本申請是申請日為2009年10月30日，申請?zhí)枮?00980153872.9，發(fā)明名稱為“神經(jīng)毒性甾醇糖苷”的發(fā)明專利的分案申請。

相關(guān)申請的交叉參照

本申請依據(jù)35u.s.c.§119(e)，要求2008年10月31日提交的美國臨時(shí)申請系列號(hào)61/110,389和2009年5月1日提交的美國臨時(shí)申請系列號(hào)61/174,707的優(yōu)先權(quán)，它們的公開通過引用結(jié)合于本文。

本發(fā)明涉及用于神經(jīng)變性疾病的動(dòng)物模型的組合物及其使用方法。更具體地說，本發(fā)明涉及神經(jīng)毒性甾醇糖苷(sterolglycosides)或神經(jīng)毒性糖酯或其組合在神經(jīng)變性疾病的動(dòng)物模型中的用途。調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性的色原烯醇也可與神經(jīng)毒性甾醇糖苷或神經(jīng)毒性糖酯或其組合聯(lián)合用于這些動(dòng)物模型。

背景和概述

典型地，僅在臨床發(fā)現(xiàn)行為缺陷之后，才診斷為神經(jīng)變性疾病、阿爾茨海默氏病(ad)、帕金森氏病(pd)、肌萎縮性側(cè)索硬化(als)和肌萎縮性側(cè)索硬化-帕金森癡呆復(fù)征(als-pdc)(arasaki和tamaki，1998；leenders等，1990；whitehouse等，1982)。在阿爾茨海默氏病中，失去來自大腦皮層和海馬的各個(gè)區(qū)域的神經(jīng)元，并表現(xiàn)為認(rèn)知功能的喪失(odle，2003)。帕金森氏病涉及黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的選擇部分的變性(schapira和olanow，2003)。最初，失去含多巴胺神經(jīng)元的末端突起。最后，來自黑質(zhì)(sn)的多巴胺能神經(jīng)元的細(xì)胞體喪失。這一結(jié)果導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)控制的紊亂并介導(dǎo)震顫、運(yùn)動(dòng)功能減退和僵硬(dauer和przedborski，2003)。終末期的肌萎縮性側(cè)索硬化的特征在于，控制運(yùn)動(dòng)功能的脊髓和皮層運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元尤其是隔的進(jìn)行性喪失(rowland和shneider，2001)，導(dǎo)致麻痹和死亡。

在上述各種疾病中，相對明確的神經(jīng)細(xì)胞群的退化并導(dǎo)致特定的行為后果。相信ad、pd和als是起因于獨(dú)特的病因?qū)W并導(dǎo)致互斥行為和神經(jīng)病理學(xué)后果的截然不同的疾病。該觀點(diǎn)基于不同的最初癥狀和病理學(xué)發(fā)現(xiàn)。然而，更加近期的工作已經(jīng)表明各神經(jīng)變性疾病之間的大量交叉重疊(參見calne和eisen，1989；muchowski和wacker，2005)。例如，pd和als患者都會(huì)表現(xiàn)出認(rèn)知功能下降，而這按慣例是ad特性(aarsland等，2003；vaphiades等，2002)。而且，ad患者可能經(jīng)受震顫，這是主要與pd有關(guān)的特征(yokoyama等，2002)。ad和pd之間的另一個(gè)交叉重疊現(xiàn)象是，某些pd患者經(jīng)歷的步態(tài)不穩(wěn)是發(fā)展ad-樣癡呆的前兆(verghese等，2002)。已經(jīng)表明，als和pd部分交叉重疊顯著，因此，伴有癡呆和/或帕金森氏病特征的als病例被稱為als-+(zoccolella等，2002)。

ad、pd和als死后組織評價(jià)也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些疾病狀態(tài)之間的許多相似性。具體說來，與蛋白折疊和聚合有關(guān)的分子機(jī)理方面的相似性已經(jīng)得到越來越多的關(guān)注(muchowski和wacker，2005)。盡管在特定神經(jīng)變性疾病中聚集的特異性蛋白往往不涉及基本氨基酸序列，但ad、pd和als的特征性損害典型地含有具有類似生物化學(xué)特征的纖維狀、淀粉樣結(jié)構(gòu)(dobson，2003)。然而，透過疾病分類，已經(jīng)觀察到具有普通基本氨基酸序列的蛋白質(zhì)內(nèi)含物的實(shí)例。例如，已經(jīng)在某些als(kokubo等，2000)和pd(arima等，1999)患者中鑒別出主要與ad有關(guān)的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(nft)。在同樣的情況下，也已經(jīng)在pd路易體和路易神經(jīng)突中鑒別出首先在ad患者的淀粉樣蛋白斑中鑒別出的α-突觸核蛋白(lucking和brice，2000)。

盡管與年老相關(guān)的疾病ad、pd和als有相似性，但相似性有限。相比之下，神經(jīng)病肌萎縮性側(cè)索硬化-帕金森癡呆復(fù)征(als-pdc)的特征在于各種老年病和其它許多神經(jīng)病所共有的廣泛范圍的行為和神經(jīng)病理學(xué)特性。als-pdc可表示為als的經(jīng)典形式或表示為有ad特征的帕金森氏病的形式。而且，已經(jīng)觀察到guam或rota的某些als-pdc患者呈現(xiàn)這些癥狀的組合(steele和guzman，1987)。因此，認(rèn)為了解als-pdc將導(dǎo)致更好地了解作為一個(gè)整體的神經(jīng)病。

為更好地在細(xì)胞水平和生物化學(xué)水平以及整個(gè)動(dòng)物水平上了解這些疾病狀態(tài)的潛在的神經(jīng)學(xué)機(jī)制，需要神經(jīng)變性疾病的動(dòng)物模型。理想地，動(dòng)物應(yīng)該顯示出近似于患有這些神經(jīng)變性疾病的人所表現(xiàn)癥狀的癥狀。本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這類動(dòng)物模型和采用神經(jīng)毒性甾醇糖苷或神經(jīng)毒性糖酯或其組合監(jiān)測動(dòng)物神經(jīng)變性疾病的方法。這些神經(jīng)毒性甾醇糖苷或神經(jīng)毒性糖酯或其組合也可與調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性的色原烯醇聯(lián)合使用。

可采用本文所述的組合物、方法和模型模擬的示例性神經(jīng)變性疾病的非限制性目錄包括肌萎縮性側(cè)索硬化、早發(fā)性帕金森氏病、遲發(fā)性帕金森氏病、阿爾茨海默氏病等。

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供本文所述的神經(jīng)變性疾病的動(dòng)物模型。該動(dòng)物模型包括使非人動(dòng)物接觸下式的神經(jīng)毒性化合物

其中

r¹為任選被取代的糖基；

r²是氫、烷基、鏈烯基、炔基、雜烷基、鹵代烷基或or⁴；

r³是氫、烷基、鏈烯基、雜烷基、鹵代烷基或or⁴；

r⁴在各種情況下獨(dú)立地選自氫、烷基、雜烷基、鹵代烷基、鏈烯基、炔基和?；?；

標(biāo)有a、a’、b、c、d、e、f和g的鍵各自獨(dú)立地選自單鍵和雙鍵，前提是對于標(biāo)有b、c和d的各鍵，相鄰的鍵不能兩者同時(shí)為雙??；和其中的神經(jīng)毒性化合物并非選自β-谷甾醇-β-d-葡糖苷和膽固醇葡糖苷的化合物。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供本文所述的神經(jīng)變性疾病動(dòng)物模型。該動(dòng)物模型包括使非人動(dòng)物接觸下式的神經(jīng)毒性化合物

其中r⁷和r⁸各自獨(dú)立地選自飽和脂肪酸酰基、單不飽和脂肪酸?；投嗖伙柡椭舅狨；?，它們各自任選被鹵素、甲基、烷基、羥基、酮基、甲氧基或烷氧基取代；和r⁹是糖基。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供本文所述的神經(jīng)變性疾病動(dòng)物模型。該動(dòng)物模型包括使非人動(dòng)物接觸下式的神經(jīng)毒性化合物

和下式的調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物

其中

r¹為任選被取代的糖基；

r²是氫、烷基、鏈烯基、炔基、雜烷基、鹵代烷基或or⁴；

r³是氫、烷基、鏈烯基、雜烷基、鹵代烷基或or⁴；

r⁴在各種情況下獨(dú)立地選自氫、烷基、雜烷基、鹵代烷基、鏈烯基、炔基和酰基；

標(biāo)有a、a’、b、c、d、e、f和g的鍵各自獨(dú)立地選自單鍵和雙鍵，前提是對于標(biāo)有b、c和d的各鍵，相鄰的鍵不能兩者同時(shí)為雙?。?/p>

r¹⁰和r¹¹各自獨(dú)立地選自烷基和鏈烯基，它們各自任選被取代；

x是選自鹵素、烷基和烷氧基的0-3個(gè)取代基；和其中的神經(jīng)毒性化合物并非選自β-谷甾醇-β-d-葡糖苷和膽固醇葡糖苷的化合物。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供神經(jīng)變性疾病的動(dòng)物模型。該動(dòng)物模型包括使非人動(dòng)物接觸下式的神經(jīng)毒性化合物

和

下式的調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物

其中r⁷和r⁸各自獨(dú)立地選自飽和脂肪酸?；?、單不飽和脂肪酸?；投嗖伙柡椭舅狨；?，它們各自任選被鹵素、甲基、烷基、羥基、酮基、甲氧基或烷氧基取代；r⁹是糖基；r¹⁰和r¹¹各自獨(dú)立地選自烷基和鏈烯基，它們各自任選被取代；和x是選自已描述的鹵素、烷基和烷氧基的0-3個(gè)取代基。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供非人動(dòng)物的神經(jīng)變性疾病的監(jiān)測方法。該方法包括給予非人動(dòng)物含有下式的神經(jīng)毒性化合物的組合物和監(jiān)測非人動(dòng)物的神經(jīng)變性疾病的步驟

其中

r¹為任選被取代的糖基；

r²是氫、烷基、鏈烯基、炔基、雜烷基、鹵代烷基或or⁴；

r³是氫、烷基、鏈烯基、雜烷基、鹵代烷基或or⁴；

r⁴在各種情況下獨(dú)立地選自氫、烷基、雜烷基、鹵代烷基、鏈烯基、炔基和?；?；

標(biāo)有a、a’、b、c、d、e、f和g的鍵各自獨(dú)立地選自單鍵和雙鍵，前提是對于標(biāo)有b、c和d的各鍵，相鄰的鍵不能兩者同時(shí)為雙??；和其中的化合物并非選自β-谷甾醇-β-d-葡糖苷和膽固醇葡糖苷的化合物。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供非人動(dòng)物的神經(jīng)變性疾病的監(jiān)測方法。該方法包括給予非人動(dòng)物含有下式的神經(jīng)毒性化合物的組合物和監(jiān)測非人動(dòng)物的神經(jīng)變性疾病的步驟

其中

r⁷和r⁸各自獨(dú)立地選自飽和脂肪酸酰基、單不飽和脂肪酸酰基和多不飽和脂肪酸?；?，它們各自任選被鹵素、甲基、烷基、羥基、酮基、甲氧基或烷氧基取代；r⁹是糖基。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供任一前述實(shí)施方案的方法，其中的組合物還包含調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物。調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物具有下式

其中

r¹⁰和r¹¹各自獨(dú)立地選自烷基和鏈烯基，它們各自任選被取代；和x是選自鹵素、烷基和烷氧基的0-3個(gè)取代基。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供用于神經(jīng)變性疾病模型中的神經(jīng)毒性組合物。該神經(jīng)毒性組合物含有下式化合物及其藥學(xué)上可接受的載體

其中

r¹為任選被取代的糖基；

r²是氫、烷基、鏈烯基、炔基、雜烷基、鹵代烷基或or⁴；

r³是氫、烷基、鏈烯基、雜烷基、鹵代烷基或or⁴；

r⁴在各種情況下獨(dú)立地選自氫、烷基、雜烷基、鹵代烷基、鏈烯基、炔基和酰基；

標(biāo)有a、a’、b、c、d、e、f和g的鍵各自獨(dú)立地選自單鍵和雙鍵，前提是對于標(biāo)有b、c和d的各鍵，相鄰的鍵不能兩者同時(shí)為雙??；和其中的化合物并非選自β-谷甾醇-β-d-葡糖苷和膽固醇葡糖苷的化合物。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供用于神經(jīng)變性疾病模型中的神經(jīng)毒性組合物。該神經(jīng)毒性組合物含有下式化合物及其藥學(xué)上可接受的載體

其中

r⁷和r⁸各自獨(dú)立地選自飽和脂肪酸?；尾伙柡椭舅狨；投嗖伙柡椭舅狨；鼈兏髯匀芜x被鹵素、甲基、烷基、羥基、酮基、甲氧基或烷氧基取代；r⁹是糖基。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供還包含調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物的任一前述實(shí)施方案的神經(jīng)毒性組合物。所述調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物具有下式

其中

r¹⁰和r¹¹各自獨(dú)立地選自烷基和鏈烯基，它們各自任選被取代；和x是選自鹵素、烷基和烷氧基的0-3個(gè)取代基。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供用于神經(jīng)變性疾病模型中的化合物。所述化合物具有下式

其中

r¹為任選被取代的糖基；

r²是氫、烷基、鏈烯基、炔基、雜烷基、鹵代烷基或or⁴；

r³是氫、烷基、鏈烯基、雜烷基、鹵代烷基或or⁴；

r⁴在各種情況下獨(dú)立地選自氫、烷基、雜烷基、鹵代烷基、鏈烯基、炔基和?；?/p>

標(biāo)有a、a’、b、c、d、e、f和g的鍵各自獨(dú)立地選自單鍵和雙鍵，前提是對于標(biāo)有b、c和d的各鍵，相鄰的鍵不能兩者同時(shí)為雙??；和其中的化合物并非選自β-谷甾醇-β-d-葡糖苷和膽固醇葡糖苷的化合物。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供檢查非人動(dòng)物神經(jīng)變性的方法。該方法包括給予動(dòng)物合成的神經(jīng)毒性甾醇糖苷的步驟，其中神經(jīng)毒性甾醇糖苷引起動(dòng)物的神經(jīng)變性，和其中動(dòng)物的神經(jīng)變性通過觀察動(dòng)物的行為異常檢查或就動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織的驗(yàn)尸檢查。舉例說明，甾醇糖苷可為任何上述甾醇糖苷神經(jīng)毒性化合物或其組合或與上述任何調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物聯(lián)合使用的這些化合物中的任何一種，所述化合物可被分離(例如，大于90％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％或99.7％純)。在上述所有實(shí)施方案中，可通過選自腿伸展試驗(yàn)(legextensiontest)、步幅長度試驗(yàn)(gaitlengthtest)、旋轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)(rotarodtest)、金屬絲懸掛試驗(yàn)(wirehangtest)、水迷宮試驗(yàn)、八臂迷宮試驗(yàn)(radialarmmazetest)、digigate系統(tǒng)試驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)軌跡自動(dòng)視頻跟蹤試驗(yàn)(ethovision)、焦慮試驗(yàn)、抑郁試驗(yàn)和嗅覺系統(tǒng)試驗(yàn)的行為試驗(yàn)鑒別神經(jīng)變性。一方面，行為異?？蔀檫\(yùn)動(dòng)功能異常或認(rèn)知功能異常。此外，舉例說明，死后檢查的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織可來自選自皮層、海馬、脊髓和黑質(zhì)的部位。舉例說明，甾醇糖苷可引起神經(jīng)元興奮性毒性(excitotoxicity)。

在又一個(gè)實(shí)施方案中，提供神經(jīng)毒性甾醇糖苷介導(dǎo)的神經(jīng)變性的動(dòng)物模型。該動(dòng)物模型包括患有通過給予足以使非人動(dòng)物引起神經(jīng)變性的量的神經(jīng)毒性甾醇糖苷所產(chǎn)生的神經(jīng)變性的非人動(dòng)物。舉例說明，甾醇糖苷可為任何一種上述神經(jīng)毒性化合物或其組合，或者甾醇糖苷可與上述任何調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物組合，該化合物可被分離(例如，大于90％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％或99.7％純)并可被合成。在該實(shí)施方案中，可通過選自腿伸展試驗(yàn)、步幅長度試驗(yàn)、旋轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)、金屬絲懸掛試驗(yàn)、水迷宮試驗(yàn)、八臂迷宮試驗(yàn)、digigate系統(tǒng)試驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)軌跡自動(dòng)視頻跟蹤試驗(yàn)、焦慮試驗(yàn)、抑郁試驗(yàn)和嗅覺系統(tǒng)試驗(yàn)的行為試驗(yàn)鑒別神經(jīng)變性。一方面，行為異?？蔀檫\(yùn)動(dòng)功能異常或認(rèn)知功能異常。此外，舉例說明，死后檢查的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織可為選自皮層、海馬、脊髓和黑質(zhì)的部位。舉例說明，甾醇糖苷可產(chǎn)生神經(jīng)元興奮性毒性。

在本文所述的任一實(shí)施方案中，可在給予動(dòng)物化合物前，水解甾醇糖苷中的糖苷鍵，例如，以確定該鍵的水解是否抑制甾醇糖苷的神經(jīng)毒性。在這些實(shí)施方案中，可在給予動(dòng)物甾醇糖苷之前，用降解神經(jīng)毒性甾醇糖苷的酶處理甾醇糖苷。在本申請中所述的任一實(shí)施方案中，甾醇糖苷可為非?；摹?/p>

在另一實(shí)施方案中，任一上述化合物的純度大于90％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％或99.7％純。這類純化合物為分離的化合物。在本文所述的任一實(shí)施方案中，所述化合物可為合成的。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供用于神經(jīng)變性疾病模型中的化合物。所述化合物具有下式

其中

r⁷和r⁸各自獨(dú)立地選自飽和脂肪酸?；?、單不飽和脂肪酸酰基和多不飽和脂肪酸?；?，它們各自任選被鹵素、甲基、烷基、羥基、酮基、甲氧基或烷氧基取代；r⁹是糖基。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，前段中所述的化合物的純度大于90％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％或99.7％純。這類純化合物為分離的化合物。在本文所述的任一實(shí)施方案中，所述化合物可為合成的。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物。調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物具有下式

其中

r¹⁰和r¹¹各自獨(dú)立地選自烷基和鏈烯基，它們各自任選被取代；x是選自鹵素、烷基和烷氧基的0-3個(gè)取代基。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，前段中所述的化合物的純度大于90％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％或99.7％純。這類純化合物為分離的化合物。在本文所述的任一實(shí)施方案中，該化合物可為合成的。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，描述用于神經(jīng)變性疾病的胎兒暴露模型中的神經(jīng)毒性組合物。所述神經(jīng)毒性組合物含有下式化合物及其藥學(xué)上可接受的載體

其中

r¹為任選被取代的糖基；

r²是氫、烷基、鏈烯基、炔基、雜烷基、鹵代烷基或or⁴；

r³是氫、烷基、鏈烯基、雜烷基、鹵代烷基或or⁴；

r⁴在各種情況下獨(dú)立地選自氫、烷基、雜烷基、鹵代烷基、鏈烯基、炔基和酰基；

標(biāo)有a、a’、b、c、d、e、f和g的鍵各自獨(dú)立地選自單鍵和雙鍵，前提是對于標(biāo)有b、c和d的各鍵，相鄰的鍵不能兩者同時(shí)為雙??；其中的非人動(dòng)物是胎兒動(dòng)物。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，描述用于神經(jīng)變性疾病模型中的神經(jīng)毒性組合物。所述神經(jīng)毒性組合物含有下式化合物及其藥學(xué)上可接受的載體

其中

r⁷和r⁸各自獨(dú)立地選自飽和脂肪酸酰基、單不飽和脂肪酸酰基和多不飽和脂肪酸?；鼈兏髯匀芜x被鹵素、甲基、烷基、羥基、酮基、甲氧基或烷氧基取代；r⁹是糖基。

附圖簡述

圖1.sg-喂養(yǎng)的動(dòng)物及其年齡匹配的對照動(dòng)物的體重。對照動(dòng)物和sg-喂養(yǎng)的動(dòng)物之間的體重值的比較顯示體重在各組之間并無顯著性差異并隨時(shí)間的過去穩(wěn)定地增加。

圖2.sg-喂養(yǎng)的動(dòng)物降低旋轉(zhuǎn)棒表現(xiàn)。在研究期間采用旋轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)以監(jiān)測動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性。sg-暴露的動(dòng)物在旋轉(zhuǎn)棒上表現(xiàn)出降低表現(xiàn)的趨勢，但數(shù)量未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性。

圖3.sg-喂養(yǎng)介導(dǎo)對腿伸展反射試驗(yàn)的表現(xiàn)下降。在研究期間用腿伸展反射試驗(yàn)監(jiān)測sg-暴露的動(dòng)物及其年齡匹配的對照動(dòng)物的后肢反射。在第一個(gè)動(dòng)物死亡(35周)后不久，在sg-喂養(yǎng)的動(dòng)物中表現(xiàn)的穩(wěn)定下降明顯。將發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)有意義的時(shí)間點(diǎn)標(biāo)上星號(hào)(t檢驗(yàn)：*p＜0.05)。相比之下，對照動(dòng)物在研究期間完全未表現(xiàn)出后肢反射的紊亂。

圖4.sg-喂養(yǎng)降低了前肢力量分析試驗(yàn)中的表現(xiàn)。在研究期間用金屬絲懸掛試驗(yàn)監(jiān)測sg-喂養(yǎng)的動(dòng)物及其年齡匹配的對照動(dòng)物肌肉力量。在第一只動(dòng)物死亡(35周)前表現(xiàn)下降明顯，到飼養(yǎng)后14周，表現(xiàn)的差異性具有統(tǒng)計(jì)顯著性(t檢驗(yàn)：*p＜0.05)并一直保持這樣，直到余下小鼠死亡時(shí)。

圖5.隨著sg-喂養(yǎng)對運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元計(jì)數(shù)。用焦油紫辨別尼氏小體的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。于35和52周對腰脊髓α-和γ-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)(a)。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元被細(xì)分為正常、健康外觀的那些(下標(biāo)“h”)、染色質(zhì)溶解的那些(下標(biāo)“c”)和固縮的那些(下標(biāo)“p”)。于35和52周時(shí)，觀察到對照組在腰脊髓的腹側(cè)角有許多健康的α-和γ-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。隨著運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的逐個(gè)計(jì)數(shù)，只發(fā)現(xiàn)在52周時(shí)對照動(dòng)物和sg-喂養(yǎng)組之間的“健康”α-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量之間的統(tǒng)計(jì)顯著性(t檢驗(yàn)：-55％，p＜0.05)(a)。當(dāng)在各組之間的α-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元總數(shù)之間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)各時(shí)間點(diǎn)上的顯著差異(t檢驗(yàn)，于35周時(shí)：-29％，*p＜0.05；t檢驗(yàn)，52周時(shí)：-47％，*p＜0.05；紅線表示歸為得到α-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元“總數(shù)”的亞類)。此外，發(fā)現(xiàn)sg-喂養(yǎng)組的α-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元總數(shù)量在35和52周之間經(jīng)歷了顯著的下降(t檢驗(yàn)：-36％，*p＜0.05；藍(lán)線表示圖表中亞組的總和)。

圖6.sg-喂養(yǎng)的小鼠脊髓中的膽堿能運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元?？鼓憠A乙?；D(zhuǎn)移酶(chat)免疫反應(yīng)性細(xì)胞被作為膽堿能細(xì)胞計(jì)數(shù)。于35和52周時(shí)，腰脊髓的腹側(cè)角中的量化抗-chat標(biāo)記顯示在對照組和sg-喂養(yǎng)組之間的顯著差異。于35和52周，sg-喂養(yǎng)的動(dòng)物分別有18％(t檢驗(yàn)：*p＜0.05)和32％(t檢驗(yàn)：*p＜0.05)更少的膽堿能神經(jīng)元(a)。此外，sg-喂養(yǎng)的動(dòng)物的膽堿能神經(jīng)元數(shù)量在35和52周之間經(jīng)歷了顯著的下降(t檢驗(yàn)：-31％，*p＜0.05)。

圖7.sg-喂養(yǎng)的小鼠腰脊髓中的活化星形膠質(zhì)細(xì)胞?？鼓z質(zhì)纖維酸性蛋白(gfap)免疫反應(yīng)性的、星形(壓緊并延長)細(xì)胞被作為星形膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。于35周和52周量化對照動(dòng)物和sg-喂養(yǎng)的小鼠的腰脊髓腹側(cè)角的抗-gfap標(biāo)記(a)。與癥狀前(t檢驗(yàn)：+337％，***p＜0.001)和癥狀時(shí)間點(diǎn)(t檢驗(yàn)：+119％，*p＜0.05)的對照動(dòng)物相比，sg-喂養(yǎng)的小鼠具有顯著更大量的星形膠質(zhì)細(xì)胞。此外，當(dāng)對照動(dòng)物隨著時(shí)間的過去經(jīng)歷星形膠質(zhì)細(xì)胞的顯著增加時(shí)(t檢驗(yàn)：+41％，*p＜0.05)，發(fā)現(xiàn)在整個(gè)相同的17周時(shí)期，sg-喂養(yǎng)的動(dòng)物經(jīng)歷gfap陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞的顯著下降(t檢驗(yàn)：-30％，*p＜0.05)。

圖8.sg-喂養(yǎng)的小鼠腰脊髓中的小膠質(zhì)細(xì)胞增殖。免疫反應(yīng)成離子鈣結(jié)合受體-1(iba-1)的細(xì)胞被作為小膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。(a)量化35周和52周的對照動(dòng)物和sg-喂養(yǎng)的小鼠腰脊髓的腹側(cè)角中的小膠質(zhì)細(xì)胞。與癥狀前(presymptomatic)(t檢驗(yàn)：+33％，**p＜0.01)和癥狀(t檢驗(yàn)：+59％，*p＜0.05)時(shí)間點(diǎn)(seudent’st檢驗(yàn)，*p＜0.05)的對照動(dòng)物相比，sg-喂養(yǎng)的小鼠具有顯著更多的小膠質(zhì)細(xì)胞。

圖9.sg-喂養(yǎng)的小鼠脊髓中的胱天蛋白酶-3標(biāo)記。于35和52周時(shí)，腰脊髓腹側(cè)角中的抗-胱天蛋白酶-3免疫反應(yīng)性細(xì)胞的量化顯示，sg-喂養(yǎng)介導(dǎo)的細(xì)胞在癥狀前和癥狀時(shí)間點(diǎn)經(jīng)歷了細(xì)胞凋亡。于35周時(shí)，觀察到sg-喂養(yǎng)動(dòng)物的顯著更大量的凋亡神經(jīng)元(t檢驗(yàn)，+78％，***p＜0.001)(a)。也觀察到于52周時(shí)sg-喂養(yǎng)的動(dòng)物的更大量的凋亡細(xì)胞，但數(shù)量并未達(dá)到顯著性(a)。

圖10.多巴胺能細(xì)胞標(biāo)記消失于sg-喂養(yǎng)的小鼠的紋狀體中。35周(t檢驗(yàn)：-34％，***p＜0.001)和52周(t檢驗(yàn)：-39％，*p＜0.05)時(shí)，與對照動(dòng)物的黑質(zhì)致密部(snpc)相比，sg-喂養(yǎng)的小鼠表現(xiàn)出顯著減少的酪氨酸羥化酶標(biāo)記(光密度)。發(fā)現(xiàn)sg-喂養(yǎng)的小鼠中的snpc的th光密度隨著時(shí)間的過去而下降(t檢驗(yàn)：-22％，*p＜0.05)(a)。于任一時(shí)間點(diǎn)(t檢驗(yàn)：不顯著p＝0.0846)，未發(fā)現(xiàn)sg-喂養(yǎng)的動(dòng)物的紋狀體中的光密度下降(f)。對sg-喂養(yǎng)的小鼠的運(yùn)動(dòng)和黑質(zhì)(niagral)紋狀體引起的毒性表明，除了其它神經(jīng)變性疾病之外，sg還可用于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病模型和帕金森氏病模型。

圖11.sg-喂養(yǎng)的動(dòng)物的細(xì)胞色素c氧化酶活性不受影響。分析sg-喂養(yǎng)的動(dòng)物和年齡匹配的對照動(dòng)物的細(xì)胞色素c氧化酶活性。于35或52周時(shí)，各組之間未觀察到顯著的差異性(a)。各組中，隨著時(shí)間的過去，觀察到細(xì)胞色素c氧化酶活性下降(a)。

圖12.腰脊髓和背和腹側(cè)脊神經(jīng)根中脂質(zhì)的油紅o染色。通過油紅o(紅色染色)顯示出各cns區(qū)域中的脂質(zhì)沉積。核用蘇木精(藍(lán)色/紫色染料)染色。觀察到對照動(dòng)物和sg-喂養(yǎng)的小鼠的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的脂質(zhì)沉積，但sg-喂養(yǎng)的動(dòng)物的腰脊髓和腹側(cè)神經(jīng)根中沉積的數(shù)量和尺寸更大。長方塊(panel)a表示于35和52周時(shí)對照動(dòng)物和sg-喂養(yǎng)的動(dòng)物的脂質(zhì)沉積的量化。腰索的腹側(cè)角的組間評價(jià)顯示，于35周時(shí)，sg-喂養(yǎng)的動(dòng)物腰脊髓的腹側(cè)角具有顯著更多的脂質(zhì)沉積(student’st檢驗(yàn)，+28％，*p＜0.05)。于35周時(shí)，與對照動(dòng)物相比，sg-喂養(yǎng)的動(dòng)物的腹側(cè)脊神經(jīng)根也具有顯著更多的脂質(zhì)(student’st檢驗(yàn)：+10％，*p＜0.05)。背神經(jīng)根的類似比較并未顯示出統(tǒng)計(jì)顯著性差別(student’st檢驗(yàn)：不顯著，p＝0.3778)。于52周時(shí)，在評價(jià)的三個(gè)cns區(qū)域中，未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)顯著性的各組間差異(腰脊髓：student’st檢驗(yàn)，p＝0.6406；背神經(jīng)根：student’st檢驗(yàn)，p＝0.6958；腹側(cè)神經(jīng)根：student’st檢驗(yàn)，p＝0.7422)。還進(jìn)行sg-喂養(yǎng)的動(dòng)物和年齡匹配的對照動(dòng)物的脂質(zhì)積聚的時(shí)間-依賴性效應(yīng)評價(jià)。對照動(dòng)物表現(xiàn)出隨時(shí)間的過去脂質(zhì)沉積總量的統(tǒng)計(jì)顯著性增加(student’st檢驗(yàn)：+29％，p＜0.05)。sg-喂養(yǎng)的動(dòng)物未經(jīng)歷隨時(shí)間的過去沉積的積聚(student’st檢驗(yàn)，p＝0.4864)。sg-喂養(yǎng)的動(dòng)物和對照動(dòng)物的背(student’st檢驗(yàn)s-對照動(dòng)物：p＝0.4864；sg-fed：p＝0.5478)或腹側(cè)神經(jīng)根(對照：p＝0.1301；sg-喂養(yǎng)：p＝0.5478)都未表現(xiàn)出時(shí)間-依賴性效應(yīng)。

圖13.選擇的sg-喂養(yǎng)的小鼠在腰脊髓的腹側(cè)角積聚磷酸化τ蛋白和含有這些磷酸化τ蛋白的子集的細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞凋亡。飲食sg-喂養(yǎng)介導(dǎo)磷酸化τ蛋白的積聚。于52周時(shí)，動(dòng)物的大多數(shù)含有磷酸化-τ蛋白的細(xì)胞活躍地經(jīng)歷細(xì)胞凋亡。(a)延長和圓形聚集體的數(shù)量分別被量化(a)。

圖14.tdp-43病理學(xué)發(fā)生于飼養(yǎng)sg的小鼠的亞組的腰脊髓。存活至52周的8只飼養(yǎng)sg的小鼠中有兩只顯示tardna結(jié)合蛋白(tdp)43病理學(xué)。在健康細(xì)胞中，在細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)tdp-43，在神經(jīng)學(xué)疾病，諸如偶發(fā)als中重新分配并積聚于細(xì)胞溶質(zhì)中。于35周時(shí)的對照動(dòng)物、sg-喂養(yǎng)的動(dòng)物和于52周時(shí)的大多數(shù)sg-喂養(yǎng)的動(dòng)物未觀察到tdp-43的異常易位。兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的對照動(dòng)物的額葉皮質(zhì)、海馬和運(yùn)動(dòng)皮層也是陰性的。長方塊a描述腰脊髓中含病理磷酸化tdp-43聚結(jié)體的量化。sg-喂養(yǎng)的動(dòng)物中的這些聚結(jié)體增加。

圖15.升高在襯墊區(qū)域之上，不會(huì)落下、牢牢地抓住或從軸上跳下的旋轉(zhuǎn)裝置被用來測量小鼠在水平轉(zhuǎn)動(dòng)軸上可保持行走的時(shí)間(3.6cm直徑；16rpm)。

圖16-18.暴露于sg和bssg的動(dòng)物在妊娠期間及其年齡相近的對照動(dòng)物的體重。喂養(yǎng)給妊娠小鼠各基本含有0.4mgsg和0.6mgbssg的食物丸子，在分娩后的不同時(shí)間間隔對其幼鼠稱重。在sg和bssg-喂養(yǎng)的幼鼠(“處理過的動(dòng)物”)和對照組在以及在處理過的雄性動(dòng)物和處理過的雌性動(dòng)物之間觀察到體重差別。分娩后從第1天開始至第22天期間，處理過的動(dòng)物比對照動(dòng)物保持顯著更高的體重(student’st檢驗(yàn)：***p＜0.0005)(圖16)，在斷奶后的第5周開始至17周期間經(jīng)處理的雄性動(dòng)物比雄性對照動(dòng)物保持顯著更高的體重(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.0005)(圖17)。在分娩后的第1天開始至第22天期間，與體重增加64.8％的對照動(dòng)物相比，處理過的動(dòng)物體重增加79.6％(student’st檢驗(yàn)：***p＜0.0005)(圖16)。此外，在斷奶后的第5周開始至17周期間，與體重增加109.8％的雄性對照動(dòng)物相比，經(jīng)處理的雄性動(dòng)物體重增加139.4％(t檢驗(yàn)：*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.0005)(圖17)。相比之下，在斷奶后的第5周開始至17周期間，經(jīng)處理的雌性動(dòng)物體重增加101.8％(與體重增加83％的雌性對照動(dòng)物相比)(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05，**p＜0.005)(圖18)。分娩后17周后，將處理過的動(dòng)物和對照動(dòng)物分入單獨(dú)的籠中(當(dāng)動(dòng)物被分入單獨(dú)的籠中時(shí)，“s”表示年齡(以周齡表示))：分離后，在經(jīng)處理的雌性動(dòng)物、雌性對照動(dòng)物(圖18)和雄性對照動(dòng)物中觀察到體重減輕，但在經(jīng)處理的雄性動(dòng)物中未觀察到(圖17)。

圖19-26.與年齡相近雄性對照動(dòng)物相比，妊娠期間暴露于sg和bssg的雄性動(dòng)物在步態(tài)分析試驗(yàn)中顯示出減弱的表現(xiàn)。用各實(shí)際含有0.4mgsg和0.6mgbssg的食物丸子飼養(yǎng)妊娠小鼠。在分娩后8周至18周期間的各種時(shí)間間隔試驗(yàn)其雄性幼鼠的左和右前爪和后爪制動(dòng)次數(shù)和左和右前爪和后爪站姿持續(xù)時(shí)間。如與雄性對照動(dòng)物相比的那樣，經(jīng)處理的雄性動(dòng)物的左后爪(圖19)和右后爪(圖20)表現(xiàn)出增加的制動(dòng)次數(shù)和左前爪(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05)(圖21)和右前爪(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05)(圖22)表現(xiàn)出顯著增加的制動(dòng)次數(shù)。此外，與雄性對照動(dòng)物相比，經(jīng)處理的雄性動(dòng)物表現(xiàn)出右前爪(圖24)增加的站姿持續(xù)時(shí)間和左前爪(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05)(圖23)、左后爪(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05，**p＜0.005)(圖25)和右后爪(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05，**p＜0.005)(圖26)顯著增加的站姿持續(xù)時(shí)間。

圖27-41.與年齡相近對照動(dòng)物相比，妊娠期間暴露于sg和bssg的動(dòng)物在曠場試驗(yàn)中顯示減弱的表現(xiàn)。用各基本含有0.4mgsg和0.6mgbssg的食物丸子喂養(yǎng)妊娠小鼠。在分娩后8周開始至18周期間試驗(yàn)它們的幼鼠在各個(gè)年齡的探索性活力。用5分鐘間隔進(jìn)行試驗(yàn)：將動(dòng)物置于試驗(yàn)場地中央，測定幾個(gè)探索性活力參數(shù)。與對照動(dòng)物相比，處理過的動(dòng)物總活動(dòng)持續(xù)時(shí)間[(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05，**p＜0.05(圖27)；和(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05)(圖28)]；越過柵欄進(jìn)入場地中央的次數(shù)[(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.0005)(圖29)；和(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05，**p＜0.005)(圖30)]；離場地邊緣的平均距離(表示處理過的小鼠顯示更喜歡場地的邊緣而不是中央)[(student’st檢驗(yàn)：***p＜0.0005)(圖31)；和(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05)(圖32)]；和在場地中央耗費(fèi)的持續(xù)時(shí)間[(student’st檢驗(yàn)：**p＜0.005)(圖33)和(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05)(圖34)]表現(xiàn)出顯著的減少。與對照動(dòng)物相比，處理過的動(dòng)物的平均轉(zhuǎn)動(dòng)角度[(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.0005)(圖35)；和(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05，*p＜0.005)(圖36)]；和首次躍入場地中央的持續(xù)時(shí)間[(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05)(圖37)和(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05)(圖38)]也表現(xiàn)出顯著的增加。此外，如與雄性對照動(dòng)物相比的那樣，證實(shí)經(jīng)處理的雄性動(dòng)物的速度顯著下降(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05)(圖39)；和角速度(t檢驗(yàn)：*p＜0.05，**p＜0.005)(圖40)和迂回程度(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05，**p＜0.005)(圖41)顯著增加。

示例性實(shí)施方案的詳述

本文所引用的各出版物都通過全文引用結(jié)合于本文中。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述一種神經(jīng)變性疾病的動(dòng)物模型，其包括使非人動(dòng)物接觸下式的神經(jīng)毒性化合物

其中r¹為任選被取代的糖基；

r²是氫、烷基、鏈烯基、炔基、雜烷基、鹵代烷基或or⁴；

r³是氫、烷基、鏈烯基、雜烷基、鹵代烷基或or⁴；

r⁴在各種情況下獨(dú)立地選自氫、烷基、雜烷基、鹵代烷基、鏈烯基、炔基和?；?；

標(biāo)有a、a’、b、c、d、e、f和g的鍵各自獨(dú)立地選自單鍵和雙鍵，前提是對于標(biāo)有b、c和d的各鍵，相鄰的鍵不能兩者同時(shí)為雙?。缓推渲械纳窠?jīng)毒性化合物并非選自β-谷甾醇-β-d-葡糖苷和膽固醇葡糖苷的化合物。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述一種神經(jīng)變性疾病的動(dòng)物模型，其包括使非人動(dòng)物接觸下式的神經(jīng)毒性化合物

和下式的調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物

其中

r¹為任選被取代的糖基；

r²是氫、烷基、鏈烯基、炔基、雜烷基、鹵代烷基或or⁴；

r³是氫、烷基、鏈烯基、雜烷基、鹵代烷基或or⁴；

r⁴在各種情況下獨(dú)立地選自氫、烷基、雜烷基、鹵代烷基、鏈烯基、炔基和?；?；

標(biāo)有a、a’、b、c、d、e、f和g的鍵各自獨(dú)立地選自單鍵和雙鍵，前提是對于標(biāo)有b、c和d的各鍵，相鄰的鍵不能兩者同時(shí)為雙??；

r¹⁰和r¹¹各自獨(dú)立地選自烷基和鏈烯基，它們各自任選被取代；

x是選自鹵素、烷基和烷氧基的0-3個(gè)取代基；和其中的神經(jīng)毒性化合物并非選自β-谷甾醇-β-d-葡糖苷和膽固醇葡糖苷的化合物。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述一種神經(jīng)變性疾病的動(dòng)物模型，其包括使非人動(dòng)物接觸下式的神經(jīng)毒性化合物

其中r⁷和r⁸各自獨(dú)立地選自飽和脂肪酸?；尾伙柡椭舅狨；投嗖伙柡椭舅狨；?，它們各自任選被鹵素、甲基、烷基、羥基、酮基、甲氧基或烷氧基取代；和r⁹是糖基。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述一種神經(jīng)變性疾病的動(dòng)物模型，其包括使非人動(dòng)物接觸下式的神經(jīng)毒性化合物

和

下式的調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物

其中r⁷和r⁸各自獨(dú)立地選自飽和脂肪酸?；尾伙柡椭舅狨；投嗖伙柡椭舅狨；鼈兏髯匀芜x被鹵素、甲基、烷基、羥基、酮基、甲氧基或烷氧基取代；r⁹是糖基；

r¹⁰和r¹¹各自獨(dú)立地選自烷基和鏈烯基，它們各自任選被取代；和

x是選自鹵素、烷基和烷氧基的0-3個(gè)取代基。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，描述任一前述實(shí)施方案的神經(jīng)變性疾病的動(dòng)物模型，其中的神經(jīng)毒性化合物具有下式

在另一個(gè)實(shí)施方案中，描述任一前述實(shí)施方案的模型，其中的神經(jīng)毒性化合物具有下式

在另一個(gè)實(shí)施方案中，描述任一前述實(shí)施方案的模型，其中的神經(jīng)毒性化合物具有下式

在另一個(gè)實(shí)施方案中，描述任一前述實(shí)施方案的模型，其中的神經(jīng)毒性化合物具有下式

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的模型，其中r¹選自己糖基和戊糖基，它們各自任選被取代。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的模型，其中r¹選自己糖基和戊糖基，它們各自任選被取代；r²為甲基或乙基；和r³是氫。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的模型，其中r¹選自己糖基和戊糖基，它們各自任選被取代；r²為甲基或乙基；r³是氫；和標(biāo)有b的鍵是雙鍵。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的模型，其中標(biāo)有g(shù)的鍵是雙鍵。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的模型，其中r¹具有下式

其中r⁵在各種情況下獨(dú)立地選自氫、甲基和c(o)r⁶，其中r⁶為烷基、鹵代烷基或雜烷基。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的模型，其中r¹是β-d-葡糖基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的模型，其中的神經(jīng)毒性化合物選自菜油甾醇葡糖苷、二氫菜子甾醇葡糖苷、麥角甾醇葡糖苷和燕麥甾醇(avenasterol)葡糖苷。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的模型，其中的神經(jīng)毒性化合物是菜油甾醇葡糖苷、二氫菜子甾醇葡糖苷、豆甾醇葡糖苷、麥角甾醇葡糖苷、燕麥甾醇葡糖苷或谷甾醇糖苷中的兩種或更多種的混合物。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的模型，其中的神經(jīng)毒性化合物是豆甾醇葡糖苷。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的模型，其中的神經(jīng)毒性化合物是菜油甾醇葡糖苷。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的模型，其中的神經(jīng)毒性化合物是二氫菜子甾醇葡糖苷。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述一個(gè)模型，其中的動(dòng)物接觸與調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物組合的任一種本文所述的神經(jīng)毒性化合物。根據(jù)本發(fā)明，關(guān)于動(dòng)物的短語“與......接觸”和術(shù)語“接觸”和“接觸的”意指給予動(dòng)物一種本文所述的化合物。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的模型，其中r⁹為單糖、二糖或三糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的模型，其中r⁹為單糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的模型，其中r⁹為二糖。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的模型，其中r⁷或r⁸之一為任選被取代的單不飽和脂肪酸酰基和r⁷或r⁸中的另一個(gè)為任選被取代的多不飽和脂肪酸?；?。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的模型，其中的調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物是生育酚或生育三烯酚。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的模型，其中調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物是β-生育酚。

在示例性實(shí)施方案中，用于神經(jīng)變性疾病動(dòng)物模型的非人動(dòng)物可為任何適用的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物。例如，非人動(dòng)物可為嚙齒動(dòng)物，諸如小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、沙鼠等。在其它實(shí)施方案中，非人動(dòng)物可為靈長目動(dòng)物，例如，猴、黑猩猩、獼猴、松鼠猴、猿或用于神經(jīng)變性疾病動(dòng)物模型的其它任何靈長目動(dòng)物。在示例性其它實(shí)施方案中，非人動(dòng)物可為兔、狗、貓或任何其它適用的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，非人動(dòng)物可為哺乳動(dòng)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，動(dòng)物可為豬。

在任何一個(gè)前述實(shí)施方案中，神經(jīng)變性疾病可選自各種疾病狀態(tài)。神經(jīng)變性疾病可選自進(jìn)行性核上性麻痹、阿爾茨海默氏病、額顳葉癡呆(例如，皮克病、額顳葉變性、進(jìn)行性失語和語義性癡呆)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病(例如，肌萎縮性側(cè)索硬化、原發(fā)性側(cè)索硬化、進(jìn)行性延髓性麻痹、假延髓性麻痹、進(jìn)行性肌萎縮癥和脊髓性肌萎縮癥)、神經(jīng)病、周圍神經(jīng)病、早發(fā)性帕金森氏病和遲發(fā)性帕金森氏病。在本文所述的模型的另一實(shí)施方案中，神經(jīng)變性疾病可選自肌萎縮性側(cè)索硬化、早發(fā)性帕金森氏病、遲發(fā)性帕金森氏病和阿爾茨海默氏病。在又一個(gè)實(shí)施方案中，神經(jīng)變性疾病為阿爾茨海默氏病或帕金森氏病。作為選擇，在任何一個(gè)前述實(shí)施方案中，神經(jīng)變性疾病可為肌萎縮性側(cè)索硬化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，神經(jīng)變性一般是有意的。

在另一示例性實(shí)施方案中，提供非人動(dòng)物神經(jīng)變性疾病的監(jiān)測方法。該方法包括給予非人動(dòng)物含有下式的神經(jīng)毒性化合物的組合物

其中r¹為任選被取代的糖基；

r²是氫、烷基、鏈烯基、炔基、雜烷基、鹵代烷基或or⁴；

r³是氫、烷基、鏈烯基、雜烷基、鹵代烷基或or⁴；

r⁴在各種情況下獨(dú)立地選自氫、烷基、雜烷基、鹵代烷基、鏈烯基、炔基和?；?；

標(biāo)有a、a’、b、c、d、e、f和g的鍵各自獨(dú)立地選自單鍵和雙鍵，前提是對于標(biāo)有b、c和d的各鍵，相鄰的鍵不能兩者同時(shí)為雙??；和其中的化合物并非選自β-谷甾醇-β-d-葡糖苷和膽固醇葡糖苷的化合物；和監(jiān)測非人動(dòng)物的神經(jīng)變性疾病的步驟。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供非人動(dòng)物神經(jīng)變性疾病的監(jiān)測方法。該方法包括給予非人動(dòng)物含有下式的神經(jīng)毒性化合物的組合物

其中

r⁷和r⁸各自獨(dú)立地選自飽和脂肪酸?；?、單不飽和脂肪酸?；投嗖伙柡椭舅狨；?，它們各自任選被鹵素、甲基、烷基、羥基、酮基、甲氧基或烷氧基取代；r⁹是糖基；和監(jiān)測非人動(dòng)物的神經(jīng)變性疾病的步驟。

在任何一個(gè)前述實(shí)施方案中，神經(jīng)毒性組合物可進(jìn)一步含有下式的調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物

其中r¹⁰和r¹¹各自獨(dú)立地選自烷基和鏈烯基，它們各自任選被取代；和x是選自鹵素、烷基和烷氧基的0-3個(gè)取代基。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的方法，其中r¹選自己糖基和戊糖基，它們各自任選被取代。

在又一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的方法，其中r¹選自己糖基和戊糖基，它們各自任選被取代；r²為甲基或乙基；和r³是氫。

在又一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的方法，其中r¹選自己糖基和戊糖基，它們各自任選被取代；r²為甲基或乙基；r³是氫；和標(biāo)有b的鍵是雙鍵。

在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的方法，其中標(biāo)有g(shù)的鍵是雙鍵。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的方法，其中r¹具有下式

其中r⁵在各種情況下獨(dú)立地選自氫、甲基和c(o)r⁶，其中r⁶為烷基、鹵代烷基或雜烷基。

在又一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的方法，其中r¹是β-d-葡糖基。在供選擇的實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的方法，其中的神經(jīng)毒性化合物選自菜油甾醇葡糖苷、二氫菜子甾醇葡糖苷、麥角甾醇葡糖苷和燕麥甾醇葡糖苷。進(jìn)一步舉例說明，在任一前述實(shí)施方案的方法中，所述神經(jīng)毒性化合物可為菜油甾醇葡糖苷、二氫菜子甾醇葡糖苷、豆甾醇葡糖苷、麥角甾醇葡糖苷、燕麥甾醇葡糖苷或谷甾醇糖苷中的兩種或多種的混合物。在另一實(shí)施方案中，神經(jīng)毒性化合物可選自豆甾醇葡糖苷、菜油甾醇葡糖苷、二氫菜子甾醇葡糖苷、麥角甾醇葡糖苷和燕麥甾醇葡糖苷。

在另一個(gè)示例性方法實(shí)施方案中，神經(jīng)毒性化合物可為豆甾醇葡糖苷。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的方法，其中的神經(jīng)毒性化合物是菜油甾醇葡糖苷。在另一個(gè)方法實(shí)施方案中，神經(jīng)毒性化合物可為二氫菜子甾醇葡糖苷。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的方法，其中r⁹為單糖、二糖或三糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的方法，其中r⁹為單糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的方法，其中r⁹為二糖。

在任一個(gè)前述方法實(shí)施方案中，r⁷或r⁸之一可說明性地為任選被取代的單不飽和脂肪酸?；?，以及r⁷或r⁸的另一個(gè)為任選被取代的多不飽和脂肪酸?；?。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的方法，其中的調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物是生育酚或生育三烯酚。在又一個(gè)方法實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物可為β-生育酚。

在示例性實(shí)施方案中，用于監(jiān)測神經(jīng)變性疾病的方法的非人動(dòng)物可為任何合適的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物。例如，非人動(dòng)物可為嚙齒動(dòng)物，諸如小鼠(例如cd-1小鼠，charlesriver)、大鼠(例如，sprague-dawley大鼠，charlesriver)、倉鼠、豚鼠、沙鼠等。在其它實(shí)施方案中，非人動(dòng)物可為靈長目動(dòng)物，例如，猴、黑猩猩、獼猴、松鼠猴、猿或用于監(jiān)測神經(jīng)變性疾病方法的其它任何靈長目動(dòng)物。在其它示例性實(shí)施方案中，非人動(dòng)物可為兔、狗、貓或其它任何合適的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，非人動(dòng)物可為哺乳動(dòng)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物可為豬。

在任一前述方法實(shí)施方案中，神經(jīng)變性疾病可選自各種疾病狀態(tài)。本文所述方法中的神經(jīng)變性疾病可選自進(jìn)行性核上性麻痹、阿爾茨海默氏病、額顳葉癡呆(例如，皮克病、額顳葉變性、進(jìn)行性失語和語義性癡呆)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病(例如，肌萎縮性側(cè)索硬化、原發(fā)性側(cè)索硬化、進(jìn)行性延髓性麻痹、假延髓性麻痹、進(jìn)行性肌萎縮癥和脊髓性肌萎縮癥)、神經(jīng)病、周圍神經(jīng)病、早發(fā)性帕金森氏病和遲發(fā)性帕金森氏病。在另一本文所述的方法實(shí)施方案中，神經(jīng)變性疾病可選自肌萎縮性側(cè)索硬化、早發(fā)性帕金森氏病、遲發(fā)性帕金森氏病和阿爾茨海默氏病。在又一個(gè)實(shí)施方案中，神經(jīng)變性疾病為阿爾茨海默氏病或帕金森氏病。作為選擇，在任一個(gè)前述方法實(shí)施方案中，神經(jīng)變性疾病可為肌萎縮性側(cè)索硬化。在另一個(gè)實(shí)施方案中，神經(jīng)變性通常是有意的。

在任一前述實(shí)施方案中，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，使非人動(dòng)物接觸神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物，或者可給予非人動(dòng)物神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物。例如，在任何一個(gè)前述實(shí)施方案中，可通過將神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物或含有神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物的組合物加入飲食中，改變非人動(dòng)物的日常飲食并喂給非人動(dòng)物該飲食，給予非人動(dòng)物含有神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物的組合物，或者可使非人動(dòng)物接觸神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物。除神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物或含有神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物的組合物之外，可用其它添加劑進(jìn)一步改善非人動(dòng)物的任何標(biāo)準(zhǔn)飲食。示例性非限制性添加劑的目錄有維生素、礦物質(zhì)(例如，鈣和磷)、氨基酸、乳化劑、矯味劑、掩味劑、芳香劑、抗生素、抗-驅(qū)蟲劑、抗-反胃劑、蛋白質(zhì)、脂肪、纖維和它們的組合物。

實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)飲食為本領(lǐng)域熟知的，舉例說明，可采用任何標(biāo)準(zhǔn)丸狀、基于谷物的飲食(例如，rodentdiet20、picolab；tekladrodentdiet#8064，harlanteklad，madison，wis.；mousediet^tm，purina，st.louismo；prolabrat，mouse，hamster3000，st.louismo.)。通常允許動(dòng)物自由飲水。

在其它實(shí)施方案中，可通過用任何可接受的載體諸如液體醇、二醇(例如，聚乙二醇)、葡萄糖溶液(例如，5％)、酯、酰胺、無菌水或緩沖鹽水(包括緩沖溶液如磷酸鹽或醋酸鹽；例如，等滲鹽水)強(qiáng)飼喂養(yǎng)或胃腸外注射，使非人動(dòng)物接觸神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物，或者給予神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物。例如，可給予神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物，或者可使動(dòng)物接觸呈丸劑、糊劑或片劑的這些化合物。根據(jù)神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物的劑型，可與神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物一起包含于組合物中的其它示例性組分有植物油、明膠、乳糖、直鏈淀粉、硬脂酸鎂、增溶劑、局部麻醉劑(例如，利多卡因)、賦形劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、鹽和潤滑劑。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，可經(jīng)胃腸外給予含有神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物的組合物，舉例說明，這樣的注射可為腹膜內(nèi)注射、皮下注射、肌內(nèi)注射或靜脈注射。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可采用慢泵遞送或給予含有神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物的組合物。胃腸外劑型的實(shí)例包括活性成分在熟知的藥學(xué)上可接受的液體載體諸如液體醇、二醇(例如，聚乙二醇)、葡萄糖溶液(例如，5％)、酯、酰胺、無菌水或緩沖鹽水(包括緩沖液如磷酸鹽或醋酸鹽；例如，等滲鹽水)中的含水溶液。在另一示例性方面，胃腸外劑型可呈含有神經(jīng)毒性化合物劑量的可重新構(gòu)成的凍干劑(lyophilizate)形式。在各個(gè)方面，可采用增溶劑、局部麻醉劑(例如，利多卡因)、賦形劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、鹽和潤滑劑。

在各實(shí)施方案中，任一前述實(shí)施方案的神經(jīng)毒性化合物劑量可在約0.1mg/kg動(dòng)物體重每日至約500mg/kg動(dòng)物體重每日范圍內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物的劑量可在約1.0mg/kg動(dòng)物體重每日至約400mg/kg動(dòng)物體重每日范圍內(nèi)。在其它實(shí)施方案中，神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物的劑量可在約10mg/kg動(dòng)物體重每日至約300mg/kg動(dòng)物體重每目、約10mg/kg動(dòng)物體重每日至約200mg/kg動(dòng)物體重每日、約10mg/kg動(dòng)物體重每日至約100mg/kg動(dòng)物體重每日或約10mg/kg動(dòng)物體重每日至約50mg/kg動(dòng)物體重每日范圍內(nèi)。

在任一前述實(shí)施方案中，可作為單一劑量或可分開的多劑量給予和作為每日多劑量方案給予含有神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物的組合物。此外，交錯(cuò)方案，例如，每周1-6天、每周一次或每月1-3次可用作每日給藥的供選擇的方案。而且，每日給藥是適當(dāng)?shù)摹?/p>

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述動(dòng)物模型或本文所述的任一實(shí)施方案的方法，其中用選自腿伸展試驗(yàn)、步幅長度試驗(yàn)、旋轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)、金屬絲懸掛試驗(yàn)、水迷宮試驗(yàn)、八臂迷宮試驗(yàn)、digigate系統(tǒng)試驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)軌跡自動(dòng)視頻跟蹤試驗(yàn)、焦慮試驗(yàn)、抑郁試驗(yàn)和嗅覺系統(tǒng)試驗(yàn)的任何一種或多種行為異常試驗(yàn)監(jiān)測或研究或檢查神經(jīng)變性疾病。進(jìn)行這些試驗(yàn)監(jiān)測和研究神經(jīng)變性和神經(jīng)變性疾病的程序描述于本文的實(shí)施例中，并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。

一方面，行為異?？蔀檫\(yùn)動(dòng)功能異?；蛘J(rèn)知功能異常。此外，舉例說明，可通過死后檢驗(yàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織，監(jiān)測或檢驗(yàn)神經(jīng)變性，該組織可來自選自皮層、海馬、脊髓和黑質(zhì)的部位。死后檢驗(yàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織的方法為本領(lǐng)域熟知并詳述于本申請的實(shí)施例章節(jié)中。

確定和測量體內(nèi)和體外神經(jīng)毒性對非人動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞和組織的影響和研究暴露于本文所述的神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物和組合物的非人動(dòng)物的行為的方法也詳述于wo2002/37122中，其公開通過全文引用結(jié)合于本文。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述用于神經(jīng)變性疾病模型中的含有下式化合物及其藥學(xué)上可接受的載體的神經(jīng)毒性組合物

其中

r¹為任選被取代的糖基；

r²是氫、烷基、鏈烯基、炔基、雜烷基、鹵代烷基或or⁴；

r³是氫、烷基、鏈烯基、雜烷基、鹵代烷基或or⁴；

r⁴在各種情況下獨(dú)立地選自氫、烷基、雜烷基、鹵代烷基、鏈烯基、炔基和?；?；

標(biāo)有a、a’、b、c、d、e、f和g的鍵各自獨(dú)立地選自單鍵和雙鍵，前提是對于標(biāo)有b、c和d的各鍵，相鄰的鍵不能兩者同時(shí)為雙??；和其中的化合物并非選自β-谷甾醇-β-d-葡糖苷和膽固醇葡糖苷的化合物。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述用于神經(jīng)變性疾病模型中的含有下式化合物及其藥學(xué)上可接受的載體的神經(jīng)毒性組合物

其中

r⁷和r⁸各自獨(dú)立地選自飽和脂肪酸?；尾伙柡椭舅狨；投嗖伙柡椭舅狨；?，它們各自任選被鹵素、甲基、烷基、羥基、酮基、甲氧基或烷氧基取代；r⁹是糖基。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述的是任一前述權(quán)利要求的神經(jīng)毒性組合物，其進(jìn)一步含有下式的調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物

其中

r¹⁰和r¹¹各自獨(dú)立地選自烷基和鏈烯基，它們各自任選被取代；和x是選自鹵素、烷基和烷氧基的0-3個(gè)取代基。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的神經(jīng)毒性組合物，其中r¹選自己糖基和戊糖基，它們各自任選被取代。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的神經(jīng)毒性組合物，其中r¹選自己糖基和戊糖基，它們各自任選被取代；r²為甲基或乙基；和r³是氫。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的神經(jīng)毒性組合物，其中r¹選自己糖基和戊糖基，它們各自任選被取代；r²為甲基或乙基；r³是氫；和標(biāo)有b的鍵是雙鍵。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的神經(jīng)毒性組合物，其中標(biāo)有g(shù)的鍵是雙鍵。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的神經(jīng)毒性組合物，其中r¹具有下式

其中r⁵在各種情況下獨(dú)立地選自氫、甲基和c(o)r⁶，其中r⁶為烷基、鹵代烷基或雜烷基。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的神經(jīng)毒性組合物，其中r¹是β-d-葡糖基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的神經(jīng)毒性組合物，其中的神經(jīng)毒性化合物選自菜油甾醇葡糖苷、二氫菜子甾醇葡糖苷、麥角甾醇葡糖苷和燕麥甾醇葡糖苷。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的神經(jīng)毒性組合物，其中的神經(jīng)毒性化合物是菜油甾醇葡糖苷、二氫菜子甾醇葡糖苷、豆甾醇葡糖苷、麥角甾醇葡糖苷、燕麥甾醇葡糖苷或谷甾醇糖苷中的兩種或多種的混合物。在另一實(shí)施方案中，神經(jīng)毒性化合物可選自豆甾醇葡糖苷、菜油甾醇葡糖苷、二氫菜子甾醇葡糖苷、麥角甾醇葡糖苷和燕麥甾醇葡糖苷。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的神經(jīng)毒性組合物，其中的神經(jīng)毒性化合物是豆甾醇葡糖苷。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的神經(jīng)毒性組合物，其中的神經(jīng)毒性化合物是菜油甾醇葡糖苷。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的神經(jīng)毒性組合物，其中的神經(jīng)毒性化合物是二氫菜子甾醇葡糖苷。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的神經(jīng)毒性組合物，其中r⁹為單糖、二糖或三糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的神經(jīng)毒性組合物，其中r⁹為單糖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的神經(jīng)毒性組合物，其中r⁹為二糖。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的神經(jīng)毒性組合物，其中r⁷或r⁸之一為任選被取代的單不飽和脂肪酸?；约皉⁷或r⁸中的另一個(gè)為任選被取代的多不飽和脂肪酸?；?。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的神經(jīng)毒性組合物，其中調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物是生育酚或生育三烯酚。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述任一前述實(shí)施方案的神經(jīng)毒性組合物，其中調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物是β-生育酚。

在任一前述組合物實(shí)施方案中，神經(jīng)變性疾病可選自多種疾病狀態(tài)。神經(jīng)變性疾病可選自進(jìn)行性核上性麻痹、阿爾茨海默氏病、額顳葉癡呆(例如，皮克病、額顳葉變性、進(jìn)行性失語和語義性癡呆)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病(例如，肌萎縮性側(cè)索硬化、原發(fā)性側(cè)索硬化、進(jìn)行性延髓性麻痹、假延髓性麻痹、進(jìn)行性肌萎縮癥和脊髓性肌萎縮癥)、神經(jīng)病、周圍神經(jīng)病、早發(fā)性帕金森氏病和遲發(fā)性帕金森氏病。在本文所述的組合物的另一實(shí)施方案中，神經(jīng)變性疾病可選自肌萎縮性側(cè)索硬化、早發(fā)性帕金森氏病、遲發(fā)性帕金森氏病和阿爾茨海默氏病。在又一個(gè)實(shí)施方案中，神經(jīng)變性疾病是阿爾茨海默氏病或帕金森氏病。作為選擇，在任一前述組合物實(shí)施方案中，神經(jīng)變性疾病可為肌萎縮性側(cè)索硬化。

在其它實(shí)施方案中，對于強(qiáng)飼喂養(yǎng)或胃腸外注射，神經(jīng)毒性組合物可呈在任何可接受載體諸如液體醇、二醇(例如，聚乙二醇)、葡萄糖溶液(例如，5％)、酯、酰胺、無菌水或緩沖鹽水(包括緩沖液如磷酸鹽或醋酸鹽；例如，等滲鹽水)中的形式?？紤]強(qiáng)飼喂養(yǎng)或胃腸外注射。例如，也可給予呈丸劑、糊劑或片劑形式的神經(jīng)毒性組合物。根據(jù)神經(jīng)毒性組合物的劑型，除神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物外，還可包含于組合物中的其它示例性組分為植物油、明膠、乳糖、直鏈淀粉、硬脂酸鎂、增溶劑、局部麻醉劑(例如，利多卡因)、賦形劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、鹽和潤滑劑。根據(jù)本發(fā)明，短語“藥學(xué)上可接受的載體”指任何這些載體或組分或本領(lǐng)域已知的其它任何藥學(xué)上可接受的載體。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，可胃腸外注射含有神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物的組合物，舉例說明，這類注射可為腹膜內(nèi)注射、皮下注射、肌內(nèi)注射或靜脈注射。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可采用慢泵遞送或給予含有神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物的組合物。胃腸外劑型的實(shí)例包括活性成分在熟知的藥學(xué)上可接受的液體載體諸如液體醇、二醇(例如，聚乙二醇)、葡萄糖溶液(例如，5％)、酯、酰胺、無菌水或緩沖鹽水(包括緩沖液如磷酸鹽或醋酸鹽；例如，等滲鹽水)中的含水溶液劑。在另一示例性方面，胃腸外劑型可呈含有神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物的劑量的可重新構(gòu)成的凍干劑形式。在不同的方面，可采用增溶劑、局部麻醉劑(例如，利多卡因)、賦形劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、鹽和潤滑劑。

在各實(shí)施方案中，任一前述實(shí)施方案的組合物中的神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物的劑量可在約0.1mg/kg動(dòng)物體重每日至約500mg/kg動(dòng)物體重每日的范圍內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物的劑量可在約1.0mg/kg動(dòng)物體重每日至約400mg/kg動(dòng)物體重每目范圍內(nèi)。在其它實(shí)施方案中，神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物的劑量可在約10mg/kg動(dòng)物體重每日至約300mg/kg動(dòng)物體重每日、約10mg/kg動(dòng)物體重每日至約200mg/kg動(dòng)物體重每目、約10mg/kg動(dòng)物體重每日至約100mg/kg動(dòng)物體重每日或約10mg/kg動(dòng)物體重每日至約50mg/kg動(dòng)物體重每日范圍內(nèi)。

在任一前述實(shí)施方案中，可作為單一劑量或可分開的多劑量給予和作為多劑量的日劑量方案給予含有神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物的組合物。此外，交錯(cuò)方案，例如，每周1-6天、每周一次或每月1-3次可用作每日給藥的供選擇的方案。而且，每日給藥是合適的。

在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物是合成的。在本發(fā)明的一個(gè)方面，可自商業(yè)途徑得到的甾醇通過本領(lǐng)域已知的方法制備本文所述的神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物。一個(gè)示例性實(shí)施例公開于us2006/0252705a1，其公開通過全文引用結(jié)合于本文。另一方面，可根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法，通過全部或部分合成制備所述化合物。示例性實(shí)施例被nagatsu等，bioorg.和medicinalchem.4卷，1619-1622，1994；ohta等，chem.pharm.，39卷，1337-1339，1991；shibuya等chem.pharm.，40卷，1166-1169，1992公開，它們各通過全文引用結(jié)合于本文中。示例的合成方法也描述于本申請的實(shí)施例章節(jié)中。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文描述的是任一前述實(shí)施方案，其中的神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物被純化?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何常規(guī)技術(shù)，諸如，凝膠過濾、離子交換層析、柱層析、親和層析、溶劑-溶劑萃取、分子蒸餾、結(jié)晶、超濾和hplc，純化神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物。舉例說明，β-谷甾醇-β-d-葡糖苷、菜油甾醇β-d-葡糖苷、二氫菜子甾醇β-d-葡糖苷、豆甾醇β-d-葡糖苷和b-谷甾醇β-d-葡糖苷的純化描述于khabazian，i.，等，journalofneurochemistry，2002，82，516-528；其公開通過全文引用結(jié)合于本文中。例如，神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物可大于90％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％或99.7％純。這類純化合物為分離的化合物。在本文所述的任一實(shí)施方案中，化合物可為合成的。

在任一上述實(shí)施方案中，接觸神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物的非人動(dòng)物可為胎兒動(dòng)物。在本發(fā)明的這個(gè)方面，可通過給予妊娠雌性動(dòng)物神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物和通過隨之發(fā)生的暴露于妊娠雌性動(dòng)物的體液的胎兒“給予”胎兒動(dòng)物，給予接觸神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物的胎兒動(dòng)物神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物。在該實(shí)施方案中，可監(jiān)測年幼動(dòng)物出生后的神經(jīng)變性(即，通過給予妊娠雌性動(dòng)物給予胎兒神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物和可監(jiān)測出生后的動(dòng)物(例如，幼仔)的神經(jīng)變性)。在該胎兒暴露實(shí)施方案中，被監(jiān)測神經(jīng)變性的年幼動(dòng)物可為雄性動(dòng)物或雌性動(dòng)物。

在該實(shí)施方案中，用于胎兒暴露的神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物的純度可大于90％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％或99.7％純。這類化合物為分離的化合物。在該實(shí)施方案中，化合物可為合成的。在胎兒暴露的示例性實(shí)施方案中，神經(jīng)毒性化合物或調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物可為本文所述的任何化合物，其包含選自豆甾醇葡糖苷、菜油甾醇葡糖苷、二氫菜子甾醇葡糖苷、麥角甾醇葡糖苷、燕麥甾醇葡糖苷的任何化合物及其組合。在該胎兒暴露實(shí)施方案中，神經(jīng)毒性化合物也可選自β-谷甾醇-β-d-葡糖苷和膽固醇葡糖苷，或者這些化合物與任何一種豆甾醇葡糖苷、菜油甾醇葡糖苷、二氫菜子甾醇葡糖苷、麥角甾醇葡糖苷、燕麥甾醇葡糖苷及其組合的組合。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供檢驗(yàn)非人動(dòng)物的神經(jīng)變性的方法。該方法包括給予動(dòng)物合成的神經(jīng)毒性甾醇糖苷的步驟，其中的神經(jīng)毒性甾醇糖苷引起動(dòng)物的神經(jīng)變性，和其中動(dòng)物的神經(jīng)變性通過觀察動(dòng)物行為異常檢查或就動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織驗(yàn)尸檢查。舉例說明，甾醇糖苷可為上述任何甾醇糖苷神經(jīng)毒性化合物或其組合，或者與上述任何調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物組合的任何這些化合物，且所述化合物可被分離(例如，大于90％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％或99.7％純)。在上述所有實(shí)施方案中，可通過選自腿伸展試驗(yàn)、步幅長度試驗(yàn)、旋轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)、金屬絲懸掛試驗(yàn)、水迷宮試驗(yàn)、八臂迷宮試驗(yàn)、digigate系統(tǒng)試驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)軌跡自動(dòng)視頻跟蹤試驗(yàn)、焦慮試驗(yàn)、抑郁試驗(yàn)和嗅覺系統(tǒng)試驗(yàn)的行為試驗(yàn)鑒別神經(jīng)變性。在一方面，行為異?？蔀檫\(yùn)動(dòng)功能異常或認(rèn)知功能異常。此外，舉例說明，死后檢查的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織可來自選自皮層、海馬、脊髓和黑質(zhì)的部位。舉例說明，甾醇糖苷可引起神經(jīng)元興奮性毒性。

在又一個(gè)實(shí)施方案中，提供神經(jīng)毒性甾醇糖苷介導(dǎo)的神經(jīng)變性的動(dòng)物模型。該動(dòng)物模型包括患有通過給予足以使非人動(dòng)物產(chǎn)生神經(jīng)變性的量的神經(jīng)毒性甾醇糖苷引起的神經(jīng)變性的非人動(dòng)物。舉例說明，甾醇糖苷可為任何一種上述神經(jīng)毒性化合物或其組合，或者甾醇糖苷可與上述任何調(diào)節(jié)神經(jīng)毒性化合物組合，及所述化合物可被分離(例如，大于90％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％或99.7％純)并可被合成。在該實(shí)施方案中，可通過選自腿伸展試驗(yàn)、步幅長度試驗(yàn)、旋轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)、金屬絲懸掛試驗(yàn)、水迷宮試驗(yàn)、八臂迷宮試驗(yàn)、digigate系統(tǒng)試驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)軌跡自動(dòng)視頻跟蹤試驗(yàn)、焦慮試驗(yàn)、抑郁試驗(yàn)和嗅覺系統(tǒng)試驗(yàn)的行為試驗(yàn)鑒別神經(jīng)變性。在一方面，行為異?？蔀檫\(yùn)動(dòng)功能異?；蛘J(rèn)知功能異常。此外，舉例說明，死后檢查的中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織可為選自皮層、海馬、脊髓和黑質(zhì)的部位。舉例說明，甾醇糖苷可引起生神經(jīng)元興奮性毒性。

在本文所述的任一實(shí)施方案中，可在給予動(dòng)物化合物前，水解甾醇糖苷中的苷鍵，例如，以確定該鍵的水解是否抑制甾醇糖苷的神經(jīng)毒性。在這些實(shí)施方案中，可在給予動(dòng)物甾醇糖苷之前，用降解神經(jīng)毒性甾醇糖苷的酶處理甾醇糖苷。在本申請中所述的任一實(shí)施方案中，甾醇糖苷可為非?；摹?/p>

在示例性實(shí)施方案中，描述形成本文所述的式i神經(jīng)毒性化合物的方法，

該方法包括使d-葡萄糖與新戊酰氯接觸的步驟，

其中r²是氫、烷基、鏈烯基、炔基、雜烷基、鹵代烷基或or⁴；

r³是氫、烷基、鏈烯基、雜烷基、鹵代烷基或or⁴；

r⁴在各種情況下獨(dú)立地選自氫、烷基、雜烷基、鹵代烷基、鏈烯基、炔基和?；?/p>

標(biāo)有a、a’、b、c、d、e、f和g的鍵各自獨(dú)立地選自單鍵和雙鍵，前提是對于標(biāo)有b、c和d的各鍵，相鄰的鍵不能兩者同時(shí)為雙?。?/p>

在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，描述本文所述式i的神經(jīng)毒性化合物的形成方法，

該方法包括使β-d-葡萄糖五新戊酸酯與hbr/hoac混合物接觸以形成第一種中間體的步驟，

以及使第一種中間體與在水和溶劑混合物中的ag2co3接觸，形成2，3，4，6-四-o-新戊酰-β-d-吡喃葡萄糖。

在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，描述本文所述的式i神經(jīng)毒性化合物的形成方法，

該方法包括使2，3，4，6-四-o-新戊酰-β-d-葡萄糖與三氯乙腈和堿接觸，形成2，3，4，6-四-o-新戊酰-α-d-吡喃葡萄糖基三氯亞氨逐乙酸酯的步驟。

在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，描述形成本文所述的式i神經(jīng)毒性化合物的方法，

該方法包括在無水溶劑中，在三氟化硼乙醚絡(luò)合物的存在下，使式ii甾醇

與2，3，4，6-四-o-新戊酰-α-d-吡喃葡萄糖基三氯亞氨逐乙酸酯接觸，形成式iii化合物的步驟

其中p是新戊酰。

在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，描述形成本文所述的式i神經(jīng)毒性化合物的方法，

該方法包括使式iii甾醇與甲醇中的甲醇鈉接觸的步驟。

在又一個(gè)實(shí)施方案中，描述本文所述的式i神經(jīng)毒性化合物的形成方法，該方法包括兩個(gè)或更多個(gè)呈任何組合的前述方法實(shí)施方案。

本文所述的某些化合物含有一個(gè)或多個(gè)手性中心，或者可另外能夠作為多種立體異構(gòu)體存在。本發(fā)明的范圍包括純立體異構(gòu)體以及立體異構(gòu)體的混合物，諸如對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體和富含對映異構(gòu)體或非對映異構(gòu)體的混合物。本文所述的某些化合物可作為幾何異構(gòu)體存在。本發(fā)明的范圍包括純幾何異構(gòu)體或幾何異構(gòu)體的混合物。

本領(lǐng)域技術(shù)人員也容易認(rèn)識(shí)到，在以普通方式將各成員一起分組的情況下，諸如以馬庫什基團(tuán)分組，本發(fā)明不僅涵蓋作為整體列出的全部基團(tuán)，而且涵蓋單獨(dú)基團(tuán)和主要基團(tuán)的所有可能的亞組的各個(gè)成員。因此，為了所有的目的，本發(fā)明不僅涵蓋主要基團(tuán)組，而且涵蓋缺乏一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)成員的主要基團(tuán)組。本發(fā)明還涵蓋一個(gè)或多個(gè)任何基團(tuán)成員的明確排除。

當(dāng)考慮到以下示例性實(shí)施方案的詳細(xì)描述時(shí)，本發(fā)明的其它特征對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，將變得顯而易見。

實(shí)施例1

動(dòng)物

小鼠：

5月齡雄性cd-1小鼠(30.1-35.7g，7.5cm-8.8cm)購自charlesriver(wilmington，ma)。選擇成年小鼠模擬als-pdc發(fā)作的平均年齡(kurland，l.t.(1988a)trendsneurosci.11，51-4；kurland，l.t.，等(1994)guam的肌萎縮性側(cè)索硬化-帕金森氏病-癡呆復(fù)征：流行病學(xué)和病原學(xué)視角.109-131)。將用于sg研究的30只小鼠隨機(jī)分為2組(14只對照動(dòng)物和16只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物)。12小時(shí)光/暗循環(huán)下，保持22℃，使所有動(dòng)物單獨(dú)居住于室內(nèi)的無病毒柵欄設(shè)施中。使小鼠可隨意取得食物和水。

實(shí)施例2

飼養(yǎng)方案

飼養(yǎng)：

將合成sg與磨細(xì)的purinachow鼠糧丸(mousediet^tm，purina)混合，制作每丸sg含量1000μg的實(shí)驗(yàn)丸。用無菌硅膠刮鏟使干燥原料混合。針對每5g的標(biāo)準(zhǔn)飲食，加入2.5ml雙蒸水(dd)h2o，揉捏生面團(tuán)并滾成小丸。在加入正常鼠糧(隨意)之前，每天早晨將含有單一甾醇糖苷的小丸放入飼養(yǎng)盤(feedingtray)中。每日小鼠吃光所有的實(shí)驗(yàn)丸。用無添加劑的同一重量的鼠糧丸喂養(yǎng)對照小鼠。每日進(jìn)行sg飼養(yǎng)15周，監(jiān)測小鼠行為直至于35周(時(shí)間點(diǎn)1)或52周(時(shí)間點(diǎn)2)處死為止。兩組動(dòng)物表現(xiàn)出正常的體重增加。參見圖1。

實(shí)施例3

行為試驗(yàn)

行為監(jiān)測：

普通條件：在無病毒設(shè)施中，在標(biāo)準(zhǔn)光條件下，在10a.m.和5p.m.之間用各行為實(shí)驗(yàn)單個(gè)測試小鼠(crawley，j.n.(2000)我的小鼠出現(xiàn)什么問題了？：轉(zhuǎn)基因和基因敲除小鼠的行為顯型.65-69)。按每時(shí)間段在各組間隨機(jī)排列小鼠的試驗(yàn)程序。在記錄行為時(shí)，觀察者不知各動(dòng)物所屬的實(shí)驗(yàn)組。

旋轉(zhuǎn)棒(rotorod)：用旋轉(zhuǎn)棒評價(jià)運(yùn)動(dòng)功能、協(xié)調(diào)和平衡(jones，b.j.，等(1968)naunynschmiedebergsarchexppatholpharmakol.259，211；sango，k.，等(1995)natgenet.11，170-6；gerlai，r.，等(1996)neurobiollearnmem.66，143-54；sango，k.，等(1996)natgenet.14，348-52；chapillon，p.，等(1998)behavbrainres.93，77-81；carter，r.j.，等(1999)jneurosci.19，3248-57；crawley，j.n.(1999)brainres.835，18-26；gerlai等，1996)。測量小鼠在襯墊區(qū)域上的在升高的轉(zhuǎn)動(dòng)軸上(3.6cm直徑；16rpm)可保持水平行走而不掉下(norflus，f.，等(1998)jclininvest.101，1881-8)、抓緊或跳下軸(crawley，1999)的時(shí)間，參見圖15。將各小鼠置于棒的中間(chen，c.，等(1995)cell.83，1233-42)和每周測試兩次最大值160秒(bameoud，p.，等(1999)expneurol.155，243-51；crawley，1999)。sg喂養(yǎng)的小鼠表現(xiàn)出未掉下的時(shí)間下降，參見圖2。

金屬絲懸掛：用金屬絲懸掛(或懸掛金屬絲(hangingwire))試驗(yàn)測試神經(jīng)肌肉力量(wilson，j.，等(2003d)neuromolecularmed.3，105-18；wilson，j.m.，等(2004c)neuroimage.23，336-43；wilson，j.m.，等(2005)socneurosci.abstr.online；tabata，r.c.，等(2008)neuromolecularmed.10，24-39、)。小鼠需要平衡和握力以保持其身體懸空(crawley，2000)。將小鼠置于軟著陸表面上升高50cm的金屬絲籠蓋(wirecagelid)上。自金屬絲裝置倒轉(zhuǎn)(180°)時(shí)起計(jì)量自金屬絲跌落的等待時(shí)間(最大值60秒)(sango等，1996)。每兩周進(jìn)行一次金屬絲懸掛試驗(yàn)。對照動(dòng)物組表現(xiàn)出裝置倒置和跌落之間的時(shí)間的增加，而sg喂養(yǎng)的小鼠并不表現(xiàn)出這種時(shí)間的增加。參見圖4。

腿伸展反射試驗(yàn)：用腿伸展反射試驗(yàn)作為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元功能異常的測量(bameoud等，1999)。用其變換形式區(qū)別更細(xì)微的行為變化。采用考慮到可能的動(dòng)物響應(yīng)而開發(fā)出的0-4級評分(wilson，j.m.，等(2002a)neuromolecularmed.1，207-21)：給出4分是指動(dòng)物兩腿表現(xiàn)出完全伸展。認(rèn)為這樣的響應(yīng)是正常的響應(yīng)。當(dāng)動(dòng)物伸展的兩腿有些震顫和/或蹬出一條腿時(shí)，給出3分。2分表示動(dòng)物伸出一條腿并縮回另一條腿，或者動(dòng)物表現(xiàn)出兩肢震顫。1分表示動(dòng)物縮回一條腿且另一條腿表現(xiàn)出震顫。當(dāng)兩腿縮回時(shí)認(rèn)定為0分。每周對每個(gè)動(dòng)物測試腿伸展反射三次。由于在先前的蘇鐵和甾醇糖苷研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)正常反射漸進(jìn)性惡化為震顫并隨后完全縮回，故設(shè)計(jì)該等級評分試驗(yàn)以表明功能的進(jìn)行性喪失(wilson，j.m.，等(2002b)neuromolecularmed.1，207-21；tabata等，2008)。研究期間sg-喂養(yǎng)的小鼠的肢伸長評分下降，參見圖3。

曠場監(jiān)測：認(rèn)為曠場中自發(fā)性活動(dòng)是運(yùn)動(dòng)功能的一種最標(biāo)準(zhǔn)化的常規(guī)測試(crawley，2000)。曠場試驗(yàn)也能顯示動(dòng)物的應(yīng)急響應(yīng)(即，電極包埋(defensiveburying)或趨觸性)(karl等，exptoxicolpathol.，2003，55(1)：69-83)。每兩周對各動(dòng)物進(jìn)行曠場試驗(yàn)。將單個(gè)鼠置于四個(gè)曠場區(qū)/盆(約1m直徑)之一中，每5分鐘試驗(yàn)測試四只動(dòng)物。已經(jīng)表明，5分鐘足以評價(jià)運(yùn)動(dòng)的總體異常和極其顯著的活動(dòng)過度或行為鎮(zhèn)靜(behavioralsedation)(crawley，2000)。由于他們更好地界定“區(qū)域”(即，中央和周邊)和允許小鼠覆蓋更長的距離并表現(xiàn)出更廣泛的運(yùn)動(dòng)變化，采用大區(qū)域。這依次增加基于恐懼的行為的檢測可能性(crawley，2000)并將動(dòng)物對曠場的適應(yīng)性減至最低(crawley，2000)。在測試各動(dòng)物之前，用70％乙醇清潔測試場地，各試驗(yàn)期結(jié)束時(shí)用quatricide清潔場地。用安裝在頂棚上的攝影機(jī)紀(jì)錄整個(gè)活動(dòng)。回放視頻剪輯，手工評分，或用自動(dòng)視頻跟蹤軟件(3.1，noldus信息技術(shù)公司，leesburg，va，usa)自動(dòng)分析。根據(jù)錄像帶播放而不是試驗(yàn)時(shí)親自進(jìn)行評分，以避免由于觀察者近距離接近小鼠的出現(xiàn)而產(chǎn)生混亂的可變因素(crawley，2000)。

步態(tài)分析：為在向前運(yùn)動(dòng)期間檢驗(yàn)前肢和后肢的步姿(steppingpatterns)的空間和時(shí)間指標(biāo)(temporalindices)，需要使小鼠在設(shè)定為30rpm，帶不閃爍(no-flicker)光源(90-250vac；25khz，mousespecifics，inc.，boston，ma，usa)的無色(pvc和聚碳酸酯)、筆直、水平、有壁機(jī)動(dòng)帶(walledmotorizedbelt)(digigait^tm，跑步機(jī)馬達(dá)(treadmillmotor)：dc，hp；扭距45lb-in，mousespecifics，inc.，boston，ma，usa)上行走，(相對于動(dòng)物)前側(cè)安裝攝像機(jī)以便能夠?qū)顒?dòng)進(jìn)行連續(xù)前側(cè)水平攝像(每秒至多150幀)。用互補(bǔ)數(shù)字成像軟件(digigait^tm，mousespecifics，inc.，boston，ma，usa)按廠商的指示進(jìn)行步態(tài)指標(biāo)分析。簡單地說，該軟件將“爪印”轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)字信號(hào)并生成腳爪位置(pawplacement)的短暫紀(jì)錄，并將數(shù)字文件拆分為三個(gè)主要參數(shù)：步幅持續(xù)時(shí)間、擺動(dòng)持續(xù)時(shí)間和站姿持續(xù)時(shí)間。站姿持續(xù)時(shí)間是肢爪接觸帶表面的時(shí)間段。該軟件進(jìn)一步將站姿持續(xù)時(shí)間細(xì)分為兩個(gè)部分：制動(dòng)持續(xù)時(shí)間(整個(gè)離散時(shí)間間隔時(shí)期的爪接觸區(qū)的增加)和推進(jìn)持續(xù)時(shí)間(整個(gè)離散時(shí)間間隔時(shí)期的爪接觸區(qū)的減少)。擺動(dòng)持續(xù)時(shí)間是爪未接觸帶表面的時(shí)間段。除這些因素之外，還產(chǎn)生超過一打的其它特征，包括站姿因素、步進(jìn)順序方式、推進(jìn)和節(jié)奏，以提供25種步態(tài)指標(biāo)的電子數(shù)據(jù)報(bào)表格式(spreadsheetformatreport)。

實(shí)施例4

器官收集和冷凍切除

處死35周齡(35.9-48.6g)和52周齡(41.2-51.4g)小鼠用于組織學(xué)分析。包括來自各時(shí)間點(diǎn)的年齡匹配的對照小鼠以作比較。用4％異氟烷深度麻醉籠中小鼠，并心臟內(nèi)輸注經(jīng)過濾的pbs(ph7.4)，直到流出液無血(2分鐘)，隨后輸注在0.1m磷酸鹽緩沖液(ph7.4)中的冷(4℃)4％低聚甲醛(pfa)5分鐘(30ml)。pbs和pfa經(jīng)分開的無菌鉑金硬化硅膠管(cole-parmercanadainc.，montreal，canada)和蠕動(dòng)泵(masterflexperistalticpump，cole-parmercanadainc.，montreal，canada)遞送。切開大腦和脊髓并4℃下固定過夜，在ph7.4、增加濃度的磷酸鹽緩沖液(10、20和25％)中的蔗糖中平衡3天的時(shí)期。當(dāng)組織下沉到裝有25％蔗糖的閃爍管的底部時(shí)，就認(rèn)為組織完全平衡。平衡后，將脊髓和大腦標(biāo)本置于沉浸于干冰上的異戊烷(bdhlaboratorysupplies，uk)浴冰凍的最適宜切片溫度(oct)凝膠-蔗糖混合物的模(tissue-tekcryomold，sakurafinetek，usa，torrance，ca)中，并于-80℃下貯存直到處理。

組織的冷凍切除(oryosectioning)：用hacker-bright低溫保持器(hackerinstruments和industriesinc.，winnsboro，sc)切割冷凍的冠狀切片(脊髓：20μm，腦：30μm)并固定在帶電載玻片(superfrostplus；fisherscientific，pittsburgh，pa)上，這樣各片上的相鄰cns切片表示脊髓和腦分別相隔100μm和150μm范圍(tabata等，2008)。于-80℃下貯存各片，直到組織學(xué)處理。為確保各動(dòng)物間的cns切片相匹配，采用鼠腦圖譜證實(shí)解剖標(biāo)志(paxinos和franklin，小鼠腦立體定位坐標(biāo)(themousebraininstereotaxiccoordinates)：第二版，k.b.j.，學(xué)術(shù)出版社，紐約，2001)。

實(shí)施例5

組織學(xué)

運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的組織學(xué)和量化：將來自各動(dòng)物的脊髓和大腦切片進(jìn)行尼氏體染色。于室溫(rt)下，在等級乙醇系列(95％：15min；70％：1min；50％：1min)中漂洗切片至再水合和自組織除去脂質(zhì)并固定化學(xué)藥品。然后在二次交換蒸餾水中再漂洗組織2min，用兩次過濾的甲酚紫染色劑(1.25g醋酸甲酚紫、0.75ml冰醋酸至250ml蒸餾水)染色，在蒸餾水中漂洗(1分鐘)，然后脫水(50％乙醇：1分鐘；1％冰醋酸-70％乙醇：2分鐘；95％乙醇：2分鐘；95％乙醇：3dips；100％乙醇：1分鐘)和在二甲苯中清除。然后用entellen浸片劑(merck，darmstadt，germany)浸泡載玻片。隨機(jī)開始選擇組織固定的載玻片并自腰第2至第6區(qū)域開始取樣。最初通過腹側(cè)和背神經(jīng)根計(jì)數(shù)確定腰和胸脊髓的高低分界線(superior-inferiorboundaries)，并通過比較小鼠腦立體定位圖譜證實(shí)(sidman，等，小鼠腦和脊髓的圖譜，哈佛大學(xué)出版社，cambridge，ma(1971))。通過側(cè)面、中間和腹側(cè)分界線的灰質(zhì)邊緣并借助于通過中央管的人工畫出的線確定腹側(cè)角的分界線。對都來自各動(dòng)物的12個(gè)切片的左和右腹側(cè)角計(jì)數(shù)。采用精確的形態(tài)學(xué)和大小標(biāo)準(zhǔn)對具和不具凋亡結(jié)構(gòu)變化的α-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和γ-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元計(jì)數(shù)。認(rèn)為以下為非凋亡α-神經(jīng)元：具有圓形淺色核的；可見的核仁；球狀尼氏體染色的細(xì)胞質(zhì)；和30-45μm直徑的大的、多極細(xì)胞。在這種情況下，星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞被排除在“α-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元”計(jì)數(shù)之外(martin，l.j.(1999)jneuropatholexpneurol.58，459-71；sepkuty，j.p.，等(2002)jneurosci.22，6372-9；tabata等，2008)。認(rèn)為經(jīng)歷凋亡的致密小體(pyknotic)或致密核(karyopyknotic)α-神經(jīng)元是具有30μm和更大的直徑、具有濃縮和黑色染色核、細(xì)胞外有或無空泡化的那些神經(jīng)元。認(rèn)為經(jīng)歷凋亡的染色質(zhì)溶解的α-神經(jīng)元是具有30μm和更大直徑、具有不可辨別的核、核自或不自其中心位置偏移到邊緣、尼氏體(嗜色細(xì)胞質(zhì)(chromophilsubstance))裂變、細(xì)胞外有或無空泡化的那些神經(jīng)元。認(rèn)為健康γ-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元是細(xì)胞大小在18μm和30μm之間的那些神經(jīng)元(szumanska，g.，等(1977)neuropatolpol.15，523-35)。認(rèn)為凋亡γ-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元是大小在18μm和30μm之間、帶濃縮和黑色染色核、細(xì)胞外有或無空泡化的那些神經(jīng)元。有完整的核(在對“健康”α-和γ-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的讀數(shù)內(nèi))、核仁和胞質(zhì)溶膠的那些運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元包含在計(jì)數(shù)內(nèi)。根據(jù)未處理動(dòng)物切片進(jìn)行的計(jì)數(shù)充當(dāng)對照物。結(jié)果見圖5和8。

實(shí)施例6

免疫熒光

如下對組織固定的載玻片進(jìn)行熒光顯微鏡法：于室溫(rt)下，在科普林缸中以三種不同的pbs漂洗切片45分鐘。然后于室溫下，在由5％正常山羊血清(ngs)、5％正常兔血清(nrs)或5％blokhenii(aveslabs，inc.，tigard，or)、0.05％tritonx-100和pbs制備的阻斷透化溶液中孵育切片30分鐘。隨后，倒干凈(tippedoff)阻斷液，在pbs中漂洗載玻片2分鐘。然后于4℃下，于加濕室中用pbs緩沖溶液孵育切片過夜，該緩沖溶液含有1％ngs或1％nrs、1％牛血清白蛋白(bsa)和以下第一抗體(primaryantibodies)中的一種：(a)兔抗-人/鼠atf-3(h-90)igg(多克隆的，1∶500；santacruzbiotechnology，inc.，santacruz，ca)，(b)抗-活化胱天蛋白酶-3igg(單克隆的，1∶250；chemiconintemational，temecula，ca)(參見圖9)，(c)山羊抗人/鼠膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(chat)igg(多克隆的，1∶100；chemiconintemational，temecula，ca)(參見圖6)，(d)兔抗-鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白igg(多克隆的，1∶250；genetexinc.，sanantonio，tx)(參見圖7)，(e)兔抗人/鼠離子鈣結(jié)合銜接分子1(iba-1)igg(多克隆的，1∶500；wakopurechemicalindustries，ltd，richmond，va)，(f)鼠抗-人/鼠克隆at8phf-1τ(單克隆的，1∶200；piercebiotechnologyinc.，rockford，il)，(g)兔抗-人/鼠tardna-結(jié)合蛋白43(tdp43)(1∶100；proteintechgroupinc.，chicago，il)(參見圖14)，(h)雞抗-人/鼠β-微管蛋白3(tuj1抗原)(多克隆的，1∶100，aveslabs，inc.，tigard，or)，(i)兔抗-鼠酪氨酸羥化酶(多克隆的，1∶500，chemiconinternational，temecula，ca或多克隆的1∶1000，affinitybioreagents，golden，co)(圖10)，(j)兔抗人/鼠抗-pjunser73igg(多克隆的，1∶200；chemiconinternational，temecula，ca)，(k)兔抗人/鼠抗-hsp-70igg(多克隆的，1∶200；chemiconinternational，temecula，ca)或(1)兔抗人/鼠抗-hsp-25igg(多克隆的，1∶100；chemiconintemational，temecula，ca)。在各實(shí)驗(yàn)中，用第一抗體和略去的第二抗體或用第二抗體和略去的第一抗體孵化其它載玻片，測試非特異性顯色。在合適的情況下，也可如上處理陽性對照載玻片(阿爾茨海默氏病患者內(nèi)嗅皮層(entorhinalcortex)，得自kinsmen實(shí)驗(yàn)室的drs.claudiaschwab和patrickmcgeer，britishcolumbia大學(xué)，vancouver，bc，加拿大)以便比較。在用第一抗體孵育過夜后，于rt下，在三種不同pbs中漂洗載玻片45分鐘。之后立即于rt下在無光暗房中用含有5％ngs或5％nrs和熒光團(tuán)共軛抗體：alexafluor568山羊抗-兔或兔抗-山羊igg(單克隆的，1∶250，吸收：578nm，發(fā)射603nm；molecularprobes，eugene，or)、alexafluor546山羊抗兔或兔抗-山羊igg(單克隆的；1∶250，吸收556nm，發(fā)射573nm；分子探針，eugene，or)或異硫氰酸熒光素(fitc)山羊抗-兔igg(多克隆的，1∶500，吸收：494nm，emission：518nm；sigma，saintlouis，mo)的第二抗體溶液孵化載玻片1小時(shí)。倒干凈第二抗體溶液，在三種不同pbs中漂洗載玻片15分鐘。組織切片用4’6聯(lián)脒并(diamidino)-2-苯基吲哚(dapi)熒光封片介質(zhì)(mountingmedia)(vectashield，吸收：360nm，發(fā)射：460nm，vectorlaboratories，burlington，on，canada)覆蓋，以標(biāo)記核，于4℃下貯存于遮光滑板箱中以阻止熒光標(biāo)記的漂白。

實(shí)施例7

tau免疫組織化學(xué)

首先用3種不同pbs漂洗載玻片-固定的腰和胸脊髓和腦的切片45分鐘，然后以pbst(pbs+0.5％tritonx-100)中的3％h2o2猝滅10分鐘。在2種不同pbst中漂洗載玻片4分鐘。按照制造商的使用說明制備mom小鼠ig封閉劑。將兩滴小鼠ig原液加至2.5mlpbs中。于rt下用該溶液孵化切片1小時(shí)。該步驟后，在2種不同pbst中漂洗切片4分鐘并用通過加入600v1mom蛋白濃縮物至7.5mlpbs中制備的mom稀溶液孵化(5分鐘)。將稀釋液倒入載玻片并被由在如上討論的相同方法制備的稀溶液中以1∶100稀釋的磷酸-τ第一抗體組成的溶液置換。于rt下，孵化切片60分鐘。隨后，在2種不同pbst中漂洗切片4分鐘，并在mom生物素化抗-鼠igg試劑(稀釋于2.5mlmom稀釋液的10v1mom生物素化抗-鼠igg)中孵化10分鐘。然后在pbst中漂洗切片，并用通過來自vectastainabcelite試劑盒(vectorlaboratories，burlingame，ca，usa)的1滴第二抗體(生物素化山羊-抗-兔igg)與3滴血清原液合并為10mlpbst制備的第二抗體孵化(rt下，1小時(shí))。在開始用第二抗體孵化載玻片后的30分鐘，通過將2滴試劑a和2滴試劑b(vectastaineliteabc試劑盒，vectorlaboratories，burlingame，ca，美國)加至2.5mlpbst中制備免疫過氧化物酶溶液。在用第二抗體溶液孵化載玻片1小時(shí)后，在兩種不同pbst中漂先載玻片4分鐘并在免疫過氧化物酶工作液中孵化30分鐘。接著，在2種不同pbst申漂洗切片4分鐘。漂洗期間，為下一步驟制備dab液體底物。按照制造商的使用說明書，合并2滴緩沖原溶、5mlddh2o、4滴dab原液和2滴過氧化氫溶液。rt下用該dab溶液孵化載玻片3分鐘并監(jiān)測顯色。在ddh2o中漂先切片5分鐘以終止反應(yīng)，并使載玻片離開dab底物。用甲基綠核復(fù)染劑顯示核和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元體細(xì)胞。按以下方法制備0.5％甲基綠復(fù)染劑：首先，將1.36g三水合醋酸鈉加至100ml蒸餾水中，用冰醋酸調(diào)節(jié)至ph4.2，制備醋酸鈉緩沖液。對每100ml緩沖溶液，加入0.5g甲基綠(乙基紫，sigma-aldrich，oakville，on，canada)以制備0.5％甲基綠溶液。rt下，將載玻片-固定的切片在以上甲基綠溶液中染色5分鐘。在蒸餾水中漂洗切片，直到水變得透明。接著，用95％乙醇(5dips)和2種不同的100％乙醇(每種5dips)使切片快速脫水，然后用10dips二甲苯清除。最后，在通風(fēng)櫥中干燥載玻片，并用含樹脂切片固定介質(zhì)(entellen，merck，darmstadt，germany)覆蓋。在未處理小鼠中未觀察到磷酸化τ聚集。在sg-喂養(yǎng)的小鼠中觀察到磷酸化τ聚集(參見圖13)。

實(shí)施例8

酪氨酸羥化酶免疫組織化學(xué)

腦切片中的多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)記經(jīng)酪氨酸羥化酶抗體鑒定orrow，c.e.，bandstra，等，(2001)neurotoxicolteratol.23，533-44)并直接免疫過氧化物酶染色。rt下，在封閉血清中孵化切片2小時(shí)，然后用第一抗體(兔抗-酪氨酸羥化酶，1∶500，affinitybioreagents，golden，co，usa)孵化3小時(shí)。室溫下，在生物素化山羊抗-兔igg(1∶100；vectorlaboratoriesinc.，burlingame，usa)中漂洗并孵化切片30分鐘，然后用abs方法觀察(vectastaineliteabc試劑盒，vectorlaboratoriesinc.)。參見圖10。

實(shí)施例9

細(xì)胞色素c氧化酶組織化學(xué)

對于熒光免疫組織化學(xué)，用根據(jù)(seligman等，j.cell.biol.1968；38：1-14和wong-riley，(1979)，brainres.171，11-28)改編的方法，處理組織-固定的載玻片。rt下，在科普林缸中以三種不同的pbs中漂洗切片15分鐘，隨后用含有50mg3，3’-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(dab)(dab底物系統(tǒng)，vectorlaboratories，burlingame，ca，usa)、90ml0.1m磷酸鹽緩沖液、20mg細(xì)胞色素c(iii型，sigma-aldrichco.，oakville，on，加拿大)和4g蔗糖的培養(yǎng)基在浸于保持在黑暗中的37℃水浴中的碟中孵化2小時(shí)。密切監(jiān)測切片的棕色反應(yīng)產(chǎn)物出現(xiàn)在組織中。一旦得到棕色培養(yǎng)基，就自培養(yǎng)基移去載玻片并在3種不同的pbs中漂洗15分鐘以停止反應(yīng)。隨后在蒸餾水中漂洗2分鐘以自載玻片除去殘余物。載玻片在通風(fēng)櫥中干燥并用entellen(merck，darmstadt，germany)覆蓋。結(jié)果表明，在對照小鼠和sg-喂養(yǎng)的小鼠之間，不存在顯著差異，盡管兩組都隨時(shí)間的過去表現(xiàn)出細(xì)胞色素c氧化酶的減少，參見圖11。

實(shí)施例10

油紅o組織化學(xué)

用改編自dr.royellis(imvsdivisionofpathology，thequeenelizabethhospital，woodville，southaustralia)的方案，處理組織-固定的載玻片，用光學(xué)顯微鏡檢查評價(jià)脂質(zhì)分布。首先，在進(jìn)行組織化學(xué)程序之前2小時(shí)制備油紅o原液。通過在40℃水浴上混合油紅o(0.5g，sigma-aldrich，oakville，on，canada)和異丙醇(100ml，fisherscientific，nepean，on，canada)，制備油紅o染色原液。在開始油紅o組織化學(xué)程序之前，即時(shí)通過每30ml油紅o染色原液合并20ml蒸餾水，制備油紅o工作液。過濾該工作液5次，以除去不溶解于溶劑的任何油紅o。rt下，在科普林缸中以3種不同的pbs漂洗載玻片固定的切片15分鐘。再于rt下，用60％異丙醇漂洗切片5分鐘。然后脊髓切片用新鮮制備的油紅o工作液染色20分鐘，隨后用60％異丙醇漂洗。通過用蘇木精(蘇木精，7211，richardallanscientific，kalamazoo，mi，usa)染色切片1分鐘，得到核復(fù)染劑。最終，切片經(jīng)蒸餾水漂洗，在通風(fēng)廚中干燥并用entellen(merck，darmstadt，germany)封蓋。參見圖12。

實(shí)施例11

組織形像化和圖像拍攝

檢驗(yàn)免疫熒光方法處理的組織切片并用zeissaxiovert200m(carlzeisscanadalimited，toronto，on)拍攝。dapi(藍(lán)熒光)圖像化需要359/461nm吸收/發(fā)射濾光片。fitc需要490,494/520nm濾光片。alexafluor546tm(紅熒光)使用56,557/572,573nm濾光片。在40倍放大量化期間，拍攝經(jīng)腰和胸脊髓部分(即，左腹側(cè)角和右腹側(cè)角)的兩張圖片。類似地，拍攝經(jīng)腦區(qū)域和經(jīng)背或腹側(cè)神經(jīng)根切片的兩張圖片。40倍圖像的尺寸為350x275vm。用axiovision4.3軟件拍攝圖像。用帶axiocamhrm的zeissaxiovertzoomaxiovision3.1分析經(jīng)免疫熒光處理的數(shù)據(jù)。檢驗(yàn)非熒光方法處理的組織切片并用moticb5專業(yè)系列3.0顯微鏡(moticinstrumentsinc.，richmond，on)拍攝，用moticb5professional，moticimagesadvanced3.0(moticinstrumentsinc.，richmond，on)分析數(shù)據(jù)。

實(shí)施例12

量化免疫反應(yīng)性細(xì)胞胞體或內(nèi)含物

在小鼠腦圖譜(2001)所界定的區(qū)域邊緣內(nèi)的600μm/600μm區(qū)域，用40x物鏡對越過脊髓的腹側(cè)角、越過大腦兩半球或通過背或腹側(cè)神經(jīng)根的免疫反應(yīng)性胞體或內(nèi)含物的數(shù)量計(jì)數(shù)。對各個(gè)動(dòng)物，研究經(jīng)脊髓或腦髓區(qū)域的8個(gè)橫切片。產(chǎn)生8個(gè)橫切片的每一個(gè)的右和左腹側(cè)角二者的平均數(shù)，以給出各動(dòng)物在各脊髓部位的最終平均數(shù)。為量化黑質(zhì)致密部和紋狀體切片中腰脊髓或酪氨酸羥化酶免疫反應(yīng)性的線粒體活性水平(細(xì)胞色素c氧化酶標(biāo)記)，將用moticb5專業(yè)系列3.0顯微鏡(moticinstrumentsinc.，richmond，on)拍攝和用moticb5professional，moticimagesadvanced3.0(moticinstrumentsinc.，richmond，on)分析的圖像掃描成tiff格式文檔，并用nihimagej1.37軟件分析，以測量抗體標(biāo)記的密度水平。包括來自各小鼠所關(guān)注的每一區(qū)域的8-12個(gè)切片。

實(shí)施例13

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

得自各脊髓或腦切片的各半球的定量數(shù)據(jù)被平均，以產(chǎn)生半球平均值，然后于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析前，平均各動(dòng)物的數(shù)據(jù)平均值。采用student’st檢驗(yàn)對對照小鼠和sg-喂養(yǎng)的小鼠之間的差異性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)評價(jià)，要出現(xiàn)顯著性差異，需要p＜0.05。將全部數(shù)據(jù)表示為平均值的平均+/-標(biāo)準(zhǔn)誤差(sem)。采用不成對雙尾t檢驗(yàn)、單因素或兩因素anova，隨后用tukey’s事后分析或fisher’slsd(graphpadprismv3.0，graphpadsoftwareinc.，sandiego，ca；statisticaforwindowsv.6.1統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包，statsoft，tulsa，ok)確定統(tǒng)計(jì)顯著性。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析經(jīng)來自universityofbritishcolumbia的統(tǒng)計(jì)學(xué)系的幾位校閱者獨(dú)立地評述。

實(shí)施例14

神經(jīng)毒性調(diào)節(jié)劑化學(xué)

一些蘇鐵粉(pl-粉)使喂過該粉的大鼠產(chǎn)生帕金森樣綜合征。當(dāng)通過hplc比較一流分(流分pl)該粉的萃取物和相同流分的來自不產(chǎn)生相同帕金森樣綜合征的其它三種粉的萃取物時(shí)，觀察到來自pl-流分的流分在萃取物中比在其它萃取物中呈現(xiàn)更大的量。hplc條件，柱sb-c18，80％mecn，20％meoh，0.2ml/min，30℃；未拆分，感興趣的一個(gè)峰在7.37min。在210nm、300nm和經(jīng)熒光(于330nm觀察，于295nm激發(fā))觀察。在更高的溫度下，峰進(jìn)一步拆分成3個(gè)峰，3.50min、3.73min、4.05min，檢波器設(shè)定在210nm；4.05min峰僅在檢波器設(shè)定在300nm時(shí)顯現(xiàn)。hplc條件sb-c18，80％mecn，20％meoh，0.2ml/min，60℃。

流分pl的質(zhì)子nmr表明，該分子中的全部質(zhì)子中的大多數(shù)衍生自脂肪酸，包括單、雙和/或多不飽和脂肪酸。在0.9的峰，甲基；1.3，亞甲基；1.6，β-co亞甲基；2.1，烯丙基亞甲基；2.3，α-co；2.8，雙烯丙基峰；5.2，甘油酯；和5.3，雙鍵。這些信號(hào)全部與提出的結(jié)構(gòu)片段有一致的2dnmr相關(guān)性并組成該流分中全部質(zhì)子的85％。而且，可鑒別在雙重雙峰的各峰的4.1和4.3ppm的亞甲基甘油酯(可能c1)。落在3.5-4.5ppm區(qū)域內(nèi)的其它所有甘油酯和糖峰被加寬。在吡啶-d5中加熱至80℃稍微有助于加寬糖區(qū)域，包括拆分105ppm處的異頭碳，但未觀察到甘油酯和糖區(qū)域的完全拆分。就nmr而言，tocsy關(guān)聯(lián)性是不完全的，且不可能確定完整的糖自旋系統(tǒng)。而且，加寬導(dǎo)致信號(hào)損失成噪音。因此，并非全部碳可經(jīng)hsqc檢測。

ms數(shù)據(jù)表明主要包含連著在三個(gè)hplc峰的兩個(gè)中的二酰甘油的單-和雙-c6-糖的相關(guān)糖酯的存在。第三個(gè)峰含有經(jīng)nmr、lcms(m+h⁺417)和uv和熒光數(shù)據(jù)鑒別為β-生育酚的化合物。產(chǎn)生帕金森樣綜合征的粉中的更大量的該原料提示，它調(diào)節(jié)著蘇鐵粉中其它組分的神經(jīng)毒性作用。

對于混合物的一種組分，ms在m+h＝417的信號(hào)和在151片段與區(qū)位異構(gòu)體的β和γ生育酚的結(jié)構(gòu)相符。uv和熒光發(fā)射譜也與生育酚結(jié)構(gòu)一致。根據(jù)我們結(jié)果中觀察到的峰，所述質(zhì)子和碳nmr數(shù)據(jù)明確證實(shí)這為β-生育酚(參見以下結(jié)構(gòu))。具體說來，觀察到β-生育酚的c7(¹h在6.46，¹³c在115.3)和c8(甲基)(¹³c在15.8)，盡管未觀察到預(yù)計(jì)為γ區(qū)域異構(gòu)體(regioisomer)c5的那些峰(1h在6.37，¹³c在112.1)和c8(甲基)(¹³c在11.9)。在來自流分pl的nmr數(shù)據(jù)中，該分子的類萜尾端未被明顯拆分，因?yàn)樗c糖脂的脂肪酸鏈的信號(hào)重疊。在0.87ppm的碳c4′、c8′和c12′上的甲基未在19ppm和22ppm明顯表現(xiàn)出與生育酚結(jié)構(gòu)一致的碳信號(hào)(脂肪酸的末端甲基在該區(qū)域重疊，但具有13ppm的碳信號(hào)。在cosy和tocsy數(shù)據(jù)(未顯示)中，生育酚的c3和c4上的質(zhì)子也被觀察到并表現(xiàn)出相互偶合。

經(jīng)高分辨質(zhì)譜法對流分的分析表明，并非β-生育酚的原料流分包含二糖和單糖糖酯的混合物。下面概述質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

質(zhì)譜數(shù)據(jù)

二糖成分

分析兩個(gè)主要質(zhì)量峰：

939峰

hrms939.5879，計(jì)算值c49h88nao15[18∶2，16∶0，己糖，己糖，na⁺]939.6021。msms顯示在685.44、683.41、659.38、657.39和405.17的峰，表示衍生自任一脂肪酸(fa)或二者的缺失的片段，各fa中的不飽和度被混合。

965峰

hrms965.6033，計(jì)算值c51h90nao15[18∶2，18∶1，己糖，己糖，na⁺]965.6177。msms顯示在683.41、685.42和405.17的峰，表示衍生自任一脂肪酸(fa)或二者的缺失的片段。

單糖成分

分析一個(gè)主要質(zhì)量峰：

801峰

hrms801.5357，計(jì)算值c45h78nao10[(18∶1，18∶3)和(18∶2，18∶2)，己糖，na⁺]801.5493。msms顯示在519.34、521.34、523.38和243.08的峰，表明衍生自一個(gè)18∶1、18∶2和18∶1fa或二者的缺失的片段。在335.28、337.31和339.3的峰表示通過自衍生自一個(gè)fa缺失的片斷進(jìn)一步缺失己糖片斷所衍生的片斷。

實(shí)施例15

分娩前暴露于甾基糖苷

9只5月齡cd-1雌性小鼠購自charlesriver實(shí)驗(yàn)室(wilmington，ma)并給予一周以適應(yīng)新的動(dòng)物留住設(shè)施。適應(yīng)期后，在包括污染有雄性草墊的籠中將雌性小鼠分為每組3只的3組居住，以介導(dǎo)和同步雌性的動(dòng)情周期。在第三天，在每日光循環(huán)結(jié)束時(shí)，將雌性與9只cd-1雄性年齡配對。每日早晨檢查雌性的射精栓。紀(jì)錄下發(fā)現(xiàn)栓的那天作為妊娠的第一天或作為胚胎的第1天(e1)。一旦發(fā)現(xiàn)栓，就使雌性與雄性分開并放回其居住的籠中。在e10和e11，根據(jù)在先前蘇鐵類飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中所用的1g蘇鐵類種子中所發(fā)現(xiàn)的平均量，用含有兩種經(jīng)鑒別的蘇鐵類甾基糖苷(0.6mgbssg和0.4mg豆甾醇葡糖苷(sg)的組合的小鼠食物丸粒喂5只妊娠雌性，而其余動(dòng)物接受標(biāo)準(zhǔn)小鼠食物丸粒(khabazian等，2002；wilson等，2002)。選擇e10和e11日，將目標(biāo)對準(zhǔn)在發(fā)育的神經(jīng)系統(tǒng)中的黑質(zhì)-紋狀體通道的分化(bayer等，1995；rice和barone，2000)。每日監(jiān)測妊娠雌性的任何異常行為。分娩典型地出現(xiàn)在e19和e20之間，每胎的幼仔數(shù)在8-15只幼仔范圍，平均為每胎約10只幼仔。對照母鼠每胎平均11.6只幼仔，而喂bssg和sg的母鼠每胎平均9.5只幼仔。盡管對照母鼠的平均每胎數(shù)量略大，但在每胎數(shù)量或出生幼仔的性別方面，對照母鼠或bssg和sg飼養(yǎng)母鼠之間沒有顯著的差別。幼仔的死亡率是11％，因?yàn)橐恢粚φ漳甘笫テ湟惶?只中的6只幼仔。兩只bssg和sg喂養(yǎng)的母鼠也分別自每胎8只和12只中各失去一只幼仔。在出生24hr內(nèi)對全部存活幼仔稱重，然后，每周進(jìn)行。在第22天，使小鼠斷奶，打耳孔以便識(shí)別，然后根據(jù)性別按12：12-小時(shí)光-暗循環(huán)分組居住，并隨意供水和食物。僅同胞幼仔住在相同籠子中。5周齡時(shí)開始用本文所述的不同行為試驗(yàn)方法進(jìn)行出生后行為分析。在出生后的8周開始至18周期間的各個(gè)周齡，測試小鼠的探索活力。經(jīng)5分鐘間隔時(shí)間進(jìn)行測試：將動(dòng)物置于測試場地的中央，并測量幾個(gè)探索活力參數(shù)。與對照動(dòng)物相比，處理過的動(dòng)物在全部運(yùn)動(dòng)的持續(xù)時(shí)間[(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05，**p＜0.05(圖27)；和(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05)(圖28)]；跨越柵格進(jìn)入場地中央的次數(shù)[(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.0005)(圖29)；和(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05，**p＜0.005)(圖30)]；至場地邊界的平均距離(表明處理過的小鼠表現(xiàn)出更喜歡場地的邊緣而不是中央)[(student’st檢驗(yàn)：***p＜0.0005)(圖31)；和(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05)(圖32)]；和在場地中央所度過的持續(xù)時(shí)間[(student’st檢驗(yàn)：**p＜0.005)(圖33)和(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05)(圖34)]方面表現(xiàn)出顯著的減少。與對照動(dòng)物相比，處理過的動(dòng)物還在平均轉(zhuǎn)動(dòng)角度[(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.0005)(圖35)；和(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05，*p＜0.005)(圖36)]；和首次跨越進(jìn)入場地中央的持續(xù)時(shí)間[(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05)(圖37)和(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05)(圖38)]方面表現(xiàn)出顯著的增加。此外，與雄性對照動(dòng)物相比，處理過的雄性動(dòng)物在速度(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05)(圖39)方面表現(xiàn)出顯著的下降；和在角速度方面(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05，**p＜0.005)(圖40)；和迂回程度(student’st檢驗(yàn)：*p＜0.05，**p＜0.005)(圖41)方面表現(xiàn)出顯著的增加。

在鄰近動(dòng)物所住籠舍的室內(nèi)進(jìn)行行為試驗(yàn)。動(dòng)物住在溫度控制室中的無病毒屏障設(shè)施中。

表1

*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.00

不顯著＝ns；lsc＝腰脊髓；tsc＝胸脊髓；腹側(cè)角＝vh；背神經(jīng)根＝dr：-＝不存在；+＝存在

實(shí)施例16

甾醇葡糖苷的合成

流程1

a.)新戊酰氯，1∶1吡啶，ch2cl2；b.)i.hbr-hoac，ch2cl2，0℃；ii.ag2co3，丙酮，h2o；c.)三氯乙腈，dbu，ch2cl2，-30℃；d.)豆甾醇或b-谷甾醇，bf3·et2o，ch2cl2，-30℃；e.)naome/meoh

b-d-葡萄糖五新戊酸酯(2)。如流程1中所示合成化合物2，得到78％得率。mp：153-156℃。¹hnmr(cdcl3，400mhz)：δ5.70(d，j＝8.3hz，1h)，5.38(t，j＝9.2hz，1h)，5.22(t，j＝9.2hz，1h)，5.17(t，j＝9.6hz，1h)，4.18-4.07(m，2h)，3.90-3.83(m，1h)，1.23(s，9h)，1.18(s，9h)，1.16(s，9h)，1.12(s，18h).

2，3，4，6-四-o-新戊酰-d-吡喃葡萄糖(3)。如流程1中所示合成化合物3。以99％得率分離白色泡沫物。無需進(jìn)一步純化，將粗化合物用于下一反應(yīng)。

2，3，4，6-四-o-新戊酰-α-d-吡喃葡糖基(glycopyranosyl)三氯亞氨逐乙酸酯(trichloroacetimidate)(4)。如流程1中所示合成化合物4。以86％得率分離純白色粉末。譜值與先前所報(bào)道的那些相符；mp：133℃(分解)；¹hnmr(cdcl3，400mhz)：δ8.68(s，1h)，6.58(d，j＝3.5hz，1h)，5.66(t，j＝10.0hz，1h)，5.23(t，j＝10.0hz，1h)，5.16(dd，j＝10.0，3.9hz，1h)，4.28-4.05(m，3h)，1.20(s，9h)，1.18(s，9h)，1.14(s，18h).

豆甾醇2，3，4，6-四-o-新戊酰-β-d-吡喃葡糖苷(5a)。室溫下，攪拌在550ml二氯甲烷中的12.45g豆甾醇(30.16mmol)、21.93g三氯亞氨逐乙酸酯4(33.18mmol)和12.75g分子篩懸液0.5h。0.5h后，經(jīng)注射器逐滴加入2.62ml三氟化硼乙醚絡(luò)合物(diethyletherate)(20.83mmol)。室溫下攪拌反應(yīng)混合物2h。加入第二份三氯亞氨逐乙酸酯4(1.01g，1.53mmol)，室溫下攪拌反應(yīng)混合物另外2h。過濾粉紅色溶液，用二氯甲烷洗滌分子篩幾次。用碳酸氫鈉飽和溶液洗滌溶液一次，然后用鹽水洗滌。有機(jī)溶液經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并真空濃縮，得到think、淺白色固體。使該固體從乙醇中再結(jié)晶，得到22.43g(73％)白色固體。¹hnmr(cdcl3，400mhz)：δ5.34-5.30(m，2h)，5.19-5.13(m，1h)，5.09-4.97(m，3h)，4.21(dd，j＝12.2，1.7hz，1h)，4.04(q，j＝6.5hz，1h)，3.74(qd，j＝6.5，1.7hz，1h)，3.51-3.43(m，1h)，2.23-0.70(m，80h).

豆甾醇β-d-吡喃葡糖苷(6a)。經(jīng)套管向850ml無水甲醇中的23.38g豆甾醇2，3，4，6-四-o-新戊酰-β-d-吡喃葡糖苷(5)(25.66mmol)懸液中加入2.07g金屬鈉的50ml無水甲醇溶液(89.81mmol)。將該反應(yīng)混合物加熱至回流24h。冷卻混合物至室溫，過濾白色固體。用amberlite中和濾液，蒸發(fā)溶劑，得到另一份白色固體。將固體合并并懸浮于400ml水中。加熱混合物至回流0.5h。冷卻至室溫后，該固體經(jīng)過濾和干燥。使所生成的化合物溶解于300ml吡啶。然后用600ml水沉淀出產(chǎn)物。過濾白色沉淀，在真空干燥前，用水、甲醇和丙酮洗滌一次，得到呈白色粉末的13.36g(91％得率)標(biāo)題化合物。¹hnmr(dmso，600mhz)：5.33-5.32(m，1h)，5.18-5.12(m，1h)，5.04-5.00(m，1h)，4.89(d，j＝4.8hz，1h)，4.87(dd，j＝4.8，1.7hz，2h)，4.43(t，j＝5.71h)，4.21(d，j＝7.9hz，1h)，3.64(qd，j＝5.7，1.8hz，1h)，3.49-3.43(m，1h)，3.40(quint.，j＝5.9hz，1h)，3.13-3.19(m，1h)，3.08-3.05(m，1h)，3.03-2.99(m，1h)，2.91-2.87(m，1h)，2.39-2.34(m，1h)，2.12(t，j＝12.1hz，1h)，2.06-1.99(m1h)，1.95-1.90(m，2h)，1.82-1.78(m，2h)，1.67-1.61(m，1h)，1.53-1.36(m，9h)，1.26-1.10(m，4h)，1.07-0.67(m，18h).¹³cnmr(dmso，150mhz)：δ141.3，138.1，128.8，121.2，100.8，76.9，76.8，73.5，70.1，61.1，56.3，55.3，50.6，49.6，41.9，40.0，39.9，39.1，38.3，36.8，36.2，31.4，31.3，31.2，29.3，28.5，24.9，23.9，21.1，20.9，20.6，19.11，18.9，12.2，11.9.ms(esi)：597(m+na⁺).

流程2

a.)tscl，吡啶，dmap；b.)meoh，吡啶，回流；c.)h2，5％pd/c，etoh；d.)tsoh，aq.二氧雜環(huán)己烷，80℃.

豆甾醇甲苯磺酸酯(8).室溫下，攪拌28.29g豆甾醇(68-55mmol)、27.44g甲苯磺酰氯(143.95mmol)和0.838g4-(二甲基氨基)吡啶(6.85mmol)的350ml經(jīng)蒸餾的吡啶溶液24小時(shí)。然后將反應(yīng)混合物傾入含有1.2l10％碳酸氫鈉溶液的2lerlenmeyer燒瓶中。過濾固體，經(jīng)水洗滌。使產(chǎn)物溶解于熱丙酮并過濾除去不溶解的白色固體。蒸發(fā)丙酮至最小體積，再結(jié)晶產(chǎn)物，得到呈透明針狀物的34.77g(89％)標(biāo)題化合物。¹hnmr(cdcl3，400mhz)：δ7.80(d，j＝8.3hz，2h)7.33(d，j＝7.8hz，2h)，5.31-5.30(m，1h)5.18-5.12(m，1h)，5.05-4.99(m，1h)，4.37-4.29(m，1h)，2.45(s，3h)，2.42-0.68(m，43h)(mccarthy，等，org.biomol.chem.2005，3，3059-3065)。

豆甾醇甲醚(9)。經(jīng)注射器，向2.901g豆甾醇甲苯磺酸酯(8)(5.12mmol)的40ml無水甲醇溶液加入1.24ml吡啶(15.35mmol)。加熱白色懸液至回流6h。冷卻反應(yīng)混合物至室溫，真空除去溶劑，得到白色固體。將殘余物萃取至乙酸乙酯中，并用水洗滌兩次，用氯化銨的飽和溶液洗滌一次。用乙酸乙酯萃取經(jīng)合并的含水部分。合并的有機(jī)物經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾和真空濃縮，得到透明的起泡固體。粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠(20∶1己烷∶乙酸乙酯)純化，得到1.94g(89％)透明粘性油，它含有化合物9∶10的5∶1的混合物。無需進(jìn)一步純化，將粗反應(yīng)混合物用于下一反應(yīng)。

β-谷甾醇(12)。向10.93g化合物9和10的混合物(25.61mmol)的50ml經(jīng)蒸餾的乙醇溶液加入2.73g5％披鈀碳。以50psi壓力向parr振蕩器中充滿氫氣并振動(dòng)20h。經(jīng)¹hnmr證實(shí)反應(yīng)完成。反應(yīng)混合物經(jīng)celite過濾并濃縮，得到油性固體。在加入0.487g對甲苯磺酸(tosicacid)(2.56mmol)前，使該固體溶解于150ml二氧雜環(huán)己烷和25ml水中。加熱溶液至80℃5h。冷卻溶液至室溫，真空除去溶劑，得到白色殘余物。將殘余物溶于氯仿，分別用水和鹽水洗滌各兩次。有機(jī)層經(jīng)硫酸鈉干燥，過濾并濃縮，得到白色/黃色固體。粗化合物經(jīng)硅膠(5∶1→1∶1己烷∶乙酸乙酯)純化，得到5.23g(33％經(jīng)過4個(gè)步驟)呈白色固體的標(biāo)題化合物。¹hnmr(cdcl3，400mhz)：δ5.36-5.34(m，1h)，3.56-3.48(m，1h)，2.32-0.68(m，48h).

β-谷甾醇2，3，4，6-四-o-新戊酰-β-d-吡喃葡糖苷(5b)。如流程1所示進(jìn)行5b的合成，得到15.05g(74％)呈白色粉末的標(biāo)題化合物；mp：185-188℃.¹hnmr(cdcl3，400mhz)：5.34-5.30(m，1h)，5.07(t，j＝9.6hz，1h)，5.00(t，j＝9.6hz，1h)，4.63(d，j＝7.9hz，1h)，4.21(dd，j＝11.6，1.2hz，1h)，4.05-4.01(m，1h)，3.75-3.71(m，1h)，3.51-3.43(m，1h)，2.21-0.68(m，84h).

β-谷甾醇β-d-吡喃葡糖苷(6b)。如流程1所示進(jìn)行6b的合成，得到9.13g(96％)呈白色粉末的標(biāo)題化合物；mp：203℃(decomp.)；¹hnmr(dmso，400mhz)：δ5.33-5.31(m，1h)，4.87-4.82(m，3h)，4.40(t，j＝5.7hz，1h)，4.21(d，j＝7.8hz，1h)，3.63(dd，j＝5.7，1.3hz，1h)，3.49-3.38(m，2h)，3.18-2.99(m，4h)，2.92-2.87(m，1h)，2.36(dd，j＝13.1，3.1hz，1h)，2.15-0.65(m，42h).¹³cnmr(dmso，100mhz)：δ207.9，141.9，122.7，102.3，78.4，78.2，74.9，71.6.62.6，57.6，56.9，51.1，46.6，43.3，39.8，38.3，37.7，36.9，34.8，32.9，32.8，32.1，30.7，30.2，29.2，26.9，25.3，24.1，22.1，21.2，20.6，20.4，20.1，13.2，13.1.ms(esi)：599(m+na⁺).

實(shí)施例17

甾醇葡糖苷的合成

膽固醇-β-d-葡糖苷的合成。根據(jù)kunz和harreus的方法完成葡糖苷合成[21]；在氬氣下，在30ml無水乙醚中，攪拌1.45g(2.5mmol)四-o-新戊酰-α-d-吡喃葡萄糖基溴化物、1.35g(3.5mmol)膽固醇、0.83g(3mmol)碳酸銀、0.05g三氟甲烷-磺酸銀和5g分子篩24h。過濾反應(yīng)混合物，蒸發(fā)濾液至于，殘余物經(jīng)用石油醚/乙酸乙酯(10∶1)作為流動(dòng)相的硅膠快速層析法純化。使純化的膽固醇-四-o-新戊酰-β-d-葡糖苷懸浮于50ml甲醇中，加入10ml甲醇鈉(0.1mol/l)?；亓?4h后，冷卻溶液，并用100ml甲醇稀釋。濾出沉淀的產(chǎn)物，用水煮沸，再次過濾，在減壓下干燥。使粗晶體溶解于熱吡啶，并通過向熱溶液加水沉淀。在約4℃下放置懸液過夜后，濾出產(chǎn)物。用水和丙酮洗滌無色晶體，經(jīng)氫氧化鉀真空干燥，得到純膽固醇β-d-葡糖苷。相應(yīng)地，處理二氫膽固醇和豆甾醇，得到二氫膽固醇-β-d-葡糖苷和豆甾醇-β-d-葡糖苷。用nmr(¹h和¹³c)和高分辨質(zhì)譜法(hrms)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特征鑒定。也采用與elsd和uv檢測組合的hplc證實(shí)純度。

膽固醇-β-d-葡糖苷：得率：1.9g(85％)，純度＞99％(hplc)，mp262-263℃.¹³cnmr(100mhz，吡啶-d5)：δ＝12.16，19.11，19.60，21.47，22.85，23.10，24.31，24.66，28.41，28.67，30.45，32.24，32.36，36.20，36.66，37.11，37.67，39.53，39.90，40.15，42.66，50.55，56.54，57.01，63.05，71.91，75.53，78.29，78.67，78.80，102.78，122.10，141.10.hrms計(jì)算值c33h56o6(m⁺)：548.4077，實(shí)測值548.4093.

二氫膽固醇-β-d-葡糖苷：得率：1.0g(70％)，純度＞99％(hplc)，mp256-258℃.¹³cnmr(100mhz，吡啶-d5)：δ＝12.42，12.49，19.07，21.63，22.85，23.10，24.31，24.61，28.41，28.69，29.22，30.20，32.45，35.03，35.78，35.91，36.20，36.64，37.41，39.90，40.41，42.95，44.80，54.66，56.69，56.74，63.15，72.01，75.56，77.36，78.73，78.85，102.32.hrms計(jì)算值c33h58o6(m⁺)：550.4233，實(shí)測值550.4218.

豆甾醇-β-n-葡糖苷：得率：1.1g(73％)，純度＞96％(hplc)，mp297-298℃.¹³cnmr(100mhz，吡啶-d5)：δ＝12.17，12.54，19.21，19.44，21.29，21.31，21.50，24.57，25.72，29.33，30.29，32.09，32.19，36.97，37.51，39.38，39.86，40.80，42.39，50.39，51.45，56.11，56.96，62.89，71.75，75.38，78.12，78.51，78.65，102.61，121.93，129.50，138.85，140.95.hrms計(jì)算值c35h58o6(m⁺)：574.4233，實(shí)測值574.4251.

盡管上面已經(jīng)描述和/或舉例說明了本發(fā)明的某些實(shí)施方案，仍預(yù)期它們可能有相當(dāng)多的變化和修飾。因此，本發(fā)明不限于本文所述和/或舉例說明的具體實(shí)施方案。