. 2)清洗3遍，每組培養(yǎng)液中加入約2000個原頭節(jié)，置37°C，5% C0J?育箱內(nèi)培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察TUDCA對細粒棘球蝴原頭節(jié)形態(tài)和活力的影響。
[0028]數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法：加藥后24h開始，每組每天均勻抽取200 y L培養(yǎng)液（平均含原頭節(jié)約90-120個），用0. 1%伊紅染色15min，倒置顯微鏡下觀察原頭節(jié)的活力?；铑^節(jié)拒染、不著色，且有活動性；死亡或活力減弱的原頭節(jié)紅染著色，伴有結(jié)構破壞。計算每組每天平均死亡率。每隔4d換液一次（每組體系和濃度同第一次加藥時），連續(xù)觀察，直至最大作用濃度的原頭節(jié)全部死亡。實驗重復三次。實驗2 :CA作用后原頭節(jié)表面結(jié)構的變化
[0029]在測活力的同時，隨機取相對應的原頭節(jié)做電鏡，觀察原頭節(jié)超微結(jié)構的變化。PBS洗滌3次，每次5min ;置4%戊二醛固定24h。將原頭節(jié)放入濃度為50%、70%、80%、90%、100%的酒精內(nèi)逐級梯度脫水，脫水時間分別為5min、10min、30min、lh至過夜，臨界點干燥，真空噴金L00A，在LE01430VP掃描電子顯微鏡下觀察原頭節(jié)表層超微結(jié)構變化。
[0030]實驗3 ：CA作用后原頭節(jié)內(nèi)部結(jié)構的變化
[0031]在測活力的同時，隨機取相對應的原頭節(jié)做電鏡，觀察原頭節(jié)超微結(jié)構的變化。PBS洗滌3次，每次5min ;置4%戊二醛前固定24h。用小離心管離心，去除上清液，用瓊脂糖包埋頭節(jié)，取出凝膠繼續(xù)放入4%戊二醛內(nèi)固定24h。將固定好的原頭節(jié)用PBS(PH7. 4)沖洗3次，每次15min，2% 0s04中后固定lh，用PBS再沖洗兩遍。酒精逐級梯度脫水，30%—50%— 60%各 10min，70% 過夜，次日再置 80%— 90% 各 lOmin，100% 30min。之后丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂（Epon812)包埋，固定后修型，LKB2088V型超薄切片機切片，醋酸鈾和硝酸鉛雙重染色，置于日立H-600型透射電子顯微鏡觀察原頭節(jié)內(nèi)部超微結(jié)構的變化。
[0032]實驗結(jié)果：
[0033]參考圖1，為CA體外培養(yǎng)細粒棘球蝴原頭節(jié)的形態(tài)變化，倒置顯微鏡下觀察，CA作用后的原頭節(jié)多呈外翻型，原頭節(jié)頂突上的小鉤排列紊亂，部分脫落，吸盤突起，變形，活動性減弱或死亡。藥物作用5d后，隨著CA濃度的增加，原頭節(jié)的形態(tài)變化明顯。DMSO組的原頭節(jié)頂突凸出或凹入，體積較大，活動良好.參考圖2，為CA對體外細粒棘球蝴原頭節(jié)的殺傷作用。不同濃度 CA (500 ymol/L、1000 ymol/L、2000 ymol/L、3000 ymol/L)體外培養(yǎng) 18d的細粒棘球蝴原頭節(jié)活力測定結(jié)果見圖2，顯示不同濃度CA對體外細粒棘球蝴原頭節(jié)均有抑制作用。其中3000 ymol/L CA作用18d原頭節(jié)死亡率達100%。從活力曲線圖中可以看出，隨著藥物濃度的增加和用藥時間的延長，原頭節(jié)的抑制率增加，此作用具有劑量依賴性和時間依賴性。各實驗組原頭節(jié)死亡率與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01)。
[0034]同時，申請人在掃描電子顯微鏡下觀察了 CA作用后的原頭節(jié)超微結(jié)構變化，觀察顯示空白對照組原頭節(jié)表面光滑，多呈內(nèi)陷型，頭節(jié)呈球形或橢圓形；用3000 iimol/L CA作用細粒棘球蝴原頭節(jié)5d后，在掃描電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，原頭節(jié)多呈外翻型，頂突破壞、頭鉤缺損、吸盤變形，體表出現(xiàn)許多陷窩，皮層呈蟲蛀樣損害（圖3)。
[0035]同時，在透射電鏡下觀察，正常培養(yǎng)的細粒棘球蝴原頭節(jié)合胞體帶結(jié)構較致密，內(nèi)有大小不等、形狀不一的囊泡，排列較規(guī)則，外側(cè)有較多排列整齊的微毛；原頭節(jié)內(nèi)含有不同類型的細胞，實質(zhì)細胞的核大而明顯，核仁居中，核內(nèi)染色質(zhì)較細膩，異染色質(zhì)較少。CA作用后的細粒棘球蝴原頭節(jié)合胞體帶變薄，結(jié)構松散，囊泡擴張，纖毛減少，且排列不規(guī)則；部分實質(zhì)細胞基質(zhì)濃縮，核周隙輕微增寬，核仁消失；合胞體帶和腔內(nèi)出現(xiàn)空泡（圖4)。
[0036]綜上可以看到，不同濃度CA對體外細粒棘球蝴原頭節(jié)均有抑制作用，濃度為3000 ymol/L的CA對細粒棘球蝴原頭節(jié)殺傷作用最明顯，隨著時間的延長，抑制作用顯著增加（P < 0. 01)。在證實CA對原頭節(jié)有抑制作用的基礎上，探索不同濃度的CA對細粒棘球蝴原頭節(jié)的形態(tài)學影響。研究結(jié)果顯示，CA作用后，可導致體外細粒棘球蝴原頭節(jié)的形態(tài)發(fā)生不同程度的改變。內(nèi)陷型和外翻型原頭節(jié)是蟲體不同的存在形式。當條件適適宜時，原頭節(jié)頂突內(nèi)凹，可保護頭鉤、吸盤、微毛不受損害；當加入CA后，外翻型的原頭節(jié)增多。正常培養(yǎng)的細粒棘球蝴原頭節(jié)生發(fā)層的微毛發(fā)育良好，數(shù)量多，附著并延伸入角質(zhì)層內(nèi)，可增加生發(fā)層與角質(zhì)層的接觸面積，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，在棘球蝴無血液供應的情況下仍可較快生長并不斷形成育囊。不同濃度CA作用后的細粒棘球蝴原頭節(jié)，在透射電鏡下觀察，微毛出現(xiàn)不同程度的缺損，并且生發(fā)層內(nèi)的細胞被空泡所替代。其不利于形成育囊，使原頭節(jié)的生長受到抑制而死亡。
[0037]總而言之，CA對體外細粒棘球蝴原頭節(jié)有殺傷作用。
【主權項】
1.膽酸作為活性成分在制備治療細粒棘球蝴病藥物中的應用。2.根據(jù)權利要求1的應用，其特征在于膽酸的濃度不低于500ymol/Lo3.根據(jù)權利要求2的應用，其特征在于膽酸的濃度為2000-3000μ mol/L。4.膽酸作為活性成分在制備治療囊性肝包蟲病藥物中的應用。5.膽酸作為細粒棘球蝴原頭節(jié)抑制劑的應用。6.根據(jù)權利要求5的應用，其特征在于膽酸的濃度不低于500μ mol/L。7.根據(jù)權利要求6的應用，其特征在于膽酸的濃度為2000-3000μ mol/L。
【專利摘要】本發(fā)明公開了膽酸作為活性成分在制備治療細粒棘球蚴病藥物中的應用，以膽酸殺滅細粒棘球蚴病的病原-細粒棘球蚴絳蟲，具有顯著的抑制和殺滅細粒棘球蚴原頭節(jié)的效果，從而實現(xiàn)細粒棘球蚴病的治療。
【IPC分類】A61K31/575, A61P33/10
【公開號】CN105012316
【申請?zhí)枴緾N201510445834
【發(fā)明人】姜玉峰, 呂海龍, 史紅娟
【申請人】姜玉峰
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年7月27日