關(guān)鍵問題是：腸道菌群的異常是通過什么機(jī)理導(dǎo)致代謝綜合癥 發(fā)生的？ 一般認(rèn)為腸道菌群的異常將對腸道的免疫系統(tǒng)造成過度的激活，產(chǎn)生持續(xù)而低 度的炎癥，而后者將抑制胰島素的信號傳導(dǎo)，產(chǎn)生胰島素抵抗，進(jìn)而產(chǎn)生高血糖。為了降 低高血糖，肝臟將血糖轉(zhuǎn)化為甘油三脂，而過度的甘油三脂，及其積累會產(chǎn)生脂變（fat degeneration),形成脂肪肝，即普通脂肪肝（simple steatosis)。如前所述，在第二次打 擊（second hit)例如肝臟病毒感染的條件下，普通脂肪肝將有可能進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為非酒精性 肝炎（non-alcoholic steatohepatitis, NASH)。而后者的特點(diǎn)是持續(xù)的肝臟炎癥，肝臟實(shí) 質(zhì)細(xì)胞（hepatocytes)的損傷，氣球樣脂肪變（ballooning fat degeneration)。肝臟實(shí) 質(zhì)細(xì)胞的損傷將會產(chǎn)生多重代謝紊亂，例如肝臟分解膽固醇的能力降低，導(dǎo)致LDL-C升高， HDL-C降低，從而造成心血管疾病，動脈粥樣硬化（Atherosclerosis),溶血系統(tǒng)的紊亂，如 腦血栓，中風(fēng)。
[0029] 7.腸道防御素與腸道菌群的平衡。
[0030] 小腸表皮細(xì)胞能夠分泌多種抗菌多肽（anti-microbe peptides, AMPs)進(jìn)入腸道 粘液層中，行使宿主的自主免疫功能。在哺乳動物中，抗菌多肽大致可以分為兩類防御素， cathelicidins 和 defensins[44]。而防御素（defensins)又包括 a，0 和 0 三種類型
[45]。防御素主要由兩類細(xì)胞產(chǎn)生，第一類是骨髓細(xì)胞來源的吞噬性白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞， 第二類是小腸末端的潘氏細(xì)胞（Panethes cells)特有的alpha防御素5 (alpha-defensin 5，DEFA5)以及alpha防御素6(alpha_defensin 6，DEFA6)。在生理狀況下，潘氏細(xì)胞在腸 道共生菌（symbionts)的作用下能夠表達(dá)一定量的抗菌肽，并分泌到腸腔黏膜中。腸腔中 抗菌肽與腸道菌群的相互制約，決定了腸道菌群的生態(tài)（Microbiome)平衡[46]。
[0031] 小腸潘氏細(xì)胞分泌的alpha防御素具有廣譜的抗菌活性。alpha防御素占 了潘氏細(xì)胞分泌的防御素的含量的70 %左右。與大多數(shù)的分泌蛋白質(zhì)一樣，細(xì)胞內(nèi) 新合成的alpha防御素需要經(jīng)過特異蛋白酶的剪切加工?；|(zhì)金屬蛋白酶7(matrix metalloproteinase 7, MMP7)是加工alpha防御素的關(guān)鍵蛋白酶，也是小腸潘氏細(xì)胞的特 異標(biāo)記[47]。因?yàn)閍lpha防御素的雙極性及表面活性劑特征，它們行使抗菌作用可能是依 靠破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的機(jī)制。維持宿主和其腸道菌群之間的平衡是一個(gè)極其復(fù)雜事情，在這 期間，需要腸道表面的免疫系統(tǒng)起作用，其中表皮細(xì)胞發(fā)揮了巨大了作用，特別是處于腸道 表皮中的潘氏細(xì)胞，由于可以分泌多種防御素，所以在維持宿主和腸道菌群的平衡方面就 起到了重要的作用[48-49]。有研宄表明，肥胖病人的腸道潘氏細(xì)胞的防御素表達(dá)降低，這 也我們的發(fā)明應(yīng)用提供了病理基礎(chǔ)[50]。
[0032] 綜上所述，作為該方面的理論基礎(chǔ)，我們推測高脂肪飲食本身并不能誘導(dǎo)典型的 代謝綜合癥，而維生素D的缺失，作為第二次打擊，將與高脂肪飲食一同才能產(chǎn)生形成代謝 綜合癥。據(jù)此，通過大量的動物試驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)在高脂肪飲食及維生素D缺乏（high fat feeding plus vitamin D deficiency, HFD+VDD)長期喂養(yǎng)條件下，小鼠獲得了與人類代 謝綜合癥以及非酒精脂肪肝炎（NASH)類似的性狀[8]。更進(jìn)一步，我們近來發(fā)現(xiàn)，在代謝 綜合癥動物模型中，腸道菌群的失衡（dysbiosis)，腸道通透性的增加，內(nèi)毒素入血，系統(tǒng) 炎癥，胰島素耐受都與腸道多種外分泌抗菌肽的下調(diào)密切相關(guān)。于是，我們應(yīng)用人工合成 的人alpha防御素對代謝綜合癥小鼠進(jìn)行治療，取得了以下發(fā)現(xiàn)：（1) 口服alpha防御素 5(alpha_defensin 5，DEFA5)可以有效地再平衡腸道菌群（eubiosis) ;(2) 口服 alpha 防 御素5可以減緩代謝綜合癥的多種癥狀，包括降低空腹血糖，降低系統(tǒng)炎癥，降低胰島素抵 抗，消融脂肪肝；（3) 口服alpha防御素5可以降低腸道肝臟螺旋桿菌（H.h印aticus)，回升 腸道共生菌Akkermanicia ; (4)體外試驗(yàn)表明alpha防御素5可以直接殺滅肝臟螺旋桿菌。 在以上新發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，我們設(shè)計(jì)了以下發(fā)明，包括制備alpha防御素5,以及以alpha防 御素5作為治療代謝綜合癥，2型糖尿病及其并發(fā)癥的應(yīng)用。因?yàn)閍lpha防御素6與alpha 防御素5有著結(jié)構(gòu)與功能的類似性，同時(shí)基于我們的試驗(yàn)結(jié)果，我們的發(fā)明也包括alpha防 御素6的制備以及應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0033] 本發(fā)明首先涉及alpha防御素5、6及其衍生物的如下方面的應(yīng)用：
[0034] (1)制備治療代謝綜合征藥物，所述代謝綜合征包括但不限于，向心性肥胖、高血 糖、高甘油三酯血癥、高血壓以及以葡萄糖不耐受和胰島素抵抗為癥狀的血糖調(diào)節(jié)異常；
[0035] (2)制備調(diào)節(jié)腸道菌群（gut microbiota)或調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的藥物，所述的腸 道菌群包括，Helicobacter Hepaticus(HH)菌屬，和Akkermansia muciniphila(AKK)菌屬，
[0036] 所述的調(diào)節(jié)具體為：上調(diào)AKK類的共生菌豐度、下調(diào)HH類的有害菌菌的豐度，或在 上調(diào)AKK類益生菌的同時(shí)下調(diào)HH類有害菌；
[0037] 所述的調(diào)節(jié)腸道菌群平衡指調(diào)節(jié)腸道菌群生態(tài)，包括增加腸道菌群的多樣性以及 豐度，以及由此而產(chǎn)生的治療效果。
[0038] (3)制備改善脂肪肝，降低血漿中甘油三醋、降低血液低密度脂蛋白膽固醇的的藥 物；該藥物也可以提升高密度脂蛋白膽固醇含量。
[0039] (4)制備治療尚血糖相關(guān)疾病的藥物，所述的尚血糖相關(guān)疾病可以是尚血糖導(dǎo)致 的感染、心血管病變、腎功能衰竭、以及糖尿病的其他并發(fā)癥包括雙目失明、下肢壞植。
[0040] 本發(fā)明還涉及一種治療代謝綜合征的藥物，所述的藥物包括，治療有效量的防御 素5、6及其衍生物，以及適用于口服給藥制劑的常用的輔料：包括稀釋劑，粘合劑，穩(wěn)定劑， 抗氧化劑等。
[0041] 所述的防御素5和防御素6的氨基酸序列結(jié)構(gòu)為：
[0042] Alpha 防御素 5 (hDEFA5) :ATCYC RHGRC ATRESL SGVCE ISGRL YRLCC R，3 位和 31 位，5位和20位，10位和30位半骯氨酸之間有三個(gè)二硫鍵，
[0043] Alpha 防御素 6 (hDEFA6) : AFTCH CRRSC YSTEY SYGTC TVMGI NHRFC CL，4 位和 31 位，6位和20位，10位和30位半骯氨酸之間有三個(gè)二硫鍵。
[0044] 所述的alpha防御素5或alpha防御素6的衍生物為，對防御素5或防御素6的 一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行多個(gè)（優(yōu)選為1~3個(gè)）氨基酸缺失、增加；或多個(gè)（優(yōu)選為1~3個(gè)）結(jié)構(gòu) 或性質(zhì)類似的氨基酸的替換；或alpha防御素5或alpha防御素6的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行糖基化， 乙?；?，磷酸化，羧基化等修飾。其排他性之要點(diǎn)是這些衍生物應(yīng)該保持或提高以上所講述 的生理以及平衡腸道菌群的功能，并且具有極低毒理及生理副作用。
[0045] 本發(fā)明還涉及維生素D3的如下方面的應(yīng)用：
[0046] (1)制備用于上調(diào)腸道中alpha防御素5、6的表達(dá)量的制劑；
[0047] (2)制備治療代謝綜合征藥物，所述代謝綜合征包括但不限于，向心性肥胖、高血 糖、高甘油三酯血癥、高血壓以及以葡萄糖不耐受和胰島素抵抗為癥狀的血糖調(diào)節(jié)異常；
[0048] (3)制備調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的藥物，所述的腸道菌群包括，Akkermansia muciniphila(AKK)菌屬和Helicobacter Hepaticus(HH)菌屬，所述的調(diào)節(jié)具體為：上調(diào) AKK類的益生菌菌落數(shù)量、下調(diào)HH類的有害菌菌落數(shù)量，或在上調(diào)AKK類益生菌菌落數(shù)量的 同時(shí)下調(diào)HH類有害菌在腸道中的含量；該藥物的制備及應(yīng)用也包括平衡腸道中的其他變 形桿菌（Proteobacteria)，包括多種條件性致病菌。
[0049] (4)制備降低血漿中甘油三醋、低密度脂蛋白膽固醇的含量的藥物；
[0050] (5)制備治療高血糖相關(guān)疾病的藥物，所述的高血糖相關(guān)疾病可以是高血糖導(dǎo)致 的感染、心血管病變、糖尿病的并發(fā)癥包括腎功能衰竭、雙目失明、下肢壞植。
[0051] 本發(fā)明還涉及一種治療代謝綜合征的藥物，所述的藥物包括，治療有效量的維生 素D3，以及適用于口服給藥制劑的常用的輔料：包括稀釋劑，粘合劑，穩(wěn)定劑，抗氧化劑等。
[0052] 本發(fā)明還涉及alpha防御素5、6的制備方法，所述方法包括如下步驟：
[0053] 第一階段，應(yīng)用固相合成樹脂將Fmoc (9-fluorenylmethyloxy-carbonyl)保護(hù)的 氨基酸通過C末端進(jìn)行連接；
[0054] 第二階段，形成三個(gè)特異的二硫鍵。
[0055] 所述的第一階段的具體步驟為：
[0056] (1)列依照人源序列設(shè)計(jì)摻入氨基酸殘基的序，
[0057] DEFA5的序列為：ATCYCRHGRCATRESLSGVCEISGRLYRLCCR;
[0058] DEFA6的序列為：AFTCHCRRSCYSTEYSYGTCTVMGINHRFCCL;
[0059] (2)側(cè)鏈殘基（side chains)的保護(hù)方法：
[0060] 對于谷氨酸，蘇氨酸和酪氨酸，色氨酸，應(yīng)用o-tbutyl，tBoc(叔丁氧羰基）；
[0061]對于精氨酸，應(yīng)用 n_2, 2, 5, 7, 8-pentamethylchroman-6-sulphonyl;
[0062] 對于N和C端的半胱氨酸，應(yīng)用三苯甲基；
[0063] 對于形成二硫鍵的半胱氨酸的保護(hù)方法：
[0064] DEFA5,其 cys-3, cys-30,以及 DEFA6,其 cys-4, cys-31 的半胱氨酸，應(yīng)用三苯甲 基作為保護(hù)基團(tuán)；
[0065] DEFA5,其 cys-5, cys-20，以及 DEFA6,其 cys-6, cys-20 的半胱氨酸，應(yīng)用 s-tbutyl作為保護(hù)基團(tuán)；
[0066] DEFA5, cys-10 和 cys-30，以及 DEFA6,其 cys-10, cys-30 的半胱氨酸，應(yīng)用乙酰 氨基（ACM)作為保護(hù)基團(tuán)；
[0067] (3)受保護(hù)的肽基樹脂，經(jīng)過TFA含有二氯甲烷，硫醚和二硫化物處理；
[0068](4)按照alpha防御素5/6的序列依次連接當(dāng)氨基酸，并將合成完畢的肽段從樹脂 上裂解，獲得線性肽粗品，經(jīng)過TFA處理，N-和C-末端的半胱氨酸殘基的S-三苯甲基保護(hù) 組保護(hù)在同時(shí)被剪除，而肽鏈從樹脂上裂解下來，而ACM和s-tbutyl保護(hù)的cys-3、cys-20、 cys-10及cys-30的保護(hù)不變；
[0069] (5)用反相高效液相色譜法，對初線性肽進(jìn)行分離，用含TFA的乙腈水進(jìn)行線性梯 度洗脫，將高峰匯集，凍干并進(jìn)行氨基酸序列分析，確定合成完畢的肽序列。
[0070] 所述的第二階段的具體步驟為：
[0071](l)Cys3與Cys31半胱氨酸殘基之間的二硫鍵形成：
[0072] 上述含游離巰基的Cys3和Cys31的線性DEFA5懸浮于在水中；
[0073] 加入乙酸銨溶液調(diào)整pH至6. 8,滴加鐵氰化鉀（K3 [Fe (CN) 6])以確保氧化；
[0074] 將溶液濃縮至小體積，然后用活化的硫醇-瓊脂糖4B樹脂柱除去含有游離硫醇基 的肽段；
[0075] 用乙酸銨緩沖液（pH6. 8)對柱中的肽進(jìn)行洗脫，將肽水溶液合并，凍干。
[0076]將干燥的物質(zhì)應(yīng)用通過反相HPLC純化，將主峰合并，冷凍干燥，進(jìn)行氨基酸和序 列分析，通過測序，質(zhì)譜分析證實(shí)正確的序列。
[0077] (2) Cys-3與Cys-20半胱氨酸殘基之間的二硫鍵：
[0078]將上述純化的線性DEFA5溶于三氟乙醇（trifluoroethanol)，通過還原反應(yīng)，以 三丁基膦（tri-butylphosphine)脫去S-叔丁基團(tuán)上Cys3以及Cys20殘基上的保護(hù)基團(tuán) (方案如圖6);
[0079] 反應(yīng)混合物濃縮至小體積，通過加入乙醚使產(chǎn)物沉淀；
[0080] 將分離的固體過濾并用乙醚洗滌，并干燥；
[0081] 將干燥的制備物懸浮于水中，然后使用鐵氰化鉀，在pH6. 8進(jìn)行氧化，經(jīng)過分離， 干燥后，對所得的材料以反相HPLC進(jìn)行分離；
[0082] 對主要峰的級分合并，分析氨基酸的組成及序列，用質(zhì)譜分析鑒定。
[0083] (3) CyslO與Cys30半胱氨酸殘基之間的二硫鍵：
[0084] 以上述肽溶于水/甲醇的混合物（5:1)中，然后滴加碘/甲醇中的溶液，進(jìn)行氧化 反應(yīng)；
[0085] 用硫代硫酸鈉中和，將甲醇通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去，然后將獲得的材料凍干；
[0086] 將粗物質(zhì)溶解在水中，并通過硫醇-瓊脂糖柱進(jìn)行分離：將柱用0.1 M乙酸銨緩沖 液，PH6. 5洗滌，將水溶液冷凍干燥，將干燥的物質(zhì)用反相HPLC純化，所有餾分被匯集，并凍 干。
[0087] 通過測定序列，光譜和氨基酸分析。合成肽的質(zhì)量可以通過比較其HPLC保留時(shí) 間，CD譜和質(zhì)譜進(jìn)行評估。
[0088] 具體描述：
[0089] (1)本發(fā)明涉及以aloha服防御素5/6實(shí)施對代謝綜合征的治療應(yīng)用。
[0090] 該專利設(shè)計(jì)的"新穎性/非顯而易見性"以及其"實(shí)用性"是基于在"技術(shù)背景"以 及下面描述的工作原理，以及我們的動物試驗(yàn)結(jié)果和新發(fā)現(xiàn)，同時(shí)包括合理的推測以及可 實(shí)施方案的設(shè)計(jì)。
[0091] Alpha防御素5/6 (DEFA5/6)是小腸潘氏細(xì)胞（Paneth cell)所外分泌的抗菌多 肽，通過協(xié)調(diào)/控制腸道菌群，使人體處于正常的生理狀態(tài)。近來通過動物實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn) 在維生素D缺乏/低下的狀態(tài)，DEFA5下降，導(dǎo)致腸道菌群的異常（dysbiosis),腸道致病 菌增加，內(nèi)毒素入血增加，產(chǎn)生系統(tǒng)炎癥，導(dǎo)致胰島素抵抗，產(chǎn)生脂肪肝，生理代謝紊亂。作 為該發(fā)明的基礎(chǔ)，我們應(yīng)用可服低劑量的人