專利名稱：一種以氨基酸短肽為配體的模擬sod化合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以氨基酸短肽為配體的模擬SOD化合物及其制備方法，特別涉及天冬氨酸短肽為配體的模擬SOD化合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
SOD(超氧化物歧化酶)對(duì)人類具有抗疲勞、抗輻射、抗衰老、增加免疫力以及預(yù)防腫瘤和癌癥的功效，原因在于其能清除對(duì)生物體有害的、過量的超氧陰離子自由基(·O2-)。然而天然SOD的提取、分離、純化手續(xù)復(fù)雜價(jià)格高昂，而且其分子量很大，例如CuZn-SOD的分子量為35000，不易滲過細(xì)胞膜，在生物體內(nèi)存活期短等，從而難以得到廣泛應(yīng)用。為了彌補(bǔ)天然SOD的不足，開始合成模擬SOD化合物。中國專利CN1465697A中公開了以聚琥珀酰亞胺為原料，經(jīng)氨水水解后用硫酸錳與其反應(yīng)而得到聚天冬氨酸錳，但其產(chǎn)率較低僅為60％。并且模擬SOD化合物還存在著下述缺點(diǎn)模擬SOD化合物的生物活性普遍低于天然SOD；而且其活性的穩(wěn)定性和催化專一性也不是很好，在生物的PH條件下比較容易分解；此外有些模擬SOD化合物還具有一定的毒性，例如一些氨基酸為配體的Cu-SOD屬于低毒或中等毒性物質(zhì)，顯然不適于人體或某些動(dòng)物體上的應(yīng)用，這樣就大大限制了模擬SOD化合物的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種以氨基酸短肽為配體的模擬SOD化合物。
上述的模擬SOD化合物具有以下化學(xué)式 通式(I)中的M選自Mn、Mg或其他過渡金屬元素中的一種，優(yōu)選的，M選自Mn、Fe、Ni、Zn或Mg中的一種，更優(yōu)選的M為Mn；n是短肽聚合物的結(jié)構(gòu)單元數(shù)，一般控制其為5～7，這樣可以使得上述短肽聚合物分子量控制在2000左右；X是水分子數(shù)，根據(jù)反應(yīng)條件的不同而會(huì)略有差異，一般X為0～2。
所指的氨基酸短肽可以是天冬氨酸短肽，但不僅限于此，也可以是其他氨基酸短肽，或二種及以上多種氨基酸短肽的共聚物。
本發(fā)明還提供了一種上述模擬SOD化合物的制備方法，該方法包括以下步驟(1)第一階段，制備氨基酸螯合物純品將L-天冬氨酸或D，L-天冬氨酸中的一種和金屬化合物按2.0∶0.8～2.0∶1.5的摩爾比，在水溶液中于40～100℃反應(yīng)2.0～8.0小時(shí)后進(jìn)行提純處理；(2)第二階段，制成短肽為配體的模擬SOD化合物將來自步驟(1)的提純后產(chǎn)物于160～260℃再縮聚反應(yīng)2.0～10.0小時(shí)，即得到白色或淺棕色模擬SOD化合物。
上述的金屬化合物可以選自二氧化錳、氧化亞錳、硫酸錳、氯化錳、碳酸錳中的一種或選自鐵、鎳、鋅、鎂的類似化合物的一種。
本發(fā)明還提供了一種上述模擬SOD化合物的制備方法，該方法包括將天冬氨酸金屬螯合物于160～260℃縮聚反應(yīng)2.0～10.0小時(shí)，即得到白色或淺棕色模擬SOD化合物。優(yōu)選的，天冬氨酸金屬螯合物為天冬氨酸錳。
本發(fā)明還提供了一種上述模擬SOD化合物的應(yīng)用，本發(fā)明將濃度為0.1～10mg/kg模擬SOD化合物水溶液。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，并對(duì)下述實(shí)施例的產(chǎn)物進(jìn)行了元素分析、分子量測(cè)定、紅外光譜測(cè)定以及活性測(cè)定，并對(duì)實(shí)施例5的產(chǎn)物進(jìn)行了穩(wěn)定性測(cè)定。其中利用了Flash EA 1112型元素分析儀進(jìn)行了元素分析采用了美國Waters公司凝膠滲透色譜儀進(jìn)行了分子量測(cè)定，該色譜儀的色譜柱ultrahydrogel linear 6～13μm(7.8×300mm)GPC column，泵515HPLC pump，檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器-717Autosample；采用了Nicolet-210FTIR進(jìn)行紅外光譜測(cè)定。
實(shí)施例1稱取天冬氨酸錳30.0g，倒入裝有120ml蒸餾水的250ml三角瓶中，在80℃下攪拌至完全溶解成透明溶液，經(jīng)適當(dāng)精制處理后，在180～205℃進(jìn)行縮聚反應(yīng)4～5h。最終形成白色粉末狀固體。產(chǎn)率93.92％。
CH N
元素分析(％)計(jì)算值30.113.798.78實(shí)測(cè)值29.754.158.69生物活性測(cè)定(氯化NBT法) (見表1，2)紅外光譜測(cè)定3151～3424cm-1強(qiáng)吸收(-NH伸縮振動(dòng)，氫鍵)1579.63cm-1強(qiáng)吸收(酰胺C＝O，-NH變形振動(dòng))1395.78cm-1(-COO-伸縮振動(dòng))凝膠色譜分析重均分子量MW＝1906實(shí)施例2稱取L-天冬氨酸60.0g，倒入裝有240ml蒸餾水的已預(yù)熱至60℃的500ml三口瓶中，攪拌，升溫至85℃，加入氧化亞錳18.81g，保溫反應(yīng)4.5小時(shí)，物料呈淡紅色，PH＝6.8。經(jīng)適當(dāng)精制處理后，在180～210℃進(jìn)行縮聚反應(yīng)5.5h，得白色粉末狀固體。產(chǎn)率90.78％。
C H N元素分析(％)計(jì)算值30.113.798.78實(shí)測(cè)值30.033.978.74生物活性測(cè)定(氯化NBT法)(見表1，2)紅外光譜測(cè)定3134～3424cm-1強(qiáng)吸收(-NH伸縮振動(dòng)，H鍵)1585.30cm-1強(qiáng)吸收(酰胺C＝O，-NH變形振動(dòng))1400.41cm-1(-COO-伸縮振動(dòng))凝膠色譜分析重均分子量MW＝1726實(shí)施例3稱取L-天冬氨酸27.0g，倒入裝有200ml蒸餾水的1L三口瓶中，升溫至80～90℃，分批加入11.7g碳酸錳在90℃保溫，反應(yīng)4～5h，經(jīng)適當(dāng)精制處理后，為透明液體，在180～220℃縮聚反應(yīng)3～5h，得淺黃色粉末狀固體。產(chǎn)率93.03％。
C H N元素分析(％)計(jì)算值33.922.839.90實(shí)測(cè)值33.123.249.31生物活性測(cè)定(氯化NBT法)(見表1，2)紅外光譜測(cè)定3265～3419cm-1強(qiáng)吸收(-NH伸縮振動(dòng)，H鍵)
1587.76cm-1 強(qiáng)吸收(酰胺C＝O，-NH變形振動(dòng))1402.20cm-1 (-COO-伸縮振動(dòng))1713.46cm-1 (酰亞胺基峰)凝膠色譜分析 重均分子量MW＝2480實(shí)施例4 (放大試驗(yàn))稱取L-天冬氨酸270g，倒入裝有1200ml蒸餾水的3L三口瓶中，升溫至80～90C，分批加入117g碳酸錳，在90℃保溫，反應(yīng)4～5h，經(jīng)適當(dāng)精制處理后，為透明液體，在180～220℃縮聚反應(yīng)3～5h，得淺黃色粉末狀固體。產(chǎn)率95.36％。
C H N元素分析(％)計(jì)算值33.922.839.90實(shí)測(cè)值33.123.429.77生物活性測(cè)定 (氯化NBT法)(見表1，2)紅外光譜測(cè)定3276.81cm-1 強(qiáng)吸收(-NH伸縮振動(dòng)，H鍵)1587.07cm-1 強(qiáng)吸收(酰胺C＝O，-NH變形振動(dòng))1400.97cm-1(-COO-伸縮振動(dòng))1717.60cm-1 (酰亞胺基峰)凝膠色譜分析 重均分子量MW＝2360實(shí)施例5(放大試驗(yàn))稱取天冬氨酸錳400.0g，倒入裝有1600ml蒸餾水，已予熱至60℃的3000ml三口瓶中，攪拌、升溫至80℃，保溫、攪拌至物料完全溶解成透明溶液，經(jīng)適當(dāng)精制處理后，在180～195℃縮聚反應(yīng)5.5h，得白色粉末狀固體。產(chǎn)率96.06％。
CH N元素分析(％)計(jì)算值30.113.798.78實(shí)測(cè)值30.293.958.89生物活性測(cè)定 (氯化NBT法)(見表1，2)紅外光譜測(cè)定 3148～3424cm-1強(qiáng)吸收(-NH伸縮振動(dòng)，H鍵)1588.17cm-1 強(qiáng)吸收(酰胺C＝O，-NH變形振動(dòng))1396.81cm-1 (-COO-伸縮振動(dòng))
凝膠色譜分析重均分子量MW＝1900采用了氮藍(lán)四唑(NBT)光照法對(duì)上述實(shí)施例中模擬SOD的活性進(jìn)行了測(cè)定，所用儀器為UV--4802型(UNICO)可控溫紫外可見光分光光度計(jì)。
按照農(nóng)業(yè)上應(yīng)用的模擬SOD濃度1～10(mg/kg)測(cè)定其抑制超氧陰離子自由基(·O2-)歧化反應(yīng)的結(jié)果，計(jì)算出了模擬SOD的抑制率和活力。同時(shí)與天然SOD作了對(duì)照，由表1可知，在實(shí)際使用濃度范圍內(nèi)，模擬SOD與天然SOD的抑制率相近，由表2可知模擬SOD活性達(dá)到天然SOD活性50～70％的水平。
表1天然SOD和模擬SOD對(duì)超氧陰離子自由基的抑制率

注上表中是對(duì)每一測(cè)定樣均同時(shí)稱取三份試樣作平行測(cè)定，取其算術(shù)平均值為結(jié)果。
表2天然SOD與模擬SOD的比活力

上表中的活力為每毫克組織蛋白或模擬物在1ml反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50％時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力(U/mg prot)。
此外，還對(duì)實(shí)施例5中的模擬SOD化合物進(jìn)行了穩(wěn)定性測(cè)試。為了獲得活力穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，對(duì)1份制備完畢的模擬SOD立即測(cè)定活性，并快速將另一份試樣封存于密閉塑料袋中，在常溫常壓條件下貯存3個(gè)月，然后重新測(cè)定其抑制率(見表3)。由表3可知，密閉、常溫常壓貯存3個(gè)月再進(jìn)行抑制率測(cè)定結(jié)果在允許誤差之內(nèi)。
表3模擬SOD穩(wěn)定性

實(shí)施例6(有關(guān)本發(fā)明模擬SOD化合物在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用)采用實(shí)施例5所制備出模擬Mn-SOD化合物，將其制備成濃度30％溶液，稀釋至0.1～10mg/kg Mn-SOD制劑的水溶液，然后對(duì)棉花苗期及生長期進(jìn)行澆灌和噴施，與對(duì)照組相比，其結(jié)果如下棉花試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)5畝棉田用上述Mn-SOD制劑先后噴施4次，第一次噴施是在棉苗長到10cm時(shí)，第二次苗長到50～80cm時(shí)，第三次是在棉花現(xiàn)蕾期，第四次是在棉花花鈴期，與2畝對(duì)照組相比較，其管理、土壤、底肥、追肥條件都相同。
噴施澆灌過Mn-SOD制劑的棉田對(duì)棉花枯萎病、黃萎病具有防治作用，沒有一株棉花死亡，而沒噴施澆灌Mn-SOD制劑的有1/3發(fā)生枯萎病、黃萎病，棉苗死亡。

從上述實(shí)施例來看產(chǎn)品經(jīng)元素分析證實(shí)，其組成與通式(1)相符；經(jīng)氯化NBT法測(cè)定其生物活性，活力達(dá)到2000U/mg prot以上，與天然SOD相比，可達(dá)到天然SOD活性的50～70％；經(jīng)凝膠色譜測(cè)定可知，其分子量在1700至2500之間；經(jīng)紅外光譜和核磁共振測(cè)試結(jié)果證實(shí)，產(chǎn)物分子鏈上確實(shí)存在相當(dāng)數(shù)量的肽鍵；經(jīng)北京疾病預(yù)防與控制中心毒理學(xué)試驗(yàn)證實(shí)(No.L0328號(hào)檢測(cè)報(bào)告)，急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)LD50》5000mg/kgBW，本發(fā)明的模擬Mn-SOD化合物急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定為微毒。
本發(fā)明的模擬SOD化合物的生物活性較高，活性的穩(wěn)定性較好，至少在三個(gè)月之內(nèi)抑制率可以維持不變；分子量較低(2500以下)，有利于透過生物體細(xì)胞膜；并且以天冬氨酸短肽為配體從而在分子鏈上保留一定數(shù)量憎水性基團(tuán)，增強(qiáng)了其脂溶性；此外本發(fā)明的模擬Mn-SOD化合物屬于微毒，因此本發(fā)明的模擬SOD化合物具有廣泛的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.一種以氨基酸短肽為配體的模擬SOD化合物，其特征在于所述的模擬SOD化合物具有以下化學(xué)式其中， M選自Mn、Mg或其他過渡金屬元素中的一種；X為0～2；n為5～7。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的模擬SOD化合物，其特征在于M選自Mn、Fe、Ni、Zn或Mg中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的模擬SOD化合物，其特征在于M為Mn。
4.一種制備權(quán)利要求1所述的模擬SOD化合物的方法，包括以下步驟(1)第一階段，制備氨基酸螯合物將L-天冬氨酸或D，L-天冬氨酸中的一種和金屬化合物按2.0∶0.8～2.0∶1.5的摩爾比，在水溶液中于40～100℃反應(yīng)2.0～8.0小時(shí)后進(jìn)行提純處理；(2)第二階段，制成短肽為配體的模擬SOD化合物將來自步驟(1)的提純后產(chǎn)物于160～260℃再縮聚反應(yīng)2.0～10.0小時(shí)，即得到白色或淺棕色模擬SOD化合物。
5.按照權(quán)利要求4所述的方法，其中所述金屬化合物選自二氧化錳、氧化亞錳、硫酸錳、氯化錳、碳酸錳中的一種或選自鐵、鎳、鋅、鎂的類似化合物的一種。
6.一種制備權(quán)利要求1所述的模擬SOD化合物的方法，所述方法包括將天冬氨酸金屬螯合物于160～260℃縮聚反應(yīng)2.0～10.0小時(shí)，即得到白色或淺棕色模擬SOD化合物。
7.按照權(quán)利要求6所述的方法，其中所述天冬氨酸金屬螯合物為天冬氨酸錳。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的模擬SOD化合物作為農(nóng)作物自由基清除劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的模擬SOD化合物作為農(nóng)作物農(nóng)作物自由基清除劑，其特征在于模擬SOD化合物水溶液的濃度為0.1～10mg/kg。
全文摘要
用L－天冬氨酸、D，L－天冬氨酸與二氧化錳、氧化亞錳、硫酸錳、氯化錳、碳酸錳等錳化物反應(yīng)形成天冬氨酸螯合錳或直接利用天冬氨酸螯合錳，將上述天冬氨酸螯合錳在160～260℃下縮聚形成天冬氨酸短肽為配體的模擬Mn－SOD。通過元素分析、紅外光譜、凝膠色譜進(jìn)行了化學(xué)組成和分子量的表征，通過氯化氮藍(lán)四唑(NBT)法測(cè)定了SOD的活性。本發(fā)明的Mn－SOD生物活性較高、水溶性好、穩(wěn)定性好、分子量低、合成產(chǎn)率高，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07C229/00GK1803812SQ20051013246
公開日2006年7月19日 申請(qǐng)日期2005年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月26日
發(fā)明者趙繪, 蔡夫柳, 曾金魁, 李立仁, 蔡乙乞 申請(qǐng)人:北京華美天意科技開發(fā)有限公司