、可溶的A卩 低聚物，而且由動態(tài)光散射技術(shù)測量的粒度為10nm-100nm，分子量 (Mw)為100 kDa- 500 kDa。在本發(fā)明的更進一步的實施方案中，所述穩(wěn)定、可溶的AP低聚物 為具有下述特性的肽制劑其中至少50%為直徑為lOnm- 50nm和Mw 為100kDa- 500 kDa的低聚物形式。在本發(fā)明的另 一個實施方案中，所述肽制劑用于產(chǎn)生 一種用以治療 阿爾茨海默氏病的治療性抗體。附圖簡述

圖1A代表pH對可溶性Ap低聚物的形成的影響。在介于4.5和9.0 之間的不同pH值的鈉緩沖液中制備A卩樣品。圖1B顯示由動態(tài)光散射 分析法獲得的AP低聚物的流體力學直徑(Dh)分布，其中(O)代表質(zhì)量分 數(shù)，(〃)代表散射強度分數(shù)。圖2代表多價離子對可溶性A卩低聚物的形成的影響。 圖3代表AP肽濃度對可溶性Ap低聚物的形成的影響。 圖4代表在4。C下貯存1天和4天之后從HP-SEC柱中回收可溶性 A卩低聚物制劑。對AP峰的總面積進行積分并相對公稱濃度作圖。圖5代表溫度和各種賦型劑對可溶性AP低聚物的形成的影響。圖 5A顯示各種賦型劑在37。C下的影響，而圖5B顯示同樣的賦型劑在4。C 下的影響。圖6代表在磷酸鈉緩沖液中甘油對可溶性AP低聚物的穩(wěn)定性的影響。圖7代表利用戊二醛所進行的APc和A(34o單體肽的交聯(lián)。顯示在 左側(cè)的分子量標記作為對尺寸分布的估計。軌跡1-5分別含有A卩42，0%、 0.01%、 0.05%、 0.10%和0.50%的戊二醛。軌跡6-10分別含有A|340, 0%、 0.01%、 0.05%、 0.10%和0.50%的戊二醛。圖8代表在50mM磷酸鹽，pH 9.0的緩沖液中形成的可溶性A卩42 低聚物在4。C(2-8。C)下貯存1、 4和7天時的穩(wěn)定性，其是通過對戊二醛 交聯(lián)樣品和非交聯(lián)對照品進行SDS-PAGE分析而確定的。分子量標記物 作為對尺寸分布的估計。圖8A:軌跡l,空白；軌跡2-4分別為第l、 4和7天的在50mM 磷酸鹽中的lmM貯存液，0.5%戊二醛；軌跡5-7分別為第l、 4和7天 的lmM貝i存液，0%戊二醛；軌跡8， MWM, 0.5%戊二醛；軌跡9， MWM， 0%戊二醛；軌跡10-12分別為第1、 4和7天的850 pM貯存液， 0%的戊二醛。圖8B:軌跡l，空白；軌跡2-4分別為第l、 4和7天的在50 mM 磷酸鹽中的850 pM貯存液，0.5%戊二醛；軌跡5, MWM, 0.5%戊二醛； 軌跡6, MWM, 0%戊二醛；軌跡7-10分別為第l、 4和7天的650 貯存液，0.5%戊二醛；軌跡10-12分別為第1、 4和7天的650 貯存 液，0%戊二趁。圖8C:軌跡l,空白；軌跡2-4分別為第l、 4和7天的在50mM 磷酸鹽中的450 (iM貯存液，0.5%戊二醛；軌跡5-7分別為第l、 4和7 天的450 pM!)&存液，0%戊二醛；軌跡8, MWM, 0.5%戊二醛；軌跡9, MWM， 0%戊二醛；軌跡10-12分別為第1、 4和7天的250 jliM貯存液， 0%戊二醛。圖8D:軌跡l，空白；軌跡2-4分別為第l、 4和7天的在50 mM 磷酸鹽中的250 pM貯存液，0.5%戊二醛；軌跡5, MWM, 0.5%戊二醛； 軌跡6, MWM， 0%戊二酪；軌跡7-10分別為第l、 4和7天的100 (iM 貯存液，0.5%戊二醛；軌跡10-12分別為第1、 4和7天的100jiM貯存 液，0%戊二醛。圖9代表在50 mM磷酸鹽，pH 9.0的緩沖液中的A^2貯存液在4 。C下經(jīng)7天后其濃度對PC-12細胞的體外生物活性的影響。填充的正方 形-5微摩爾試驗濃度，開圓-1微摩爾試驗濃度。發(fā)明詳述制備可溶性Ap低聚物的標準步驟("標準方案")是在4。C下于F12培養(yǎng)基(pH 7.4)中在高達100 pM的濃度下將A卩肽培養(yǎng)過夜(Lambert, M.P.等人,Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 6448-6453 (1998)， ChromyB.A. 等人，Biochemistry 42: 12749-12760 (2003),Stine W.B.等人，J. Biol. Chem. 278: 11612-11622 (2003))。這些研究一致表明經(jīng)凝膠電泳法分析在這些 條件下形成的可溶性A卩低聚物制劑顯示含有三聚物、四聚物(12 kDa -17 kDa)和一些分子量(Mw)為50 kDa-200 kDa的l史大^氐聚物的混合物， 經(jīng)原子力顯微鏡法(AFM)分析其粒度為3.5-10納米直徑。所述標準方 案得到的可溶性A|3低聚物制劑中絕大部分混合物仍舊以單體形式存 在。這樣，該制劑在用作抗原時產(chǎn)生免疫響應的傾向較低，而且其中更 難于重新獲得特別地針對AP低聚物的抗體。淀粉狀蛋白P原纖維的形成是一個復雜的過程，在獲得最終的卩-構(gòu)造之前其可能涉及暫時性螺^走狀中間體的存在(Walsh.D.M.等人，L Biol. Chem. 274: 25945-25952 (1999))。體外研究表明低濃度的螺旋-誘 導溶劑，三氟乙醇(TFE)在pH 7.4下誘使原纖維的形成，該濃度遠遠低 于形成Ap原纖維的臨界濃度(大約為20 ^M)。在高于20^的TFE濃度 下，螺旋結(jié)構(gòu)成為主要結(jié)構(gòu)，從而對原纖維的延長產(chǎn)生抑制作用(Fezoui, Y.和Teplow,D.B., J. Biol. Chem. 277: 36948-36954 (2002》。雖然不希 望受任何理論的限制，但是申請人認為由于AP的組氨酸殘基的離子化 狀態(tài)影響結(jié)合現(xiàn)象，因而使pH升高至大大高于離子化范圍就會產(chǎn)生使 原纖維的形成受到抑制的情況和加入少量螺旋-誘導性溶劑就會促進結(jié) 構(gòu)形成和隨后的結(jié)合的情況。因此，這種情況會提高Ap低聚物的產(chǎn)率 和穩(wěn)定性。如下述實施例所示，申請人已經(jīng)制備了這種穩(wěn)定、可溶的A卩 低聚物。如本文中所用的，術(shù)語"可溶性AP低聚物"指可溶的、低聚形式 的A卩肽。在優(yōu)選的實施方案中，可溶的A(3低聚物為低聚形式的Ap42， ^旦是，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應該i人識到還可以使用其它形式的A|3，包 括那些含有變異和變體的A|3。例如，本申請中可以使用利用在原序列 的氨基酸殘基1和2上具有變異的合成肽而得到的A(3形式。參見，WO 02/094985和WO 04/099376中關(guān)于在原A(3序歹'J的氨基酸殘基1和2上 具有變體的肽的例子，將其如同全文列出一樣引入本文。另一個適當?shù)?肽的例子包括使用生物素化形式的A卩肽。如本文中所用的，術(shù)語"穩(wěn)定的、可溶的A卩低聚物"指由本申請中所要求的方法制備的可溶的、低聚形式的A卩肽。"穩(wěn)定的"意指具 有相對于低聚物而言的較少的單體的制劑，而且該制劑中如此形成的可溶性A|3低聚物基本上不易于進一步結(jié)合而形成原纖維或聚集體，并且 更不易于分解成單體。使用在本發(fā)明之前的本領(lǐng)域已知的標準方案時， 則濃度高達約100嗎/ml的低聚物的穩(wěn)定性約為1天。根據(jù)本文中描述 的方法，濃度為1 mg/ml和更高的低聚物可以在4。C下貯存1周。使用 尺寸排阻色譜(SEC)技術(shù)來具體確定由于聚集物在預-過濾器上發(fā)生滯留 而導致的不良峰位置和不良回收的存在或不存在，從而測量作為穩(wěn)定性 量度的聚集程度。在本發(fā)明中，申請人使用相對于標準方案非標準的條件來誘導穩(wěn) 定、可溶的AP低聚物的形成，所述的非標準條件包括提高的濃度(大于 100 juM),升高的pH (pH 〉 7.5)和使用二價陰離子。用申請人的改進的 方法制備了顯著穩(wěn)定的、可溶的A卩低聚物，經(jīng)動態(tài)光散射法測定其直 徑為約10 nm - 50 nm，經(jīng)靜態(tài)光散射法測量其分子量為約100 kDa - 500 kDa。在優(yōu)選的實施方案中，申請人發(fā)現(xiàn)本申請中要求的低聚物直徑為 18nm,測量的分子量(Mw)為約155,000 Da。通過使用SDS-PAGE法獨 立交聯(lián)和分析所得的低聚物而使這些測量結(jié)果得到確認。申請人認為之 前的文獻報導低估了這些低聚物的尺寸，原因在于在SDS溶液中形成了 三聚物和四聚物以及在原子顯微鏡測量中掃描探針尖端忽略了流動的 多肽鏈碎片。例如，Chromy等人，Biochemistry 42: 12749-12760 (2003) 報導了由原子力顯微鏡(AFM)測量的小于10 nm的直徑和由SDS-PAGE 試驗確定的大部分為三聚物和四聚物的結(jié)合狀態(tài)。本發(fā)明的穩(wěn)定、可溶的A卩低聚物由于其高產(chǎn)率和穩(wěn)定性而適合用 作抗原。所述的低聚物在低濃度螺旋-誘導溶劑，例如5。/。的TFE溶液中 尤其穩(wěn)定。其它有機溶劑，例如二氯甲烷可能具有螺旋-誘導性質(zhì)，而且 可以用于低聚物的形成。通過在環(huán)狀二向色性儀器中滴定未結(jié)構(gòu)化的肽 可以單獨試驗其誘導螺旋結(jié)構(gòu)的傾向。一些不具有螺旋-誘導性質(zhì)的有機 溶劑，例如二曱基亞砜也非常適合在初始的單體貯存液中用于制備。而且由于A卩為自-抗原，因此產(chǎn)生具有下述性質(zhì)的低聚物是有利 的具有與天然的有毒的可擴散性低聚物類似的結(jié)構(gòu)，而且為了打破免 疫耐受性其應為高度致免疫性的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知結(jié)合為大的 集群的抗原通常更具有致免疫性(參見例如，Kovacsovics-Bankowski, M.等人，P腦.Natl. Acad. Sci. USA 90: 4942-4946 (1993))。結(jié)構(gòu)相關(guān)的、 穩(wěn)定、可溶的A卩低聚物的可利用性對于產(chǎn)生、選擇和定性控制治療性 單克隆抗體而言是有益的。這樣，本發(fā)明的穩(wěn)定、可溶的AP低聚物可 以給用于被動免疫法的抗原的研發(fā)提供改善的制劑，所述被動免疫法用 于治療AD和其它與異常的A卩聚集有關(guān)的疾病。本發(fā)明的一個實施方案包含直徑為10 nm-50 nm的穩(wěn)定、可溶的 A卩低聚物，其代表在試樣中為主要部分的均勻的群體。在優(yōu)選的實施 方案中，當在濃度高于100 ]iM, pH為7.5或更高和在二價陰離子存在 下形成時，本發(fā)明的可溶性A卩低聚物包含至少50%的肽抗原制劑。更 優(yōu)選，穩(wěn)定、可溶的A卩低聚物包含至少70%的肽抗原制劑，最優(yōu)選， 本發(fā)明的穩(wěn)定、可溶的AP低聚物包含至少90%的肽抗原制劑。應該注意，可溶性A卩低聚物的表觀尺寸可能不同于使用由探針尖 端檢測固體物質(zhì)的原子力顯微鏡(AFM)技術(shù)由動態(tài)光散射法確定的尺 寸。在這種情況中，由于假設尖端不能記錄松散懸浮在溶液中的肽末端 而導致所得的尺寸確定值可能低估了實際的低聚物尺寸。相反，當使用 動態(tài)光散射技術(shù)時，這些松散懸浮的末端對總散射系數(shù)產(chǎn)生主要影響， 并且趨于提高所得的流體動力學尺寸(K叩pel, D. E., J. Chem. Phvs. 37: 4814-4820 (1972))。未結(jié)構(gòu)化的低聚物外層的存在與報導的在原纖維中 肽的N-末端缺少結(jié)構(gòu)的情況相一致(Petkova等人，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 16742-16747(2002))。不希望受任何理論的限制，但是申請人認為本申請中描述的穩(wěn)定、 可溶的AP低聚物的性質(zhì)部分是由于在其制備和貯存過程中使用了相對 高的pH。 AP肽由六個負電荷氨基酸殘基(三個天冬氨酸殘基和三個谷氨 酸殘基)和六個潛在的正氨基酸殘基(一個精氨酸、 一個賴氨酸殘基、一 個末端氨基和三個組氨酸殘基)組成。在pH 6.5下具有^H爾電離常數(shù)pKi 的三個組氨酸殘基的存在在酸性和中性pH下趨于電離(成為正電性)，同 時在高的pH下維持中性(去質(zhì)子化)。三個組氨酸殘基的電離導致肽的凈 電荷為中性，而且由于缺少電荷排斥而導致加速結(jié)合。相反，組氨酸殘 基的去質(zhì)子化作用導致總共帶有三個負電荷，其使結(jié)合作用更具有選擇 性。結(jié)果，用于形成原纖維的大部分公開方案都建議使用低pH和低離 子強度，能夠使靜電相互作用最小化的條件。這樣，本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員應該認識到申請人在本方法中使用升高的pH來形成穩(wěn)定、可溶的A卩低聚物不同于制備原纖維的已知方法的教導。優(yōu)選在多價陰離子存在下形成和貯存本申請中描述的穩(wěn)定、可溶的 A卩低聚物。同樣，不希望受任何理論的限制，但是申請人認為該優(yōu)選情況可能與已知的AP對含有磷脂酰肌醇的脂質(zhì)膜，含有磷酸酯基團的 負電荷脂質(zhì)具有的親合力有關(guān)。多價陰離子的優(yōu)選存在可能還與A卩對 單唾液酰神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)具有的親合力有關(guān)。已知GM1在水溶液中集 合在膠束內(nèi)而形成含有帶負電荷的羧基的寡糖表面。通常，選擇磷酸鹽 離子作為多價陰離子。但是，由于已知的磷酸鹽離子與含有氫氧化鋁的 輔料，例如Merck鋁輔料的共價鍵合(Klein等人，J. Pharrn. Sci. 89: 311-321 (2000)),因此當使用含有氫氧化鋁的輔料作為部分抗原制劑 時，優(yōu)選使用硫酸鹽離子。從Ap能夠分配進入含有磷脂酰肌醇的膜或者進入GM1膠束內(nèi)的能 力可以顯而易見其具有兩性性質(zhì)。盡管提高了肽的濃度，其顯示出在沒 有TFE5存在下約100 濃度的肽仍保持單體形式。這種觀察結(jié)果與報 導的肽的類似表面活性劑的性質(zhì)相一致(Kim，J.和Lee,M., Biochem. Biophvs. Res. Commun. 31G(^: 393-7(2004)),正如所述的，申請人通過 將濃度提高至200 和更高而將該性質(zhì)用于實現(xiàn)穩(wěn)定、可溶的A(3低聚 物的高產(chǎn)率。相反，之前通過在100)iM濃度和生理pH(7.4)下使用更長 的反應時間(7天)來形成低聚物的嘗試只能導致生成過量的原纖維 (Stine， W.B.等人，J.Biol. Chem. 278: 11612-11622 (2003》。申請人還發(fā)現(xiàn)，在用介電常數(shù)顯著低于水的溶劑，例如甘油進行稀穩(wěn)定、可溶的Ap低聚物中,當需要在較低濃度下:用初始低聚物試樣 和使粒子的分解最小化時，本發(fā)明的這個方面可以用在涉及配體篩選的 試驗中。甘油的存在會導致在稀釋之后較高比例的低聚物保持在初始的 低聚狀態(tài)下，因此在結(jié)合試驗或?qū)嶒炛袝е赂叩挠H合力。人們認為用于制備穩(wěn)定、可溶的Ap低聚物的溫度也是很重要的， 因為升高的溫度已知可以加速聚集(Stine等人，J. Biol. Chem. 278: 11612-11622 (2003》。申請人發(fā)現(xiàn)可以使用2°C-8°C的溫度，從而可以使 原纖維的形成最小化。在本發(fā)明的一個實施方案中，制備穩(wěn)定的A(3低聚物時在37。C下使 用螺旋-誘導性有機溶劑來加速低聚物的形成，并通過使原纖維的形成最小化來使低聚物在貯存中保持穩(wěn)定。在這種實施方案中，所述方法使用TFE來促進單體肽至可溶性低聚物的轉(zhuǎn)化和使可溶性低聚物穩(wěn)定化。當 TFE的毒性不相關(guān)或者可以在與鋁輔料結(jié)合之后通過例如沉淀-傾析法 將其除去時優(yōu)選使用該方法來形成穩(wěn)定、可溶的AP低聚物。在不存在 這種穩(wěn)定化溶劑時，除了較高的pH和濃度之外，還需要使用低溫(2°0-『C)來實現(xiàn)最佳的穩(wěn)定性(最少7天)。此外，由于如其顯示的，本申請中的可溶性AP低聚物的穩(wěn)定性依 賴于濃度，因此化學交聯(lián)可以保護如此制得的低聚物使其免于發(fā)生因稀 釋而導致的分解。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，如用SDS處理的 試驗的，使用戊二醛來保護低聚物使其不發(fā)生分解。實施例 實施例1pH對可溶性Ap低聚物的形成和尺寸的影響除非另外說明，否則所有化學品和試劑都得自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。將A卩肽(1隱42) (A|342) (American peptide, Sunnyvale, CA)溶解在 100。/。的六氟異丙醇(HFIP)中，分成2 mg的等分試樣并裝入1.7 ml的聚 丙烯試管中，在真空和低溫下進行離心作用(CentriVap Concentrator, Labconco, Kansas City, MO)直至溶劑被蒸發(fā)掉。對干燥的膜進行保護使 其不受潮并在-70。C下貯存至使用。在室溫下達到平衡之后將100 )iL無 水二甲基亞砜(DMSO)加入到2 mg干燥膜中并通過用移液管重復抽吸而 溫和地進4亍混合，從而制得肽貯存液。貯存液在室溫下最多貯存2周。在pH為4.5-9.0之間的不同值的50 mM磷酸鈉緩沖液中制備A卩試 樣(IOO pM),并在4。C下培養(yǎng)3天。在工作臺式離心機(半徑7 cm)上于 7,000rpm下離心試樣3分鐘，以除去大的聚集物或原纖維，之后經(jīng)0.22 微米的過濾器(Millipore, Bedford, MA)除去對于尺寸-排阻柱而言太大的 顆粒。將10 jxl的各個濾液注入到尺寸排阻色譜(SEC)柱上。穩(wěn)定、可溶 的A卩低聚物的峰在約6.5 ml處洗脫，而單體峰在約9 ml處洗脫。使用利用 Waters Protein PAK 125 7.8 x 300 mm柱的 Alliance HPLC系統(tǒng)(Waters Corporation, Milford, MA)進行尺寸排阻色譜 法。操作緩沖液為50 mM的磷酸鈉，pH 9，以1 ml/mm的速度洗脫。注入的肽的最小量為25 pg。安裝光電二4 L管陣列UV一企測器在210和 350 nm之間;險測，分辨率為3.5 nm。不時地才僉查^[氐聚物和單體的譜圖 峰，用以確認峰的性質(zhì)。將整個UV讀數(shù)轉(zhuǎn)化為電子數(shù)據(jù)形式(Excel, Microsoft Corporation, Redmond, WA),將其中在230 nm處的UV吸收 率提取出來并相對于洗脫體積作圖。在一些情況中，使用內(nèi)裝函數(shù)和低 聚物分數(shù)對峰下的面積進行積分(即，在5 ml和7.5 ml之間洗脫的總物 質(zhì)的分數(shù))，并估算總的回收率。使用裝備了 IW 488 nm氬激光的Malvern 4700系統(tǒng)(Malvern Instruments, Southborough, MA),采用靜態(tài)和動態(tài)光散射分析法確定低聚 物的尺寸，之后在半徑為約4.5 cm的轉(zhuǎn)子上以40,000 r.p.m.的轉(zhuǎn)速進刊-15分鐘的離心作用(Beckman最佳超速離心機)，以除去直徑為約200 nm 的小(<5%)部分聚集物。通常，對來自5個測量過程的結(jié)果進行平均， 其中每次測量進行3分鐘。使用非線性最小二乘方擬合程序(Malvern Instruments)進4亍凄史才居分才斤。圖1A中顯示了對在不同pH水平下制備的可溶性低聚物試樣進行 高壓尺寸排阻色譜(HP-SEC)分析所得的結(jié)果。在pH 4.5和pH 6下進行 培養(yǎng)的試樣的峰下面積表明初始材料基本上都損失。在pH 6下培養(yǎng)的 試樣出現(xiàn)可見的混濁，通過溫和的離心并由0.22微米(220nm)過濾器過 濾除去大部分試樣。由于大部分物質(zhì)損失在離心和過濾步驟中，因此在 pH4.5下培養(yǎng)的試樣表現(xiàn)為澄清透明，但是卻形成相當大的原纖維/聚集 物。在高于7.0的pH下進行培養(yǎng)的兩個試樣均顯示已被完全回收而且 大部分物質(zhì)以低聚物形式存在。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，將pH保 持在高于8的水平上用以對低聚速率進行控制。由于較高比例的材料發(fā) 生進一步結(jié)合和未從HP-SEC柱(未示出)上洗脫下來，因此得出判斷使 用pH為7.4, 50 mM的磷酸鈉緩沖液在2°C-8°C下形成和貯存低聚物會 產(chǎn)生較低的貯存穩(wěn)定性。為了確定如此形成的AP低聚物的尺寸，申請人對試樣進行動態(tài)光 散射分析。非線性最小二乘方(NLLS)分析法表明大部分物質(zhì)以直徑為約 20 nm的形式存在，少量(少于5 %)以非常大的顆粒(直徑約200nm)形式 存在。由于散射光的強度與散射顆粒的分子量成正比，而且較大粒子， 即估計其Mw超過1百萬Da的粒子構(gòu)成總散光強度的約50%,因此申 請人使用離心步驟除去較大粒子。在半徑為4.5 cm的轉(zhuǎn)子上于40,000rpm下離心15分鐘足以除去大部分大粒子(約200 nm)。根據(jù)在275 nm 處的UV吸收率(數(shù)據(jù)未示出)判斷，該離心步驟中的總質(zhì)量損失約為 3%。在pH 9下制備的離心A卩低聚物試樣的光散射分析結(jié)果和在450 liiM下測量的結(jié)果在表IB中示出。通過對散射光的波動進行分析可以確 定散射系數(shù)，并因此可以確定流體動力學直徑分布。使用非線性最小二 乘方擬合后發(fā)現(xiàn)主要的可溶性A卩低聚物的直徑為18.9 nm +/- 0.3 nm。 之前在使用標準方案形成的低聚物(數(shù)據(jù)未示出)中得到了基本相同的結(jié) 果D「21.4nm +/- 0.7 nm。實施例2二價陰離子對可溶性A卩低聚物的形成的影響。該實施例顯示緩沖組分的價態(tài)對AP低聚物的形成的影響。在50 mM的濃度下制備緩沖液，并使用1 M鹽酸或氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)至 9.0。在4。C下將220 pM試樣培養(yǎng)過夜并用HP-SEC進行分析。分別對6 和8分鐘之間與8和9.5分鐘之間的峰進行整合從而得到低聚物和單體 的峰面積。所有情況下均使用鈉作為陽離子。對220 的、在4。C下培養(yǎng)了整夜的可溶性Ap低聚物制劑進行 HP-SEC分析，其結(jié)果如圖2所示。含有多價陰離子(磷酸鹽和檸檬酸鹽) 的制劑與在單價離子(Tris和硼酸鹽)存在下制得的制劑相比，其可溶性 A卩低聚物的比例顯著提高。實施例3A卩濃度對可溶性Ap低聚物的形成的影響。該實施例顯示A卩濃度對可溶性Ap低聚物的形成的影響。按照不 同比例將100% DMSO中的A卩的20 mg/ml貯存液溶解在50 mM磷酸鈉 中，并在4。C下培養(yǎng)過夜。進行HP-SEC分析，用可溶性A(3低聚物的總 面積除以單體和低聚物峰之和的總面積。在4。C下額外培養(yǎng)3天后也對 高濃度試樣進行了試驗。圖3顯示提高A卩濃度導致可溶性A卩低聚物的比例升高。對于高 濃度試樣而言，經(jīng)過整夜培養(yǎng)之后形成過程近于完全。此外，當約90% 的肽轉(zhuǎn)變?yōu)榈途畚镔|(zhì)時，增加的濃度所產(chǎn)生的作用似乎飽和。這說明肽具有溶解度極限，這與表面活性劑的臨界膠束濃度(cmc)類似。 實施例4可溶性AP低聚物的穩(wěn)定性該實施例顯示在4。C下貯存1天和4天之后從HP-SEC柱中回收可 溶性AP低聚物。對總的AP峰面積進行積分并相對于^^稱濃度作圖。實施例3中描述的試驗還用于估計制劑在4。C下被培養(yǎng)之后的穩(wěn)定 性。圖4顯示經(jīng)過整夜和4天的培養(yǎng)之后不同濃度下的總峰面積。根據(jù) UV檢測法的判斷，由HP-SEC柱中回收的物質(zhì)的總量在1 -4天之間沒 有變化，這說明這些制劑在貯存中是穩(wěn)定的。實施例5溫度和賦型劑對可溶性A卩低聚物的形成的影響。該實施例顯示溫度和賦型劑對可溶性A|3低聚物的形成的影響。在 100 ^M濃度下制備試樣，用HP-SEC試驗，之后對峰進行積分。在37 。C(圖5A)和4。C(圖5B)下評價試樣。除非另外說明，否則緩沖液為50 mM 的磷酸鈉。從圖5A中可以看出，除了含有40%甘油的情況之外，在于37。C下 培養(yǎng)的試樣中觀察到不良回收。由相應的4。C的試樣考察可溶性A卩低對照試樣相比)。不希'望受任何理論的限制，;旦是在已經(jīng)形成低聚物之后再加入甘油時，該抑制作用可能成為觀察到的穩(wěn)定化作用的基礎(chǔ)。此 外，二價陰離子(磷酸鹽和硫酸鹽)以及丙二醇的存在似乎促進可溶性A卩 低聚物的形成。還顯示4'C下可溶性Ap低聚物的形成發(fā)生在實用的動 力學范圍內(nèi)，其與在之前的試驗中觀察到的穩(wěn)定性相一致(實施例3和 4)。此外，由于注意到與表面活性劑的性質(zhì)相比，可溶性A卩低聚物在 溶解時發(fā)生部分分解，因此對介電常數(shù)低得多的惰性賦型劑進行試驗以 建立其對可溶性AP低聚物的穩(wěn)定性的影響。如從圖5A中看出的，40% 甘油在37。C下顯示這種穩(wěn)定化作用。實施例6甘油對可溶性A(3低聚物在稀釋溶液中的穩(wěn)定性的影響該實施例顯示在40%甘油的存在下對于在440 pM濃度下制備并在 50mM、 pH為9的磷酸鈉緩沖液內(nèi)稀釋4倍的可溶性AP低聚物的分解 的抑制(圖6)。相同的但配制時未加入甘油的試樣作為對照。在將試樣 注入到HP-SEC柱之前在4。C下將試樣培養(yǎng)過夜。在含有甘油的試樣中 觀察到更高比例的低聚物。實施例7化學交聯(lián)對可溶性AP低聚物的穩(wěn)定化作用該實施例顯示對可溶性Ap低聚物進行交聯(lián)所必須的戊二醛濃度。 與在最佳條件下形成的低聚物相關(guān)聯(lián)的一個潛在問題是其在稀釋時發(fā) 生分解。另一方面，大范圍的化學改性通常導致生物活性的損失。該實 施例顯示用于分析目的(相對高的戊二醛濃度，生物活性發(fā)生損失)和用 于制備用在生物學試驗中的物質(zhì)(相對低的戊二醛濃度，生物活性得以保 持)時用于交聯(lián)低聚物的交聯(lián)試劑的最佳濃度。用戊二醛交聯(lián)可溶性AP低聚物，在室溫下培養(yǎng)10分鐘，之后用 1M甘氨酸、pH 7.5的1M Tns-HCl淬滅。然后在Tris-甘氨酸SDS試樣 緩沖液中將交聯(lián)試樣稀釋至最終濃度0.02|ig/^iL。為了進行分析，使用 4%-20%的Tris-甘氨酸凝膠(Invitrogen, Carlsbad, CA)用電泳法在125 V 下將0.28昭單體或低聚形式的AP(公稱濃度)分離約100分鐘。然后用銀 對凝膠著色以顯像可溶性A卩低聚物的尺寸分布。為了最優(yōu)化戊二醛的 濃度，將HFIP-干燥的A|342或HFIP-干燥的Ap4Q溶解在DMSO (20 mg/mL, 4.4mM)中，加入到50 mM pH 9.0的磷酸鹽中，達到最終濃度 1.8 mg/mL (400 ^M),并在4。C下避光培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)過夜之后，使36 ng 的A卩蛋白與0-0.5%的不同濃度的戊二醛交聯(lián)。下圖7中顯示的銀著色的凝膠代表從該試驗中得到的數(shù)據(jù)。結(jié)果表 明0.1%的戊二醛足以使在4。C下培養(yǎng)過夜而形成的可溶性AP"低聚物 交聯(lián)。在0.01和0.05%濃度的戊二醛下，在軌跡2和3中可以看到少 量的二聚物(8 kDa)。軌跡5-10表明在50 mM磷酸鹽，pH 9.0下于4°C 下培養(yǎng)24小時的過程中A(34o主要保持單體形式，沒有形成低聚物。在 17 kDa范圍內(nèi)看到的帶代表SDS處理的產(chǎn)品，其在加入SDS之前不存 在；如果其開始，即在加入SDS之前就存在于試樣中，則其將已經(jīng)發(fā)生 交聯(lián)。因此，可溶性AP低聚物的分子量應在150 kDa范圍內(nèi)，其與認為分子量在20 kDa范圍內(nèi)的本領(lǐng)域的一致意見相反。作為該實施例的結(jié)果，申請人得出結(jié)論該方法可以有效監(jiān)測可溶'f生 A卩低聚物制劑的形成并且可以確定其尺寸分布。實施例8可溶性A(3低聚物在50mM磷酸鹽，pH 9.0下的穩(wěn)定性如實施例l-4中所示，在于2-8。C下進行貯存的過程中，A卩42在50 mM磷酸鹽，pH 9.0的緩沖液中形成可溶性A卩低聚物。但是，并未確 定形成的最佳濃度、生物活性和這些低聚物質(zhì)在貯存過程中的貯存穩(wěn)定 性。如實施例7中所述，研發(fā)了一種方法，其中為了進行分析使用0.1% 的戊二醛交聯(lián)A卩42低聚物質(zhì)。在SDS存在下這些交聯(lián)后的物質(zhì)并未分 解，因此采用SDS-PAGE可以確定適當?shù)牧６确植?。在該實施例中，?上所述在50 mM磷酸鹽，pH9.0的緩沖液中制備lmM、 850|iM、 650|iM、 450|iM、 250pM和lOO^M的Ap42。在4。C下培養(yǎng)1、 4和7天之后，用 0.5%的戊二醛交聯(lián)試樣，或者采用等當量的水作為非交聯(lián)對照，之后采 用SDS-PAGE按照實施例7中的描述進行分離。如圖8所示，在八(342濃度為1 mM時，如在圖8A,軌跡2中所觀 察到的，在4。C下培養(yǎng)一天后形成可溶性A卩低聚物(為約150 kDa,下 文中稱作"150kDa物質(zhì)"，相當于35-mers和更高)。在4。C下貯存4 天和7天后，該物質(zhì)的量減少并觀察到更高分子量的物質(zhì)(圖8A,軌跡 3和4)。針對850 pM和650 )iM的八|342原濃度觀察到類似的圖案(分別 為圖8B的軌跡2、 3、 4、 7、 8和9)，但是在貯存期間1500kDa物質(zhì)的 相對量逐漸減少。但是，使用450 ^M的A卩42原濃度時，在4。C下的七 天的貯存過程中150kDa物質(zhì)的量保持一致，并且觀察到很少或者未觀 察到更高分子量的物質(zhì)(圖8C，軌跡2、 3和4)。最后，250 |xM和100 pM 的A&2原濃度產(chǎn)生的物質(zhì)在4'C下貯存1天后仍舊主要為單體(約 4kDa)，只形成很少的150kDa物質(zhì)(圖8D,軌跡2和7)。在4。C下再貯 存一段時間，150 kDa物質(zhì)的量不增加，而單體的表觀量似乎降低(圖 8D,軌跡3、 4、 8和9)。這i兌明A(342肽隨時間降解?；谶@些結(jié)果， 申請人:得出結(jié)論原濃度為450 的六(342在50 mM磷酸鹽，pH 9.0的緩 沖液中形成相對穩(wěn)定的低聚物質(zhì)，其在4。C下可以貯存7天。除了實施 例9中提供的MTT試驗數(shù)據(jù)之外，該數(shù)據(jù)也可以支持使用50mM磷酸鹽，pH 9.0的緩沖液中的450^M A卩42貯存液作為相對穩(wěn)定的、生物活 性的可溶性AP低聚物。實施例9對于可溶性A卩低聚物的毒性的評價之前HP-SEC已經(jīng)顯示(實施例l-4)A卩42在50 mM磷酸鹽，pH 9.0 的緩沖液中形成可溶性AP低聚物。這些可溶性AP低聚物在PC-12 MTT (3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-四唑溴化物)還原試驗(實施例 10)中還顯示出生物活性。然而Ap42形成這些物質(zhì)的臨界濃度和/或提供 最大細胞生物活性的臨界濃度還是未知的。因此，通過研究來確定適合 這兩種情況的A卩"貯存液。將PC-12細胞放置在30,000細胞/孔的板上并使其在37°C/5% C02 下生長過^ ^。以1 jiM和5 pM的濃度將可溶性AP j氐聚物或載體加入到 細胞中。在37°C/5% C02下培養(yǎng)4小時之后進行MTT還原試驗(Lambert 等人，2001, J. Neu腦hem. 79, 595-605)。筒言之，將MTT (10 ^L, 5 mg/mL) 加入到每個孔中并培養(yǎng)4小時。加入增溶緩沖液(100pL, 0.01NHC1中 的10% SDS)并在37°C/5% C02下將板培養(yǎng)過夜。然后，在Tecan Spectrafluor Plus讀板器(Tecan Systems, San Jose, CA)上在595 nm處定 量確定試驗。在該試驗中，按照實施例8中的描述，制備50mM磷酸鹽，pH9.0 的緩沖液中的1 mM、 850 |iM、 650 pM、 450 |aM、 250 和lOO)iM濃 度的Ap42。在4。C下培養(yǎng)7天后，通過MTT試一險4全測試^r以確定生物 活性。圖9顯示了在1 pM和5 的^^稱濃度下試驗這些試樣所得的結(jié) 果。該結(jié)果表明A卩42在450 pM- 650 ^iM的原濃度下生物活性很高。在 5pM的試驗濃度下，這些原濃度顯示MTT降低約55%。相反，原濃度 低于450 ^M和高于650 |iM時顯示出很低的生物活性，在PC-12細胞中 顯示MTT降低80-105%。基于這些結(jié)果，申請人得出結(jié)論原濃度為450 pM- 650 ^M的A卩42在50 mM石粦酸鹽，pH 9.0的緩沖液中形成的可溶 性AP低聚物在2-8t:下貯存達7天仍保持生物活性。實施例10穩(wěn)定、可溶的AP低聚物的制備將A卩肽(1-42) (A卩42) (American peptide, Sunnyvale, CA)溶解在 1000/。的六氟異丙醇(HFIP)中，分成2 mg的等分試樣并裝入1.7 ml的聚 丙烯試管中，在真空和低溫下進行離心作用(CentriVap⑧Concentrator, Labconco, Kansas City, MO)直至溶劑一皮蒸發(fā)掉。對干燥膜進行保護l吏其 不受潮并在-7(TC下貯存至使用。在室溫下達到平衡之后將100 pL無水 二曱基亞砜(DMSO)加入到2 mg干燥膜中并通過用移液管重復抽吸而溫 和地進行混合，從而制得肽貯存液。貯存液在室溫下最多貯存2周。按照不同比例將A(3貯存液加入到50 mM磷酸鈉中，pH為9，同時 在室溫下進行渦流以獲得最終的400和700 pM之間的肽濃度。將試樣 轉(zhuǎn)移至2-8。C下，而且在使用前至少貯存1天。實施例11穩(wěn)定、可溶的AP低聚物抗原的制備除了使用50 mM的硫酸鈉代替磷酸鈉之外，按照實施例8中的描 述制備穩(wěn)定、可溶的低聚物。加入少量單價援沖液(例如，10 mM Tris) 以維持pH高于8.0。在2-8。C下培養(yǎng)過夜之后，將低聚物試樣加入到 Merck鋁輔津十中，同時在渦流下混合。通過離心試4羊而將最終的緩沖液 引入到明礬顆粒中，交換上清液并將抗原-明礬絡合物重新懸浮在渦流 中。任選地，還可以引入非-明礬輔料。任選地，為了使與明礬的結(jié)合最 小化可以使用磷酸鋁或磷酸鈉-預制(prepated)的低聚物。實施例12將抗原-明礬絡合物注入到動物體內(nèi)，優(yōu)選以重復的方式進4亍。處死 動物，將脾細胞與骨髓瘤細胞混合并進行融合。然后對這些融合的雜交 細胞進行培養(yǎng)，對從這些培養(yǎng)物中收集的上清夜進行篩分以確定抗-低聚 物抗體的存在。繁殖陽性克隆體以制備單克隆抗體。可選地，在96-孔板上固定A(3低聚物，篩選抗菌素庫以確定識別 A卩低聚抗原的能力。繁殖陽性抗菌素物質(zhì)并用于抗體的制備。
權(quán)利要求
1、一種制備穩(wěn)定、可溶的淀粉狀蛋白β(Aβ)低聚物的方法，包括(a)得到在有機溶劑中的Aβ肽的濃縮貯存液；和(b)將所述肽的濃縮貯存液加入到具有至少10mM二價陰離子而且pH被緩沖至至少7.5的水溶液中，以形成最終的肽濃度超過100μM的反應混合物；其中穩(wěn)定、可溶的Aβ低聚物是經(jīng)放置而在步驟(b)的反應混合物中形成的，而且其包含至少50％的所述反應混合物。
2、 權(quán)利要求l的方法，其進一步包括在2。C-8。C的溫度下培養(yǎng)步驟(b)的反應混合物。
3、 權(quán)利要求1的方法，其進一步包括通過尺寸排阻色譜分離步驟(b) 的反應混合物以制備洗脫的低聚部分，和從洗脫的低聚部分中回收所述 穩(wěn)定、可溶的AP低聚物。
4、 權(quán)利要求1的方法 ,其進一步包括向步驟(b)的水溶液中加入螺旋誘導性有機溶劑。
5、 權(quán)利要求1的方法，其中貯存液的A卩濃度為200 pM-900 pM。
6、 權(quán)利要求1的方法， 其中反應混合物的pH為7.5-11.0。
7、 權(quán)利要求1的方法 離子 ，其中二價陰離子選自磷酸鹽離子和硫酸鹽。
8、 權(quán)利要求4的方法,其中螺旋誘導性賦型劑為2%-15%的三氟 乙醇。
9、 由權(quán)利要求1的方法制備的穩(wěn)定、可溶的Ap低聚物。
10、 權(quán)利要求9的穩(wěn)定、可溶的A卩低聚物，其在5%-50%甘油的 存在下貯存。
11、 粒度為10nm-100nm直徑的權(quán)利要求9的低聚物。
12、 分子量為100 kDa-500 kDa的權(quán)利要求9的低聚物。
13、 分離的、穩(wěn)定、可溶的A卩低聚物制劑，其中所述低聚物制劑 包含由動態(tài)光散射技術(shù)測量的直徑尺寸為10-100 nm的顆粒。
14、 分子量為100 kDa-500 kDa的權(quán)利要求13的低聚物。
15、 一種制備穩(wěn)定、可溶的淀粉狀蛋白P(Ap)低聚物的方法，包括(a) 得到在有機溶劑中的AP肽的濃縮貯存液；(b) 將所述肽的濃縮貯存液加入到具有至少IO mM二價陰離子而且pH被緩沖至至少7.5的水溶液中，以形成最終的肽濃度超過100 pM的反 應混合物；和(c)對在步驟(b)的反應混合物中形成的穩(wěn)定、可溶的Ap低聚物和輔料一起進行配制；其中穩(wěn)定、可溶的AP低聚物包含至少50。/。的所述步驟(b)的反應混合物。
16、 利要求15的方法，其進一步包括在2。C-8。C的溫度下培養(yǎng)步 驟(b)的反應混合物。
17、 權(quán)利要求15的方法，其進一步包括通過尺寸排阻色譜分離步 驟(b)的反應混合物以制備洗脫的低聚部分，和從洗脫的低聚部分中回收 所述的穩(wěn)定、可溶的AP低聚物。
18、 權(quán)利要求15的方法，其進一步包括將螺旋誘導性有機溶劑加 入到步驟(b)的水溶液中。
19、 權(quán)利要求18的方法，其中螺旋誘導性賦型劑為2%-15%的三氟 乙醇。
20、 由權(quán)利要求15的方法制備的穩(wěn)定、可溶的AP低聚物。
21、 權(quán)利要求20的穩(wěn)定、可溶的A卩低聚物，其在5%-50%甘油的 存在下貯存。
22、 粒度為10 nm-100 nm直徑的權(quán)利要求20的低聚物。
23、 分子量為100 kDa-500 kDa的權(quán)利要求20的低聚物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備穩(wěn)定、可溶的淀粉狀蛋白β(Aβ)低聚物的方法及其組合物，其用作抗原，其中所述抗原用于產(chǎn)生治療阿爾茨海默氏病和其它與淀粉狀蛋白β的異常聚集有關(guān)的病癥的抗體。該方法使用超過7.0的pH和高的Aβ濃度，所述方法任選包括使用二價陰離子或螺旋-誘導性溶劑來形成低聚物。用動態(tài)光散射技術(shù)測量時，由本申請的方法制備的Aβ低聚物具有直徑為10-100nm的粒度，和100-500kDa的分子量。
文檔編號C07K14/47GK101218248SQ200680023669
公開日2008年7月9日 申請日期2006年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月30日
發(fā)明者D·納夫羅茨基, D·蒂里奧特, H·馬赫, R·埃文斯 申請人:默克公司