專利名稱：聯(lián)合用藥的雌激素－雄激素－孕激素口服避孕藥的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及本發(fā)明廣義地涉及了藥物制劑領域并且特別涉及到口服避孕藥的領域。具體而言，本發(fā)明涉及年輕的口服避孕藥使用者中峰骨質(peak bonemass)的自然增長。
2．現(xiàn)有技術在美國，由于十三歲到十九歲年齡段的受孕率相對較高，所以有關兒科及青春期婦科專家經(jīng)常建議年輕婦女采取一些避孕方式來預防意外妊娠(避孕報告，1995)。青少年中最常見的避孕方法是口服避孕藥，這占性行為群體的近46％。因此，幾乎半數(shù)的絕經(jīng)前女性(＜44歲)在她們骨胳仍處于成熟且未達到峰骨質之前就可能已服用了口服避孕藥，峰骨質是在大約30-35歲時出現(xiàn)。峰骨質是一項用于描述骨密度所能及的最高點的術語。就婦女而言，她們的骨密度在約30-35歲前不斷增加但在其余生卻緩慢減少。該峰值被當作峰骨質。由于骨密度在晚年降低，所以更容易發(fā)生骨質疏松癥或骨折。因此，盡可能達到較高的峰(骨質)值對于預先防止上述問題的發(fā)生很重要。
在絕經(jīng)前婦女中，雌激素雖然是維持骨密度所必需的，但雄激素的作用或它們的聯(lián)用效果是不確定的。通常認為，低劑量雌激素在少女體內是有效的骨胳生長促進劑并且可能提供主要的生長刺激，而在少男中，雌激素可以和睪酮一起參與快速生長(Kulin,1991)。然而，某些近期的跡象表明，雄激素在女性及男性中對骨骼的構筑及維持都起重要作用。在青春期期間，雄激素影響骨骼的生長及峰骨質，但在青春期以后、青春期期間以及成年早期，雄激素也參與骨質的維持。峰骨質直至30-35歲才能達到(Recker等人，1992)，但成人身高的15％及骨骼質量的48％是在青春期時期達到的。
不幸的是，口服避孕藥療法(如卵巢切除術)會導致雄激素水平的急劇降低，因此口服避孕藥通常用來治療婦女多毛癥(Carr等人，1995)。患有雄激素過多癥(hyperandrogenemia)的年輕婦女表現(xiàn)為促黃體素(LH)的升高以及游離睪丸素/總睪丸素比值(fT/T)的增高，以及性激素-結合球蛋白(SHBG)血清水平的降低。低劑量口服避孕藥可減輕激素失調及雄激素過多癥(Yamamoto和Okada,1994；Rosenfield和Lucky,1993)。令人感興趣的是，口服避孕藥療法不僅降低雄激素過多癥婦女的血清A、T及fT，并且口服避孕藥療法中的雌激素(E2)水平也顯著降低。
在用于抑制排卵的首批口服活性類固醇中，一些本來就具有雌激素活性而隨后發(fā)現(xiàn)某些孕酮制劑與雌激素有染。這表明，雌激素提高了孕激素的抑制活性從而導致了兩者混合物的普遍應用。Rock、Pincus和Garcia最先就通過使用孕激素藥來抑制排卵進行了綜合性調查。研究表明，只要需要就可以令排卵停止并且這具有極強的規(guī)律性(Rock等人，1957；Pincus,1960)。所用化合物是從19-去甲睪酮衍生的，這些化合物是在月經(jīng)第5至25天口服給藥。
最常見類型的口服避孕藥是聯(lián)用制劑，這種聯(lián)用制劑中同時含有雌激素和孕激素。這些制劑的應用經(jīng)驗表明它們中99-100％有效。因此，這種可逆避孕法最有效并且仍在開發(fā)中。其它有關類固醇避孕法的改進也已嘗試成功。順序用制劑在作為口服避孕藥時已能夠達到約98-99％的成功率，在順序用制劑中，雌激素需攝入14-16天并在其后攝取5或6天的雌激素與孕激素的混合物。但是，由于有報導認為子宮內膜瘤發(fā)生率的增加以及較低的有效性，此類順序用制劑業(yè)已從市場上消失。取而代之的是含有雌激素及在月經(jīng)周期內可改變的相對低劑量的孕激素的產(chǎn)品。在表1中列出了二期及三期順序用的口服避孕藥制劑。人們正在試圖研制激素給予量更低的此類制劑，從而降低副作用的發(fā)生率及嚴重性。
已有許多人體研究驗證了口服避孕藥的使用與骨骼健康之間的關系。Tuppurainen等人(1994)用BMD(骨無機物密度)來研究口服避孕藥對絕經(jīng)中的婦女(48-60歲)的影響。29％的婦女是口服避孕藥的曾經(jīng)使用者?？诜茉兴幍氖褂谜?n=939)比未用藥者(n=2283)具有略微高(但呈統(tǒng)計學顯著性)的腰BMD。在1968至1990年間進行了涉及更多受試對象的研究(皇家學院普通開業(yè)醫(yī)師對口服避孕的研究，n=46,000婦女)并對口服避孕藥的應用與隨后首次骨折的發(fā)生率(包括頭骨骨折、肋骨骨折及多發(fā)性骨折)之間的關系進行驗證，受試對象是已婚或同居婦女(Cooper等人，1993)。在對年齡、經(jīng)產(chǎn)狀況、吸煙及社會經(jīng)濟階層進行調整后發(fā)現(xiàn)，曾服用口服避孕藥的婦女比從未使用過口服避孕藥的婦女相比，她們繼發(fā)骨折的危險性極高(相對危險率1.20)，因此，這種極其前瞻性的研究建議，口服避孕藥的使用并不能長期促進骨骼健康，而且甚至會受到骨折風險的危害。
當多數(shù)人體內研究已深入到絕經(jīng)后婦女人群中時，一些研究對“更年輕”女性表現(xiàn)出關注，這些人群還未達到峰骨質。在對156位絕經(jīng)前女性(年齡在20-30間)的縱深研究中，Recker等人(1992)發(fā)現(xiàn)口服避孕藥的使用與全身骨質之間存在正性關系，但與腰椎(L2-L4)或前臂的骨質無關。Lindsay等人(1986)報導了從2個橫切片(cross-sectional)試驗中取得的結果，其中一個試驗涉及57位年齡在25-35歲間的健康絕經(jīng)前婦女，其中的24人已服用了不止6個月的口服避孕藥(30或50mg炔雌醇和炔諾孕酮)。在研究期間受試對象無一攝入口服避孕藥。先前的口服避孕藥使用與腰椎內BMD的增加有關，但與撓骨的無關。第2個橫切片試驗表明，與24個年齡相當?shù)膮⒄諏ο笙啾?，?4位絕經(jīng)后婦女中口服避孕藥的使用與腰椎BMD無關。
在對60位24-35歲間的婦女進行的橫切片研究中，Kanders等人(1984)發(fā)現(xiàn)，口服避孕藥的使用者(使用多于5個月)比未使用者具有顯著高的腰椎BMD。Goldsmith和Johnston(1975)于1969至1970年期間在一個大型橫切片試驗中對不同婦女群體就口服避孕藥的使用與撓骨遠側無機物之間的聯(lián)系進行了試驗，那時，多數(shù)年齡為20-29歲間的口服避孕藥使用者服用美雌醇(n=219)而相對較少的對象服用炔雌醇(n=47)。高劑量美雌醇的應用(＞100mg/天)與撓骨質量的增加有關，而炔雌醇(50或100mg/天)的使用與撓骨質量之間的關系在白種女性(n=65)中表現(xiàn)為無關而在黑人女性(n=11)中呈負性相關。
Stevenson等人(1989)發(fā)現(xiàn)在112位年齡為21-52歲(中間年齡=34.1)的絕經(jīng)前婦女中，在某些位置口服避孕藥的使用與骨密度無關，其中包括腰椎。但是，在172位年齡在28-68(中間年齡=53.4)的絕經(jīng)后婦女中，這些相同位置的骨密度與口服避孕藥的使用呈正性相關。Mazess和Barden(1991)在對200-300位年齡在20-39歲間健康婦女的研究中發(fā)現(xiàn)，口服避孕藥的使用與脊柱、撓骨或股骨頸的BMD無關。近期，Hansen(1994)研究了249位年齡在21-51歲(17位小于30歲)間的絕經(jīng)前健康婦女并報導說，口服避孕藥的使用與骨骼多處位置的骨密度無關，但是可觀測到，口服避孕藥的當前使用者與從未用藥者相比其BGP顯著降低(＜32％)。
在最近的研究中，使用口服避孕藥的年輕女性在超限時間仍未達到脊柱骨密度(Carr等人，1995)。根據(jù)他們的報導年齡(平均年齡26±1s歲)并利用Recker等人(1992)提出的回歸線，研究中多數(shù)女性的骨密度應在研究期間已經(jīng)增加，并且止于正平衡。此外，Teegarden等人(1995)調查了口服避孕藥的使用與年齡在18-31歲間的婦女的運動間的相互作用，令人驚奇地是，6個月后，運動并使用口服避孕藥的婦女損失大量的脊柱骨無機物密度(BMD)，而不運動但口服避孕藥的婦女卻獲得顯著量的脊柱BMD。但沒有關于激素的血清內濃度的報導(Teegarden等人，1995)。上述結果提出了嚴重后果。若年輕女性進行運動并服用口服避孕藥則無法在其青春期和成年早期(15-30歲)生長骨骼，她們將僅達到比預期值低的峰骨質。因此，有關年齡段的及絕經(jīng)后的骨損失將對骨質造成極大影響，同時骨折閾值在其一生中可能會較早地到來。
因此，特別是十三歲到二十幾歲間的女性急需那些可以有效防止意外妊娠并仍能保證達到正常峰骨質的口服避孕藥。
發(fā)明概述本發(fā)明將全面描述用于口服避孕的新組合物及方法。本發(fā)明的這些組合物及方法提供了超過以往口服避孕方法的改善作用，其中，雄激素被包含在確定的制劑中，目的是減少口服避孕藥的年輕使用者骨骼自然增長的降低。本發(fā)明人著重認為，含雌激素口服避孕藥的年輕使用者不能獲得如同她們在未服用口服避孕藥時所能達到的處于峰骨質(約30-35歲)的高骨礦化水平。這種影響將產(chǎn)生例如骨質疏松癥或以后生活中的骨折的問題。本發(fā)明人還認為，這種作用可以通過在口服避孕藥制劑中添加雄激素來進行拮抗，尤其是在那些用于未達到峰骨質女性的制劑中。但是，任何年齡的口服避孕藥使用者都可以用這此類制劑來恢復更自然的雌激素/雄激素平衡。
本發(fā)明可以從廣義的角度來描述作為避孕藥的制劑，該制劑包含有效量的雌激素和孕激素和雄激素而且用于減少口服避孕藥使用者骨質增加的損失。雄激素可以是任何已知的適合在口服避孕藥制劑中采用的雄激素，優(yōu)選是睪丸素(睪酮)，更優(yōu)選甲基睪丸素。常見的代表性雄激素如表2所示。應理解的是，任何適合口服避孕藥的上述制劑都在本發(fā)明的實施中有效。還應明白，含雄激素的雌激素/孕激素避孕藥的應用可以以任何其它的形式給藥，例如作為植入劑或大量濃注用的注射劑也屬于所附權利要求書的范圍。
劑量應取決于給藥對象對節(jié)育制劑中雄激素存在的生理反應，并應由處方醫(yī)師來監(jiān)控。例如，特定對象(例如運動員)可能需要她們的血清睪丸素水平不受到影響。因此，醫(yī)師應在約每三個月的時期監(jiān)控血清睪丸素，以確定例如口服避孕藥制劑中含有恰當?shù)牟G丸素水平。此外，我們考慮避孕制劑可以有三種或更多種的雄激素水平，因此醫(yī)師應根據(jù)口服避孕藥使用者體內血清睪丸素水平的變化來開出較高或較低的雄激素制劑處方。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，青春期直至約30-35歲年齡的女性在使用含有雌激素和孕激素口服避孕藥時將出現(xiàn)骨自然增長的某些降低。本發(fā)明組合物將提高骨的自然增長，換言之，將減輕與此年齡組女性使用口服避孕藥有關的副作用。無論是所述的提高作用還是減輕作用都是對現(xiàn)有技術的改進，即使未達到正常峰骨質。然而，本發(fā)明的目的是使口服避孕藥的使用者恢復接近正?；虻扔谡５墓趋雷匀辉鲩L及同等程度的峰骨質。
本發(fā)明的某些制劑中將在每個日劑量中含有約0.2mg-約1.5mg的甲基睪丸素。例如，制劑可以含有0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5mg/日劑量。用術語“約”0.2-1.5mg表示略微超出該范圍的劑量也是有效和安全的，并且此類制劑也屬于本發(fā)明權利要求的范圍內。含有甲基睪丸素的制劑優(yōu)選在月經(jīng)周期的第8-13天間給藥，以與月經(jīng)周期中自然出現(xiàn)的睪丸素水平增加相吻合。例如，已知在正常月經(jīng)周期的該階段睪丸素和雌激素水平都會增加。含有雄激素或睪丸素的組合物還優(yōu)選含有雌激素及孕激素用于避孕。優(yōu)選在每個日劑量中孕激素是以約0.050mg濃度存在的左炔諾孕酮并且所述雌激素是以約0.03mg濃度存在的炔雌醇。
本發(fā)明的一個實施方案可被描述成一種口服避孕藥制劑，該制劑包含第一組合物并且該第一組合物含有在月經(jīng)周期第8天至約第13天每天給藥的甲基睪丸素與左炔諾孕酮和炔雌醇。該避孕藥制劑還包含第二組合物并且該第二組合物含有在第一組合物給藥完畢后的第14天至約第18天每天給藥的左炔諾孕酮和炔雌醇。上述制劑還可以被規(guī)定成包含第三組合物的制劑，而且該第三組合物含有在第二組合物給藥完畢后月經(jīng)周期的約第19天至約第28天每天給藥的左炔諾孕酮和炔雌醇。該制劑可以進一步包含在月經(jīng)周期第1-7天服用的安慰劑組合物。應認為，優(yōu)選在第8-13天服用第一組合物，在第14-18天服用第二組合物并在第19-28天服用第三組合物。但是，應將該給藥時間理解為這些制劑的最佳給藥時間，而對該給藥時間進行略微的改變也不違反本發(fā)明的范圍及宗旨。第一組合物可以進一步被定義成在其每個日劑量中含有約0.2mg-1.5mg甲基睪丸素和約0.05mg左炔諾孕酮和約0.03mg炔雌醇。優(yōu)選將第二組合物定義成為約0.075mg左炔諾孕酮和約0.04mg炔雌醇/日劑量?？梢赃M一步將第三制劑規(guī)定為約0.125mg左炔諾孕酮和約0.03mg炔雌醇/日劑量。
本發(fā)明還在某些實施方案中公開了含有約0.2mg-約1.5mg甲基睪丸素、約0.05mg左炔諾孕酮和約0.03mg炔雌醇/日劑量的口服避孕藥組合物。在特定的實施方案中，本發(fā)明為配制如下的28片的口服避孕藥組合物6片含有約0.2mg-約1.5mg甲基睪丸素、約0.05mg左炔諾孕酮和約0.03mg炔雌醇的片劑；5片含有約0.075mg左炔諾孕酮和約0.04mg炔雌醇的片劑；和，10片含有約0.125mg左炔諾孕酮和約0.03mg炔雌醇的片劑；并且組合物還可以含有約7片的安慰劑片劑。應理解的是，任何在此描述的組合物的安慰片劑可以含有鐵、鈣、維生素、無機物或其他有益添加物，目的在于增加口服避孕藥使用者的營養(yǎng)。
本發(fā)明的一個實施方案中還提供一種提高受試者骨自然增長的方法，其中該受試者服用含雌激素的口服避孕藥并且未達到峰骨質。該方法包括向服用口服避孕藥的受試者給予雄激素。在該方法的優(yōu)選實施方案中，雄激素在月經(jīng)周期第8-13天的每天中以約0.2mg-約1.5mg甲基睪丸素的量給藥。本發(fā)明還提供一種避孕方法。該方法包括給予受試者一種制劑，該制劑含有在月經(jīng)周期第8-13天服用的約0.2mg-約1.5mg甲基睪丸素、約0.05mg左炔諾孕酮和約0.03mg炔雌醇；此后，在月經(jīng)周期第14-18天服用的約0.05mg左炔諾孕酮和約0.04mg炔雌醇；和在月經(jīng)周期第19-28天使用的約0.125mg左炔諾孕酮和約0.03mg炔雌醇。
本發(fā)明的一個實施方案中公開了一種口服避孕藥的整月用包裝，該包裝內包含7片第一組合物，該片劑含有在月經(jīng)周期第1-7天時每天使用的安慰劑組合物。該整月用口服避孕藥包裝還包含6片第二組合物，該第二組合物片劑含有在月經(jīng)周期第8-13天每天使用的約0.2mg-約1.5mg甲基睪丸素、約0.05mg左炔諾孕酮和約0.03mg炔雌醇。該整月用口服避孕藥包裝還可以包含5片第三組合物，該第三組合物片劑含有在月經(jīng)周期第14-18天每天使用的約0.075mg左炔諾孕酮和約0.040mg炔雌醇。該包裝還可以包含10片第四組合物，該第四組合物片劑含有在月經(jīng)周期第19-28天每天使用的約0.125mg左炔諾孕酮和約0.030mg炔雌醇。該整月用包裝還包括帶有28個隔室的分配器，每個隔室內包含一個口服避孕藥組合物。典型的分配器內應包括28粒藥，它們按預定順序每天使用1粒。分配器的例子是在美國專利4,165,709、美國專利4,807,757、美國專利3,678,884或美國專利3,651,927中公開的那些(這些文獻在此引入作為參考)。
本發(fā)明的另一實施方案中公開了一種整月用口服避孕藥包裝，該包裝內包含7片第一組合物，該片劑含有在月經(jīng)周期第1-7天時每天使用的安慰劑組合物。該整月用口服避孕藥包裝還包含6片第二組合物，該第二組合物片劑含有在月經(jīng)周期第8-13天使用的約0.2mg-約1.5mg甲基睪丸素、約0.05mg左炔諾孕酮和約0.03mg炔雌醇。該整月用口服避孕藥包裝還可以包含5片第三組合物，該第三組合物片劑含有在月經(jīng)周期第14-18天每天使用的約0.075mg左炔諾孕酮、約0.04mg炔雌醇和約0.2mg-約0.5mg甲基睪丸素。該包裝還可以包含10片第四組合物，該第四組合物片劑含有在月經(jīng)周期第19-28天每天使用的約0.125mg左炔諾孕酮、約0.030mg炔雌醇和約0.2mg-約0.5mg甲基睪丸素。該整月用包裝還包括帶有28個隔室的分配器，每個隔室內包含一個口服避孕藥組合物。
除非另有說明，在此所用的技術和科學術語都具有本發(fā)明所屬領域技術人員所能理解的常規(guī)含義。雖然，任何類似或等同于本文所述方法和材料的都可以在本發(fā)明的實施及試驗中采用，但優(yōu)選的方法和材料將在此說明。
發(fā)明詳述本發(fā)明為年輕的避孕藥使用者提供了用于預防意外妊娠并保證骨質正常自然增長的口服避孕藥，從而使那些使用者能夠獲得最佳峰骨質。因此，本發(fā)明是一種可防止某些與雌激素/孕激素口服避孕藥有關的副作用發(fā)生的安全口服避孕藥，所述副作用包括使用者在其余生由較低峰骨質導致的易于患骨質疏松癥的危險性，而這種較低的峰骨質是由于未達到峰骨質前已使用雌激素/孕激素口服避孕藥造成的。本發(fā)明提供的組合物是最適宜30歲以下用戶使用的口服避孕藥，但本發(fā)明組合物也可以有效預防所有絕經(jīng)前婦女的妊娠。
本發(fā)明源自下列發(fā)現(xiàn)口服避孕藥阻礙非人類的年輕雌性靈長類骨骼的正常自然增長，并且這種阻礙作用歸因于內源性雄激素水平的受抑制。該動物試驗強有力地說明在年輕婦女(15-30歲)中也可產(chǎn)生同樣的副作用并具有相同的機理(雄激素水平的抑制)。骨骼自然增長的減弱妨礙了最大峰骨質的獲得，因此導致骨質疏松癥在使用者余生中的高危性。年輕女性中存在的骨質低自然增長問題是由于目前含有雌激素和孕激素的標準口服避孕藥制劑引起的。本發(fā)明組合物除含有雌激素和孕激素外還另外含有雄激素，從而本發(fā)明組合物表現(xiàn)出特有的使骨骼正常自然增長并達到正常峰骨質的有益作用。雌激素/孕激素口服避孕藥的制劑和劑量表1列出目前仍用作口服避孕藥的一些制劑。所列的聯(lián)合制劑類含有0.02-0.05mg炔雌醇或美雌醇以及不同含量的孕激素，而且此類制劑需服用21天。下一療程在末劑量使用后的7天后或行經(jīng)開始后的5天后開始。應注意，炔雌醇的有效性幾乎是美雌醇的兩倍。
順序用制劑被配制成在兩個(二階段)或三個(三階段)連續(xù)階段內服用的制劑。二階段制劑中，需服用10天劑量固定的雌激素與孕激素的混合物，隨后再服用11天不同固定劑量的雌激素與孕激素的混合物。藥粒在周期性給藥重新開始前中斷7天。三階段制劑在其中的三組片劑中含有相同量或不同量的雌激素以及可變量的孕激素。每組片劑需服用5-10天，這取決于具體的制劑。給藥21天后，藥物在周期性給藥重新開始前需中斷7天。
表1一些口服避孕藥的組成及劑量雌激素(mg)孕激素1(mg) 代表性商品名聯(lián)合用制劑20.02炔雌醇1.0乙酸炔諾酮LOESTRIN 1/200.03炔雌醇0.3炔諾孕酮 LO/OVRAL0.03炔雌醇1.5乙酸炔諾酮LOESTRIN 1.5/300.03炔雌醇0.15乙酸炔諾酮 NORDETTE0.035炔雌醇 0.4炔諾酮OVCON 350.035炔雌醇 0.5炔諾酮BREVICON0.035炔雌醇 1.0雙醋炔諾醇DEMULEN 1/350.035炔雌醇 1.0炔諾酮ORHTO-NOVUM 1/350.05美雌醇1.0炔諾酮ORTHO-NOVUM 1/500.05炔雌醇0.5炔諾孕酮 OVRAL0.05炔雌醇1.0雙醋炔諾醇DEMULEN 1/500.05炔雌醇1.0炔諾酮OVCON 500.05炔雌醇1.0乙酸炔諾酮NORLESTRIN 1/500.05炔雌醇2.5乙酸炔諾酮NORLESTRIN 2.5/50順序用制劑30.03,0.04,0.03炔雌醇0.05,0.075,0.125左炔諾孕酮TRI-LEVLEN0.035炔雌醇 0.5,1.0,0.5炔諾酮 TRI-NORINYL0.035炔雌醇 0.5,0.75,1.0炔諾酮ORTHO-NOVUM 7/7/70.035炔雌醇 0.5,1.0炔諾酮 ORTHO-NOVUM 10/11微丸4-- 0.35炔諾酮MICRONOR-- 0.075炔諾孕酮 OVRETTE交媾后用藥物5己烯雌酚1在所用的孕激素中，炔諾孕酮略呈雄激素活性，而其他孕激素具有極小的雄激素活性。2聯(lián)合用片劑需服用21天并中止服用7天。這些制劑按照雌激素量增加的次序列出。3此類制劑包含劑量固定的片劑并且這些片劑具有相同量或不同量的雌激素以及可變量的孕激素。對于二階段制劑，第一組片劑需服用10天并且第二組片劑服用11天，隨后中止服藥7天。對于三階段制劑，各組片劑按照三個順序階段分別服用5-10天，隨后停藥7天。4“微丸”連續(xù)每天服用。5己烯雌酚在交媾后72小時內以25mg的劑量每日服用2次并連續(xù)5天。
許多避孕制劑是分配在常規(guī)的日程表式容器內以協(xié)助使用者計算天數(shù)。有時為了排除計數(shù)的需要，可以將7片空白藥粒摻入到包裝內，從而提供3周的治療及1周的非治療。無論月經(jīng)何時開始或停止需每日服用1丸。一些制劑的“空白”粒中含有鐵。
“微丸”(例如MICRONOR和NOR-QD，含有0.35mg炔諾酮；及OVRETTE，含有75μg炔諾孕酮)需連續(xù)每天使用。由于有效性較低而且在給藥期間仍可能懷孕，患者應在經(jīng)閉若持續(xù)45-60天以上時中止服用“微丸”，同時應去檢測是否妊娠。此外，如果患者遺忘了服用一個或數(shù)個藥粒并已停經(jīng)45天以上，它們同樣應檢測是否妊娠。雄激素的制劑及劑量表2概括了一些臨床使用的雄激素腸胃外制劑和口服制劑。雄激素療法已主要應用于改善和/或維持第二性征。雄激素已可通過肌肉內制劑給藥，此外還可以口服。本發(fā)明的雄激素包括但不限于是表2列出適用于口服避孕藥組合物的那些。
表2非標準名稱 商品名實例劑型和常用劑量睪丸素 Testoject-50TM肌肉內使用的含水懸浮液10-50mg，每周三次丙酸睪丸素 TestexTM肌肉內使用的油溶液10-25mg，每周2-3次庚酸睪丸素 Delatestyl 肌肉內使用的油溶液每2-4周50-400mg，環(huán)戊丙酸睪丸素 Depo- 肌肉內使用的油溶液每2-4周50-Testosterone 400mg癸酸南諾龍 Deca- 肌肉內使用的油溶液每3-4周50-Durabolin 100mg苯丙酸南諾龍 Durabolin 肌肉內使用的油溶液每周50-100mg，用于治療乳腺癌炔睪醇 Danocrine 膠囊每日200-800mg氟羥甲睪酮 Halotestin 片劑每日2.5-20mg去氫甲基睪丸素Dianabol 片劑每日2.5-5mg，用于骨質疏松癥甲基睪丸素 Metandren，片劑和膠囊劑每日10-50mg；Oreton Methyl 口腔片每日5-25mg氧甲氫龍 Anavar 片劑每日2.5-20mg羥甲睪丸素 Anadrol-50 片劑1-5mg/kg·每天用于貧血癥吡唑甲基睪丸素winstrol 片劑每日6mg睪內酯 Teslac 片劑250mg，每日四次，用于乳腺癌雄激素對骨骼的作用不受任何特定理論的限制，口服避孕藥使年輕女性峰骨質降低的機理基于下列考慮。由卵巢產(chǎn)生的初級甾類物質是雄甾烯二酮(A)，睪丸素(T)和雌二醇(E2)是它在周邊的衍生物。循環(huán)內高比例的雄激素可能來自于卵巢，這是由于卵巢切除術后血清T和A降低(50％),(Adashi,1994；Hughes等人1991)。a)體外細胞的證據(jù)雄激素受體是在成骨細胞類細胞內被識別(Colvard等人1989,；Wiren等人，1995)并且可以在骨細胞內調節(jié)鈣通道(Takeuchi和Guggino,1995)。此外，雄激素還刺激成骨細胞的分化及增殖(Kasperk等人，1990)。b)雄激素作用于動物模型骨骼的證據(jù)據(jù)信，不論對于女性還是男性，雄性激素在構建和維持骨骼方面都起一定作用?？剐坌约に厮幬铮?，抑制了對生殖腺及腎上腺雄激素的應答。在完整雌性大鼠中給予氟他胺(口服15mg/kg/d)會誘發(fā)骨質稀少。有完整卵巢的雌性大鼠中的骨更新也受到影響，通過檢測骨骼45Ca的變化發(fā)現(xiàn)，氟他胺-介導的雄激素不足型骨薄化主要是由骨形成減少引起(Goulding和Gold,1993)。近期，上述發(fā)現(xiàn)被在完整雌性大鼠體內再現(xiàn)，其中，雌性大鼠每天給予非甾類抗雄激素純品(Casodex)并持續(xù)3周。干骺端的骨體積以及骨的縱向發(fā)育都與賦形劑處理的完整雌鼠類似。但是，動力學組織形態(tài)法(histophometry)表明，Casodex處理的大鼠中的骨形成速率明顯降低(Flanagan等人，1995)。
雄激素對骨骼的直接影響發(fā)生在卵巢切除大鼠接受雄甾烯二酮的情況下并通過減少骨的更新來預防卵巢切除術誘發(fā)的骨質稀少。在老齡卵巢切除大鼠中進行二氫睪丸素(DHT)的測試，這是由于DHT與睪丸素類似并都與雄激素受體結合，但與睪丸素不同的是，DHT并不使雌激素芳香化。在老齡卵巢切除大鼠中，DHT與雌二醇都具有拮抗卵巢切除術誘發(fā)型骨質稀少的防護作用。
在白尾鹿鹿茸脫落后立即將甾類抗雄激素環(huán)丙孕酮進行肌肉內給藥，這可以誘發(fā)(a)血漿內睪丸素水平的戲劇性減少，(b)雄鹿中伴隨鹿角徹底礦化的早熟灌制(casting)，和(c)在礦化不完全的鹿角內骨重建活性發(fā)生更新，因此阻斷了灌制(Bubenik等人，1987)。
雌猴中進行的激素處理對其機體組成及骨無機物狀態(tài)都產(chǎn)生影響(Jayo等人，1989)。在采用以硅橡膠作為植入物的激素療法1年后，全體安慰劑組的猴子與全體接受(A+雌酮(E1))的猴子或接受睪丸素的猴子相比，它們在腰椎骨質和全身骨骼方面都要低。和另外兩組猴子相比，睪丸素處理組猴子的體重增加得最明顯，但雄激素處理組的脛骨強度和皮質密度顯著提高(Kasra和Grynpas,1995)。c)雄激素作用于婦女骨骼的證據(jù)根據(jù)近期在西班牙報導的一位婦女患有雄激素感覺遲鈍癥的一個病例中，顯示出女性骨狀態(tài)中需要適當雄激素刺激的直接證據(jù)。該年齡為17歲的女性具有不良的骨密度及水平增高的雄激素。醫(yī)師用雌激素治療該少女，但她對雌激素療法缺乏反應，由此推斷出雄激素刺激甚至在青春期以后都很重要(Munoz-Torres等人，1995)。Daniel等人(1992)研究了吸煙對20-35歲年輕婦女(25位吸煙者，27位非吸煙者)的影響。兩組間的骨無機物密度沒有區(qū)別，但兩組的SHBG及游離雄激素指數(shù)(T/SHBG)都在骨密度變化中發(fā)揮出有效作用(P＜0.05)。
青春期黑人婦女比青春期白種婦女具有更高的骨密度及更高水平的血清睪丸素(Wright等人，1995)。在對老齡黑人婦女的研究中發(fā)現(xiàn)，她們的骨質比老齡白人婦女要高。在該老齡組，體重指數(shù)(kg/m2)及E1與骨質有關，而雄激素則無關。在各種族中，骨質隨血清E1濃度的增高而呈線性增加(Cauley等人，1994)。此外，老齡白種婦女體內游離睪丸素水平(fT)而不是總的T水平與她們脊柱、髖部及腕部的骨密度相關(Greendale等人，1995)。所以，生物活性物fT的水平是隨年齡而越密切地與骨質相關。
在早期的研究中，21-48年齡段內的婦女的小梁骨密度僅僅與血清A密切相關(Buchanan等人，1988)。在具有正常血清雄激素水平的婦女中，皮質骨密度與血清總T及生物活性物fT有關。理論上，這種皮質質量的提高應有助于防止余生骨折的發(fā)生。內源性雄激素對骨密度產(chǎn)生合成作用同時在雄激素過量的婦女體內小梁骨密度(脊柱)明顯增高(Buchanan等人，1988)。絕經(jīng)前婦女體內性激素-結合球蛋白(SHBG)、硫酸二氫表雄甾酮(dihydroepiandrosterone sulfate)(DHEAS)、雄激素類與骨質之間的相互關系業(yè)已被發(fā)現(xiàn)(Johnston等人，1993)。游離睪丸素是在全部被測位置與骨質關系最密切的雄激素。d)口服避孕藥作用于絕經(jīng)前的猴子和婦女骨骼的作用的證據(jù)為測定口服避孕藥療法對骨密度及骨代謝血清標記的影響，本發(fā)明人對年輕的成年雌性cynomoglus猴進行了縱向預見性研究。將207只完好的猴子分成兩組并用不含藥物(對照)或含有三階段口服避孕藥試劑盒(Triphasil)的致動脈粥樣化的食物飼養(yǎng)。
對骨密度及血清骨生物標記物在處理前和處理后定期檢測。預處理數(shù)據(jù)變量中沒有明顯差別。兩組動物的骨無機物密度(BMD)在試驗中皆有增加，這表明它們未曾達到它們的峰骨質。在整個試驗過程中Triphasil-處理的動物與對照動物相比，其腰椎骨無機物的增加較少，導致其腰椎骨無機物密度在20個月后與對照組差別顯著。對縱向數(shù)據(jù)的重復測量分析表明，經(jīng)10和20個月的處理后，Triphasil-處理組動物的全身骨無機物含量(BMC)以及脊椎的BMC和密度比未處理的完好對照組動物明顯降低。
Triphasil處理組的血清堿性磷酸酶(ALP)顯著降低，同時其血清酸性磷酸酶(ACP)及鈣雖然降低但程度較小。該結果表示，以三階段口服避孕藥處理未達到峰骨質的年輕成年雌猴將因降低其骨更新速率而抑制骨的凈自然增長，該作用的結果是使這些動物的峰骨質較低。
用于解釋上述發(fā)現(xiàn)的一種機理是骨吸收與骨形成之間的平衡被改變，由此骨形成弱于骨吸收。事實上，口服避孕藥療法中引起40％骨形成(血清ALP)標記物的減少而對骨吸收標記物僅引起極小的變化(ACP降低10-15％且對TRAP的作用極其微弱)。因此，口服避孕藥療法可使骨形成減少的程度比骨吸收的要大，結果是經(jīng)處理年輕動物的骨凈自然增長比月經(jīng)周期未經(jīng)處理的雌性動物低。
該理論的另一解釋是骨更新率存在一個最佳區(qū)間(optimumwindow)，高于或低于該最佳范圍時將不足以維持骨骼。所以卵巢切除的cynomolgus猴表現(xiàn)為骨更新率提高。如同婦女，與未處理對照動物相比，用雌激素替代療法(使用或不使用醋酸甲羥孕酮)處理的卵巢切除動物會因此發(fā)生骨吸收和骨形成標記物的減少以及脊椎BMC和BMD的增加。
本發(fā)明人進行的口服避孕藥研究揭示出在不同情況下，未達到峰骨質的年輕猴子在骨更新減弱的同時還平行發(fā)生骨無機物自然增長的降低。絕經(jīng)中及絕經(jīng)后婦女可能遭受骨損失，這符合增高的骨更新率，而雌激素替代療法通過降低骨更新率來抑制這種骨損失。
絕經(jīng)期婦女在接受口服避孕藥時，雖然血清骨鈣蛋白(骨gla蛋白[BGP])并未變化，但羥脯氨酸尿排泄物減少而同時椎骨BMD顯著(p＜0.001)增加(Gambacciani等人，1994)。但是，與正常狀態(tài)相比，健康的絕經(jīng)前青春期婦女及動物中骨更新率的降低可能伴隨有骨無機物凈自然增長的降低，這將最終導致峰骨質的降低。
在持續(xù)1年的預見性研究中，以年齡在20-30歲間的19位婦女為對象就口服避孕藥對骨代謝的影響進行了研究，所用口服避孕藥含有20μg炔雌醇+0.150mg去氧孕酮。在試驗結束時，骨密度僅表現(xiàn)出輕微的而非明顯的增加。尿內羥脯氨酸/肌酸酐的比例及血清ALP水平都顯著降低。該結果揭示出雖然使用了口服避孕藥的年輕女性的遠端撓骨骨密度并未顯著增加，但骨吸收已減弱(Maris等人，1993)。
上述試驗開始時所采用的動物的平均年齡據(jù)牙列估算已為6歲齡。這約是此類物種生長板(growth plate)閉合的時間，但該年齡還未達到峰骨質的9歲齡(Jayo等人，1994)。雖然女性在少年期已達到性成熟，但由峰骨質反映的骨骼成熟期并未達到直至約30歲(Recker等人，1992)。在骨骼成熟方面，上述年齡的猴相應于15-30歲齡的女性。所以，上述結果揭示出口服避孕藥對接近成熟的骨骼的影響，但已達到峰骨質的情況不包括在內。但是，骨更新的抑制與骨無機物自然增長之間的關系不可能僅與動物仍處于生長期的原因有關，因為處理組的軀干長度數(shù)據(jù)并未明顯改變。藥物組合物應了解，本發(fā)明配制的藥丸可以含有作為填充劑、粘合劑及用于編號著色的成份。這些成份是現(xiàn)行口服避孕藥制劑中常用的，其中包括但不限于乳糖、玉米淀粉、磷酸鈣、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸鎂、硬脂酸、膠態(tài)二氧化硅、羥丙甲基纖維素、聚乙二醇以及一種或多種下列染料FD&C藍No.1色淀、FD&C藍No.2鋁色淀、D&C綠No.5、D&C黃No.10、FD&C黃No.6或FD&C紅No.3。當然這些僅僅是填充劑和染料的例子，該領域專業(yè)人員應了解其他適用于本發(fā)明制劑的制備的惰性成份。
雄激素副作用在較高劑量條件下可能會顯現(xiàn)?；颊吆歪t(yī)師很容易發(fā)現(xiàn)并檢測出的早期副作用包括痤瘡及多毛癥(尤指婦女多毛癥)，出現(xiàn)上述兩種副作用時應考慮將劑量減少。若在早期及時發(fā)現(xiàn)，則上述癥狀很容易逆轉。重度多毛癥、變聲、肌肉質量改變等是更嚴重的雄激素過量副作用，應根據(jù)早期檢測并及時調整劑量來避免這樣的嚴重副作用發(fā)生。為將副作用降至最低，建議對骨質自然增長產(chǎn)生有益作用的最低有效劑量為1.25mg/天。但是應理解為，醫(yī)師應根據(jù)特定需要來決定各個病例所需的較高或較低劑量。
所有本發(fā)明所述的制劑都可以由專供一個月使用的分配器提供。典型的分配器應按預定順序提供28粒藥丸以供每天服用一丸。分配器實例為在美國專利4,165,709、4,807,757、3,678,884或3,651,927中公開的那些，(這些專利在此引入作為參考)。分配器或分配方式本身并不構成本發(fā)明，并且，任何將藥丸分成獨立包裝并提供一種以特定次序將藥丸每次1粒地進行分配從而使用戶了解具體某天應服用某粒藥丸的分配方式均可被接受。一盒中還可以裝有一個月或多個月用的分配器；諸如，在一個紙盒內例如裝有產(chǎn)品資料和/或使用說明書。分配器還可以被裝在裝飾性的箱子內，目的是使其不作為節(jié)育藥丸分配器而被立刻辨認出來。動物試驗的方法雌性cynomolgus猴在激素對骨代謝的作用的試驗中是適宜的動物模型。此類猴子在月經(jīng)周期的時間長短及周期期間激素的變化方面都與女性類似(Mahoney,1970)。此外，卵巢切除的獼猴在應答雌激素替代療法時，骨骼變化的方式與在絕經(jīng)后婦女中的方式類似(Jerone等人，1994)。在整個試驗中，對骨密度、血清及尿內的骨更新標記物、血清內性激素、血脂、體重和重量分布、血壓以及骨骼結構和形態(tài)學進行測定。在試驗結束時，將對全部猴子進行尸體剖檢并且對比各組的骨參數(shù)及冠狀動脈粥樣硬化(CAA)的程度。這種預見性試驗是無法以人作受試對象的，原因是這種試驗具有(人身)攻擊性、費用高并且會由于無法控制的可變性導致并發(fā)癥。
以試驗為目的，將雌性獼猴分成3組第一組=完好的未處理對照組第二組=口服避孕藥-處理組，口服Triphasil,OCTriphasil(婦女的劑量)第1-7天，無激素；第8-13天，0.03mg炔雌醇和0.05mg左炔諾孕酮；第14-18天，0.04mg炔雌醇和0.075mg左炔諾孕酮；第19-28天，0.03mg炔雌醇和0.125mg左炔諾孕酮。
第三組=口服避孕藥-處理組，服用Triphasil加三階段甲基睪丸素(MT)(Steraloids,Inc.Wilton,NH)Triphasil+MT(婦女的劑量)第1-7天，無激素；第8-13天，0.03mg炔雌醇、0.05mg左炔諾孕酮和0.40mgMT；第14-18天，0.04mg炔雌醇、0.075mg左炔諾孕酮和0.60mgMT；第19-28天，0.03mg炔雌醇、0.125mg左炔諾孕酮和0.40mgMT。動物的獲得以及起始數(shù)據(jù)從印度尼西亞的雅加達購得并進口100只年輕的成年(6-8歲齡)雌性cynomolgus猴。在以實驗飲食飼養(yǎng)期間，根據(jù)法律要求對這些動物進行檢疫。在為期一個月的基線階段，利用體內骨光密度測定法和放射照相術檢測骨異常。替換下患有骨骼異?；虼嬖谖撮]合骺的動物。以機體測量法(體重和軀干長度)、骨光密度測定法、血清化學及血脂結果為依據(jù)將受試猴分成三個匹配組(如上所述)。用基線數(shù)據(jù)來校驗各組為等值。處理24個月后，將全部動物尸體剖檢，目的在于研究比較各組的骨骼結構、強度變化及CAA。
用于組織形態(tài)學檢測(histomorphometric)分析的髂骨活組織檢查是在基線以熒光染料標記后并在處理12個月后收集。在0、1、3、6、12、18和24個月時收集血樣和尿樣。在所有時間點(timepoint)測量血清及尿內的骨更新生物標記物。在0、6、12和24個月時測量腰椎、髖及猴的身長。在0、6、12、18和24個月時檢測血脂并且在第12個月時進行LDL分子量測定。每6個月進行一次身體測量(體重、軀干長等)(在DEXA掃描時)。
統(tǒng)計學乘冪(statistical power)的計算(Dupont和Plummer,1990)是為了算出最小樣品量，從而檢測出任意兩組之間在不同方法中的預期差異。骨無機物密度(BMD)、骨結構中的變異性估計值將利用組織形態(tài)學檢測法進行評估(骨體積/總體積％[CnBV％])，本試驗還計算出血清內骨代謝標記物(堿性磷酸酶，ALP)和CAA的內膜面積。表3列出調整的組規(guī)模(n)、可測差分、乘冪(power)、初級終點(primary endpoint)的雙側水平的顯著性。
表3初級終點的數(shù)據(jù)變量可測差異 組(n) 冪雙側(β)(α)BMD 4％ 300.800.05CnBV％33％190.800.05ALP 23％240.800.05CAA 70％300.750.05在允許5％的年死亡率(基于本試驗及長達24個月的處理；75只初始動物中存活67只)的前提下，將100只猴隨機分成3個處理組的動物經(jīng)2年的處理后共獲得90只可評估動物。本發(fā)明人以那些臨床似乎相關、生物可能合理的可測差分為目標，而這些是以表3所列的試驗終點為基礎，同時也合理地基于發(fā)明人在近期噻嗪(thiazide)研究中的發(fā)現(xiàn)(Jayo等人，1995)。飼養(yǎng)及飲食組成將猴子以每組4-5只的數(shù)量圈養(yǎng)在不限制行動和群體交往的室內圍欄中(2.0×3.2×2.5m)。通過自動飲水裝置隨時供水。給猴子喂以適度致動脈粥樣化的半純食物。食物中含有43％得自脂肪的熱量及0.30mg膽固醇/卡。這種飲食通?？深A期誘發(fā)約200-400mg/dl的總血漿膽固醇濃度。該飲食含有2.5IU的維生素D3/g食物并且鈣(Ca)/磷(P)的比例為1.0(207mgCa和206mgP/100g食物)。此物種適宜采用上述維生素D3量及Ca/P比。這種飲食已在CMCRC中采用(Jayp等人，1995)。試驗方法是由動物保護和使用公共委員會建立的，整個試驗過程全部符合州和聯(lián)邦制訂的法律以及Department of health and Human Services的標準。
將Triphasil(炔雌醇[EE]和左炔諾孕酮[LNG])加入上述飲食組合物中并給予第2組。將Triphasil+MT加入到上述飲食并給予第3組。飲食中加入適當劑量的藥物并在如上所述的預定月份的某天投食。對照組(第1組)在整個28天的月經(jīng)周期中以不添加激素的基礎飲食喂養(yǎng)。篩選和取樣緊隨檢疫期后，猴子將進入30天的基線階段。在這一個月的期間內，收集血樣和尿樣以便分析骨更新標記物、血脂及激素檢測。收集血樣和尿樣時對動物進行鎮(zhèn)靜(鹽酸氯胺酮，15mg/kg，肌肉內)。通過檢疫期觀測到的月經(jīng)周期來確定猴子是否具有正常卵巢功能，此后用陰道擦子來判斷卵巢功能。利用放射照片來進行椎骨大小的測定、變形評分及病理篩選。利用DEXA檢測BMC和BMD。同時進行身體測量，包括BW、軀干長度、皮褶厚度以及軀干和附肢的周長。完成上述檢測后，將動物分成具有相當?shù)墓菬o機物狀況、身體測量數(shù)據(jù)、血清骨生物標記物及脂質特性的3個試驗組。處理對照組的完整猴(intact monkey)接受不添加藥物的食物。由完整猴組成的第2組動物接受24個月的Triphasil(Wyeth-Ayerst，一種三階段口服避孕藥)。第3組猴整體接受24個月的Triphasil+三階段甲基睪丸素。之所以選擇口服釋藥體系是由于該途徑為婦女所采用并且另一原因是肝臟可以影響藥物的代謝。需密切監(jiān)測受試動物疾病的臨床癥狀，并且如果需要，將添加物包含在飲食中給予各組動物。選擇三階段甲基睪丸素制劑是基于激素的正常節(jié)律水平(睪丸素/炔雌醇比例)并且該節(jié)律水平是通過觀察雌猴動情周期獲得(Wilson等人，1982)。所選用的MT劑量可在動情周期內產(chǎn)生與T相似的雄激素刺激。適用于絕經(jīng)后婦女的較高劑量藥物(Estratest,Solvay Pharmaceuticals,Marietta,GA)可能會在絕經(jīng)前青春期女性中引起意外的副作用(Hickock等人，1993；Watts等人，1995)。常規(guī)健康狀況一旦到達(試驗)中心后，初步的體格檢查將提供每只動物的健康及身體狀況資料。若需要，可測定血液學參數(shù)及臨床化學參數(shù)，其中包括全血計數(shù)及鑒別(defferentials)、總血清蛋白、白蛋白、血清葡萄糖、尿、氮、肌酸酐、鈣和磷酸鹽。尿分析樣品和糞便樣本可在需要時測定。建立一套雌性cynomolgus獼猴的正常參比值。用自動細胞計數(shù)器(庫爾特計數(shù)儀M430,Hialeah,FL)進行全血計數(shù)，還進行了白細胞鑒別。在整個試驗過程中檢測CBCs、肝功能試驗、總血清蛋白水平及葡萄糖。身體測量利用體重(kg)以及從胸骨上切跡至恥骨聯(lián)合處的軀干長度來計算機體質量指數(shù)(body mass index)(BMI=BW/[TL/100]2)。還測出了三頭肌、肩胛下、髂骨上、腹部、大腿中部、肩胛中部及胸廓皮褶厚度。同時測定腰、髖部、大腿和上臂的周長(cm)(Shicely等人，1987)。骨骼的光密度測定法在按上述方法用鹽酸氯胺酮(15mg.kg,i.m)和馬來酸乙酰丙嗪(0.15mg/kg,i.m)肌肉內麻醉的前提下，體內測定腰椎(L2-L4)、猴子全身及髖部的骨無機物含量及密度。骨密度是確定分組的基礎并使所得結果能夠與從人體臨床試驗獲得的類似數(shù)據(jù)進行比較。DEXA掃描是在基線和第6、12、18和24個月時進行。血清和尿的骨生物標記物利用組織形態(tài)學檢測法難于獲得骨更新的真實且復雜的動態(tài)數(shù)據(jù)，尤其是骨吸收的。血清和尿的生物標記物在無需損傷性外科手術的條件下就可以提供一種經(jīng)濟實用的骨形成和骨吸收的檢測途徑。在基線和第1、3、6、12、18和24個月時分析血清和尿的骨生物標記物。用Cobas Fara化學分析器(Roche Diagnostics,Nutley,NJ)檢測血清總ALP(骨形成)、ACP和耐酒石酸鹽ACP(TACP，骨吸收)、鈣及磷(Carlson等人，1992；Jayo等人，1995；Jerome等人，1994)。用已建成的放射免疫分析法來測定血清BGP(骨更新)。骨吸收還可以用FDA批準的N-端肽膠原分泌標記物(Osteomark,Ostex,Seattle,WA)來測定。絕經(jīng)后婦女體內的Ⅰ型膠原交聯(lián)N-端肽將降低至在接受6周雌激素替代療法的絕經(jīng)前婦女中觀測到的水平(Hanson等人，1992)。激素測定利用Yerkes地區(qū)靈長類研究中心檢測實驗室(Yerkes RegionalPrimate Research Center’s assay Laboratory)建立的方法來測定睪丸素、游離睪丸素、甲基睪丸素、雌酮、雌二醇、炔雌醇、性激素-結合球蛋白及雄甾烯二酮在血漿中的濃度。檢測MT是為了測定釋藥體系的有效性以及(若有的話)轉化為T的有效率。血脂以Cobas Fara化學分析器(Roche Diagnostics,Nutley,NJ)并利用酶促技術來分析總血漿的膽固醇、甘油三酯及HDL膽固醇。同時還檢測了LDL的分子量和組分。血壓的測量及心電圖在鎮(zhèn)靜狀態(tài)下測量動物的血壓。令動物右側躺下并使其右臂趨向頭側方向直至右臂幾乎垂直于身體縱軸。在從肩膀至肘部之間的中間位置測量出上臂周長，可以采用適當大小的套。檢測收縮壓、舒張壓、心率(Castro等人，1981)。記錄下上述檢測數(shù)據(jù)的平均值。以利用了示波技術的Dinamap便攜式成人/兒童及新生兒生命信號監(jiān)視器(8100型)來非介入性地檢測收縮壓、舒張壓及平均動脈壓以及心率。該裝置微機化地算出血壓和心率并消除主觀干擾(Corbett等人，1981)。用醫(yī)學系統(tǒng)(Greendale,NY)的心電圖描記器(MSC20001型)進行心臟病評估。心電圖掃描器在動物背臥的狀態(tài)下工作并記錄下標準導聯(lián)(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、AVR、AVL、AVF)和三個胸部導聯(lián)(Ⅴ-1、Ⅴ-4、Ⅴ-6)。骨收集和組織形態(tài)學分析的方法熒光染料標記骨組織形態(tài)學檢測需要預先在體內施用骨-搜索熒光染料標記物。在第1天對猴子接受滅菌靜脈內注射并在隨后的14天內令它靜止休息，在第21天時進行第2次標記注射。7-10天后，采集活組織檢查樣品或尸體剖檢樣品。在三個骨采集時間點的每個時間點給所有受試猴使用下列骨-搜索熒光染料中的一種鈣黃綠素(10mg/kg)、二甲酚橙(90mg/kg)或鹽酸去甲金霉素(20mg/kg)，當然這些熒光染料僅是舉例而其它熒光染料是所屬領域專業(yè)人員已知的那些。
該類型方法的應用可以檢測出動力學參數(shù)(Jerome等人，1994；Carlson等人，1992)。在不同時間點所測的骨形成率可能會出現(xiàn)差異，這是由于這些標記物的摻入速率不同(Goodwin和Jerome,1987)。通過在各時間點給予相同的熒光染料可降低在單個時間點組與組之間參比的變異性，但標記物摻入中可能的變化應被考慮在分析試驗隨時間發(fā)生的變化中。對標記物的間距及范圍進行測定可以計算出骨形成率的結果，而使用不同熒光染料標記物可以鑒別出在先的骨礦化活性。髂骨的活組織檢查從每只動物身上采集兩份髂骨嵴活組織，每側一份。基于獲得的數(shù)據(jù)(表10)，卵巢切除的動物網(wǎng)狀骨質的骨更新率是激素替代的動物的近兩倍。所以髂骨嵴網(wǎng)狀骨質骨骼每年被替代了50-100％。以一年為間期對髂骨活組織進行組織形態(tài)學分析，以便定性分析網(wǎng)狀骨質的骨骼機能變化，這是由于大多數(shù)現(xiàn)存骨骼是在一年的間隔期內形成的。在基線時，無菌采集左側髂骨嵴的活組織并且在開始處理后的第一年時采用右側髂骨嵴的活組織。發(fā)明者開發(fā)的用于猴髂骨嵴活組織檢查的方法為分析試驗提供了具有足夠骨面積和周長的皮質的及網(wǎng)狀骨質的骨骼(Goodwin和Jerome,1987)。骨的組織學方法組織形態(tài)學測定將用于組織形態(tài)學檢測分析的髂骨活組織及尸檢骨骼標本固定在70％乙醇中、加工、嵌埋在異丁烯酸甲酯/鄰苯二甲酸二丁酯中，采用下列的一種或兩種方法進行切片1)用LKB Macrotome錘制顯微切片刀或Jung Supercut旋轉顯微切片刀以5-10μm的厚度進行切片，并且用堿性甲苯胺藍或改進的Von Kossa法將切片染色或未染色封固(mounte)；2)用Isomet鋸(Buehler,Lake Bluff,IL)以100-125μm的厚度進行切片，在Faxitron柜(Hewlett-Packard,Rockville,MD)內進行顯微放射照相，和/或粘著在載玻片上、拋光、按von Kossa法表面染色。
免疫細胞化學將所選的尸檢樣本固定在新制并且冷卻的4％低聚甲醛中以維持樣本的抗原特性，再實施下列方法中的一種或兩種1)嵌入到異丁烯酸甲酯中，不脫鈣；或2)在1％EDTA中脫鈣，石蠟包埋，并連續(xù)切片，以便用于免疫細胞化學或就地的雜交試驗。發(fā)明者開發(fā)的可靠技術確保了對骨骼相關蛋白質存在和/或生成的評估(Tulli等人，1992；Carlson等人，1993)。多個骨膜(bone envelopes)的標準組織形態(tài)學測定本試驗采用改進的Parfitt(1987a)等所述方法。所用的測量結果和縮寫基于ASBMR標準命名法(Parfitt等人，1987b)。結構及動力學參數(shù)分別來自于骨膜(Ps)、哈弗系統(tǒng)(haversian)(H)、內皮質(Ec)和網(wǎng)狀骨質(Cn)的骨膜。同時還計算H+Ec和全部(Tt)結合骨膜的骨體積。這種分析試驗用于分析骨內動力學(功能性)變化的初級值，它能夠評估出皮質-骨內膜(cortical-endosteal)和網(wǎng)狀骨質膜對于骨骼的大-和微-體系結構的相對作用。利用此方法，可以測定試驗操作引起不同骨膜的結構變化的相對作用。該分析試驗中包括的其它參數(shù)是有關侵蝕深度和壁厚的測量結果，而這些參數(shù)可用來判斷每個重建周期中的骨平衡及激活頻率(Cohen-Solal等人，1991)。該分析試驗消耗時間，即使有自動的方法作協(xié)助，但它只能在每個骨切片的基礎上完成。多個骨切片的自動組織形態(tài)學分析用Isomet鋸切取股骨頸、股骨骨干、腰椎、遠側撓骨的多個橫切片，將它們表面染色和/或顯微放射照相，再以Apple Power微機并利用NIH圖形分析系統(tǒng)來進行分析。顯微放射照相的或von Kossa-染色的切片應具有足夠強的對比度，這樣根據(jù)用彩色照相機照出的圖形灰度界限可以很容易區(qū)分骨與骨髓?？蓪⒎纸绲幕叶葓D形轉化為二元影像(可以用黑色和白色圖形代表)，以便使檢測快速并精確。尸體剖檢和組織采集在DEAX掃描24個月后，用鹽酸氯胺酮(10mg/kg體重)將動物鎮(zhèn)靜以便運往尸檢實驗室。靜脈內戊巴比妥鈉(13mg/kg體重)給藥以使動物達到手術麻醉。將林格溶液經(jīng)18號針導入到左(心)室內。靜脈內注射5ml(325mg)戊巴比妥鈉以實施安死術。在腹部下腔靜脈處切出一縱向切口從而引流出心血管系統(tǒng)內的血液。切割下心臟和主血管，并在100mm/Hg的壓力下灌注1小時的10％中性緩沖的福爾馬林(NBF)。仔細地將心臟、主動脈、頸動脈和髂動脈切割分開，并浸固在10％的NBF中直至進一步的制備。取出包括顱內動脈在內的腦部并浸固在20％NBF中。粗粗地對所有主要器官系統(tǒng)進行檢查。收集生殖的、內分泌的、心血管的及其它的軟組織，固定在4％的低聚甲醛中和/或用液氮速凍，隨后進一步仔細地評估因處理所致的變化。
在將軟組織從屠體取出后，用高分辨率的DEXA對兩個股骨頭進行體外掃描，以描繪出局部的BMC差異，包括股骨頸、Ward氏三角和中骨干(皮質骨)的。將肱骨、右股骨及成對的腰3&4椎包在濕(林格液或鹽水)紗布中，用簽條標記，并置于適當?shù)挠袠撕灥腪iploc袋中以便在-20℃下冷凍，需要時可用于進一步的研究。
將左撓骨、腰椎2和5及胸椎6-9固定在70％的乙醇中，以便用于組織形態(tài)學分析。將左股骨置于10％NBF中用于DEXA掃描，隨后將其轉移到70％的乙醇中。將兩個膝蓋固定在10％NBF中并隨后置于70％的乙醇中，從而進行關節(jié)軟骨和軟骨下骨骼的關節(jié)評估。用Isomet鋸將胸骨節(jié)及胸椎13縱向切片(1-3mm厚)(除去背弓及橫突后)并固定在冷凍的4％低聚甲醛中。24小時后，將上述切片轉移到40％的乙醇中。將上述切片進行免疫細胞化學(Tulli等人，1992)及就地的雜交。生物力學(biomechanical)實驗對冷凍的骨骼進行生物力學骨折實驗及骨強度分析。力學實驗包括對股骨頸、肱骨中部骨干的三點結合處進行抗剪試驗，對椎骨進行疲勞試驗。冠狀動脈粥樣硬化評估為研究冠狀動脈粥樣硬化的范圍及嚴重性，垂直于動脈的長軸切取15塊樣品(各長3mm)。其中的5塊是從冠狀動脈左卷曲得到的連續(xù)塊，5塊是從左前下行冠狀動脈得到，而另5塊是從右冠狀動脈獲得。高濃度乙醇處理以將組織塊脫水，再包埋入石蠟中。從各組織塊上切取兩個切片(5μm)并用蘇木精和曙紅或Verhoeff-van·Gieson氏染色，隨后進行形態(tài)學評估。將Verhoeff-van·Gieson氏染色的動脈切片用投影顯微鏡投影到數(shù)字轉換器臺(digitizer plate)上。用手持尖筆與計算機輔助數(shù)字轉換器來描繪出動脈的組成部分。
對內膜面積、每單位長度的內彈性層的內膜面積、內彈性層中的內膜面積及冠狀動脈腔面積進行測定。內膜面積的測定是通過將各冠狀動脈切片的內彈性層與腔表面之間的區(qū)域進行數(shù)字化來算得。內膜面積的計算采用綜合性方法。內膜面積可用斑的尺寸表示。為得到每單位長度的內彈性層的內膜面積，將內彈性層的長度按內膜面積劃分。該測量結果提供了有關所取冠狀動脈切片的大致平均內膜厚度的情況。內彈性層的長度(周緣)可用來計算面積。該測量結果用來定性測量動脈尺寸。還可測量外彈性層的面積，但有關其精確位置的原理還不像對內彈性層的了解得那么清楚。兩者(內彈性層和外彈性層)的測量結果密切相關，因此，用內彈性層作為測量尺度。軟組織評估對所有其它軟組織的經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋及蘇木精和曙紅染色的切片進行評估。數(shù)據(jù)分析及解釋統(tǒng)計學方法由順序抽樣獲得的數(shù)值(例如組織形態(tài)學測定、光密度測定、血清和尿化學檢測)用重復測定方差分析(ANOVA)或協(xié)方差分析(ANCOVA)來進行分析，或采用適當?shù)姆菂?shù)方法。當需要參比任何兩個數(shù)據(jù)點時，可采用適當?shù)膮?shù)(t-統(tǒng)計)或非參數(shù)(Mann-Whitney或Wilcoxon)試驗。利用回歸及相關模型(參數(shù)及非參數(shù)的)來鑒定變量間的關系；例如，組織形態(tài)學測定及吸光分析測量之間的相關性。利用線性或曲線性的回歸分析來鑒定隨時間發(fā)生的變化率。此處所有參數(shù)分析采用Sokal和Rohlf(1981)的方法，并且所有非參數(shù)分析采用Seigel(1956)的方法。
下列實施例涉及說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的實施例。所屬領域技術人員應理解，實施例中那些公開的技術內容是按照發(fā)明人開發(fā)的有代表性的技術，都是為使發(fā)明的實施易于進行，因此，可以認為發(fā)明的實施是由優(yōu)選方式組成。但是，所屬領域技術人員還應該了解，按照本發(fā)明公開的內容，這些具體實施方案還可以有許多改變并同樣可以獲得相同或相似的結果，但都不脫離本發(fā)明的宗旨及范圍。
實施例1口服避孕藥對靈長類動物骨代謝的作用動物若絕經(jīng)前類固醇避孕藥物(Triphasil)的使用對CAA的進展及手術絕經(jīng)后的骨質疏松癥有影響，則選用207只雌性cynomolgus猴(Macacafascicularis)作為臨床對比實驗中專用于受試的成員。動物的平均年齡(根據(jù)牙列判斷)約為6歲齡，并且各組間無顯著性差異(p＞0.040)。將207只動物隨機地分成103只的未處理動物(對照)的組及104只口服避孕藥(Triphasil)-處理動物的組。在此提供的數(shù)據(jù)將根據(jù)降低的傾斜度(斜率)以及使組方差相等的需要來進行變換，并將它們進行方差分析(AVONA)或重復測定的協(xié)方差分析(ANCOVA)。所有在此所示的數(shù)據(jù)代表未變換數(shù)據(jù)的平均值±SEM。利用重復測定的ANCOVA來分析從0、10和20個月獲得的縱向骨光密度測定數(shù)據(jù)。以0月獲得的數(shù)據(jù)(基線)來作為預處理(未處理)變量對照。
給藥雌性cynomolgus猴消耗熱量約是婦女平均熱量的17％，或約306卡/天。基于估算出的120卡/kg體重(或一個成年婦女平均的1800卡/天)熱量攝取量，計算口服避孕藥劑量近似于人類的劑量來計算。所以，Triphasil-處理的猴子接受4種單獨的制劑(第1-7天，無激素；第8-13天，0.03mg炔雌醇和0.05mg左炔諾孕酮；第14-18天，0.04mg炔雌醇和0.075mg左炔諾孕酮；第19-28天，0.03mg炔雌醇和0.125mg左炔諾孕酮)飲食中含有0.55IU維生素D3/卡(168IU/天)、1.75mg鈣/(535mg/天)及1.49mg磷/卡(456mg/天)，鈣/磷的比例為1.17。該水平的鈣攝取量可換算成耗能1800卡/天婦女的3147mg鈣/天，該水平是年輕女性鈣推薦攝取量(1000mg/天)的三倍以上(參見Kanders等人，1988)，并且是絕經(jīng)后婦女鈣推薦攝取量(1500mg/d)的兩倍多。飲食中的維生素D3水平相應于婦女推薦日劑量的約兩倍。
骨光密度測定用Norland XR26的雙能(dual-energy)X-射線吸收比色計(DEXA；Norland,Ft.Atkinson,WI)來測定腰椎(L2-L4)骨無機物的含量(BMCsp,g)及密度(BMDsp,g/cm2)和全身骨無機物含量(BMCw,g)。在0和處理10個月時將207只動物各掃描一次，其中的188只還在處理20個月后進行掃描。在所有時間點兩組的BMDsp都沒有顯著的差異。兩組的BMDsp在0個月時無顯著性差異，但在10個月的Triphasil處理組卻顯著降低(p＜0.05)，并在處理20個月后繼續(xù)顯著降低。雖然BMCsp和BMDsp都隨時間增加，但存在顯著性組X時間的交互作用，這表明處理組的變化隨時間而不同。
Triphasil動物在BMCsp和BMDsp方面比未處理對照動物在此期間增長得少。兩組中的BMCw也隨時間增加，并且同樣存在顯著性組X時間的交互作用。Triphasil動物在處理10個月后比對照組獲得的BMCw要少。
血清生物標記物在處理前和處理期間每5個月的間期都需采集血清，用于評估骨代謝的循環(huán)標記物。取樣是在激素給藥的第21天進行。用Cobas Fara 11自動分析器來檢測ALP(U/L)、ACP(U/L)、TRAP(U/L)、鈣(Ca2+,mg/dl)和無機磷(Pi,mg/dl)，該分析器采用了由Roche Diagnostic Systems,Inc.(Nutley,NJ)提供的方法和試劑。在Triphasil組中，血清ALP水平比基線值降低了約43％，而在對照組中僅略微(12％)降低。在該試驗的過程中，Triphasil處理動物的血清ALP活性近似等于對照組的55-60％。Triphasil動物中的血清ACP和Ca2+也顯著降低，而處理對TRAP并沒有顯著影響，但從血清Pi水平中可觀察出對循環(huán)的作用。所以，Triphasil組表現(xiàn)出減少的骨吸收(ACP)及骨形成(ALP)的生物標記物。
血清雄激素水平口服避孕藥的使用引起了時間依賴型的抑制作用，該抑制作用導致血清DHEAS被抑制20-30％(p＜0.01)以及血清A的抑制；總T水平的顯著降低，達到30-35％(P＜0.01)；并且fT降低了60％(p＜0.01)；但SHBG在第11和21天時升高200-240％(p＜0.01)。這些結果證明，雄激素水平及周圍的雄激素代謝遭到深度抑制。(Wiegratz等人，1995；Kuhnz等人，1994)。
在對猴子的試驗中，在第10和20個月時采集血清并檢測總T、A和DHEAS。如表4所示，Triphasil組的血清雄激素水平是對照組的約半數(shù)。表4．絕經(jīng)前猴子的血清雄激素濃度(平均±SEM)對照 Triphasil p-值T(ng/ml)0.367±0.0190.182±0.0090.0001A(ng/ml) 3.96±0.191 1.89±0.0920.0001DHEAS(μg/ml)15.43±1.06 12.09±0.860.015身體測量及光密度測量表5列出在不同時間點從兩個處理組獲得的身體測量及光密度測量結果(平均±sem)。從表5可看出，當取207只動物在第0和10個月的時間點及取188只動物在第20個月的時間點處采集光密度測量數(shù)據(jù)時，每組的觀測數(shù)量在試驗中隨時間減少。由于該原因，應對各時間點分別進行分析。在任一時間點處，各組間在體重、軀干長、BMCw、BMCs方面都沒有顯著性差異。各組的BMDx在0時沒有顯著差異，但在第10個月時避孕組卻顯著性降低，并且在處理20個月后持續(xù)顯著降低。
由于在第3個時間點(20個月)的觀測(動物)數(shù)量減少，所以對第0和10個月的數(shù)據(jù)采用2×2方差分析法來進行分析。為了驗證長期作用，通過對全部三個時間點的2×3ANOVA或將為預處理測量調整的第10和20個月時間點的2×2ANCOVA來進行數(shù)據(jù)分析。表5．對從服用安慰劑(對照)或避孕藥(避孕)的207完整雌性cynomolgus猴在第0和10個月以及188動物在第20個月采集的身體測量數(shù)據(jù)及光密度測量數(shù)據(jù)在各時間點比較中的方差分析以及方差檢驗(ANOVA)。數(shù)值為平均±s.e.
對照 避孕 n p體重(kg)0月 2.80±0.042.89±0.04207 0.1510月2.89±0.042.97±0.04207 0.2020月2.89±0.042.99±0.04188 0.08干長(cm)0月 26.9±0.0127.0±0.01207 0.5910月27.0±0.0127.1±0.01207 0.4220月27.0±0.0127.2±0.01188 0.23椎骨L2-4的BMC(g)0月 4.23±0.084.27±0.07207 0.7310月4.54±0.084.46±0.08207 0.4620月4.63±0.094.50±0.08188 0.30椎骨L2-4的BMD(g/cm2)0月 0.476±0.006 0.473±0.005207 0.6510月 0.507±0.006 0.490±0.006207 0.0420月 0.515±0.006 0.494±0.006188 0.02全身BMC(g)0月111.5±2.1114.1±2.0207 0.7810月122.3±2.2122.6±2.0207 0.9120月123.8±2.5122.7±2.0188 0.72表6列出上述變量在0和10個月時的重復測定ANOVA結果。各組在基線時并無差別的體重在喂食中都發(fā)生顯著增加。在前10個月結束時沒有發(fā)現(xiàn)軀干長度受到組間的或時間的影響。但椎骨(L2-4)的BMC和BMD都隨時間增高，并出現(xiàn)顯著性組×時間的交互作用，這表明處理組隨時間發(fā)生不同的變化?？诜茉兴幪幚淼膭游镌谧倒荁MC和BMD隨時間變化方面比未處理對照組增加的少。各組都表現(xiàn)出全身BMC隨時間增加，并且也出現(xiàn)顯著性組×時間的交互作用。處理10個月后，避孕藥處理的動物獲得的BMC要比對照組少。表6．對從服用安慰劑(對照)或避孕藥(避孕)的207只完整雌性cynomolgus猴在第0個月(基線)及處理10個月后所采集的身體測量數(shù)據(jù)及光密度測量數(shù)據(jù)的重復測定方差分析。<
在0、10和20個月時獲得的縱向身體測量和骨光密度測量的數(shù)據(jù)采用重復測定ANCONA法進行發(fā)現(xiàn)。0月(基線)時的數(shù)據(jù)用于對照預處理變量。還列出接受評估的動物在全部三個時間點處的數(shù)據(jù)的各平均值及標準偏差(表7和8)。與表5中的值相比略微改變，這是由于需消除不完全數(shù)據(jù)。在前10個月時顯著增加的體重在第二個10月期間并未改變并且沒有表現(xiàn)出組或組×時間的交互作用(表7)。兩組中，軀干長度隨時間增加的跡象較微弱，但沒有觀察到組或組×時間的交互作用。表7．從0、10和20個月時間點采集的完全身體測量數(shù)據(jù)的重復測定方差1和協(xié)方差2分析。
體重(kg)對照避孕(n=91) (n=97)0月 2.80±0.042.91±0.0410月2.89±0.043.00±0.0420月2.89±0.042.99±0.041〔無協(xié)方差〕，組的p=0.06；時間的p=0.00；組×時間交互作用的p=0.982〔協(xié)方差=0月時的BW〕，組的p=0.75；時間的p=0.59；組×時間交互作用的p=0.92軀干長 對照 避孕(cm) (n=91)(n=97)0個月 26.9±0.127.1±0.110個月26.9±0.127.2±0.120個月27.0±0.127.2±0.11〔無協(xié)方差〕，組的p=0.26；時間的p=0.00；組×時間交互作用的p=0.402〔協(xié)方差=0月時的TL〕，組的p=0.17；時間的p=0.01；組×時間交互作用的p=0.86在對預處理(0時)差別進行調整后，觀察顯著性組、時間及受時間影響組的腰椎骨無機物含量和密度(表8)。椎骨BMC及BMD在0和10月期間有所增加，但在10和20月期間增加的很少。與對照動物相比，避孕藥處理的動物骨獲得率要低，這導致在處理的10和20個月時椎骨BMC和BMD較低。同時還觀察顯著性組、時間及與時間的交互作用組的全身BMC。全身BMC在第一個10月時對照組和避孕藥處理組都顯著性增加，但在下一個10月時對照組略微增加而避孕藥處理組略微降低。表8．從0、10和20個月時間點采集的完全骨光密度測量數(shù)據(jù)的重復測定方差和協(xié)方差分析(組平均值±sem)。協(xié)方差分析的調整平均值列在方括號內〔〕。椎骨BMC(g)0月 4.22±0.08 4.29±0.0810月4.52±0.08[4.56]4.48±0.08[4.45]20月4.62±0.09[4.66]4.50±0.08[4.46]1〔無協(xié)方差〕，組的p=0.78；時間的p=0.00；組×時間交互作用的p=0.002〔協(xié)方差=0月時的BMC(椎骨)，軀干長〕，組的p=0.00；時間的p=0.00；組×時間交互作用的p=0.00椎骨BMD(g/cm2)0月 0.476±0.006 0.473±0.00610月 0.506±0.006
0.491±0.006
20月 0.515±0.006
0.494±0.006
1〔無協(xié)方差〕，組的p=0.12；時間的p=0.00；組×時間交互作用的p=0.002〔協(xié)方差=0月時的BMD(椎骨)，BMC(椎骨)〕，組的p=0.00；時間的p=0.00；組×時間交互作用的p=0.03全身BMC(g)對照(n=91) 避孕(n=97)0月 111.4±2.0 115.0±2.010月122.0±2.2[123.8]124.0±2.0[122.4]20月123.8±2.4[125.5]122.7±2.0[121.0]1〔無協(xié)方差〕，組的p=0.61；時間的p=0.00；組×時間交互作用的p=0.002〔協(xié)方差=0月時的BMC(全身)，BMC(椎骨〕，組的p=0.00；時間的p=0.71；組×時間交互作用的p=0.00骨生物標記物表9列出血清生物標記物分析的結果。由于觀測數(shù)量隨時間發(fā)生了改變，所以對各時間點分別進行組比較。在避孕組中，血清堿性磷酸酶水平比預處理時(0時)的數(shù)值降低了約43％，而對照組中堿性磷酸酶水平比預處理時僅略微降低(12％)。在處理期間，避孕藥處理的動物的血清堿性磷酸酶活性是對照組的約55-60％。避孕組的血清酸性磷酸酶及鈣也有顯著性降低，但對耐酒石酸酸性磷酸酶或血清磷酸水平都沒有觀測到相似的作用。所以，避孕組表現(xiàn)出降低了的骨吸收(酸性磷酸酶)和骨形成(堿性磷酸酶)血清標記物。表9．各時間點血清生物標記物數(shù)據(jù)比較的方差分析對照避孕n p=堿性磷酸酶(U/L)0月197.1±6.8 180.2±7.21800.0905個月 173.5±6.9 103.5±5.91130.00010個月 172.7±4.9 104.7±3.31740.00015個月 190.9±9.1 104.8±4.41710.00020個月 173.4±9.0 102.5±6.860 0.000酸性磷酸酶(U/L)0月8.39±0.21 8.47±0.251800.8205個月 8.35±0.31 7.89±0.321130.30710個月 8.90±0.23 7.89±0.171740.00615個月 9.01±0.22 8.11±0.181720.00220個月 8.72±0.35 7.07±0.35 590.002耐酒石酸酸性磷酸酶(U/L)0月3.70±0.07 3.80±0.061780.2805個月 4.12±0.10 3.68±0.151130.01310個月 4.44±0.09 4.33±0.091740.36015個月 4.14±0.08 4.09±0.101720.70020個月 4.35±0.19 4.09±0.1659 0.306鈣(mg/dl)0月 9.23±0.04 9.27±0.041800.4705個月 9.12±0.05 8.90±0.051130.00510個月9.19±0.07 8.96±0.051740.00815個月8.98±0.05 8.73±0.041720.00020個月9.03±0.07 8.85±0.0860 0.092磷酸(mg/dl)0月 3.78±0.113.51±0.11 1800.0795個月 3.67±0.083.99±0.10 1130.08210個月3.74±0.103.97±0.09 1740.09715個月3.71±0.083.46±0.07 1720.01520個月3.77±0.144.00±0.15 60 0.272上述生化發(fā)現(xiàn)表明，口服避孕藥處理在上述動物中引起骨更新的整體減緩。骨更新率的降低通常與骨無機物的保存相關，這是由于雌激素替代療法可能通過降低總骨更新率來保存卵巢切除的猴子的骨密度。但在這種情況下，相對于對照動物而言，口服避孕藥的處理可導致骨更新生物標記物的減少以及對凈骨無機物密度的明確副作用。
上述數(shù)據(jù)表明，在正處于自然生長的年輕雌性猴子中，長時間口服避孕藥的療法將減弱骨的凈自然增長并且可能導致較低的峰骨質。
實施例2雌激素對絕經(jīng)后猴子的作用骨組織學和生物力學本實施例提供了從絕經(jīng)后猴子試驗中獲得的組織形態(tài)學測量數(shù)據(jù)。骨組織形態(tài)學測量在未處理的卵巢切除婦女中，如同雌激素-不足的卵巢切除猴，當骨更新增強時，凈作用結果卻是骨損失?，F(xiàn)有的報告已證明血清標記物與組織形態(tài)學測量數(shù)據(jù)間的良好相關性(Jerome等人，1994)。在處理11個月后，對在卵巢切除的猴子中髂骨及腰骨網(wǎng)狀骨質出現(xiàn)的結構變化進行研究(Jayo等人，1995)。將受試動物的兩側卵巢都切除并分成3組1)未處理(OVX)，2)接受雌激素替代療法(ERT)，和3)接受ERT加噻吩類利尿劑(thiazide diuretics)(ERT+TZ)。表10列出髂骨網(wǎng)狀骨質組織形態(tài)學測量的資料。表10 在OVX、OVX+ERT、ERT+TZ的cynomolgus猴子中髂骨網(wǎng)狀骨質的結構組織形態(tài)學測定(平均值±sem，采納Jayo等人，1995)測量結果 OVX(n=10) ERT(n=10) ERT+TZ p-值(n=10)網(wǎng)狀骨質體積(％)0月 28.87±2.0327.17±2.9725.47±2.19NS11個月 17.92±1.5125.65±2.6323.62±1.91 0.036小梁厚度(μm)0月 130.00±6.27 138.05±5.53 119.12±7.76NS11個月 102.12±6.44 110.85±7.16 101.71±6.29NS小梁n(/mm)0月2.23±0.14 1.95±0.18 2.14±0.12NS11個月 1.68±0.14 2.23±0.18 2.28±0.16 0.023小梁的分距(μm)0月 334.08±28.83 412.61±50.08 365.54±35.77NS11個月 540.43±63.10 370.66±51.83 355.36±29.24 0.026有文獻公開有關卵巢切除猴子在25個月后，其椎骨網(wǎng)狀骨質(腰)骨的中矢狀(midsagittal)切片出現(xiàn)結構變化(Carlson等人，1992；Jerome等人，1994)。各組在椎骨網(wǎng)狀骨質體積及小梁厚度方面也存在顯著性差異，但在小梁數(shù)量或分離距離方面沒有差異(表11)。表11在卵巢切除的(OVX)、OVX+17-β雌二醇(ERT)及OVX+17-β雌二醇+孕酮處理的(ERT+P)cynomolgus猴子中椎骨網(wǎng)狀骨質的結構及動力學組織形態(tài)學測量測量 OVX(n=10)ERT(n=10) ERT+P網(wǎng)狀骨質體積(％) 24.3±1.224.6±1.3 8.6±1.02*類骨質表面(OS/BS,μm) 17.5±3.16.8±0.911.9±2.2無機物外積率(μm/天) 0.65±0.03 0.48±0.02 0.56±0.03*p＜0.05對OVX和ERTp＜0.05對OVXp＜1.0對ERT總之，血清生物標記物及組織形態(tài)學數(shù)據(jù)表明，骨形成率在手術絕經(jīng)的猴子中明顯增高，骨更新通常需持續(xù)至少2年才增加。這種功能的變化將伴隨有網(wǎng)狀骨質構造變化及趨勢以及相應的結構成份的損失。為驗證結構成份損失的推斷，測定了卵巢切除動物骨折所需的生物機械力。骨生物機械試驗將在術后30個月時從INT及OVX獼猴采集的脛骨收集、冷凍并用Instron材料試驗系統(tǒng)(Kasra和Grynpas,1992)測定。使中干承受無破壞性3點彎曲試驗以測定彈性模量，隨后進行破壞性扭轉試驗以測量剪切模量和破壞剪切應力。還測量中干的橫切面積。雖然橫切面積在各組中沒有差異，但其它所有參數(shù)在OVX動物中要比在INT動物的顯著降低(p＜0.05)，這表明骨骼在絕經(jīng)后機械性能減弱并且脆性增加(表12)。表12完整(INT)和卵巢切除(OVX)的cynomolgus獼猴在術后30個月時的脛骨機械特性試驗INT(n=11) OUX(n=11)p-值彈性模量(MPa)9044±4007193±412＜0.01剪切模量(MPa)2849±1382215±147＜0.05破壞應力(MPa) 47±2.4 35±2.1＜0.05面積(mm2)37±1.2 37±1.5NS在完整雌性猴(INT)、用雄甾烯二酮加E1(ANDRO)處理的完整猴及用睪丸素處理的完整猴(TETSO)中評估雄激素對骨生物機械特性的作用(Adams等人，1995；Kasra和Gynpas,1995)。在該試驗中，TESTO的猴子接受超生理學(supraphysiological)水平的T、使它們具有與公猴類似的T水平以及雄性機體的組成。對從股骨頭取出的芯樣進行研究并且結果列在表13中。表13．INT、ANDRO及TESTO的cynomolgus獼猴在處理后30個月時的股骨小梁骨的機械特性(平均值±sd，每組n=12)。采納kasra等人，1995。共有的符號表示顯著性差異(p＜0.05)試驗 INT ANDROTESTO彈性模量(MPa) 392±70*+ 737±152 812±123*最大應力(MPa) 23.6±4.8*23.2±2.6 29.8±5.4*密度(g/cm3) 1.326±0.09*1.389±0.05 1.440±0.06*同時也對脛骨進行生物機械試驗，并且發(fā)現(xiàn)TESTO組具有強壯的、堅韌的及強直的脛骨(Kasra和Grypas,1995)。
上述骨試驗表明，手術性絕經(jīng)后獼猴的骨骼變化與絕經(jīng)后婦女的相似，其中包括骨更新的增強、骨質降低、網(wǎng)狀骨質微結構的變化以及折衷(compromised)的骨強度。通過含有或不含有孕激素的ERT法可以預防這些變化。在絕經(jīng)前猴子中，雄激素處理的動物的骨強度有所提高，并且T處理的動物具有更強和更致密的骨骼。
實施例3絕經(jīng)前猴子中的動脈粥樣硬化相關性試驗口服避孕藥對完整雌性cynomolgus獼猴CAA的作用業(yè)已公開(Clarkson等人，1990)。在該試驗中，給年輕的成年雌性cynomolgus獼猴喂食致動脈粥樣硬化的飲食并將它們分成三組對照組、炔雌醇和炔諾孕酮給藥組、炔雌醇和雙醋炔諾醇給藥組。兩種避孕藥制劑都使HDL膽固醇降低。但是，兩種避孕藥都使CAA程度減輕。
本發(fā)明人研究了雌性猴在食用可誘發(fā)動脈粥樣硬化飲食后所引發(fā)的過度雄性性征(hyperandrogenism)作用(Adams等人，1995)。30個月后，TESTO組動物的CAA比未處理INT組動物增加了近兩倍(p＜0.05)，但ANDRO處理并未對動脈粥樣硬化的程度造成影響。T的致動脈粥樣化作用與血漿脂蛋白風險變量無關。雖然TESTO組猴子中動脈粥樣硬化程度較高，但血管舒縮活性與INT猴子的相似。本發(fā)明人已觀察到，手術絕經(jīng)后猴子在添加甲基睪丸素(MT)的炔雌醇療法中并未受到損害。MT療法沒有抑制炔雌醇對動脈壁的有益作用。
實施例4如下所述的包含28片的口服避孕藥制劑6片含有0.03mg炔雌醇、0.05mg左炔諾孕酮及0.25mg甲基睪丸素的在月經(jīng)周期第8-13天連續(xù)服用的片劑；5片含有約0.075mg左炔諾孕酮及約0.040mg炔雌醇并在月經(jīng)周期第14-18天連續(xù)服用的片劑；10片含有約0.125mg左炔諾孕酮及約0.030mg炔雌醇的在月經(jīng)周期第19-28天連續(xù)服用的片劑；和，7片不含任何口服避孕激素的安慰劑，它們在月經(jīng)周期的第1-7天服用。
實施例5如下所述的包含28片的口服避孕藥制劑6片含有0.03mg炔雌醇、0.05mg左炔諾孕酮及0.3mg甲基睪丸素并在月經(jīng)周期第8-13天連續(xù)服用的片劑；5片含有約0.075mg左炔諾孕酮及約0.040mg炔雌醇且在月經(jīng)周期第14-18天時連續(xù)服用的片劑；10片含有約0.125mg左炔諾孕酮及約0.030mg炔雌醇并在月經(jīng)周期第19-28天連續(xù)服用的片劑；和，7片不含任何口服避孕激素的安慰劑，它們在月經(jīng)周期的第1-7天服用。
實施例6如下所述的包含28片的口服避孕藥制劑6片含有0.03mg炔雌醇、0.05mg左炔諾孕酮及0.5mg甲基睪丸素并且在月經(jīng)周期第8-13天連續(xù)服用的片劑；5片含有約0.075mg左炔諾孕酮及約0.040mg炔雌醇且在月經(jīng)周期第14-18天時連續(xù)服用的片劑；10片含有約0.125mg左炔諾孕酮及約0.030mg炔雌醇并在月經(jīng)周期第19-28天連續(xù)服用的片劑；和，7片不含任何口服避孕激素的安慰劑，它們是在月經(jīng)周期的第1-7天服用。
實施例7如下所述的包含28片的口服避孕藥制劑6片含有0.03mg炔雌醇、0.05mg左炔諾孕酮及0.75mg甲基睪丸素并在月經(jīng)周期第8-13天連續(xù)服用的片劑；5片含有約0.075mg左炔諾孕酮及約0.040mg炔雌醇且在月經(jīng)周期第14-18天時連續(xù)服用的片劑；10片含有約0.125mg左炔諾孕酮及約0.030mg炔雌醇并在月經(jīng)周期第19-28天連續(xù)服用的片劑；和，7片不含任何口服避孕激素的安慰劑，它們在月經(jīng)周期的第1-7天服用。
實施例8如下所述的包含28片的口服避孕藥制劑6片含有0.03mg炔雌醇、0.05mg左炔諾孕酮及1.0mg甲基睪丸素并在月經(jīng)周期第8-13天連續(xù)服用的片劑；5片含有約0.075mg左炔諾孕酮及約0.040mg炔雌醇且在月經(jīng)周期第14-18天時連續(xù)服用的片劑；10片含有約0.125mg左炔諾孕酮及約0.030mg炔雌醇并在月經(jīng)周期第19-28天連續(xù)服用的片劑；和，7片不含任何口服避孕激素的安慰劑，它們在月經(jīng)周期的第1-7天服用。
實施例9如下所述的包含28片的口服避孕藥制劑6片含有0.03mg炔雌醇、0.05mg左炔諾孕酮及1.5mg甲基睪丸素并在月經(jīng)周期第8-13天連續(xù)服用的片劑；5片含有約0.075mg左炔諾孕酮及約0.040mg炔雌醇且在月經(jīng)周期第14-18天時連續(xù)服用的片劑；10片含有約0.125mg左炔諾孕酮及約0.030mg炔雌醇并在月經(jīng)周期第19-28天連續(xù)服用的片劑；和，7片不含任何口服避孕激素的安慰劑，它們在月經(jīng)周期的第1-7天服用。
實施例10如下所述的包含28片的口服避孕藥制劑6片含有0.03mg炔雌醇、0.05mg左炔諾孕酮及1.5mg甲基睪丸素并在月經(jīng)周期第8-13天連續(xù)服用的片劑；5片含有約0.075mg左炔諾孕酮及約0.040mg炔雌醇且在月經(jīng)周期第14-18天連續(xù)服用的片劑；10片含有約0.125mg左炔諾孕酮及約0.030mg炔雌醇并在月經(jīng)周期第19-28天連續(xù)服用的片劑；和，7片不含任何口服避孕激素的安慰劑，它們在月經(jīng)周期的第1-7天服用。
實施例11如下所述的包含28片的口服避孕藥制劑6片含有0.03mg炔雌醇、0.05mg左炔諾孕酮及0.25mg甲基睪丸素并在月經(jīng)周期第8-13天連續(xù)服用的片劑；5片含有約0.075mg左炔諾孕酮、約0.040mg炔雌醇及約0.25mg甲基睪丸素且在月經(jīng)周期第14-18天時連續(xù)服用的片劑；10片含有約0.125mg左炔諾孕酮、約0.030mg炔雌醇、0.025mg甲基睪丸素并在月經(jīng)周期第19-28天連續(xù)服用的片劑；和，7片不含任何口服避孕激素的安慰劑，它們在月經(jīng)周期的第1-7天服用。
實施例12如下所述的包含28片的口服避孕藥制劑6片含有0.03mg炔雌醇、0.05mg左炔諾孕酮及0.5mg甲基睪丸素并在月經(jīng)周期第8-13天連續(xù)服用的片劑；5片含有約0.075mg左炔諾孕酮、約0.040mg炔雌醇及約0.5mg甲基睪丸素且在月經(jīng)周期第14-18天時連續(xù)服用的片劑；10片含有約0.125mg左炔諾孕酮、約0.030mg炔雌醇0.5mg甲基睪丸素并在月經(jīng)周期第19-28天連續(xù)服用的片劑；和，7片不含任何口服避孕激素的安慰劑，它們在月經(jīng)周期的第1-7天服用。
雖然本發(fā)明的組合物及方法是通過優(yōu)選實施方案加以說明的，但所屬領域技術人員可清楚地理解那些對于此處所述組合物、方法及所述方法的步驟或步驟的順序進行的改變都不脫離本發(fā)明的概念、宗旨和范圍。具體而言，很顯然，某些化學上及物理上相關的試劑可以取代此處所述的藥劑來獲得相同的或相似的結果。所有此類的對于所屬領域技術人員很顯然的相似取代物及改進都被認定是屬于本發(fā)明如權利要求書定義的宗旨、范圍及概念中。
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權利要求
1．一種避孕制劑，該制劑含有有效量的雌激素、孕激素和雄激素，該制劑可以促進該避孕藥使用者骨骼的自然增長。
2．根據(jù)權利要求1的制劑，其中所述雄激素為甲基睪丸素。
3．根據(jù)權利要求2的制劑，所述制劑被進一步定義為每個日劑量含有約0.2mg-約1.5mg甲基睪丸素。
4．根據(jù)權利要求1的制劑，其中所述制劑在月經(jīng)周期約第8-13天給藥。
5．根據(jù)權利要求1的制劑，其中所述孕激素為約0.050mg的左炔諾孕酮并且所述雌激素為約0.03mg的炔雌醇。
6．一種口服避孕藥制劑，該制劑包括(a)在月經(jīng)周期第8天至約第13天每天給藥的含有甲基睪丸素、左炔諾孕酮及炔雌醇的一種組合物；(b)在月經(jīng)周期第13天以后每天給藥的含有左炔諾孕酮和炔雌醇的一種組合物；
7．根據(jù)權利要求6的制劑，該制劑進一步含有在月經(jīng)周期第1-7天每天給藥的安慰劑組合物。
8．根據(jù)權利要求6的制劑，其中(a)的組合物被進一步定義成為每個日劑量含有約0.2mg-約1.5mg甲基睪丸素。
9．根據(jù)權利要求8的制劑，其中(a)的組合物被進一步定義成包含約0.050mg左炔諾孕酮和約0.030mg炔雌醇。
10．根據(jù)權利要求6的制劑，其中(b)的組合物被進一步定義成為一種在月經(jīng)周期第14-18天服用的包含約0.075mg左炔諾孕酮和約0.040mg炔雌醇的第一組合物；一種在月經(jīng)周期第19-28天服用的包含約0.125mg左炔諾孕酮和約0.030mg炔雌醇的第二組合物。
11．根據(jù)權利要求10的制劑，其中的第一組合物、所述第二組合物或兩者都被進一步定義成為每個日劑量包含約0.25mg-約0.5mg的甲基睪丸素。
12．一種口服避孕藥組合物，該組合物每個日劑量中含有約0.2mg-約1.5mg甲基睪丸素、約0.050mg左炔諾孕酮及約0.030mg炔雌醇。
13．一種配制成下列28種片劑的口服避孕藥組合物(a)6片含有約0.2mg-約1.5mg甲基睪丸素、約0.050mg左炔諾孕酮及約0.03mg炔雌醇的片劑；(b)5片含有約0.075mg左炔諾孕酮及約0.040mg炔雌醇的片劑；(c)10片含有約0.125mg左炔諾孕酮及約0.030mg炔雌醇的片劑；和(d)7片安慰劑。
14．一種根據(jù)權利要求13的口服避孕藥組合物，其中組合物(b)、組合物(c)或兩者進一步在其每個日劑量中包含0.20mg-0.50mg甲基睪丸素。
15．一種根據(jù)權利要求13的口服避孕藥組合物，其中所述片劑是包裝在一個包括28個腔室的分配器內，每個腔室專用于容納一個片劑，并且其中所述分配器提供一種將所述片劑按照預定順序分配的方式。
16．一種提高服用含雌激素口服避孕藥對象骨骼自然增長的方法，其中所述對象還未達到峰骨質，該方法包括在給予所述對象口服避孕藥的同時給予雄激素。
17．根據(jù)權利要求16的方法，其中所述雄激素是在月經(jīng)周期第8-13天期間每天給予約0.2mg-約1.5mg的甲基睪丸素。
18．根據(jù)權利要求16的方法，其中所述雄激素是在月經(jīng)周期第8-28天期間每天給予約0.2mg-約1.5mg的甲基睪丸素。
19．一種預防使用者妊娠的方法，該方法包括給予所述使用者一種制劑，該制劑包括在月經(jīng)周期第8-13天每天服用的0.2mg-約1.5mg甲基睪丸素、約0.050mg左炔諾孕酮及約0.030mg炔雌醇；在月經(jīng)周期第14-18天每天服用的約0.075mg左炔諾孕酮及約0.040mg炔雌醇；和在月經(jīng)周期第19-28天每天服用的約0.125mg左炔諾孕酮及約0.030mg炔雌醇。
20．一種預防使用對象妊娠的方法，該方法包括給予使用對象一種制劑，該制劑包括在月經(jīng)周期第8-13天每天服用的0.2mg-約1.5mg甲基睪丸素、約0.050mg左炔諾孕酮及約0.030mg炔雌醇；在月經(jīng)周期第14-18天每天服用的約0.075mg左炔諾孕酮、約0.040mg炔雌醇及約0.2mg-約0.5mg甲基睪丸素；和在月經(jīng)周期第19-28天每天服用的約0.125mg左炔諾孕酮、約0.030mg炔雌醇及約0.2mg-約0.5mg甲基睪丸素。
21．一種月用口服避孕藥包裝，該包裝含有7片含有安慰劑組合物的片劑，它們在月經(jīng)周期的第1-7天服用；6片含有約0.2mg-約1.5mg甲基睪丸素、約0.050mg左炔諾孕酮及約0.030mg炔雌醇并且在月經(jīng)周期第8-13天服用的片劑；5片含有約0.075mg左炔諾孕酮及約0.040mg炔雌醇且在月經(jīng)周期第14-18天時服用的片劑；10片含有約0.125mg左炔諾孕酮及約0.030mg炔雌醇并在月經(jīng)周期第19-28天連續(xù)服用的片劑；和一個含有28個腔室的分配器，所述各腔室含有一種口服避孕藥組合物。
22．一種月用口服避孕藥包裝，該包裝含有7片含有安慰劑組合物的片劑，它們在月經(jīng)周期的第1-7天每天服用；6片含有約0.2mg-約1.5mg甲基睪丸素、約0.050mg左炔諾孕酮及約0.030mg炔雌醇并且在月經(jīng)周期第8-13天每天服用的片劑；5片含有約0.075mg左炔諾孕酮、約0.040mg炔雌醇及約0.2mg-約0.5mg甲基睪丸素且在月經(jīng)周期第14-18天時每天服用的片劑；10片含有約0.125mg左炔諾孕酮、約0.030mg炔雌醇及約0.2mg-約0.5mg甲基睪丸素并在月經(jīng)周期第19-28天每天連續(xù)服用的片劑；和一個含有28個腔室的分配器，所述各腔室含有一種口服避孕藥組合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了口服避孕的方法及組合物。本發(fā)明的特定組合物包含雄激素,優(yōu)選甲基睪丸素,所述的本發(fā)明組合物是供年輕的避孕藥使用者服用,從而抑制由于使用口服避孕藥而對骨無機物密度產(chǎn)生的負作用。
文檔編號A61K9/20GK1225008SQ97196255
公開日1999年8月4日 申請日期1997年7月9日 優(yōu)先權日1997年7月9日
發(fā)明者C·L·小·修斯, M·J·杰伊 申請人:威克福雷大學