本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種腺苷在制備雌激素類(lèi)藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物雌激素存在于一些天然植物中，具有雌激素樣作用。植物雌激素可與體內(nèi)雌激素受體和雌激素相關(guān)受體結(jié)合起到雙向調(diào)節(jié)雌激素受體作用，顯示出雌激素樣活性。在體內(nèi)雌激素水平較低時(shí)有擬雌激素樣作用；當(dāng)體內(nèi)雌激素水平較高時(shí)，可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性與雌激素受體結(jié)合，抑制內(nèi)源性雌激素的作用而產(chǎn)生抗雌激素活性。因此，植物雌激素被稱(chēng)為天然的選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑。天然的植物雌激素相比于合成的雌激素，其雌激素樣活性要低，但是所引起的乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等副作用也更少，使用會(huì)更安全。因此對(duì)植物雌激素的研究逐漸成為熱點(diǎn)。

腺苷，指由腺嘌呤的n-9與d-核糖的c-1通過(guò)β糖苷鍵連接而成的化合物，其磷酸酯為腺苷酸。腺苷是一種遍布人體細(xì)胞的內(nèi)源性核苷，可直接進(jìn)入心肌經(jīng)磷酸化生成腺苷酸，參與心肌能量代謝，同時(shí)還參與擴(kuò)張冠脈血管，增加血流量。腺苷對(duì)心血管系統(tǒng)和肌體的許多其它系統(tǒng)及組織均有生理作用。腺苷能使房室結(jié)傳導(dǎo)減慢，阻斷房室結(jié)折返途徑，陣發(fā)性室上性心動(dòng)過(guò)速(psvt)(伴或不伴預(yù)激綜合征)患者恢復(fù)正常竇性心律，而腺苷的雌激素樣作用的研究未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述情況，為解決現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種腺苷在制備雌激素類(lèi)藥物中的應(yīng)用，即腺苷的新用途，可有效用于雌激素類(lèi)藥物的制備。

本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，達(dá)到雌激素樣作用的腺苷給藥量不低于50mg/kg/d。

本發(fā)明開(kāi)辟了腺苷的新用途，有效用于雌激素類(lèi)藥物的制備，解決由于體內(nèi)雌性激素分泌不足而引起的相關(guān)疾病，是藥物上的創(chuàng)新。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合試驗(yàn)資料對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)腺苷具有雌激素樣作用，有關(guān)試驗(yàn)資料如下：

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)藥物

腺苷(索萊寶a8240)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株

清潔級(jí)昆明種小鼠，雌性，出生21天(剛斷乳)，體重9～12g，購(gòu)自于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：scxk(京)2016-0011。人乳腺癌細(xì)胞(mcf-7)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

1.3儀器與試劑

戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥)；酶標(biāo)儀(bio-rad680)；zrd-7080全自動(dòng)新型鼓風(fēng)干燥箱(上海智城分析儀器制造有限公司)；微量加樣器(nichipetexplus)；ab204-n電子讀數(shù)分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品)；10cm培養(yǎng)皿、96孔培養(yǎng)板、凍存管(corning)；普通手術(shù)器械；90-3磁力攪拌器(上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；倒置顯微鏡(nikoneclipsets100)；二氧化碳培養(yǎng)箱(stik)；sorvallst16rcentrifuge高速低溫冷凍離心機(jī)(thermofisherscientific公司)。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1小鼠子宮增重實(shí)驗(yàn)

將小鼠按體重均衡和隨機(jī)的原則分組，持續(xù)給藥7天。正常組每日蒸餾水0.02ml/g灌胃；陽(yáng)性對(duì)照組隔日灌胃戊酸雌二醇(0.33mg/kg/d)灌胃；腺苷0.5mg/10g/d，配成水溶液，每日按0.02ml/g灌胃。最后一次給藥24h后，摘眼球取血，脫頸椎處死小鼠，立即摘取子宮稱(chēng)重，計(jì)算子宮系數(shù)[子宮濕重×(體重)^-1×100％]。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)三次。結(jié)果與正常組相比，計(jì)算p值，考察有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2mcf-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

mcf-7細(xì)胞經(jīng)含5％去雌激素胎牛血清的無(wú)酚紅dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)1周后，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，pbs洗兩次，用0.05％胰蛋白酶消化后，加入無(wú)酚紅dmem培養(yǎng)基吹打均勻，以2×10⁴個(gè)/ml的濃度接種于96孔板內(nèi)，每孔培養(yǎng)總體積為200μl。培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁后，換為腺苷培養(yǎng)液(5μm)繼續(xù)培養(yǎng)。37℃、5％co2培養(yǎng)48h后，每孔加入mtt溶液(5mg/ml)20μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸凈培養(yǎng)液，每孔加入150μldmso，震蕩5-10min，使紫色結(jié)晶完全溶解。用酶標(biāo)儀在490nm下測(cè)定各孔吸光度值(a)，計(jì)算平均a值和細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)三次。

細(xì)胞活力＝各組od值/正常組od值

2.3ici182,780拮抗實(shí)驗(yàn)

mcf-7細(xì)胞經(jīng)含5％去雌激素胎牛血清的無(wú)酚紅dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)1周后，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以2×10⁴個(gè)·ml^-1的濃度接種于96孔板內(nèi)，每孔培養(yǎng)總體積為200μl。細(xì)胞貼壁后，加藥干預(yù)，其中拮抗組在給藥前2h加雌激素受體阻斷劑ici182,780(1μm)。37℃、5％co2培養(yǎng)48h后，每孔加入mtt溶液(5mg/ml)20μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸凈培養(yǎng)液，每孔加入150μldmso，震蕩5-10min，使紫色結(jié)晶完全溶解。用酶標(biāo)儀在490nm下測(cè)定各孔吸光度值(a)，計(jì)算平均a值和細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)三次。

細(xì)胞活力＝各組od值/正常組od值

2.4elisa法檢測(cè)血清e(cuò)2、lh、fsh

小鼠摘眼球取血，血液室溫靜置1h后，3000轉(zhuǎn)離心10min，取上清。按照elisa試劑盒說(shuō)明書(shū)仔細(xì)操作。

3統(tǒng)計(jì)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，用spss20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析(one-wayanova)進(jìn)行組間差異的比較，以p<0.05為差異有顯著性意義，以p<0.01為差異有極顯著性意義。

4實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1腺苷對(duì)性未成熟雌性小鼠子宮系數(shù)的影響

與正常組相比，腺苷能顯著誘導(dǎo)性未成熟雌性小鼠子宮系數(shù)的增加(p<0.05)。提示腺苷在體內(nèi)具有雌激素樣作用。見(jiàn)表1。

表1腺苷對(duì)性未成熟雌性小鼠子宮系數(shù)的影響(n＝10)

注:與正常組比較，^*表示p<0.05，^**表示p<0.01。

4.2腺苷對(duì)mcf-7細(xì)胞促增殖作用

腺苷在10μm時(shí)與正常組比，對(duì)mcf-7細(xì)胞有顯著的促增殖作用(p<0.05)。提示腺苷在體外具有雌激素樣作用。見(jiàn)表2。

表2腺苷對(duì)mcf-7細(xì)胞增殖的影響(n＝6)

注:與正常組比較，^*表示p<0.05，^**表示p<0.01。

4.3ici182,780對(duì)腺苷促mcf-7細(xì)胞增殖的影響

腺苷能顯著促進(jìn)mcf-7細(xì)胞的增殖(p<0.05)；但當(dāng)與雌激素受體阻斷劑ici182,780共同干預(yù)時(shí)，腺苷的促增殖作用消失，與正常組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示腺苷對(duì)mcf-7細(xì)胞的促增殖作用是通過(guò)雌激素受體介導(dǎo)發(fā)揮的，見(jiàn)表3。

表3ici182,780對(duì)腺苷促mcf-7細(xì)胞增殖的影響(n＝6)

注:與正常組比較，^*表示p<0.05，^**表示p<0.01。

4.4腺苷對(duì)血清e(cuò)2、lh、fsh的影響

與正常組相比，腺苷能顯著增加小鼠血清e(cuò)2、fsh的水平，但基本不影響血清lh的水平(p<0.05)。提示腺苷在體內(nèi)具有雌激素樣作用，可能與其增加體內(nèi)e2以及fsh的水平有關(guān)。見(jiàn)表4。

表4腺苷對(duì)血清e(cuò)2、lh、fsh的影響(n＝10)

注:與正常組比較，^*表示p<0.05，^**表示p<0.01。

子宮中含有大量的雌激素受體(ers)，雌激素類(lèi)物質(zhì)通過(guò)與該受體結(jié)合，可誘導(dǎo)子宮靶蛋白(ips)含量增加，表現(xiàn)為子宮組織增生等，因此可以通過(guò)測(cè)定外源雌激素對(duì)性未成熟小鼠子宮促增長(zhǎng)作用來(lái)評(píng)價(jià)藥物的雌激素樣活性。本實(shí)驗(yàn)采用性未成熟雌性小鼠子宮濕重與體重之比(子宮系數(shù))作為評(píng)價(jià)雌激素樣活性的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腺苷可顯著增加性未成熟小鼠子宮系數(shù)，提示其在體內(nèi)具有雌激素樣作用。

mcf-7細(xì)胞是雌激素受體陽(yáng)性的人乳腺癌細(xì)胞株，能特異地受雌激素或雌激素樣活性物質(zhì)調(diào)節(jié)而增殖，是最常用的檢測(cè)雌激素樣活性的細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腺苷在濃度為5μm時(shí)對(duì)mcf-7細(xì)胞有顯著的促增殖作用。ici182,780是一類(lèi)新型的純雌激素受體拮抗劑，可以顯著地減弱或抑制由配體與雌激素受體結(jié)合所激發(fā)的、并受雌激素應(yīng)答元件(ere)調(diào)控的雌激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。當(dāng)腺苷與ici182,780共同作用時(shí)，其對(duì)mcf-7細(xì)胞的促增殖作用被顯著抑制。提示腺苷在體內(nèi)、體外均有一定的雌激素樣作用，且是通過(guò)雌激素受體途徑發(fā)揮作用的。

雌二醇是體內(nèi)主要由卵巢成熟濾泡分泌的一種天然雌激素，能促進(jìn)和調(diào)節(jié)女性性器官及副性征的正常發(fā)育。促黃體生成素由垂體產(chǎn)生的一種激素在女性中刺激卵巢分泌女性雌激素。卵泡刺激素是垂體前葉嗜堿性細(xì)胞分泌的一種激素，主要作用為促進(jìn)卵泡成熟，促進(jìn)整個(gè)卵巢長(zhǎng)大。實(shí)驗(yàn)表明，腺苷可以顯著性增加未成熟雌性小鼠的血清e(cuò)2以及fsh的水平，但對(duì)lh的影響不大。推測(cè)腺苷增加小鼠子宮系數(shù)發(fā)揮雌激素樣活性可能與其增加體內(nèi)e2以及fsh的水平有關(guān)。

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)腺苷在體內(nèi)、體外均有一定的雌激素樣作用，且是通過(guò)雌激素受體途徑發(fā)揮作用的，開(kāi)辟了腺苷的新用途，是藥物上的一大創(chuàng)新，具有良好的推廣和應(yīng)用價(jià)值。