組，分組情況見表3。
[0071] 免疫后四周翅靜脈采血，檢測血清中IBD的抗體效價，結(jié)果見圖3,其中，佐劑A、B、 C、D為同一劑量的不同球蟲佐劑。結(jié)果表明本發(fā)明球蟲佐劑不需與活疫苗混合，只需同時 免疫即可達到免疫增強的效果。
[0072] 表3球蟲佐劑對雞傳染性法氏囊病活疫苗的免疫效果試驗

[0074] 實施例4
[0075] 按照與實施例1相同的方法制備球蟲佐劑，區(qū)別僅在于，分別使柔嫩艾美耳球蟲、 和緩艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲、斯氏艾美耳球蟲及剛地弓形蟲制備球蟲佐劑A、B、C、D、 E〇
[0076] 將上述佐劑A-E用于雞新支減流四聯(lián)滅活疫苗后，檢測其對新支減流四聯(lián)滅活疫 苗（La Sota株+M41株+AV127株+H9S2株）的免疫增強效果。其中A-l、A-2均為佐劑A， B-l、B-2均為佐劑B，A、B、C、D、E為五種不同的球蟲佐劑。
[0077] 球蟲佐劑與滅活疫苗混勻后，Votex上再點混20s，混好后放在冰上，盡快使用。取 120日齡蛋雞80只，隨機分為8組，分組情況見表4,全部頸部皮下注射，每只0. 5ml。
[0078] 免疫后18天翅靜脈采血測定血清中冊、18405、及禽流感119亞型抗體效價，結(jié)果 見圖4,結(jié)果表明本發(fā)明球蟲佐劑對四聯(lián)苗中的EDS有著明顯的免疫增強效果，可比疫苗對 照組提高接近3個抗體滴度。
[0079] 表4球蟲佐劑用于新支減流四聯(lián)滅活疫苗的免疫效果試驗
[0081] 實施例5
[0082] 按照以下方式獲得卵囊提取物：
[0083] 球蟲卵囊提取物1的制備：
[0084] 取IX 107個柔嫩艾美耳球蟲卵囊離心沉淀，加入lmL飽和鹽水55°C水浴30min， 期間混勾數(shù)次；加入4mL PBS，3600rpm離心5min，棄上清；加入lmL次氯酸鈉溶液（有效氯 含量彡4% )，冰浴30min，期間混勾數(shù)次；加入4mL PBS，3600rpm離心5min，棄上清，重復(fù)3 次，至無明顯"消毒液"氣味，棄上清，保留沉淀；沉淀加入5mL TRIzol，用移液器反復(fù)吸打幾 次，室溫（15-30°C )放置5min ;加入lmL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置3min ;4°C，12000rpm 離心15min，混合物分為兩層；上層水相轉(zhuǎn)移至新管，體積補至5mL，記為卵囊提取物1，4°C 保存?zhèn)溆谩?br>[0085] 球蟲卵囊提取物2的制備：
[0086] 取1X107個柔嫩艾美耳球蟲卵囊離心沉淀，加入lmL鉻硫酸，冰浴lOmin，加 入10mL PBS，3600rpm，離心5min，棄上清，重復(fù)3次洗絳沉淀；沉淀加少量PBS，旋禍震蕩 5min，3600rpm，離心5min，棄上清；沉淀加入5mL TRIzol，用移液器反復(fù)吸打幾次，室溫 (15_30°C )放置5min ;加入lmL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置3min ;4°C，12000rpm離心 15min，混合物分為兩層；下層有機相轉(zhuǎn)移至新管，加入1. 5mL無水乙醇，-20°C，15min后， 4°C，12000rpm離心15min，沉淀加入5mL PBS，記為卵囊提取物2,4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0087] 球蟲卵囊提取物3的制備
[0088] 取1X107個柔嫩艾美耳球蟲卵囊離心沉淀，加入lmL PBS、100y 1蛋白酶K(10mg/ mL)、50 y 1 SDS混勾，70°C水浴lh ;3600rpm離心5min，棄上清，沉淀沉淀加入5mL TRIzol， 用移液器反復(fù)吸打幾次，室溫（15-30°C )放置5min ;加入lmL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置 3min ;4°C，12000rpm離心15min，混合物分為兩層；下層有機相轉(zhuǎn)移至新管，加入1. 5mL無 水乙醇，-20°C，15min后，4°C，12000rpm離心15min，上清轉(zhuǎn)移至新管，加入7. 5mL異丙醇， 室溫放置101^11，41：，12000印111離心101^11，棄上清；用含0.311鹽酸胍的95%乙醇洗滌沉 淀，4°C，12000rpm離心10min，重復(fù)兩次；加入lmL SDS(1% )，50°C水浴溶解沉淀，PBS補至 5mL，記為卵囊提取物3,4°C保存?zhèn)溆?br>[0089] 將以上制備的球蟲卵囊提取物佐劑1-3用于H7N9病毒滅活疫苗免疫小鼠后檢測 其對H7N9滅活疫苗的免疫效果，結(jié)果見圖5和見圖6。
[0090]4-6周齡雌性BALB/c小鼠分為10組，每組10只。分別腹腔注射PBS，鋁佐劑（AL)， H7N9病毒滅活疫苗+鋁佐劑（AL+HA)，球蟲佐劑1 (Col)，球蟲佐劑1+H7N9病毒滅活疫苗 (Col+HA)，球蟲佐劑2 (Co2)，球蟲佐劑2+H7N9病毒滅活疫苗（Co2+HA)，球蟲佐劑3 (Co3)，球 蟲佐劑3+H7N9病毒滅活疫苗（C〇3+HA)。其中，滅活H7N9病毒100ug/只，鋁佐劑（AL) 60ug/ 只。共進行兩次免疫，間隔14天。每次免疫14天后尾靜脈采血，測定血清中H7N9血凝抑制 抗體滴度，結(jié)果見圖5,結(jié)果顯示，一免后HA免疫組有30%小鼠產(chǎn)生抗體保護，幾何均數(shù)為 2. 6 ;AL+HA組有3只產(chǎn)生抗體，幾何均數(shù)為2. 6 ;Col+HA組10只小鼠都產(chǎn)生抗體，幾何均數(shù) 為26. 4, Co2+HA組9只小鼠產(chǎn)生抗體，幾何均數(shù)為22. 5 ;Co3+HA組3只小鼠產(chǎn)生抗體，幾何 均數(shù)為2. 5 ;其余組小鼠未產(chǎn)生HI抗體。二免后，HA免疫組、HA+AL組、HA+Col組、HA+Co2 組、HA+Co3組小鼠100%產(chǎn)生抗體，其余各組均未產(chǎn)生抗體。HA免疫組，HI抗體幾何均數(shù)為 140 ;AL+HA組HI抗體幾何均數(shù)為242 ;C01+HA組HI抗體滴度幾何均數(shù)為557, C02+HA組HI 抗體滴度幾何均數(shù)為735 ;C03+HA組HI抗體滴度幾何均數(shù)為80。
[0091] 一免后14天及二免后14天，小鼠輕度麻醉后，以50ul/只、107 5TCID5QH7N9禽流 感病毒滴入小鼠鼻腔。感染后第5天每組處死6只小鼠，取小鼠鼻洗液和肺組織測定病毒 滴度，結(jié)果見圖6,其中，圖A與圖B為一免后鼻洗液及肺組織中的病毒滴度；圖C為二免 后鼻洗液及肺組織中病毒滴度。一免后14天，10個組在感染后第5天鼻洗液中都檢測到 病毒復(fù)制，PBS組鼻洗液病毒滴度均值為logl02 84TCID5(l，AL組鼻洗液病毒滴度高于PBS組 為logl0 3 44TCID5Q，Col組、Co2組、Co3組、HA組、HA+AL組、HA+Co3組鼻洗液病毒滴度與 PBS組接近沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0. 05)。HA+Col組和HA+C〇2組鼻洗液病毒滴度顯著低于 PBS 組，分別為 loglOa28TCID5Q和 loglO UTCID^PW. 01)。除 HA+Co2 組，其余 9 個組在感 染后第5天肺組織中都檢測到病毒復(fù)制，PBS組肺組織病毒滴度均值為logl05 34TCID5(l，AL 組為l〇gl〇4 66TCID5(l，Col組、Co2組、Co3組肺組織病毒滴度與PBS組接近沒有統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0. 05)。HA組、HA+AL組、HA+Co3組的肺組織病毒滴度接近，低于PBS組。HA+Col組和 HA+Co2組肺組織病毒滴度顯著低于PBS組，分別為logl0 147TCID5(l和0 (P〈0. 01)。二免后 14天，PBS組、AL組、Col組、Co2組和Co3組的鼻洗液平均病毒滴度高于logl02. 5TCID50， 肺組織勻漿平均病毒滴度高于l〇gl〇5. 2TCID50。HA組、HA+AL組、HA+Col組、HA+Co2組和 HA+C〇3組鼻洗液病毒滴度均低于檢測下限。HA組和HA+AL組，每組各有1只小鼠肺組織 勻漿檢測到病毒復(fù)制（n = 6)。HA組肺組織勻漿病毒滴度為loglOO. 75TCID50、HA+AL組 肺組織勻漿病毒滴度為loglOO. 5TCID50。HA+Col組、HA+Co2組和HA+Co3組鼻