熊去氧膽酸作為活性成分在制備治療細(xì)粒棘球蚴病藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及熊去氧膽酸的藥學(xué)應(yīng)用，屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)粒棘球蝴病(echinococcosis)又稱囊性包蟲病(cysticechinococcosis,CE)，是由細(xì)粒棘球蝴絳蟲(Echinococcus granulosus，Eg)的中絳期幼蟲所致的一種嚴(yán)重危害人民健康和畜牧業(yè)發(fā)展的人獸共患寄生蟲病。該病呈全球性分布，在我國主要流行于新疆、青海、內(nèi)蒙古、西藏等畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的省區(qū)。囊性包蟲病主要影響肝臟，也可以在肺中發(fā)展。目前，針對于該病的治療主要是外科手術(shù)的方法，即肝包蟲外膜內(nèi)外囊完整切除術(shù)。近年來所采用的肝包蟲外膜內(nèi)外囊完整摘除術(shù)盡管能大大降低包蟲病的復(fù)發(fā)率，最大程度地減少手術(shù)對肝實質(zhì)的損傷，但當(dāng)包蟲囊腫體積較大或貼近重要臟器或管道(肝門或膽管)時，則需要選擇開放式外膜內(nèi)外囊完整摘除術(shù)。此種術(shù)式可能會有頭節(jié)的外漏和殘留，術(shù)中和術(shù)后需要藥物輔助治療預(yù)防包蟲復(fù)發(fā)。因此總體來看，術(shù)中頭節(jié)外溢及頭節(jié)的處理不當(dāng)是手術(shù)治療囊性包蟲病存在的難以克服的缺陷。
[0003]針對上述問題，本領(lǐng)域嘗試在體外采用高濃度酸性(HCl)和堿性溶液(KOH)，臨床常用的局部化療藥物有20%高滲鹽水，但對周圍正常肝組織有一定的破壞作用；本領(lǐng)域也曾有研究發(fā)現(xiàn)膽汁可以抑制包蟲囊腫的發(fā)育，但是膽汁成分復(fù)雜，作用目標(biāo)多，藥學(xué)效果多變，例如膽汁、膽汁酸在肝臟和血液中滯留會產(chǎn)生多種毒性作用，包括細(xì)胞毒作用及急、慢性毒性作用，造成肝損傷及全身多系統(tǒng)、多器官損害，最終導(dǎo)致肝硬化、肝功能衰竭和死亡；也曾有研究發(fā)現(xiàn)膽汁酸對胰腺腺泡細(xì)胞形成損傷等。
[0004]因此，獲得一種作用確切、療效明確、能有效防治細(xì)粒棘球蝴病的藥物依舊是本領(lǐng)域亟待解決的課題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]申請人在長期研究過程中驚喜地發(fā)現(xiàn)熊去氧膽酸(UDCA)可以有效抑制和殺滅原頭節(jié)的生長，從而用于細(xì)粒棘球蝴病的臨床治療。
[0006]在本發(fā)明中，熊去氧膽酸(UDCA)，其化學(xué)名稱為:3 α，7β-二羥基-5β-膽甾烷-24-酸，是一種親水膽酸，存在于正常人膽汁中，占人體總膽酸的3%，可松弛膽總管括約肌，促進(jìn)肝臟糖原蓄積，保肝解毒，自1989年應(yīng)用于原發(fā)性膽汁性肝硬化和原發(fā)性硬化性膽管炎的治療，是FDA批準(zhǔn)治療原發(fā)性膽汁性肝硬化的唯一藥物。
[0007]熊去氧膽酸作為一種溶解膽固醇性結(jié)石的藥物，因具有較強(qiáng)的抑肝作用而廣泛用于多種肝病的治療。最近國內(nèi)學(xué)者還發(fā)現(xiàn)熊去氧膽酸具有治療脂肪肝的療效，可降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)按酶(AST)、r-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(r_GT)，降低血脂，明顯緩解脂肪肝癥狀，改善脂肪肝的影像學(xué)表現(xiàn)，且不良反應(yīng)輕微。
[0008]首先，本發(fā)明公開了熊去氧膽酸作為活性成分在制備治療細(xì)粒棘球蝴病藥物中的應(yīng)用。
[0009]上述的藥物，既可以是單純的活性成分原料，還可以是將熊去氧膽酸作為活性成分與其他輔料做成的各種制劑，例如常見的片劑、膠囊、滴丸、輸液、凍干粉針等，對于藥物劑型及其相應(yīng)輔料的選擇，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整。
[0010]上述的細(xì)粒棘球蝴病，既可以是動物體上的，也可以是人體上的，根據(jù)該癥的臨床發(fā)病部位，通常指的是囊性肝包蟲病。
[0011]因此，本發(fā)明還公開了熊去氧膽酸作為活性成分在制備治療囊性肝包蟲病藥物中的應(yīng)用。
[0012]根據(jù)需要，可使用不同濃度的熊去氧膽酸，一般來說，為了有效的殺滅病原，熊去氧膽酸的濃度不低于1000 ymol/L。
[0013]針對常見的原頭節(jié)生長密度，優(yōu)選的，熊去氧膽酸的濃度為2000-4000 μ mol/L。
[0014]優(yōu)選的，連續(xù)用藥時間不低于6天。
[0015]在上述濃度下，對細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)具有比較理想的抑制和殺滅效果。
[0016]在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明還公開了熊去氧膽酸作為細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)抑制劑的應(yīng)用。
[0017]本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，在多種實驗環(huán)境下，尤其是動物離體實驗情況下，為了防止由于動物體內(nèi)的細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)在體外的生長和頭節(jié)外溢，需要加入必要的抑制劑，例如20%高滲鹽水等。
[0018]與上述類似，熊去氧膽酸的濃度不低于1000 ymol/L，優(yōu)選的，熊去氧膽酸的濃度為 2000-4000 μmol/L。
【附圖說明】
[0019]圖1為熊去氧膽酸對細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)形態(tài)的影響，其中，A:空白組原頭節(jié):DMSO組原頭節(jié)；C:2000 μ mol/L UDCA作用6d的原頭節(jié)；D:4000 μ mol/L UDCA作用6d的原頭節(jié)；E:2000 μ mol/L UDCA作用12d的原頭節(jié)；F:4000 μ mol/L UDCA作用12d的原頭節(jié)。
[0020]圖2為不同濃度的熊去氧膽酸對細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)活力的影響。
[0021 ]圖3為熊去氧膽酸對細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)表面超微結(jié)構(gòu)的影響，其中，A:對照
[0022]組原頭節(jié)；B、C:4000 μ mol/L熊去氧膽酸作用6d原頭節(jié)。
【具體實施方式】
[0023]為了說明熊去氧膽酸(UDCA)的應(yīng)用效果，申請人進(jìn)行了體外實驗說明熊去氧膽酸對細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)的殺滅效果，申請人進(jìn)行了下述實驗。
[0024]實驗1:UDCA體外作用于細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)的效果
[0025]取新鮮的自然感染細(xì)粒棘球蝴的綿羊肝臟，清潔羊肝表面，用75%酒精消毒表面，無菌條件下抽取含原頭節(jié)的囊液，移入無菌瓶中。用PBS (PH = 7.2)清洗原頭節(jié)3次至澄清，用0.1%伊紅染液做染色排斥實驗，98%以上拒染。肉眼觀察原頭節(jié)呈細(xì)白沙樣均勻顆粒，活性好的原頭節(jié)沉降速率快，活性不好的或者死亡的原頭節(jié)沉降速率相對比較慢。
[0026]倒置顯微鏡下觀察原頭節(jié)蟲體呈內(nèi)陷型，散在密布，蟲體結(jié)構(gòu)飽滿，呈橢圓形，結(jié)構(gòu)清晰完整，鈣顆粒清亮而明顯。然后將原頭節(jié)分裝至含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中(青霉素100U/mL，鏈霉素100U/mL)，置37°C、5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0027]實驗分組:RMP1-1640培養(yǎng)基空白對照組、1000 ymol/L UDCA 組、2000 μ mol/LUDCA 組、3000 μ mol/L UDCA 組、4000 μ mol/L UDCA 組、DMSO 組。取六孔板，每孔設(shè) 5mL 體系，按以上分組，配好相應(yīng)的培養(yǎng)液。
[0028]將在體外培養(yǎng)5天后的細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)用PBS (pH = 7.2)清洗3遍，每組培養(yǎng)液中加入約2000個原頭節(jié)，置37°C ,5% C0J?育箱內(nèi)培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察UDCA對細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)形態(tài)和活力的影響。
[0029]數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法:加藥后24h開始，每組每天均勻抽取200 μ L培養(yǎng)液(平均含原頭節(jié)約90-120個)，用0.1 %伊紅染色15min，倒置顯微鏡下觀察原頭節(jié)的活力?；铑^節(jié)拒染、不著色，且有活動性；死亡或活力減弱的原頭節(jié)紅染著色，伴有結(jié)構(gòu)破壞。計算每組每天平均死亡率。每隔4d換液一次(每組體系和濃度同第一次加藥時)，連續(xù)觀察，直至最大作用濃度的原頭節(jié)全部死亡。實驗重復(fù)三次。實驗2:UDCA作用后原頭節(jié)表面結(jié)構(gòu)的變化
[0030]在測活力的同時，隨機(jī)取相對應(yīng)的原頭節(jié)做電鏡，觀察原頭節(jié)超微結(jié)構(gòu)的變化。PBS洗滌3次，每次5min ;置4%戊二醛固定24h。將原頭節(jié)放入濃度為50%、70%、80%、90%、100%的酒精內(nèi)逐級梯度脫水，脫水時間分別為5min、10min、30min、Ih至過夜，臨界點干燥，真空噴金L00A，在LE01430VP掃描電子顯微鏡下觀察原頭節(jié)表層超微結(jié)構(gòu)變化。
[0031]實驗結(jié)果:
[0032]參考圖1，為UDCA體外培養(yǎng)細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)6d及12d的形態(tài)變化，倒置顯微鏡下觀察，UDCA作用后的原頭節(jié)多呈外翻型，原頭節(jié)頂突上的小鉤排列紊亂，部分脫落，吸盤突起，變形，活動性減弱或死亡。隨著UDCA濃度的增加，原頭節(jié)的形態(tài)變化明顯?？瞻讓φ战M和DMSO組的原頭節(jié)頂突凸出或凹入，體積較大，活動良好。
[0033]參考圖2，為UDCA對體外細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)的殺傷作用。不同濃度UDCA(1000 μ mol/L、2000 μ mol/L、3000 μ mol/L、4000 μ mol/L)體外培養(yǎng) 12d 的細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)活力測定結(jié)果見圖2，顯示不同濃度UDCA對體外細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)均有抑制作用。其中4000 μ mol/L UDCA作用12d原頭節(jié)死亡率達(dá)100%。3000 μ mol/L作用12d原頭節(jié)死亡率為74.6%。從活力曲線圖中可以看出，隨著藥物濃度的增加和用藥時間的延長，原頭節(jié)的抑制率增加，此作用具有劑量依賴性和時間依賴性。各實驗組原頭節(jié)死亡率與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05)。
[0034]同時，申請人在掃描電子顯微鏡下觀察了 UDCA作用后的原頭節(jié)超微結(jié)構(gòu)變化，觀察顯示空白對照組原頭節(jié)表面光滑，多呈內(nèi)陷型，頭節(jié)呈球形或橢圓形；用4000 ymol/LUDCA作用細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)6d后，在掃描電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，原頭節(jié)多呈外翻型，頂突破壞、頭鉤缺損、吸盤變形，體表出現(xiàn)許多陷窩，皮層呈蟲蛀樣損害(圖3)。
[0035]綜上可以看到，不同濃度UDCA對體外細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)均有抑制作用，濃度為4000 μ mol/L的UDCA對細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)殺傷作用最明顯，隨著時間的延長，抑制作用顯著增加(P < 0.05)。在證實UDCA對原頭節(jié)有抑制作用的基礎(chǔ)上，探索不同濃度的UDCA對細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)的形態(tài)學(xué)影響。研究結(jié)果顯示，UDCA作用后，可導(dǎo)致體外細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)的形態(tài)發(fā)生不同程度的改變。內(nèi)陷型和外翻型原頭節(jié)是蟲體不同的存在形式。當(dāng)條件適適宜時，原頭節(jié)頂突內(nèi)凹，可保護(hù)頭鉤、吸盤、微毛不受損害；當(dāng)加入UDCA后，外翻型的原頭節(jié)增多。正常培養(yǎng)的細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)生發(fā)層的微毛發(fā)育良好，數(shù)量多，附著并延伸入角質(zhì)層內(nèi)，可增加生發(fā)層與角質(zhì)層的接觸面積，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，在棘球蝴無血液供應(yīng)的情況下仍可較快生長并不斷形成育囊。
[0036]總而言之，UDCA對體外細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)有殺傷作用。
【主權(quán)項】
1.熊去氧膽酸作為活性成分在制備治療細(xì)粒棘球蝴病藥物中的應(yīng)用。2.根據(jù)權(quán)利要求1的應(yīng)用，其特征在于熊去氧膽酸的濃度不低于1000ymol/L。3.根據(jù)權(quán)利要求2的應(yīng)用，其特征在于熊去氧膽酸的濃度為2000-4000μ mol/L。4.熊去氧膽酸作為活性成分在制備治療囊性肝包蟲病藥物中的應(yīng)用。5.熊去氧膽酸作為細(xì)粒棘球蝴原頭節(jié)抑制劑的應(yīng)用。6.根據(jù)權(quán)利要求5的應(yīng)用，其特征在于熊去氧膽酸的濃度不低于1000μ mol/L。7.根據(jù)權(quán)利要求6的應(yīng)用，其特征在于熊去氧膽酸的濃度為2000-4000μ mol/L。
【專利摘要】本發(fā)明公開了熊去氧膽酸作為活性成分在制備治療細(xì)粒棘球蚴病藥物中的應(yīng)用，以熊去氧膽酸殺滅細(xì)粒棘球蚴病的病原-細(xì)粒棘球蚴絳蟲，可以顯著抑制和殺滅細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)，從而實現(xiàn)細(xì)粒棘球蚴病的治療。
【IPC分類】A61P33/10, A61K31/575
【公開號】CN105012317
【申請?zhí)枴緾N201510447706
【發(fā)明人】呂海龍, 姜玉峰, 郭文平
【申請人】呂海龍
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年7月27日