勻后離心，棄除上層的生理鹽水；再向剩余的紅細胞中加入等體積的生 理鹽水，混勻后即得到分離好的紅細胞樣品。
[0026] 取50μL紅細胞樣品，置于螺旋蓋玻璃離心管中，加入十七燒酸作為內標溶液，加 入lmL3mol/L的鹽酸-甲醇溶液，混勻后置烘箱中，90°C避光反應3h，衍生化反應完畢后， 冷卻至室溫，加入2mL正己烷萃取甲酯化反應產物，取上清液并進行氮氣吹干，然后向殘渣 中加入正己烷作為復溶劑，混勻，得到樣品檢測液。其中，十七烷酸與紅細胞樣品的體積比 為1 :1 ;紅細胞樣品、鹽酸-甲醇溶液、萃取劑及復溶劑的體積比為1 :20 :40 :8。
[0027] 通過上述前處理，將紅細胞中的脂肪酸轉化為揮發(fā)性較強、適用于氣相色譜-質 譜儀檢測的脂肪酸甲酯產物，并萃取分離出來，有效避免了其他物質對后續(xù)檢測的干擾。
[0028] 實施例二全血紅細胞脂肪酸的檢測 將樣品檢測液使用氣相色譜-質譜儀進行檢測。
[0029] 色譜條件包括：色譜柱為規(guī)格為20m*0. 18mm(ID)*0· 20μm(film)的極性毛細管 色譜柱(購自安捷倫，型號DB-23,PartNumber122-2361 )，載氣為99. 999%純度的氦氣，載 氣流速為〇. 90mL/min，進樣方式為不分流進樣，進樣體積為?μL，進樣口溫度為230°C，后運 行溫度為240°C，后運行時間為2min，吹掃流量為4.OmL/min，總流量為55mL/min。程序升 溫條件如表1所示。
[0030]
質譜檢測采用電子轟擊電離模式，采用全掃描和選擇離子掃描方式。質譜條件包括：電 離源為電子轟擊離子源（EI)，70ev;傳輸線溫度為230°C，離子源溫度為250°C，四極桿質量 分析器溫度為150°C，溶劑延遲時間為3. 70min;掃描模式為全掃描（Scan)和選擇離子掃描 (SHO,全掃描范圍為m/z60. 00~450. 00,選擇離子掃描（SHO模式參數如表2所示。
[0031]
全血紅細胞中脂肪酸的定性、定量檢測：以樣品中各脂肪酸與標準品的甲酯產物保留 時間、全掃描所得的質譜圖進行NIST譜庫檢索以及與標準物質的質譜圖進行比對作為定 性依據，各脂肪酸甲酯的保留時間如表3所示。樣品色譜圖中所選擇的定性定量離子的相 對豐度比與標準溶液的離子相對豐度比的偏差不超過預設規(guī)定范圍，則可以判斷樣品中存 在對應的目標物質。用內標標準曲線法定量，二十烷三烯酸甲酯的峰面積與相應內標物甲 酯峰面積的比值為縱坐標，二十烷三烯酸的濃度與內標物的濃度比值為橫坐標，繪制標準 曲線，結果如圖1所示，計算人紅細胞二十烷三烯酸的含量。
[0032]
采用上述方法，對1例全血紅細胞樣品中的脂肪酸進行了檢測，得出了 20種脂肪酸各 自的含量，脂肪酸甲酯的總離子流色譜圖如圖2所示。從圖2可以看出，各脂肪酸甲酯峰型 對稱，沒有拖尾現象，分離效果很好。全血紅細胞樣品中，二十烷三烯酸甲酯的選擇離子色 譜圖如圖3所示，十七烷酸甲酯的選擇離子色譜圖如圖4所示。
[0033]本發(fā)明的檢測方法最低檢出限達到了 0. 01mg/L，得出人紅細胞樣品中20種脂肪 酸在測定的濃度范圍內，線性良好，決定系數R2在〇. 996-0. 999之間。
[0034]重復性實驗：取同一來源的全血樣品5份，進行相同的前處理和檢測，結果20種脂 肪酸含量的RSD都在3°Ρ8%之間，表明該方法的重復性好。
[0035]以上內容是結合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定 本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術領域的普通技術人員來說，在 不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發(fā)明的 保護范圍。
【主權項】
1. 一種快速檢測全血紅細胞二十烷三烯酸的方法，其特征在于：包括如下步驟： A) 全血樣品的前處理：從全血樣品中分離紅細胞，加入內標溶液和鹽酸-甲醇溶液進 行衍生化反應，然后加入萃取劑萃取，取上清液并氮氣吹干，殘渣中加入復溶劑，混勻，得到 樣品檢測液； B) 對所述樣品檢測液采用氣相色譜-質譜儀進行檢測，氣相色譜條件包括：色譜柱采 用極性色譜柱，載氣為氦氣，不分流進樣，線速度流量控制方式，載氣流量為0. 80~1. OOmL/ min，起始柱溫60°C，先升溫至180°C，然后升溫至220°C，整個升溫程序的梯度時間為 8~15min ;質譜條件為：采用電子轟擊離子源，采用全掃描和選擇離子掃描方式。2. 根據權利要求1所述的快速檢測全血紅細胞二十烷三烯酸的方法，其特征在于：所 述內標溶液選自十七烷酸。3. 根據權利要求1所述的快速檢測全血紅細胞二十烷三烯酸的方法，其特征在于：所 述萃取劑選自正己烷，所述復溶劑選自正己烷。4. 根據權利要求3所述的快速檢測全血紅細胞二十烷三烯酸的方法，其特征在于：所 述內標溶液與紅細胞的體積比為1 :(1~2);所述紅細胞、鹽酸-甲醇溶液、萃取劑及復溶劑 的體積比為 1 : (1〇~25) : (20~50) : (4~10)。5. 根據權利要求4所述的快速檢測全血紅細胞二十烷三烯酸的方法，其特征在于：所 述紅細胞、鹽酸-甲醇溶液、萃取劑及復溶劑的體積比為1 :20 :40 :8。6. 根據權利要求1所述的快速檢測全血紅細胞二十烷三烯酸的方法，其特征在于：所 述極性色譜柱選自規(guī)格為20m*0. 20 ym的極性毛細管色譜柱。7. 根據權利要求1至6中任一項所述的快速檢測全血紅細胞二十烷三烯酸的方法，其 特征在于：所述氣相色譜條件還包括：進樣體積為1ML，進樣口溫度為220~230°C，后運行溫 度為240~250°C，后運行時間為2min，吹掃流量為3. 0~5. OmL/min，總流量為50. 0~60. 0 mL/ min，平均線速度為35. 0~45. Ocm/s。8. 根據權利要求1至6中任一項所述的快速檢測全血紅細胞二十烷三烯酸的方法，其 特征在于：所述質譜條件還包括：接口溫度為210~230°C ;離子源溫度為220~240°C ;四極桿 溫度為140~160°C，溶劑延遲時間為3. 0~4. Omin，全掃描范圍為m/z 60. 00~450. 00。9. 根據權利要求1至6中任一項所述的快速檢測全血紅細胞二十烷三烯酸的方法，其 特征在于：還包括如下步驟：檢測結果的定性判斷和/或定量計算。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種快速檢測全血紅細胞二十烷三烯酸的方法，屬于生物檢測技術領域，包括如下步驟：A）全血樣品的前處理；B）對所述樣品檢測液采用氣相色譜-質譜儀進行檢測。本發(fā)明提供的檢測方法具有樣品用量少，前處理簡單，靈敏度高，特異性強，定性、定量功能強大，并且整個檢測過程時間短、檢測通量高等優(yōu)點。
【IPC分類】G01N30/02
【公開號】CN105241970
【申請?zhí)枴緾N201510545380
【發(fā)明人】劉菲菲, 燕啟江, 梁耀銘, 程雅婷, 趙蓓蓓, 郭周萍, 趙強
【申請人】廣州金域醫(yī)學檢驗中心有限公司
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2015年8月31日