專(zhuān)利名稱(chēng)：脂質(zhì)混合物以及含該脂質(zhì)混合物的磷脂懸浮物的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及脂質(zhì)混合物以及含該脂質(zhì)混合物的均勻可過(guò)濾磷脂懸浮物的制備方法，這種懸浮物可用作超聲造影劑。
背景技術(shù)：
磷脂造影劑的生產(chǎn)可以分為以下步驟(1)制備脂質(zhì)混合物；(2)混勻所述本體溶液(bulk solution)，包括脂質(zhì)混合物在基本水介質(zhì)中水合和分散產(chǎn)生脂質(zhì)懸浮物；(3)經(jīng)除菌過(guò)濾器過(guò)濾所述本體溶液從而使得所述懸浮物不含微生物污染物；(4)在受控?zé)o菌區(qū)將所述無(wú)菌懸浮物分配裝入各個(gè)管制瓶中；(5)把所分裝的管制瓶載入冷凍干燥器室以用全氟丙烷氣(PFP)替代管制瓶上部氣體；(6)將氣體交換后密封的管制瓶轉(zhuǎn)移至高壓滅菌器以進(jìn)行最后的滅菌。在該方法中有三個(gè)主要障礙(1)所述脂質(zhì)混合物的均勻性；(2)所述脂質(zhì)混合物的水合作用；(3)所述懸殊浮物的均勻性和顆粒大??；以及(4)所述懸浮物經(jīng)除菌過(guò)濾器無(wú)菌過(guò)濾。
通常將需要的脂質(zhì)溶解或懸浮于合適的水溶劑或非水溶劑體系中，然后經(jīng)冷凍或蒸餾減少體積，從而生產(chǎn)磷脂混合物。理想的是，該方法生產(chǎn)高度的含量均勻性和高純度的混合固體物。然而，盡管在小的實(shí)驗(yàn)室規(guī)?？奢^好實(shí)施，但是該簡(jiǎn)單方法一旦擴(kuò)大到生產(chǎn)規(guī)模的量時(shí)常常是有問(wèn)題的。難點(diǎn)包括(1)在溶劑去除步驟中保持含量的均勻性(由于不同溶解度引起的)；(2)保持純度(當(dāng)使用水時(shí)由于水解副反應(yīng)引起的常見(jiàn)問(wèn)題)；(3)提高純度；(4)最小化溶劑體積；和(5)回收最后的固體(例如從大反應(yīng)器刮出固體不是可行的)。
生產(chǎn)脂質(zhì)混合物后，最后的混合通常包括把所述混合物加入水介質(zhì)中。因?yàn)榱字鞘杷缘牟㈦y溶于水，所以磷脂或脂質(zhì)混合物直接加入水溶液中引起所述脂質(zhì)粉聚合形成非常難以分散的團(tuán)塊。因此，所述水合作用過(guò)程不能控制在合理的過(guò)程時(shí)間范圍內(nèi)。磷脂或脂質(zhì)混合物在水介質(zhì)中的直接水合作用產(chǎn)生顆粒范圍0.6μm-100μm的混濁懸浮液。由于較大的顆粒大小分布，所以當(dāng)所述懸浮液溫度低于脂質(zhì)的凝膠到液晶(gel-to-liquid crystal)的相變溫度時(shí)，所述懸浮液不能在室溫下過(guò)濾。所述脂質(zhì)將累積在過(guò)濾器中，導(dǎo)致流速受限，在大多數(shù)情況下，不久所述過(guò)濾器就完全阻塞。通過(guò)常規(guī)的分批法，即使用常規(guī)使用的船舶式螺旋槳(marine propeller)在溫度升高(例如40℃-80℃)下延長(zhǎng)混合時(shí)間(例如6小時(shí))后，也不能獲得所述懸浮物顆粒大小的進(jìn)一步減小。
盡管在溫度升高即高于脂質(zhì)的相變溫度的情況下過(guò)濾是可能的，但是當(dāng)使用正常過(guò)濾壓時(shí)，仍然要除去大量的較大的脂質(zhì)顆粒。所述無(wú)菌過(guò)濾物的濃縮在批與批文間同樣有不同的脂質(zhì)含量，脂質(zhì)含量取決于所述脂質(zhì)開(kāi)始時(shí)如何進(jìn)行水合的，而其水合作用又由所述原料的物理特征例如形態(tài)學(xué)所決定。
直接水合所述脂質(zhì)或脂質(zhì)混合物以產(chǎn)生均勻懸浮物和經(jīng)除菌過(guò)濾器過(guò)濾所述懸浮物的方法可能是困難的，并且放大到任何合理的工業(yè)規(guī)模例如＞20L的成本高昂。
因此，目前要求保護(hù)的生產(chǎn)脂質(zhì)混合物以及隨后的磷脂懸浮物的方法，目的是通過(guò)提供切實(shí)可行的方法解決上述問(wèn)題，該方法容易放大并可用于各種生產(chǎn)設(shè)備而不需要大改變或定制現(xiàn)有設(shè)備。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的目的之一是提供一種制備脂質(zhì)混合物的新方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種制備得自所述脂質(zhì)混合物的磷脂懸浮物的新方法。
本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了這些目的以及其它目的，這些目的在以下詳細(xì)說(shuō)明書(shū)中將變得顯而易見(jiàn)，所述發(fā)現(xiàn)是在加入水溶液前將脂質(zhì)混合物溶解于合適非水溶劑中使得可以生產(chǎn)磷脂懸浮物。
發(fā)明詳述[1]因此，在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種制備磷脂懸浮物的新方法，包括(1)使脂質(zhì)混合物與非水溶劑接觸，由此使得所述脂質(zhì)混合物基本上溶解于所述非水溶劑中；以及，(2)使步驟(1)的溶液與水溶液接觸形成脂質(zhì)懸浮物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非水溶劑選自丙二醇、乙二醇和聚乙二醇300。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非水溶劑是丙二醇。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)混合物包括(a)1,2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿；(b)1,2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷脂酸一鈉鹽；和，(c)N-(甲氧基聚乙二醇5000氨基甲?；?-1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺一鈉鹽。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(1)中，所述非水溶劑在與所述脂質(zhì)混合物接觸前加熱至溫度約30-70℃。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非水溶劑在與所述脂質(zhì)混合物接觸前加熱至溫度約50-55℃。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂質(zhì)混合物與非水溶劑的比率為從每mL非水溶劑含脂質(zhì)混合物約5mg至約15mg/mL。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂質(zhì)混合物與非水溶劑的比率為約10mg/mL。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)中，所述水溶液選自水、鹽水、鹽水/甘油混合物和鹽水/甘油/非水溶劑混合物。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述水溶液是鹽水和甘油的混合物。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述水溶液是鹽水、甘油和丙二醇的混合物。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，存在氯化鈉6.8mg/mL、存在甘油0.1mL/mL、存在丙二醇0.1mL/mL以及存在所述脂質(zhì)混合物約0.75-1.0mg/mL。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，存在脂質(zhì)混合物0.75mg/mL。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，存在脂質(zhì)混合物1.0mg/mL。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)中，所述水溶液在與步驟(1)的溶液接觸前加熱至溫度約45-60℃。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述水溶液在與步驟(1)的溶液接觸前加熱至溫度約50-55℃。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法還包括(3)加熱步驟(2)的脂質(zhì)懸浮物至溫度約等于或高于存在于所述懸浮物中的脂質(zhì)的凝膠到液晶的最高相變溫度。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(3)中，所述脂質(zhì)懸浮物加熱至溫度至少約67℃。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法還包括(4)經(jīng)除菌過(guò)濾器過(guò)濾所述脂質(zhì)懸浮物。在另一甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(4)中，用兩個(gè)除菌過(guò)濾柱進(jìn)行過(guò)濾。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(4)中，所述除菌過(guò)濾柱的溫度從約70℃至80℃。在另一還優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(4)中使用0.2μm親水性濾膜。在另一甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法還包括(5)將步驟(4)的過(guò)濾溶液分配裝入管制瓶中。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法還包括
(6)用全氟烴氣交換步驟(5)的管制瓶上部的氣體。在另一甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述全氟烴氣是全氟丙烷。在另一甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，用冷凍室進(jìn)行上部氣體的交換。在另一甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法還包括(7)滅菌步驟(6)的管制瓶。在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(7)中，所述管制瓶于約126-130℃滅菌1-10分鐘。在第二個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種制備脂質(zhì)混合物的新方法，包括(a)使至少兩種脂質(zhì)與第一種非水溶劑接觸；(b)濃縮所述溶液成為稠密的凝膠；(c)使所述稠密凝膠與第二種非水溶劑接觸；以及，(d)收集所得的固體物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(a)中，所述脂質(zhì)是(ⅰ)1,2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿；(ⅱ)1,2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷脂酸一鈉鹽；和，(ⅲ)N-(甲氧基聚乙二醇5000氨基甲酰基)-1,2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺一鈉鹽。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(a)中，第一種非水溶劑是乙醇和甲苯的混合物。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(c)中，第二種非水溶劑是甲基叔丁基醚。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(a)中，所述溶液加熱至足以使所述脂質(zhì)完全溶解入所述溶劑中的溫度。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(a)中，所述溶液加熱至約25-75℃。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(d)，所收集的固體物用甲基叔丁基醚洗滌并真空干燥。在第三個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種新的磷脂懸浮物，它包括(a)懸浮物的脂質(zhì)混合物量約0.75-1.0mg/mL。
(b)懸浮物的氯化鈉量約6.8mg/mL。
(c)懸浮物的甘油量約0.1mL/mL。
(d)懸浮物的丙二醇量約0.1mL/mL；和(e)水；其中所述懸浮物用所述方法制備，該方法包括(1)使脂質(zhì)混合物與非水溶劑接觸，由此使得所述脂質(zhì)混合物基本上溶解于非水溶劑中；(2)使步驟(1)溶液與水溶液接觸形成脂質(zhì)懸浮物；(3)加熱步驟(2)的脂質(zhì)懸浮物至溫度約等于或高于存在于所述懸浮物中的脂質(zhì)的凝膠到液晶的最高相變溫度。
(4)經(jīng)除菌過(guò)濾器過(guò)濾所述脂質(zhì)懸浮物。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)混合物包含(a)1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿；(b)1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸一鈉鹽；和，(c)N-(甲氧基聚乙二醇5000氨基甲?；?-1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺一鈉鹽。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述非水溶劑在與所述脂質(zhì)混合物接觸前加熱至溫度約50-55℃。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂質(zhì)混合物與非水溶劑的比率約10mg/mL。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述水溶液是鹽水、甘油和丙二醇的混合物。在一個(gè)甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，存在脂質(zhì)混合物0.75mg/mL。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述水溶劑在與步驟(1)的溶液接觸前加熱至溫度約50-55℃。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(3)中，所述脂質(zhì)懸浮物加熱至至少約67℃。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(4)中，使用二個(gè)0.2μm親水性濾膜。
配方打算從至少數(shù)克規(guī)模、一公斤規(guī)模、數(shù)公斤規(guī)?；蚬I(yè)規(guī)模實(shí)施本發(fā)明。作為本文所用的數(shù)克規(guī)模最好是其中至少一種原料物質(zhì)以10g或10g以上、更優(yōu)選至少50g或50g以上、甚至更優(yōu)選至少100g或100g以上存在的規(guī)模。作為本文所用的數(shù)公斤規(guī)模是指其中使用至少一種原料物質(zhì)為一公斤以上的規(guī)模。作為本文所用的工業(yè)規(guī)模是指非實(shí)驗(yàn)室規(guī)模并且足以供應(yīng)足夠用于臨床試驗(yàn)或分銷(xiāo)給消費(fèi)者的產(chǎn)品的規(guī)模。
作為本文所用的脂質(zhì)混合物或磷脂混合物是指已經(jīng)混合的兩種或兩種以上的脂質(zhì)。所述脂質(zhì)混合物一般為粉末形式。最好是至少一種脂質(zhì)是磷脂。所述脂質(zhì)混合物最好含有1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿(DPPC)、1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸一鈉鹽(DPPA)和N-(甲氧基聚乙二醇5000氨基甲?；?-1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺一鈉鹽(MPEG5000-DPPE)。存在于所述混合物的各種脂質(zhì)的量將取決于所需要的最終產(chǎn)品。各種脂質(zhì)的優(yōu)選比率描述于實(shí)施例部分。在本發(fā)明方法中可以使用種類(lèi)繁多的其它脂質(zhì)，例如描述于Unger等的美國(guó)專(zhuān)利第5,469,854號(hào)中的脂質(zhì)，該專(zhuān)利內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
作為本文所用的磷脂是含一個(gè)油性(疏水的)烴鏈和一個(gè)極性(親水的)磷首基的脂肪物質(zhì)。磷脂類(lèi)是兩親的。它們?cè)谒橘|(zhì)中自然形成界面和密閉小泡。磷脂構(gòu)成動(dòng)物細(xì)胞漿膜物質(zhì)的約50％。
脂質(zhì)混合物的制備所述脂質(zhì)混合物可以通過(guò)水懸浮物-冷凍干燥法或使用有機(jī)溶劑的有機(jī)溶劑溶解-沉淀法制備。在水懸浮物-冷凍干燥法中，所需要的脂質(zhì)懸浮于溫度升高的水中，然后經(jīng)冷凍干燥濃縮。最好使用溶解法。步驟(a)所述有機(jī)溶劑溶解-沉淀法包括使需要的脂質(zhì)(例如DPPA、DPPC和MPEG5000 DPPE)與第一種非水溶劑系統(tǒng)接觸。該系統(tǒng)通常是溶劑的組合物，例如CHCl3/MeOH,CH2Cl2/MeOH和甲苯/MeOH。第一種非水溶劑系統(tǒng)最好是甲苯和甲醇的混合物。最好是加熱所述脂質(zhì)溶液至足以達(dá)到完全溶解的溫度。該溫度最好為約25-75℃，更優(yōu)選約35-65℃。
溶解后，需要通過(guò)熱過(guò)濾或冷卻至室溫后過(guò)濾除去不需要的外來(lái)物質(zhì)?？梢允褂靡阎倪^(guò)濾方法(例如重力過(guò)濾、真空過(guò)濾或壓力過(guò)濾)。步驟(b)然后濃縮所述溶液至稠密凝膠/半固體。最好是經(jīng)真空蒸餾進(jìn)行濃縮。也可以使用其它方法，例如旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮該溶液。該步驟的溫度最好為約20-60℃，更優(yōu)選30-50℃。步驟(c)然后將所述稠密凝膠/半固體分散于第二種非水溶劑。最好在接近室溫(例如15-30℃)下，使該混合物淤漿化。有用的第二種非水溶劑是使得所述脂質(zhì)從過(guò)濾溶液沉淀的非水溶劑。第二種非水溶劑最好是甲基叔丁基醚(MTBE)?？梢允褂闷渌杨?lèi)和醇類(lèi)。
步驟(d)然后收集在加入第二種非水溶劑后產(chǎn)生的固體物。所收集的固體物最好用另一部分的第二種非水溶劑(例如MTBE)洗滌。最好是在室溫下通過(guò)真空過(guò)濾或離心進(jìn)行收集。收集后，最好是所述固體物于溫度約20-60℃下真空干燥。
相對(duì)于所述水懸浮物/冷凍干燥法，優(yōu)選使用有機(jī)溶劑溶解-沉淀法，原因如下(1)因?yàn)樗鲋|(zhì)易溶于甲苯/甲醇，所以溶劑體積明顯減少(相對(duì)于所述水溶液法)。
(2)因?yàn)槿芙舛仍黾?，所述方法的溫度也相?duì)低于水溶液法，由此避免脂肪酸酯的水解不穩(wěn)定性。
(3)當(dāng)溫度回降至室溫時(shí)，脂質(zhì)的甲苯/甲醇溶液保持均質(zhì)，使得可以室溫過(guò)濾以去除固體外來(lái)物質(zhì)。
(4)MTBE沉淀使得可以快速簡(jiǎn)便地分離脂質(zhì)混合物固體。而所述水溶液法，要使用耗時(shí)的冷凍干燥過(guò)程分離物質(zhì)。
(5)MTBE沉淀還使得可以去除進(jìn)入過(guò)濾的廢水流中的可溶于MTBE的任何雜質(zhì)。當(dāng)直接濃縮溶液或冷凍干燥至固體時(shí)，不能實(shí)現(xiàn)去除雜質(zhì)的潛力。
(6)本發(fā)明方法提供均勻固體。
脂質(zhì)懸浮物的制備步驟(1)在第一步中，脂質(zhì)混合物與非水溶劑接觸，因此所述脂質(zhì)混合物基本上溶解于非水溶劑中。或者，可以使單獨(dú)的脂質(zhì)依次與所述非水溶劑接觸，所述脂質(zhì)次序?yàn)镈PPC、DPPA和MPEG5000-DPPE；DPPC、MPEG5000-DPPE和DPPA；MPEG5000-DPPE、DPPA和DPPC；或MPEG5000-DPPE、DPPC和DPPA。不首先加入脂質(zhì)溶解最少以及脂質(zhì)含量最少的DPPA。在加入DPPA前或與其同時(shí)加入一種其它脂質(zhì)有助于DPPA的溶解。在另一替代方法中，各種脂質(zhì)可以以其固體形式組合，該固體組合物與非水溶劑接觸。
當(dāng)脂質(zhì)混合物和非水溶劑的混合物變透明時(shí)，一般表示基本溶解。如前所述，磷脂一般不是水溶性的。因此，磷脂混合物直接加入水環(huán)境中引起所述脂質(zhì)混合物聚集形成非常難以分散的團(tuán)塊。本發(fā)明通過(guò)將脂質(zhì)混合物在加入水溶液前溶解于非水溶劑中，從而克服該制約。這使得人們可以將脂質(zhì)混合物均勻地分散到液體中。然后該液體分散物可以加入到所需要的水環(huán)境中。
非水的是指一種溶劑或溶劑的混合物，其中存在的水量足夠低以便不影響所述脂質(zhì)混合物的溶解。所需要的非水溶劑的量取決于脂質(zhì)混合物的溶解度，并且還取決于各個(gè)組分的最終需要濃度。作為一個(gè)普通技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，存在于非水溶劑中的可允許的水的水平隨脂質(zhì)混合物中的各種脂質(zhì)的水溶解度而改變。各種磷脂的水溶解度越高，可以存在于步驟(1)中的水越多。最好是使用丙二醇作非水溶劑。然而，可以使用其它多羥基化合物家族成員，例如乙二醇和聚乙二醇300。
機(jī)械混合脂質(zhì)混合物和非水溶劑可能是達(dá)到完全溶解所必需的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可用各種混合方法。最好使用高剪切均化器。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，升高溶劑的溫度有助于脂質(zhì)混合物的溶解。在可實(shí)施步驟(1)的溫度范圍可以從室溫至選定溶劑的沸點(diǎn)溫度。所述溫度優(yōu)選為約30-70℃，更優(yōu)選為約45-60℃，甚至更優(yōu)選為約50、51、52、53、54或55℃。當(dāng)使用乙二醇或聚乙二醇300時(shí)，所述溫度優(yōu)選為約50℃-約60℃，而更優(yōu)選為約55℃。保持所述溶液于較高溫度將降低溶液粘度并便于配制。
溶解所述脂質(zhì)混合物的優(yōu)選方法如下(a)將丙二醇加至合適稱(chēng)量容器中。(b)在熱浴中加熱丙二醇至約40-80℃。(C)稱(chēng)量脂質(zhì)混合物裝入分開(kāi)的容器。(d)當(dāng)丙二醇達(dá)到所需要的溫度范圍時(shí)，將該溶液轉(zhuǎn)移入裝有所述脂質(zhì)混合物的容器中。(e)把該容器放回?zé)嵩≈?，直到所述溶液變?yōu)橥该鳌?f)機(jī)械混合所述脂質(zhì)混合物/丙二醇溶液以進(jìn)一步保證完全溶解以及均勻分散所述脂質(zhì)混合物。
當(dāng)然，脂質(zhì)混合物與非水溶劑的比率受限于所述脂質(zhì)混合物的溶解度。該比率也將受到最終制劑中的脂質(zhì)混合物的需要量的影響。優(yōu)選的所述比率為從每mL溶劑約1mg脂質(zhì)混合物(mg/mL)至約100mg/mL。更優(yōu)選的是，所述脂質(zhì)混合物以約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15mg/mL存在。甚至更優(yōu)選的是，所述脂質(zhì)混合物以約10mg/mL存在。步驟(2)第二步包括使步驟(1)的溶液與水溶液接觸形成脂質(zhì)懸浮物。所述水溶液可以是水、鹽水、鹽水/甘油混合物或鹽水/甘油/非水溶劑混合物。按如上定義，非水溶劑最好是丙二醇。作為本文所用的懸浮物是指其中不溶性顆粒分散于液體介質(zhì)的分散物。
在所述脂質(zhì)混合物達(dá)到完全溶解(步驟(1))后，可將所得的溶液加至水溶液中。該水溶液可以含有一種或多種選自氯化鈉、甘油和非水溶劑的組分。該水溶液優(yōu)選含有甘油和氯化鈉。最好是，在加入步驟1的溶液前，在所述水溶液中存在足夠量的丙二醇，以便達(dá)到所需要的丙二醇終濃度。
不希望所需組分的加入次序會(huì)嚴(yán)重影響所生成的脂質(zhì)懸浮物。然而，所述脂質(zhì)混合物液優(yōu)選加至已經(jīng)含有上述另外組分的水中。然后可以加入所需要的另外組分。更優(yōu)選的是，所述脂質(zhì)混合物液加至水和氯化鈉的溶液(即鹽水)中。還優(yōu)選的是，所述脂質(zhì)混合物液加至水、氯化鈉和甘油的溶液中。甚至更優(yōu)選的是，所述脂質(zhì)混合物液加至水、氯化鈉、甘油和丙二醇的溶液中。
優(yōu)選的是，每mL制劑存在6.8mg氯化鈉。優(yōu)選每mL制劑存在0.1mL甘油。優(yōu)選終濃度為每mL制劑0.1mL丙二醇。所述制劑的最終pH優(yōu)選為約5.5-7.0。所述脂質(zhì)混合物液最好是以每mL制劑0.75-1.0mg的量存在。
水溶液的溫度范圍可以是從室溫到70℃。該溫度優(yōu)選為約45-60℃，甚至更優(yōu)選50、51、52、53、54或55℃。為了達(dá)到完全溶解，需要振蕩所述混合物，最好是攪拌。此外，可能需要根據(jù)所需要的最終制劑調(diào)節(jié)所述溶液的pH?？梢约尤胨?例如鹽酸)或堿(例如氫氧化鈉)以進(jìn)行該調(diào)節(jié)。
所述脂質(zhì)懸浮物將含有不同大小的液體顆粒。本發(fā)明的益處之一是能夠恒定地獲得幾乎均勻大小的小顆粒。因此，最好是獲得的大部分顆粒直徑小于100nm，更優(yōu)選小于50nm。
溶解所述脂質(zhì)混合物的優(yōu)選的方法如下(a)將注射用水(WFI)加入混合容器。(b)開(kāi)始混合并保證溫度為50-55℃。(c)將氯化鈉加至混合容器。在進(jìn)行下一步前，等待直到所述固體完全溶解。(d)將甘油加至所述混合容器中。使其有足夠時(shí)間以完全混合。(e)加入非所述脂質(zhì)混合物/丙二醇溶液中的余下丙二醇。給予足夠時(shí)間以充分混合。(f)降低混合率以減少混合容器中的湍流。(g)將所述脂質(zhì)混合物/丙二醇溶液加至混合容器中。(h)再調(diào)節(jié)混合至原初速率。(i)必要時(shí)，加入另外的WFI。(i)連續(xù)混合約25分鐘并保證完全混勻。(k)檢驗(yàn)并調(diào)節(jié)該溶液至目標(biāo)pH。步驟(3)第三步包括加熱得自步驟(2)的脂質(zhì)懸浮物至溫度約等于或高于存在于該溶液中的脂質(zhì)的凝膠至液晶的最高相變溫度。
該步驟的目的之一是提供可過(guò)濾的懸浮物。假如在正常的過(guò)程中流速?zèng)]有明顯的下降而在該過(guò)濾系統(tǒng)中壓力下降無(wú)明顯的增加時(shí)，則認(rèn)為溶液/懸浮物是可過(guò)濾的。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，所述制劑中的脂質(zhì)應(yīng)該超過(guò)其凝膠到液晶的相變，以便簡(jiǎn)化無(wú)菌過(guò)濾。當(dāng)所述脂質(zhì)低于所述相變溫度時(shí)，所述懸浮物顆粒是剛性的。然而，當(dāng)它們高于其相應(yīng)的凝膠-液晶相變溫度時(shí)，它們是更疏松結(jié)構(gòu)的構(gòu)型，因此更容易過(guò)濾。
DPPC和DPPA分別顯示相變溫度為41℃和67℃。MPEG5000-DPPE溶于水，因此它不表現(xiàn)出為大多數(shù)水合脂質(zhì)懸浮物的特征的凝膠-液晶相變。因?yàn)閮?yōu)選的制劑中的脂質(zhì)均顯示不同的凝膠到液體的相變，所以最好使用最高相變溫度67℃過(guò)濾所述溶液。通過(guò)維持溫度于67℃或高于67℃，使得所有脂質(zhì)高于其相應(yīng)的相變，從而保證疏松的構(gòu)型而通過(guò)所述過(guò)濾器。
通過(guò)于所述混合容器外套上熱交換線(xiàn)圈可以實(shí)現(xiàn)加熱。得自可控來(lái)源(例如熱水浴或熱水器)的熱水/蒸氣就會(huì)傳遞足夠的熱以維持所述混合液于設(shè)定的溫度。也可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它熱源。步驟(4)通過(guò)除菌過(guò)濾器過(guò)濾所述脂質(zhì)懸浮物從而進(jìn)行第四步。該步驟之后的目的是提供基本上無(wú)菌的懸浮物。當(dāng)過(guò)濾物含至少一個(gè)形成菌落的微生物的概率小于10-6時(shí)，則認(rèn)為該過(guò)濾物基本上無(wú)菌。
最好用除菌過(guò)濾柱進(jìn)行過(guò)濾。此外，可能需要強(qiáng)制溶液通過(guò)所述過(guò)濾器的手段(例如泵送或加壓)。由于進(jìn)行過(guò)濾的溶液需要保持在存在于溶液中的脂質(zhì)的凝膠到液晶最高相變溫度或高于該溫度下，所以過(guò)濾應(yīng)該在大致相同的溫度下進(jìn)行。為此，最好將過(guò)濾器(例如除菌過(guò)濾柱)密封在護(hù)套式過(guò)濾器外殼中，該外殼不斷加熱(例如通過(guò)來(lái)自溫控水浴的熱水流)，以保證所述懸浮物高于脂質(zhì)相變溫度。除菌過(guò)濾器的溫度優(yōu)選為50-100℃，更優(yōu)選為60-90℃，甚至更優(yōu)選70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80℃。
可以使用一個(gè)或多個(gè)除菌濾膜過(guò)濾所述懸浮物。需要的濾膜數(shù)目將取決于其除菌效果。最好使用兩個(gè)濾膜。濾膜孔的大小受限于提供無(wú)菌懸浮物的需要。最好使用0.2μm親水性濾膜。
優(yōu)選配方的本體溶液通過(guò)兩個(gè)0.2μm親水性濾膜以約1L/分鐘(1L/min)流速連續(xù)過(guò)濾長(zhǎng)達(dá)3小時(shí)，即所述懸浮液通過(guò)過(guò)濾器總計(jì)180L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)明顯的濾膜阻塞。脂質(zhì)分析表明，在所述過(guò)濾過(guò)程中沒(méi)有可檢測(cè)的脂質(zhì)丟失(由于過(guò)濾介質(zhì)累積引起的)。
優(yōu)選配方的本體溶液于40℃-80℃混合，所述懸浮物在無(wú)菌過(guò)濾前冷卻至室溫。未觀察到明顯的濾膜阻塞，表明所述懸浮物顆粒大小分布完全低于0.2μm的濾膜孔大小。最好是在過(guò)濾過(guò)程中應(yīng)用加熱以便保證脂質(zhì)混合物在無(wú)菌過(guò)濾物中的最大回收(即使脂質(zhì)顆粒在過(guò)濾介質(zhì)中的潛在保留最小化)。
過(guò)濾脂質(zhì)懸浮物的優(yōu)選方法如下(a)保證所有裝套的過(guò)濾器于70℃-80℃。(b)保證過(guò)濾裝置中的閥關(guān)閉。(c)連接過(guò)濾入口軟管至混合容器的出口。(d)打開(kāi)閥使溶液通過(guò)所述濾器。(e)在收集過(guò)濾物前使3升溶液通過(guò)過(guò)濾器進(jìn)行中洗。(f)連續(xù)過(guò)濾直至完成。步驟(5)將所述過(guò)濾液分配裝入管制瓶從而完成第五步。最好是在可控?zé)o菌區(qū)進(jìn)行該步驟。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，選定的管制瓶和傳遞至管制瓶的懸浮物的量應(yīng)該取決于所設(shè)想的脂質(zhì)懸浮物的最終用途。通過(guò)各種方法可以實(shí)現(xiàn)分裝，包括吸管、手動(dòng)注射器式分配器(例如Filamatic注射器式分配器)或工業(yè)自動(dòng)分配器(例如Cozzli或TL自動(dòng)灌裝機(jī))。步驟(6)用全氟烴氣交換得自步驟5的管制瓶的上部氣體，從而進(jìn)行第六步。交換的優(yōu)選方法是把已分裝的管制瓶載入冷凍干燥器室，用全氟烴氣替換管制瓶上部氣體。優(yōu)選的氣體是全氟丙烷(PFP)。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的上部氣體交換的其它方法。
在完成所述管制瓶上部氣體交換循環(huán)后，密封管制瓶。當(dāng)所述冷凍干燥器壓力下降回到大氣壓時(shí)，用PFP充入該室。固定管制瓶塞以封閉該管制瓶。步驟(7)第七步包括在步驟6后最后滅菌管制瓶。一種終末滅菌的方法是使用高壓滅菌器。此外，所述密封管制瓶可以最后在蒸汽滅菌器中滅菌，以進(jìn)一步提高所述產(chǎn)品的無(wú)菌保證。在滅菌過(guò)程中必須小心注意，因?yàn)榭捎^察到高壓滅菌引起的一定程度的脂質(zhì)降解。最好是所述管制瓶于126-130℃滅菌1-10分鐘。
本發(fā)明的其它特征在以下示例性實(shí)施方案的說(shuō)明過(guò)程中將變得顯而易見(jiàn)，給出所述實(shí)施方案是為了說(shuō)明本發(fā)明而不是用來(lái)對(duì)其進(jìn)行限制。
實(shí)施例表1脂質(zhì)混合物的目標(biāo)組成
脂質(zhì)混合物的生產(chǎn)方法 將甲苯(3.3L)、甲醇(1.2L)、DPPA(59.6g)、DPPC(535g)和MPEG5000 DPPE(405g)裝入一個(gè)燒瓶中。用0.9L甲醇沖洗固體接觸表面后，將該淤漿加熱至45-55℃直到完全溶解。
過(guò)濾該溶液，然后于35-45℃真空濃縮成為稠密凝膠。加入甲基叔丁基醚(MTBE,5.4L)，將該混合物于15-30℃淤漿化。經(jīng)離心或真空過(guò)濾收集白色固體，并用MTBE(0.9L)洗滌。然后將該固體放入真空爐中，并于40-50℃干燥至恒重。所干燥的脂質(zhì)混合物轉(zhuǎn)移至瓶中并保藏于-15-25℃。
在本發(fā)明脂質(zhì)混合物生產(chǎn)方法的另一實(shí)施方案中，也可以使用以下方法。
脂質(zhì)混合物的替代生產(chǎn)方法 根據(jù)分析證明“使用(Use As)”值的純度調(diào)節(jié)磷脂量。該實(shí)驗(yàn)的批量大小(合并的磷脂重量)是2kg。
向旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)瓶依次裝入甲苯(3,300mL)、甲醇(1,200mL)、DPPA(122.9g，校正的“使用”純度為97.0％)、DPPC(總量1,098.5g；500.8g取自98.4％“使用”純度的一批，597.7g取自96.7％“使用”純度的一批)和MPEG5000 DPPE(815.7g；校正的“使用”純度為99.3％)。用甲醇(900mL)把殘余的固體沖洗入所述燒瓶后，燒瓶放置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上(非真空)，將淤漿加熱至45-55℃(外部)。完全溶解后，使所述外部溫度降至35-45℃，采用真空，使溶液濃縮成白色半固體。從蒸發(fā)器取出燒瓶，用刮勺粉碎固體。燒瓶再用于蒸發(fā)器，繼續(xù)濃縮。達(dá)到終點(diǎn)(最終真空壓力為220mbar；白色顆粒型堅(jiān)固固體)后，經(jīng)旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器的加入管加入MTBE(5,400mL)，終止真空，所述混合物于15-30℃淤漿化15-45分鐘。經(jīng)離心或真空過(guò)濾分離固體，用MTBE(3,800mL)沖洗，在真空爐(40-50℃)中干燥至恒重。在轉(zhuǎn)移至帶聚丙烯蓋的聚乙烯瓶中以前，使固體過(guò)篩(0.079英寸目)去除固體塊，提供為白色固體的脂質(zhì)混合物(SG896)1,966.7g(98％)。
優(yōu)選的脂質(zhì)懸浮物含有1,2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷脂酸一鈉鹽(DPPA)；1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿(DPPC)；V-(甲氧基聚乙二醇5000氨基甲酰基)-1,2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺一鈉鹽(MPEG5000-DPPE)；聚乙二醇，USP；甘油，USP；氯化鈉，USP；和，注射用水，USP。
表2優(yōu)選的對(duì)照劑配方
*配方A的脂質(zhì)混合物濃度為1mg/mL；配方B的脂質(zhì)混合物濃度為0.75mg/mL。**該脂質(zhì)混合物包含DPPC 53.5wt.％，DPPA 6.0wt.％和MPEG5000-DPPE 40.5wt.％。
表3優(yōu)選的容器和封閉
成品的裝量體積可以為1.0-2.0mL/管制瓶。
在優(yōu)選配方的制備中，當(dāng)所述脂質(zhì)混合物與含注射用水、氯化鈉、甘油和丙二醇的水基質(zhì)溶液直接水合時(shí)，與過(guò)濾前的本體溶液相比，所述過(guò)濾物的脂質(zhì)含量較少。脂質(zhì)的丟失量變化范圍12％-48％。這些結(jié)果證實(shí)，所述無(wú)菌過(guò)濾過(guò)程是不能有效控制的，因此成品的脂質(zhì)含量是高度變異的。
相反，用目前描述的方法，所述脂質(zhì)的分析結(jié)果表明脂質(zhì)在所述過(guò)濾過(guò)程中全部回收。分析結(jié)果在理論值附近的變化是在正常的分析方法變異范圍內(nèi)。由在丙二醇中的第一種溶解脂質(zhì)混合物制備的懸浮物的數(shù)目、體積和反射密度的顆粒大小分布表明，在55℃以及70℃的過(guò)濾前本體溶液中，大多數(shù)顆粒小于50nm。顆粒分布型過(guò)濾后沒(méi)有變化。
應(yīng)用部分現(xiàn)在要求保護(hù)的方法用于制備超聲造影劑。這類(lèi)造影劑應(yīng)該可用于各種成像應(yīng)用，包括在超聲心動(dòng)圖和放射性超聲顯像中增強(qiáng)對(duì)比度。
顯然，根據(jù)上述內(nèi)容對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改進(jìn)和改變是可能的。因此，理所當(dāng)然的是，在后附的權(quán)利要求范圍內(nèi)，可以如本文所具體描述的其它內(nèi)容實(shí)施本發(fā)明。
權(quán)利要求
1．一種制備磷脂懸浮物的方法，包括(1)使磷脂混合物與非水溶劑接觸，由此使所述磷脂混合物基本上溶解于所述非水溶劑中，以及(2)使得自步驟(1)的溶液與水溶液接觸形成脂質(zhì)懸浮物。
2．按照權(quán)利要求1的方法，其中所述非水溶劑選自丙二醇、乙二醇和聚乙二醇300。
3．按照權(quán)利要求2的方法，其中所述非水溶劑是丙二醇。
4．按照權(quán)利要求2的方法，其中所述脂質(zhì)混合物包括(a)1,2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿；(b)1,2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷脂酸一鈉鹽；和(c)N-(甲氧基聚乙二醇5000氨基甲?；?-1,2-二棕櫚?；?sn-甘油基-磷脂酰乙醇胺一鈉鹽。
5．按照權(quán)利要求2的方法，其中所述非水溶劑在與所述脂質(zhì)混合物接觸前加熱至溫度約30-70℃。
6．按照權(quán)利要求5的方法，其中所述非水溶劑在與所述脂質(zhì)混合物接觸前加熱至溫度約50-55℃。
7．按照權(quán)利要求2的方法，其中脂質(zhì)混合物與非水溶劑的比率為每mL非水溶劑約含5mg脂質(zhì)混合物至約15mg/mL。
8．按照權(quán)利要求7的方法，其中脂質(zhì)混合物與非水溶劑的比率約為10mg/mL。
9．按照權(quán)利要求2的方法，其中在步驟(2)中，所述水溶液選自水、鹽水、鹽水/甘油混合物和鹽水/甘油/非水溶劑混合物。
10．按照權(quán)利要求9的方法，其中所述水溶液是鹽水和甘油的混合物。
11．按照權(quán)利要求9的方法，其中所述水溶液是鹽水、甘油和丙二醇的混合物。
12．按照權(quán)利要求11的方法，其中存在氯化鈉6.8mg/mL，存在甘油0.1mL/mL，存在丙二醇0.1mL/mL以及存在所述脂質(zhì)混合物約0.75-1.0mg/mL。
13．按照權(quán)利要求12的方法，其中存在脂質(zhì)混合物0.75mg/mL。
14．按照權(quán)利要求12的方法，其中存在脂質(zhì)混合物1.0mg/mL。
15．按照權(quán)利要求2的方法，其中在步驟(2)中，所述水溶液在與得自步驟(1)的溶液接觸以前加熱至溫度約45-60℃。
16．按照權(quán)利要求15的方法，其中所述水溶液在與得自步驟(1)的溶液接觸前加熱至溫度約50-55℃。
17．按照權(quán)利要求1的方法，其中所述方法還包括(3)加熱得自步驟(2)的脂質(zhì)懸浮物至溫度約等于或高于存在于所述懸浮物中的脂質(zhì)的凝膠到液晶的最高相變溫度。
18．按照權(quán)利要求17的方法，其中在步驟(3)中，所述脂質(zhì)懸浮物加熱至溫度至少約67℃。
19．按照權(quán)利要求17的方法，其中所述方法還包括(4)所述脂質(zhì)懸浮物通過(guò)無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾。
20．按照權(quán)利要求19的方法，其中在步驟(4)中，用兩根無(wú)菌過(guò)濾柱進(jìn)行過(guò)濾。
21．按照權(quán)利要求20的方法，其中在步驟(4)中，所述除菌過(guò)濾柱的溫度約70-80℃。
22．按照權(quán)利要求21的方法，其中在步驟(4)中，使用0.2μm的親水性濾膜。
23．按照權(quán)利要求19的方法，其中所述方法還包括(5)將得自步驟(4)的過(guò)濾的溶液分裝入管制瓶中。
24．按照權(quán)利要求23的方法，其中所述方法還包括(6)用全氟烴氣替換得自步驟(5)的管制瓶上部的氣體。
25．按照權(quán)利要求24的方法，其中所述全氟烴氣為全氟兩烷。
26．按照權(quán)利要求25的方法，其中用冷凍干燥室進(jìn)行上部氣體的交換。
27．按照權(quán)利要求24的方法，其中所述方法還包括(7)消毒得自步驟(6)的管制瓶。
28．按照權(quán)利要求27的方法，其中在步驟(7)中，所述管制瓶于約126-130℃消毒1-10分鐘。
29．一種制備脂質(zhì)混合物的方法，包括(a)使至少兩種脂質(zhì)與第一種非水溶劑接觸；(b)濃縮該溶液至稠密凝膠；(c)使稠密凝膠與第二種非水溶劑接觸；以及，(d)收集所得的固體。
30．按照權(quán)利要求29的方法，其中在步驟(a)中，所述脂質(zhì)是(ⅰ)1,2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿；(ⅱ)1,2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷脂酸一鈉鹽；和(ⅲ)N-(甲氧基聚乙二醇5000氨基甲酰基)-1,2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺一鈉鹽。
31．按照權(quán)利要求30的方法，其中在步驟(a)中，所述第一種非水溶劑是甲醇和甲苯的混合物。
32．按照權(quán)利要求30的方法，其中在步驟(c)中，所述第二種非水溶劑是甲基叔丁基醚。
33．按照權(quán)利要求30的方法，其中在步驟(a)中，將所述溶液加熱至足以使所述脂質(zhì)完全溶解到所述溶劑中的溫度。
34．按照權(quán)利要求33的方法，其中在步驟(a)中，將所述溶液加熱至約25-75℃。
35．按照權(quán)利要求30的方法，其中在步驟(d)中，所收集的固體用甲基叔丁基醚洗滌并在真空干燥。
36．一種磷脂懸浮物，包括(a)懸浮物的脂質(zhì)混合物量約0.75-1.0mg/mL；(b)懸浮物的氯化鈉量約6.8mg/mL；(c)懸浮物的甘油量約0.1mL/mL；(d)懸浮物的丙二醇量約0.1mL/mL；以及(e)水；其中所述懸浮物通過(guò)所述方法制備，該方法包括(1)使脂質(zhì)混合物與非水溶劑接觸，由此使所述脂質(zhì)混合物基本上溶解于所述非水溶劑中。(2)使得自步驟(1)的溶液與水溶液接觸形成脂質(zhì)懸浮物；(3)將得自步驟(2)的脂質(zhì)懸浮物加熱至溫度約等于或高于存在于所述懸浮物中的脂質(zhì)的凝膠到液晶的最高相變溫度。(4)通過(guò)除菌過(guò)濾器過(guò)濾所述脂質(zhì)懸浮物。
37．一種按照權(quán)利要求36的磷脂懸浮物，其中所述脂質(zhì)混合物包括(a)1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿；(b)1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸一鈉鹽；和(c)N-(甲氧基聚乙二醇5000氨基甲?；?-1,2-二棕櫚?；?sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺一鈉鹽。
38．一種按照權(quán)利要求37的磷脂懸浮物，其中所述非水溶劑在與所述脂質(zhì)混合物接觸前加熱至溫度約50-55℃。
39．一種按照權(quán)利要求37的磷脂懸浮物，其中脂質(zhì)混合物與非水溶劑的比率為約10mg/mL。
40．一種按照權(quán)利要求37的磷脂懸浮物，其中所述水溶液是鹽水、甘油和丙二醇的混合物。
41．一種按照權(quán)利要求40的磷脂懸浮物，其中存在脂質(zhì)混合物0.75mg/mL。
42．一種按照權(quán)利要求37的磷脂懸浮物，其中所述水溶液在與得自步驟(1)的溶液接觸前加熱至溫度約50-55℃。
43．一種按照權(quán)利要求37的磷脂懸浮物，其中在步驟(3)中，將所述脂質(zhì)懸浮物加熱至溫度至少約67℃。
44．一種按照權(quán)利要求43的磷脂懸浮物，其中在步驟(4)中，使用兩個(gè)0.2μm親水性濾膜。
全文摘要
本發(fā)明描述了制備脂質(zhì)混合物和含該脂質(zhì)混合物的均勻可過(guò)濾的磷脂懸浮物的方法,該懸浮物可用作超聲造影劑。
文檔編號(hào)A61K49/00GK1288373SQ99802102
公開(kāi)日2001年3月21日 申請(qǐng)日期1999年1月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年1月14日
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