專利名稱：人內(nèi)皮生長因子受體2蛋白全人單克隆抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更確切地說涉及一種人內(nèi)皮生長因子受體2蛋白全人單克隆抗體及其制備方法。
本發(fā)明提供的技術(shù)解決方案如下一種人內(nèi)皮生長因子受體2蛋白全人單克隆抗體，其特殊之處在于，它由下述制備方法制得，依次包括以下步驟，①培育HER2致敏人B細胞；②HER2致敏的人B細胞與人骨瘤細胞融合，具體操作過程如下首先將用于融合的(1～2)×106人骨髓瘤細胞Karpas 707H與步驟①所得到的(3～7)×106致敏人B細胞混合，在2分鐘內(nèi)逐滴加入1～2ml新鮮配制的PEG-2000；然后快速滴入RPMI1640 50～60ml，200×g離心5分鐘，棄上清，重復(fù)加入RPMI1640 50～60ml洗滌；最后將融合細胞調(diào)制成1～2×106/ml，預(yù)培養(yǎng)飼養(yǎng)細胞1天，向細胞培養(yǎng)板中每孔加入100ul，HAT RPMI1640 培養(yǎng)12～15天，轉(zhuǎn)HT RPMI1640培養(yǎng)7～12天；③抗HER2胞外段單克隆抗體的篩選；④抗HER2胞外段單克隆抗體的擴增。
一種人內(nèi)皮生長因子受體2蛋白全人單克隆抗體的制備方法，依次包括以下步驟①培育HER2致敏人B細胞；
②HER2致敏的人B細胞與人骨瘤細胞融合，具體操作過程如下首先將用于融合的1～2×106Karpas 707H與步驟①所得到的3～7×106致敏人B細胞混合，在2分鐘內(nèi)逐滴加入1～2ml新鮮配制的PEG-2000；然后快速滴入RPMI1640 50～60ml，200×g離心5分鐘，棄上清，重復(fù)加入RPMI1640 50～60ml洗滌；最后將融合細胞調(diào)制成1～2×106/ml，預(yù)培養(yǎng)細胞，向細胞培養(yǎng)板中每孔加入常規(guī)量，HAT RPMI1640培養(yǎng)12～15天，轉(zhuǎn)HT RPMI1640培養(yǎng)7～12天；③抗HER2胞外段單克隆抗體的篩選；④抗HER2胞外段單克隆抗體的擴增。
上述方案中，所述步驟①，可以通過三條途徑實現(xiàn)的第一條途徑是直接從高表達HER2/neu的乳腺癌患者血中提取HER2致敏的人B細胞，首先確定目標自愿者，取患者外周血2～5ml，用商業(yè)化試劑盒測定抗HER2抗體，選擇其滴度大于1∶64者，然后自目標自愿者抽外周血50～100ml，加B細胞分離液，200×g離心，取中層乳白色B細胞層；第二條途徑是首先取高表達HER2/neu乳腺癌患者的癌周淋巴結(jié)，無菌操作剪碎，胰蛋白酶消化8～12小時，過150～200目不銹鋼篩，懸浮在20ml淋巴細胞分層液上，200×g離心，收集界面乳白色淋巴細胞，然后將用以上方法獲得的B淋巴細胞用商業(yè)化免疫珠(標記抗人IgG抗體和抗人IgM抗體)試驗證實是否致敏；第三條途徑是體外HER2免疫，將末致敏的人外周血B細胞經(jīng)條件培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時后，轉(zhuǎn)完全培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)5～7天，所述完全培養(yǎng)基的成分含HER2/neu 1～2ng/ml，AB型人血清1～10％，白介素(IL)-2 100～150U/ml，IL-4 8～12ng/ml，IL-6 16～20ng/ml，巨噬細胞1～2×105/ml。
上述方案中的步驟③，首先將用于篩選克隆的微孔板用購買的親和純HER2/neu包被，每孔加常規(guī)量細胞培養(yǎng)上清，37℃培育過夜；然后洗滌后加HRP標記的鼠抗人IgG Fc mAb，37℃培育30～45分鐘，洗滌后加底物TMB顯色，OD值大于10×空白OD者為陽性。
上述方案的步驟④，是將陽性克隆雜交瘤細胞調(diào)為1～2×106/ml，取1ml注射到裸鼠腹腔或SCID小鼠腹腔，7～10天后取腹水，200～250×g離心，取上清，加30～50％ glycerol，-20℃以下保存；或?qū)㈥栃钥寺‰s交瘤細胞調(diào)為1～2×106/ml，取20ml無菌操作加入生物反應(yīng)器中，培養(yǎng)2周左右，根據(jù)細胞處理系統(tǒng)狀況及取樣測定的抗體滴度，取培養(yǎng)液200～250×g離心，取上清，加30～50％ glycerol，-20℃以下保存。
上述方案還包括步驟⑤純化步驟，該純化步驟采用的是親和層析法。
上述步驟⑤是將人HER2/neu抗原胞外段經(jīng)CNBr偶聯(lián)到Sephrose 4B制備全人HER2/neu單克隆抗體親和層析柱，所述全人HER2/neu單克隆抗體親和層析柱用0.01M PB，pH6.8，0.1mM α-mercaptothanol的Buffer A預(yù)平衡，4℃保存，其操作是首先將100ml含全人HER2/neu單克隆抗體的上清，加入200ml柱體積的親和層析柱中，4℃過夜，然后用Buffer A充分流洗到OD280小于0.01，流速為8ml/min，用0.01M PB，pH6.8，0.1mM α-mercaptothanol，150mM NaClBuffer B洗脫，最后收集OD280＞0.02的部分，冷凍干燥，-20℃保存；或用蛋白A(SPA)經(jīng)CNBr偶聯(lián)到Sephrose 4B制備SPA親和層析柱。SPA親和層析柱用0.2M甘氨酸，pH2.3，0.1mM α-mercaptothanol Buffer C預(yù)平衡，并流洗200ml，流速0.5ml/min，其操作是首先將100ml含全人HER2/neu單克隆抗體的上清，加入100ml柱體積的親和層析柱中，4℃過夜，然后用0.01M PB，pH8.0，0.1mM α-mercaptothanol Buffer D充分流洗到OD280小于0.02，流速1ml/min，用0.1M檸檬酸緩沖液，pH6.0，0.1mM α-mercaptothanol Buffer E洗脫IgG1，用0.1M檸檬酸緩沖液，pH3.5，0.1mM α-mercaptothanol BufferF洗脫IgG2b，用0.1M檸檬酸緩沖液，pH4.4，0.1mM α-mercaptothanol BufferG洗脫IgG2a，最后收集OD280＞0.02的部分，冷凍干燥，-20℃保存；或用蛋白G(Protein G)CNBr偶聯(lián)到Sephrose 4B制備Protein G親和層析柱，ProteinG親和層析柱用0.2M甘氨酸，pH2.3，0.1mM α-mercaptothanol Buffer C預(yù)平衡，并流洗200ml，流速0.5ml/min，其操作是首先將100ml含全人HER2/neu單克隆抗體的上清，加入100ml柱體積的親和層析柱中，4℃過夜，然后用0.01MPB，pH8.0，0.1mM α-mercaptothanol Buffer D充分流洗到OD280小于0.02，流速1ml/min，用0.1M檸檬酸緩沖液，pH3.0，0.1mM α-mercaptothanol BufferH洗脫IgG，最后收集OD280＞0.02的部分，冷凍干燥，-20℃保存。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點是1、ER2/neu單克隆抗體分子中不含有任何鼠源蛋白成分，從根本上解決了HAMA問題，可長程體內(nèi)給藥，提高治療的效果；2、是人體免疫系統(tǒng)天然選擇產(chǎn)生的，具有與天然抗體完全相同的分子結(jié)構(gòu)與構(gòu)象，因此，與天然抗體有相同的免疫反應(yīng)能力；3、因為有完整的Ig分子結(jié)構(gòu)，因此具有更長的半衰期；4、比傳統(tǒng)的單抗表達系統(tǒng)的產(chǎn)量更高。
以下將提供實施例詳細說明人內(nèi)皮生長因子受體2蛋白全人單克隆抗體的制備過程，但本發(fā)明并不限于下述實施例。
實施例1經(jīng)外周血獲得致敏B細胞制備全人HER2/neu單克隆抗體步驟①，首先確定目標自愿者，選擇100名自愿者，均為乳腺癌患者，各取靜脈血5ml，分離血清，-20℃保存，經(jīng)商業(yè)化HER2 ELISA KIT篩選，抗HER2抗體陽性且滴度大于1∶64者為目標自愿者；然后在目標自愿者取外周血50ml，加淋巴細胞分層液，200×g離心，取界面B細胞層，取100ul B細胞作免疫珠試驗判斷B細胞是否致敏。合并致敏的B細胞，用RPMI1640洗滌3次。步驟②，用RPMI1640調(diào)B細胞至5×106/ml，人骨髓瘤細胞為Karpas707H RPMI調(diào)至2×106/ml。將Karpas 707H與致敏人B細胞各1ml混合，在2分鐘內(nèi)逐滴加入新鮮配制的2ml PEG-2000，然后立即快速滴入50mlRPMI1640終止PEG作用，200×g離心5分鐘，棄上清，重復(fù)加入50mlRPMI1640洗滌，將融合細胞用HAT培養(yǎng)基調(diào)制成1×106/ml，預(yù)培養(yǎng)飼養(yǎng)細胞1天，在96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入100ul，HAT RPMI1640 培養(yǎng)12天(37℃，5％CO2)，轉(zhuǎn)HT RPMI1640培養(yǎng)7天；步驟③，用于篩選克隆的96孔微孔板用HER2/neu胞外區(qū)包被，每孔加100ul細胞培養(yǎng)上清，37℃培育過夜，洗滌后加HRP標記的鼠抗人IgG Fc mAb，37℃培育30分鐘，洗滌后加底物(TMB)顯色，OD值大于10×空白OD者為陽性，結(jié)果得到抗HER2/neu胞外區(qū)陽性克隆2株，標準有限稀釋法克隆得到單個克隆2E5和6H13；步驟④，將陽性克隆2E5雜交瘤細胞調(diào)為1×106/ml，取20ml注射到裸鼠腹腔，每只1ml，10天后取腹水，測抗體滴度為1∶20000，200×g離心，取上清，共80ml，加等量50％glycerol，-20℃保存；步驟⑤，用人HER2/neu抗原胞外段經(jīng)CNBr偶聯(lián)到Sephrose 4B制備全人HER2/neu單克隆抗體親和層析柱，全人HER2/neu單克隆抗體親和層析柱用0.01M PB，pH6.8，0.1mM α-mercaptothanol Buffer A預(yù)平衡4小時，4℃保存。其操作是首先將160ml含全人HER2/neu單克隆抗體的上清，加入200ml柱體積的親和層析柱中，4℃過夜，然后用Buffer A充分流洗到OD280小于0.01，流速8ml/min，用0.01M PB，pH6.8，0.1mM α-mercaptothanol，150mM NaCl Buffer B洗脫，流速2ml/min，收集OD280＞0.02的部分，冷凍干燥，得到純化的全人HER2/neu單克隆抗體2E5 3mg，-20℃保存。
實施例2經(jīng)體外免疫獲得致敏B細胞制備全人HER2/neu單克隆抗體步驟①，從血庫購進新鮮采集的檸檬酸鈉抗凝的靜脈血400ml，分離血漿，經(jīng)商業(yè)化HER2 ELISA KIT確定為抗HER2抗體陰性，加淋巴細胞分層液，200×g離心，取界面B細胞層。取100ul B細胞作免疫珠試驗確定為B細胞末致敏。末致敏的人外周血B細胞經(jīng)條件培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時后，轉(zhuǎn)完全培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)5天，該完全培養(yǎng)基含HER2/neu胞外區(qū)2ng/ml，AB型人血清1％，IL-2 100U/ml，IL-4 8ng/ml，IL-6 16ng/ml，巨噬細胞1×105/ml，經(jīng)免疫珠試驗確定有28％B細胞已致敏，致敏的B細胞，用RPMI1640洗滌3次；步驟②，用RPMI1640調(diào)B細胞至7×106/ml，人骨髓瘤細胞為Karpas 707H RPMI調(diào)至1×106、/ml。Karpas 707H與致敏人B細胞各1ml混合，在2分鐘內(nèi)逐滴加入新鮮配制的2ml PEG-2000，然后快速滴入RPMI1640 50ml終止PEG作用，200×g離心5分鐘，棄上清，重復(fù)加入RPMI1640 50ml洗滌。融合細胞用HAT培養(yǎng)基調(diào)制成1×106/ml，預(yù)培養(yǎng)飼養(yǎng)細胞1天，96孔細胞培養(yǎng)板中每孔1加入100u，HAT RPMI1640培養(yǎng)15天(37℃，5％CO2)，轉(zhuǎn)HT RPMI1640培養(yǎng)10天；步驟③，取上清作克隆篩選，將用于篩選克隆的96孔微孔板用HER2/neu胞外區(qū)包被，每孔加100ul細胞培養(yǎng)上清，37℃培育過夜，洗滌后加HRP標記的鼠抗人IgG Fc mAb，37℃培育30分鐘，洗滌后加底物(TMB)顯色，OD值大于10×空白OD者為陽性，結(jié)果得到抗HER2/neu胞外區(qū)陽性克.1株，標準有限稀釋法克隆得到單個克隆3C19；步驟④，將陽性克隆3C19雜交瘤細胞調(diào)為1×108/ml，取20ml注射到SCID鼠腹腔，每只1ml，10天后取腹水，測抗體滴度為1∶16000。200×g離心，取上清，共55ml，4℃保存；步驟⑤，用蛋白G(Protein G)經(jīng)CNBr偶聯(lián)到Sephrose 4B制備Protein G親和層析柱。Protein G親和層析柱用0.2M甘氨酸，pH2.3，0.1mM α-mercaptothanol BufferC預(yù)平衡，并流洗200ml，流速0.5ml/min。55ml含全人HER2/neu單克隆抗體的上清，加入100ml柱體積的親和層析柱中，4℃過夜。用0.01M PB，pH8.0，0.1mM α-mercaptothanol Buffer D充分流洗到OD280小于0.02，流速1ml/min，用0.1M檸檬酸緩沖液，pH3.0，0.1mM α-mercaptothanol Buffer H洗脫IgG，收集OD280＞0.02的部分，冷凍干燥，得到親和純化的全人HER2/neu單克隆抗體3C19 2.34mg，-20℃保存。
權(quán)利要求
1.一種人內(nèi)皮生長因子受體2蛋白全人單克隆抗體，其特征在于它由下述制備方法制得，依次包括以下步驟，①培育HER2致敏人B細胞；②HER2致敏的人B細胞與人骨瘤細胞融合，具體操作過程如下首先將用于融合的1～2×106Karpas 707H與步驟①所得到的3～7×106致敏人B細胞混合，在2分鐘內(nèi)逐滴加入1～2ml新鮮配制的PEG-2000；然后快速滴入RPMI1640 50～60ml，200×g離心5分鐘，棄上清，重復(fù)加入RPMI1640 50～60ml洗滌；最后將融合細胞調(diào)制成1～2×106/ml，預(yù)培養(yǎng)細胞，向細胞培養(yǎng)板中每孔加入常規(guī)量，HAT RPMI1640 培養(yǎng)12～15天，轉(zhuǎn)HT RPMI1640培養(yǎng)7～12天；③抗HER2胞外段單克隆抗體的篩選；④抗HER2胞外段單克隆抗體的擴增。
2.一種人內(nèi)皮生長因子受體2蛋白全人單克隆抗體的制備方法，包括以下個步驟①培育HER2致敏人B細胞；②HER2致敏的人B細胞與人骨瘤細胞融合，具體操作過程如下首先將用于融合的1～2×106Karpas 707H與步驟①所得到的3～7×106致敏人B細胞混合，在2分鐘內(nèi)逐滴加入2ml新鮮配制的PEG-2000；然后快速滴入RPMI1640 50～60ml，200×g離心5分鐘，棄上清，重復(fù)加入RPMI164050～60ml洗滌；最后將融合細胞調(diào)制成1～2×106/ml，預(yù)培養(yǎng)飼養(yǎng)細胞1天，向細胞培養(yǎng)板中每孔加入100ul，HAT RPMI1640培養(yǎng)12～15天，轉(zhuǎn)HTRMI1640培養(yǎng)7～12天；③抗HER2胞外段單克隆抗體的篩選；④抗HER2胞外段單克隆抗體的擴增。
3.如權(quán)利要求2所述的人內(nèi)皮生長因子受體2蛋白全人單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述步驟①，可以通過三條途徑實現(xiàn)的，第一條途徑是直接從高表達HER2/neu的乳腺癌患者血中提取HER2致敏的人B細胞，首先確定目標自愿者，取患者外周血2～5ml，測定抗HER2抗體，選擇其滴度大于1∶64者，然后自目標自愿者抽外周血50～100ml，加B細胞分離液，200～250×g離心，取中層乳白色B細胞層；第二條途徑是首先取高表達HER2/neu乳腺癌患者的癌周淋巴結(jié)，無菌操作剪碎，胰蛋白酶消化8～12小時，過150～200目不銹鋼篩，懸浮在20ml淋巴細胞分層液上，200～250×g離心，收集界面乳白色淋巴細胞，然后將用以上方法獲得的B淋巴細胞用免疫珠(標記抗人IgG抗體和抗人IgM抗體)試驗證實是否致敏；第三條途徑是體外HER2免疫，將末致敏的人外周血B細胞經(jīng)條件培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時后，轉(zhuǎn)完全培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)5～7天，所述完全培養(yǎng)基的成分含HER2/neu胞外區(qū)1～2ng/ml，AB型人血清1～10％，IL-2 100～150U/ml，IL-4 8～12ng/ml，IL-6 16～20ng/ml，巨噬細胞1～2×105/ml。
4.如權(quán)利要求2或3所述的人內(nèi)皮生長因子受體2蛋白全人單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述步驟③，首先將用于篩選克隆的微孔板用HER2/neu胞外區(qū)包被，每孔加常規(guī)量細胞培養(yǎng)上清，37℃培育過夜；然后洗滌后加HRP標記的鼠抗人IgG Fc mAb，37℃培育30～45分鐘，洗滌后加底物TMB顯色，OD值大于10×空白OD者為陽性。
5.如權(quán)利要求4所述的人內(nèi)皮生長因子受體2蛋白全人單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述步驟④，是將陽性克隆雜交瘤細胞調(diào)為1～2×106/ml，取1ml注射到裸鼠腹腔或SCID小鼠腹腔，7～10天后取腹水，200～250×g離心，取上清，加30～50％glycerol，-20℃以下保存；或?qū)㈥栃钥寺‰s交瘤細胞調(diào)為1×106/ml，取20ml無菌操作加入生物反應(yīng)器中，培養(yǎng)2周左右，根據(jù)細胞處理系統(tǒng)狀況及取樣測定的抗體滴度，取培養(yǎng)液200～250×g離心，取上清，加30～50％ glycerol，-20℃以下保存。
6.如權(quán)利要求5所述的人內(nèi)皮生長因子受體2蛋白全人單克隆抗體的制備方法，其特征在于還包括步驟⑤純化步驟，該純化步驟采用的是親和層吸法。
7.如權(quán)利要求6所述的人內(nèi)皮生長因子受體2蛋白全人單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述步驟⑤是將人HER2/neu抗原胞外段經(jīng)CNBr偶聯(lián)到Sephrose 4B制備全人HER2/neu單克隆抗體親和層析柱，所述全人HER2/neu單克隆抗體親和層析柱用0.01M PB，pH 6.8，0.1mM α-mercaptothanol的Buffer A預(yù)平衡，4℃保存，其操作是首先將100ml含全人HER2/neu單克隆抗體的上清，加入200ml柱體積的親和層析柱中，4℃過夜，然后用Buffer A充分流洗到OD280小于0.01，流速為8ml/min，用0.01M PB，pH 6.8，0.1mM α-mercaptothanol，150mM NaCl Buffer B洗脫，最后收集OD280＞0.02的部分，冷凍干燥，-20℃保存；或用蛋白A(SPA)經(jīng)CNBr偶聯(lián)到Sephrose 4B制備SPA親和層析柱。SPA親和層析柱用0.2M甘氨酸，pH 2.3，0.1mM α-mercaptothanol Buffer C預(yù)平衡，并流洗200ml，流速0.5ml/min，其操作是首先將100ml含全人HER2/neu單克隆抗體的上清，加入100ml柱體積的親和層析柱中，4℃過夜，然后用0.01M PB，pH 8.0，0.1mM α-mercaptothanol Buffer D充分流洗到OD280小于0.02，流速1ml/min，用0.1M檸檬酸緩沖液，pH6.0，0.1mM α-mercaptothanol Buffer E洗脫IgG1，用0.1M檸檬酸緩沖液，pH3.5，0.1mM α-mercaptothanol Buffer F洗脫IgG2b，用0.1M檸檬酸緩沖液，pH4.4，0.1mM α-mercaptothanol Buffer G洗脫IgG2a，最后收集OD280＞0.02的部分，冷凍干燥，-20℃保存；或用蛋白G(Protein G)CNBr偶聯(lián)到Sephrose 4B制備Protein G親和層析柱，Protein G親和層析柱用0.2M甘氨酸，pH 2.3，0.1mMα-mercaptothanol Buffer C預(yù)平衡，并流洗200ml，流速0.5ml/min，其操作是首先將100ml含全人HER2/neu單克隆抗體的上清，加入100ml柱體積的親和層析柱中，4℃過夜，然后用0.01M PB，pH 8.0，0.1mM α-mercaptothanol BufferD充分流洗到OD280小于0.02，流速1ml/min，用0.1M檸檬酸緩沖液，pH3.0，0.1mM α-mercaptothanol Buffer H洗脫IgG，最后收集OD280＞0.02的部分，冷凍干燥，-20℃保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人內(nèi)皮生長因子受體2蛋白全人單克隆抗體及其制備方法。本發(fā)明利用HER2/neu胞外段的全人單克隆抗體，從根本上解決鼠源單抗的HAMA問題，提高治療效果。制備過程包括四個步驟①培育HER2致敏人B細胞；②融合HER2致敏人B細胞與人骨瘤細胞(Karpas 707H)；③抗HER2胞外段單克隆抗體的篩選；④抗HER2胞外段單克隆抗體的擴增。其特性是抗原表位為HER2/neu胞外段多肽，可特異地與HER2/neu胞外段結(jié)合；指導(dǎo)合成的全部基因序列均來源于人的B淋巴細胞和人骨髓瘤細胞；它與HER2/neu胞外段結(jié)合的解離系數(shù)等于或低于10
文檔編號C07K16/18GK1396182SQ0213932
公開日2003年2月12日 申請日期2002年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月31日
發(fā)明者劉鐳, 李軍, 王太重 申請人:陜西超英生物醫(yī)學(xué)研究開發(fā)有限公司