用于治療代謝綜合征的融合蛋白的制作方法
【專利說明】用于治療代謝綜合征的融合蛋白
[0001] 本發(fā)明涉及FGF-21融合蛋白以及包含F(xiàn)GF-21融合蛋白的藥物化合物、牽涉FGF 融合蛋白的藥物組合物、用途和方法，特別是治療至少一種代謝綜合征和/或動脈粥樣硬 化，特別是糖尿病、血脂異常、肥胖癥（obesity)和/或多脂（adipositas)。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病由其臨床表現(xiàn)表征，即非胰島素依賴性或成人發(fā)病型（maturity onset form)，也稱為2型糖尿病，和胰島素依賴性或青年發(fā)病型（juvenile onset form)，也稱為 1型糖尿病。2型糖尿病和潛在肥胖癥臨床癥狀的表現(xiàn)通常在超過40的年齡出現(xiàn)。相比之 下，1型糖尿病通常顯示更快的疾病發(fā)作，通常在30以前。該疾病為人代謝性疾病，在普通 人群中的發(fā)病率約為百分之一，其中四分之一為1型糖尿病而四分之三為2型糖尿病。2型 糖尿病的疾病特征為高循環(huán)血糖、胰島素和皮質(zhì)類固醇水平。
[0003] 目前，存在多種治療2型糖尿病的藥理學(xué)方法，其可單獨(dú)或組合使用，并通過不同 的作用模式發(fā)揮作用：
[0004] 1)磺酰脲刺激胰島素分泌；
[0005] 2)雙胍（二甲雙胍）通過促進(jìn)葡萄糖利用、減少肝臟葡萄糖生成并減少腸內(nèi)葡萄 糖產(chǎn)出發(fā)揮作用；
[0006] 3)胰高血糖素樣肽-1受體激動劑（GLP-1R激動劑），稱作"腸降血糖素模擬物"， 通過胰腺β細(xì)胞的葡萄糖依賴性胰島素分泌發(fā)揮作用，并且減緩胃排空。
[0007] 4)〇〇葡糖苷酶（〇(3-8111(3〇81(^86)抑制劑（阿卡波糖、米格列醇）減緩碳水化合物 消化，并因此減緩腸道吸收并降低餐后高血糖；
[0008] 5)噻唑烷二酮類（曲格列酮）增強(qiáng)胰島素作用，從而促進(jìn)外周組織中血糖利用； 和
[0009] 6)胰島素刺激組織葡萄糖利用并抑制肝臟葡萄糖產(chǎn)出。
[0010] 然而，大多數(shù)藥物功效有限，且無法解決最重要的問題一一β-細(xì)胞功能降低和相 關(guān)的肥胖。
[0011] 1型糖尿病因胰腺中產(chǎn)生胰島素的β-細(xì)胞的自身免疫性破壞造成，并且特征性 地顯示出非常低的或不可測量的血漿胰島素，伴有升高的胰高血糖素。因?yàn)棣?細(xì)胞分泌 胰島素，所以特異性針對β -細(xì)胞的免疫應(yīng)答導(dǎo)致1型糖尿病。目前1型糖尿病的治療方 案試圖最小化因天然胰島素缺乏導(dǎo)致的高血糖。
[0012] 肥胖癥為一種在現(xiàn)代社會高度普遍的慢性疾病，并與包括糖尿病、胰島素抗性、高 血壓、高膽固醇血癥和冠心病在內(nèi)的多種醫(yī)學(xué)難題相關(guān)。其與糖尿病和胰島素抗性進(jìn)一步 高度相關(guān)，后者通常伴有高胰島素血癥或高血糖或兩者。另外，2型糖尿病與二至四倍冠狀 動脈疾病風(fēng)險相關(guān)。
[0013] 成纖維細(xì)胞生長因子21 (FGF21或FGF-21)為主要由肝臟產(chǎn)生的新型代謝調(diào)節(jié)物， 其在肥胖癥和2型糖尿病動物模型中發(fā)揮有效的抗糖尿病和降脂作用。這種激素有助于 體重調(diào)節(jié)，并且參與小鼠對營養(yǎng)缺乏（nutritional deprivation)和生酮狀態(tài)（ketogenic state)的應(yīng)答。FGF-21代謝作用的主要位點(diǎn)為脂肪組織、肝臟和胰腺。實(shí)驗(yàn)性研宄已經(jīng)顯 示，在對糖尿病小鼠和靈長類中施用FGF-21后，糖尿病代償和血脂障礙有改善（Dostalova 等，2009)。已顯示在存在和不存在胰島素時，F(xiàn)GF21刺激小鼠3T3-L1脂肪細(xì)胞中的葡萄糖 吸收，并以劑量依賴的方式減少〇b/ob及db/db小鼠和8周齡的ZDF大鼠中攝食和空腹血 糖、甘油三酯和胰高血糖素水平，如此，這為FGF-21用作治療糖尿病和肥胖癥的療法提供 了基礎(chǔ)（例如參見W003/011213)。
[0014] 成纖維細(xì)胞生長因子（FGF)是在發(fā)育中的和成體的組織中廣泛表達(dá)的多肽。FGF 家族目前由FGF-I到FGF-23的23個成員組成。FGF家族成員在脊椎動物物種間的基 因結(jié)構(gòu)和氨基酸序列高度保守。有18種哺乳動物成纖維細(xì)胞生長因子（FGF1-FGF10和 FGF16-FGF23)，它們根據(jù)序列同源性和種系發(fā)生上的差異分為6個亞家族。少數(shù)幾個未分 配到亞家族的"FGF"，即FGF同源因子（之前稱為FGFl 1-FGF14)，與FGF家族具有高度序列 同一性，但不激活FGF受體（FGFR)，因此通常不被認(rèn)為是FGF家族的成員。
[0015] 盡管大多數(shù)FGF充當(dāng)細(xì)胞生長和分化的局部調(diào)節(jié)物，但最近研宄顯示包括 FGF-15/-19、FGF-21和FGF-23在內(nèi)的FGF-19亞家族成員通過內(nèi)分泌方式發(fā)揮重要的代謝 作用。FGF-19亞家族成員調(diào)節(jié)多種不受經(jīng)典FGF影響的生理過程。這些內(nèi)分泌因子種類廣 泛的代謝活性包括調(diào)節(jié)膽汁酸、碳水化合物和脂質(zhì)代謝，以及磷酸鹽、鈣和維生素 D體內(nèi)穩(wěn) 態(tài)（Tomlinson 等 2002， Holt 等 2003， Shimada 等 2004， Kharitonenkov 等 2005， Inagaki 等 2005, Lundasen 等 2006)。
[0016] FGF-21最初從小鼠胚胎中分離。FGF-21mRNA在肝臟中表達(dá)最豐富，在胸腺中表達(dá) 程度較少（Nishimura等2000)。人FGF-21與小鼠 FGF-21高度同一（約75%的氨基酸同一 性）。在人FGF家族成員中，F(xiàn)GF-21與FGF-19最相似（約35 %的氨基酸同一性）（Nishimura 等 2000)。FGF-21 沒有增殖和致瘤效應(yīng)（Kharitonenkov 等 2005, Huang 等 2006, Wente 等 2006)，而所述效應(yīng)對FGF家族的大部分成員很典型（Ornitz和Itoh 2001，Nicholes等， 2002, Eswarakumar 等，2005)。
[0017] 向瘦蛋白缺陷型肥胖ob/ob小鼠、瘦蛋白受體缺陷型db/db小鼠和肥胖ZDF大 鼠施用FGF-21顯著地降低了血糖和甘油三酯，減低了空腹胰島素水平，并且在口服葡萄 糖耐受實(shí)驗(yàn)中改善了葡萄糖清除率。在兩周的施用過程中，F(xiàn)GF-21沒有影響糖尿病或瘦 小鼠和大鼠的食物攝入或體重/構(gòu)成。重要的是，F(xiàn)GF-21在糖尿病或健康動物中測試 的任何劑量下，或當(dāng)在轉(zhuǎn)基因小鼠中過表達(dá)時，都沒有誘導(dǎo)有絲分裂、低血糖或體重增加 (Kharitonenkov等2005)。FGF-21過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠對飲食誘導(dǎo)的肥胖癥有抗性。
[0018] 向糖尿病恒河猴施用FGF-216周后降低了空腹血漿葡萄糖、果糖胺、甘油三酯、胰 島素和胰高血糖素（glucagone)水平。重要的是，盡管有顯著的降低葡萄糖作用，但在研宄 中沒有觀察到低血糖。施用FGF-21也顯著減少了 LDL膽固醇和增加了 HDL膽固醇，并且相 比小鼠（Kharitonenkov等2005)，輕微但顯著地降低了體重（Kharitonenkov等2007) 〇
[0019] 進(jìn)一步的信息可從下列參考文獻(xiàn)中獲得：
[0020] I.Dostalova I.等：Fibroblast Growth Factor 21:A Novel Metabolic Regulator With Potential Therapeutic Properties in Obesity/Type 2Diabetes Mellitus.Physiol Res 58:1-7,2009。
[0021] 2. ESWARAKUMAR V. P.等：Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors.Cytokine Growth Factor Rev 16:139-149,2005〇
[0022] 3. HOLT J. A.等：Def inition of a novel growth factor-dependent signal cascade for the suppression of bile acid biosynthesis.Genes Dev 17:1581-1591，2003。
[0023] 4. HUANG X.等：Forced expression of hepatocytespecific fibroblast growth factor 21delays initiation of chemically induced hepatocarcinogenesis. Mol Carcinog 45:934-942,2006。
[0024] 5. INAGAKI T.等：Endocrine regulation of the fasting response by PPAR a -mediated induction of fibroblast growth factor 21.Cell Metab 5:415-425, 2007。
[0025] 6. KHARIT0NENK0V A.等：FGF_21as a novel metabolic regulator. J Clin Invest 115:1627-1635,2005。
[0026] 7. KHARIT0NENK0V A.等：The metabolic state of diabetic monkeys is regulated by fibroblast growth factor-21. Endocrinology 148:774-781，2007〇
[0027] 8. LUNdA SEN T.等：Circulating intestinal fibroblast growth factor 19has a pronounced diurnal variation and modulates hepatic bile acid synthesis in man. J Intern Med 260:530