本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及l(fā)gk974在制備治療多囊腎病的產(chǎn)品中的應(yīng)用，特別涉及l(fā)gk974在制備治療常染色體顯性遺傳性多囊腎疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

常染色體顯性遺傳性多囊腎(autosomaldominantpolycystickidneydisease，adpkd)疾病是最常見的單基因遺傳性腎病之一。其主要臨床癥狀為雙側(cè)腎臟形成大量大小不等的球形液性囊腫，并進行性增大，破壞腎臟的結(jié)構(gòu)和功能，最終導致腎功能衰竭。adpkd通常在成人中發(fā)病，其發(fā)病率為1:500-4000，是目前世界上終末腎衰竭的第四大主要原因。除腎病表型外，adpkd患者的非腎臟部位病變表型也十分明顯：83％的adpkd患者出現(xiàn)肝囊腫，10％的adpkd患者出現(xiàn)胰腺囊腫，16％的患者出現(xiàn)腦動脈瘤。其他病理表型包括主動脈根，胸部動脈異常，二尖瓣脫垂以及腹壁疝氣。約50％的患者年滿60歲后將出現(xiàn)終末腎衰竭。正常人的尿素氮(bun)參考范圍為2.14-7.14mmol/l，血肌酐(cr)參考范圍為44-133μmol/l，當血肌酐超過133μmol/l為炎癥損傷期，超過186μmol/l為腎功能損傷期，超過451umol/l為腎功能衰竭期。最新研究結(jié)果表明，adpkd致病基因pkd1和pkd2的缺失可以導致經(jīng)典wnt信號通路的異常激活，經(jīng)典wnt/β-catenin信號通路很可能密切的參與腎臟囊腫形成過程的調(diào)節(jié)。

lgk974是有效的特異性porcn的抑制劑，ic50為4nm。lgk974通過特異性抑制porcn介導的酰基化修飾從而抑制wnt配體分子如wnt-3a的分泌。lgkp74可抑制哺乳動物porcn?；D(zhuǎn)移酶活性，抑制wnts配體的激活并減少wnt受體lpr6的磷酸化從而促使wnt信號通路靶基因表達降低，進而抑制經(jīng)典wnt通路的活性。lgk974作為有效的porcn特異性抑制劑，現(xiàn)用于治療依賴wnt配體的惡性腫瘤。目前，該藥已用于臨床i期實驗。wnt-c59也是特異性porcn的抑制劑，作用于wnt3a介導的多聚tcf結(jié)合位點驅(qū)動的熒光素酶的激活。wnt-c59可在納摩爾水平抑制哺乳動物porcn?；D(zhuǎn)移酶活性。在hek293細胞中ic50為74pm。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供lgk974的新用途。

本發(fā)明提供了lgk974在制備治療常染色體顯性遺傳性多囊腎的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了lgk974在制備如下(1)-(4)中至少一種產(chǎn)品中的應(yīng)用：

(1)減弱患病機體腎囊腫程度的產(chǎn)品；

(2)降低患病機體腎臟體重比的產(chǎn)品；

(3)降低患病機體的腎臟囊腫指數(shù)的產(chǎn)品；

(4)降低患病機體血液中肌酐和/或尿素氮含量的產(chǎn)品。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種產(chǎn)品。

本發(fā)明提供的產(chǎn)品的活性成分為lgk974；所述產(chǎn)品的用途為如下(a)-(e)中的至少一種：

(a)治療常染色體顯性遺傳性多囊腎；

(b)減弱患病機體腎囊腫程度；

(c)降低患病機體腎臟體重比；

(d)降低患病機體的腎臟囊腫指數(shù)；

(e)降低患病機體血液中肌酐和/或尿素氮含量。

上述應(yīng)用或上述產(chǎn)品中，所述患病機體為具有常染色體顯性遺傳性多囊腎臨床癥狀的機體。

上述應(yīng)用或上述產(chǎn)品中，所述產(chǎn)品為藥物。

本發(fā)明以vil-cre；pkd2^f3/f3小鼠作為adpkd動物模型，進行了wnt信號通路抑制劑—lgk974和wnt-c59對常染色體顯性遺傳性多囊腎(adpkd)治療的效果研究，結(jié)果表明，wnt信號通路抑制劑—lgk974對于治療常染色體顯性遺傳性多囊腎具有一定的效果，具體體現(xiàn)在：(1)可減弱vil-cre；pkd2^f3/f3小鼠的腎囊腫程度；(2)可降低vil-cre；pkd2^f3/f3小鼠的腎臟體重比；(3)可降低vil-cre；pkd2^f3/f3小鼠的血液中肌酐和/或尿素氮的含量。本發(fā)明對于常染色體顯性遺傳性多囊腎(adpkd)發(fā)病機制的分析，對于治療常染色體顯性遺傳性多囊腎(adpkd)的藥物的研發(fā)均具有重要意義。

附圖說明

圖1為回交后代小鼠基因型的pcr檢測結(jié)果。其中，圖1a為針對pkd2基因pcr檢測結(jié)果，pkd2^f3/f3為pkd2基因純合，pkd2^+/f3為pkd2基因雜合；圖1b為針對cre基因的pcr檢測結(jié)果，vil-cre為表達vil-cre；wt為不表達vil-cre。

圖2為vil-cre；pkd2^f3/f3小鼠模擬人類adpkd的疾病表型。其中，圖2a為vil-cre；pkd2^f3/f3小鼠腎臟形態(tài)；圖2b為vil-cre；pkd2^f3/f3小鼠肝臟形態(tài)；圖2c為vil-cre；pkd2^f3/f3小鼠胰腺形態(tài)；圖2d為vil-cre；pkd2^f3/f3小鼠的腎臟橫切面；圖2e為pkd2^f3/f3小鼠的腎臟橫切面。

圖3為兩組小鼠的腎臟肉眼觀察和he染色結(jié)果。其中，圖3a為對照組肉眼觀察結(jié)果；圖3b為治療組肉眼觀察結(jié)果；圖3c為對照組he染色結(jié)果；圖3d為治療組he染色結(jié)果。

圖4為兩組小鼠的腎臟體重比測定結(jié)果。

圖5為兩組小鼠的腎臟囊腫指數(shù)測定結(jié)果。

圖6為兩組小鼠的血液中尿素氮(bun)與肌酐(cr)的含量測定結(jié)果。其中，圖6a為肌酐含量；圖6b為尿素氮含量。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中的pkd2^f3/f3小鼠記載于文獻“l(fā)ngyukim,tianbingding,yulongfu,etal.conditionalmutationofpkd2causescystogenesisandupregulatesβ-catenin.jamsocnephrol,2009(20):2556-2569”中。其構(gòu)建及鑒定步驟如下：首先，在pkd2基因的3號外顯子兩側(cè)插入兩個loxp位點，在陽性選擇性neo的兩側(cè)有frt位點，由于該結(jié)構(gòu)沒有完全阻斷正常pkd2基因的表達，所以用這種載體通過基因打靶技術(shù)產(chǎn)生的pkd2^nf3小鼠可避免死于胚胎期；再將pkd2^nf3小鼠與actb-flep小鼠雜交，即產(chǎn)生沒有neo元件的pkd2^f3/f3小鼠。鑒于在pkd2^f3/f3小鼠中沒有觀察到多囊表型，pc2的表達也沒有發(fā)生改變，認為這種pkd2^f3等位基因不會導致pkd2的表達失活。

下述實施例中的帶有vil-cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠購自thejacksonlaboratory，strainname：b6.sjl-tg(vil-cre)997gum/j，stocknumber：004586，詳見網(wǎng)址：http://jaxmice.jax.org/strain/004586.html。

下述實施例中的lgk974是selleck公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號s7143。分子量：396.44；化學式：c23h20n6o；cas號：1243244-14-5；溶解性(25℃)：dmso79mg/ml，水<1mg/ml，乙醇<1mg/ml；穩(wěn)定性：3年-20℃粉狀，6月-80℃溶于溶劑。

下述實施例中的wnt-c59是selleck公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為s7037。分子量：379.45；化學式：c25h21n3o；cas號：1243243-89-1；溶解性(25℃)：dmso76mg/ml，水<1mg/ml，乙醇<1mg/ml；穩(wěn)定性：3年-20℃粉狀，6月-80℃溶于溶劑。

實施例1、vil-cre；pkd2^f3/f3小鼠模型的構(gòu)建及鑒定

vil-cre；pkd2^f3/f3小鼠是利用cre-loxp系統(tǒng)建立的可以條件性敲除pkd2的小鼠模型，可產(chǎn)生與人類常染色體顯性遺傳性多囊腎(autosomaldominantpolycystickidneydisease，adpkd)類似臨床表型，并早期死于腎衰竭，可作為adpkd動物模型。其構(gòu)建及鑒定過程如下：

一、vil-cre；pkd2^f3/f3小鼠模型的構(gòu)建

將pkd2^f3/f3小鼠與帶有vil-cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠(b6.sjl-tg(vil-cre)997gum/j)進行雜交，得到f1代(理論上有1/2后代的基因型為vil-cre:pkd2^+/f3；1/2后代的基因型為pkd2^+/f3)；將f1代中vil-cre:pkd2^+/f3小鼠(針對cre基因進行pcr鑒定，具體方法參見下文，經(jīng)鑒定得到大小為650bp目的條帶的f1代小鼠)與pkd2^f3/f3小鼠進行回 交，得到回交后代。

從以上所得回交后代中，篩選得到pkd2基因純合，同時可表達vil-cre的小鼠，具體操作如下：

提取回交后代鼠尾基因組，以其為模板，分別對pkd2基因以及cre基因進行pcr鑒定，其中針對pkd2基因的pcr所用引物序列為如下三條：

5’-tctgacttgcagactgtggg-3’，

5’-aggtaggggaaggtcagggttgg-3’；

5'-tttacgtccagccaagct-3'；

針對cre基因的pcr所用引物序列為如下兩條：

5’-ccaggttacggatatagttcatg-3’；

5’-tgccacgaccaagtgacagc-3’。

當采用針對pkd2基因的三條引物在同一反應(yīng)體系中進行pcr擴增時，如果得到大小分別為650bp和350bp的兩個條帶，則對應(yīng)的回交后代小鼠為pkd2基因雜合(pkd2^+/f3)，如果得到大小為650bp的單一條帶，則對應(yīng)的回交后代小鼠為pkd2基因純合(pkd2^f3/f3)；當采用針對cre基因的兩條引物進行pcr擴增時，如果得到大小為650bp的目的條帶，則對應(yīng)的回交后代小鼠表達vil-cre，如果沒有得到大小為650bp的目的條帶，則對應(yīng)的回交后代小鼠不表達vil-cre。

結(jié)果如圖1所示，圖1a中的pkd2^f3/f3為pkd2基因純合，圖1b中的vil-cre為可表達vil-cre。經(jīng)過以上鑒定，從回交后代中得到的pkd2基因純合，同時可表達vil-cre的小鼠，即為vil-cre:pkd2^f3/f3小鼠。vil-cre為受控于villin1啟動子的cre酶，其中villin1啟動子表達于小鼠胚胎期第12.5天的腸上皮細胞，小鼠在cre酶的作用下，可在細胞水平上產(chǎn)生pkd2^d3/d3，由于pkd2^d3/d3等位基因上的3號外顯子已被剪切掉，進而產(chǎn)生移碼突變，導致3號外顯子下游不遠處產(chǎn)生終止子，進而使pkd2基因產(chǎn)物pc2成為截斷蛋白。

二、vil-cre；pkd2^f3/f3小鼠模型的鑒定

常規(guī)飼養(yǎng)步驟一得到的vil-cre；pkd2^f3/f3小鼠，觀察其存活狀態(tài)。待小鼠四月齡，取其腎臟、肝臟、胰腺，觀察病變情況；另外對腎臟進行he染色分析(具體操作參見實施例2相關(guān)步驟)。同時設(shè)置pkd2^f3/f3小鼠作為對照。

結(jié)果如圖2所示，其中，圖2a為vil-cre；pkd2^f3/f3小鼠腎臟形態(tài)；圖2b為vil-cre；pkd2^f3/f3小鼠肝臟形態(tài)；圖2c為vil-cre；pkd2^f3/f3小鼠胰腺形態(tài)；圖2d為vil-cre；pkd2^f3/f3小鼠的腎臟橫切面；圖2e為pkd2^f3/f3小鼠的腎臟橫切面。從圖中可以看出，步驟一得到的vil-cre；pkd2^f3/f3小鼠在第4～5月左右死亡，其腎臟、肝臟、胰腺均出現(xiàn)嚴重的囊腫，而且腎臟的he染色結(jié)果進一步表明腎臟無腎實質(zhì)，腎功能嚴重 受損，判定vil-cre；pkd2^f3/f3小鼠死于腎囊腫導致的腎衰竭，而同窩同齡的pkd2^f3/f3小鼠則表型正常。

以上結(jié)果表明，步驟一得到的vil-cre；pkd2^f3/f3小鼠表型與人類adpkd患者相似，可作為adpkd動物模型。

實施例2、lgk974和wnt-c59在治療常染色體顯性遺傳性多囊腎中的應(yīng)用

本實施例以實施例1獲得的vil-cre；pkd2^f3/f3小鼠作為adpkd動物模型，研究分析lgk974和wnt-c59在治療常染色體顯性遺傳性多囊腎中的應(yīng)用。具體如下：

一、實驗方法

1、實驗分組及處理

(1)lgk974溶液

將lgk974用溶液a溶解，至其濃度為3mg/ml，后用生理鹽水稀釋至0.3mg/ml。溶液a的溶劑為水，溶劑為甲基纖維素和吐溫80，其中，甲基纖維素在溶液a中的質(zhì)量分數(shù)為0.5％，吐溫80在溶液a中的體積分數(shù)為0.5％。

(2)wnt-c59溶液

將wnt-c59用溶液a溶解，至其濃度為3mg/ml，后用生理鹽水稀釋至1mg/ml。

(3)分組及處理

按照是否用藥物處理分為lgk974治療組，wnt-c59治療組和對照組(安慰劑)，每組隨機選取至少20只vil-cre:pkd2^f3/f3小鼠。從小鼠出生后第三十天開始，進行連續(xù)兩個月的灌胃給藥，每天給藥直至小鼠三月齡停藥，治療組每只小鼠按3mg/kg(每kg體重給3mglgk974)和10mg/kg(每kg體重給10mgwnt-c59)的劑量給藥；對照組每只小鼠每天注射等體積的含有等量0.5％甲基纖維素/0.5％吐溫80的生理鹽水。

2、各組小鼠治療情況分析

(1)he染色分析兩組小鼠的腎囊腫表型

在小鼠兩月齡停藥后，每組隨機選取不少于10只小鼠，處死后，摘除雙側(cè)腎臟。在電子天平上精確稱重，計算腎臟體重比(g/g)，即雙側(cè)腎臟重量(g)/體質(zhì)量(g)。后將雙側(cè)腎臟沿著矢狀面切開，用10％中性福爾馬林溶液固定24小時，后梯度乙醇脫水，然后用石蠟包埋機常規(guī)包埋，蠟塊待后行切片及he染色。

a.脫水包埋

具體步驟：①脫水：70％乙醇1h→75％乙醇1h→80％乙醇1h→85％乙醇1h→90％乙醇1h→95％乙醇1h→100％乙醇1h→二甲苯15min×2；②包埋：石蠟包埋機進行包埋。

b.切片

將腎臟蠟塊在輪轉(zhuǎn)式切片機上做成3μm厚度的連續(xù)腎組織切片，用毛筆輕輕扶起，在溫水中將其充分展開，再用多聚賴氨酸處理過的玻片撈起腎組織切片，電熱干燥機烤干，然后放于電熱恒溫鼓風干燥箱里中，70℃恒溫烘烤1小時，以使組織切片與玻片緊密粘連，置于盒中備用。

c.he病理染色

原理：蘇木精(hematoxylin)染液為堿性，主要使細胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍色；伊紅(eosin)為酸性染料，主要使細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)中的成分著紅色。

步驟：

①二甲苯脫蠟，后用100％乙醇洗去；

②不同濃度的乙醇依次水化；

③磷酸緩沖液搖床緩洗5分鐘；

④蘇木精浸提8次；

⑤流水沖洗5分鐘；

⑥鹽酸酒精浸提8次；

⑦流水沖洗2分鐘；

⑧伊紅染色10分鐘；

⑨不同濃度的乙醇依次脫水；

⑩二甲苯透明，后用中性樹膠封片；顯微鏡觀察。

⑾結(jié)果顯示：細胞漿紅色，細胞核藍紫色。

(2)小鼠的腎臟囊腫指數(shù)的測定

lgk974治療組，wnt-c59治療組和對照組小鼠he染色的腎臟切片拍照后，圖片運行于gnuimagemanipulationprogram。首先將圖片轉(zhuǎn)換為灰度圖，然后調(diào)整圖片像素至800×598。將調(diào)整后的圖片運行添加網(wǎng)格程序，設(shè)定每個網(wǎng)格為大小為22×22像素。計算囊腫區(qū)域網(wǎng)格數(shù)量和腎臟區(qū)域總網(wǎng)格數(shù)量比例即可得到囊腫指數(shù)。

(3)lgk974治療組，wnt-c59治療組和對照組小鼠adpkd相關(guān)生化指標的測定

本發(fā)明的發(fā)明人為了準確反應(yīng)出治療組小鼠腎肝功能的改善程度，進一步對lgk974治療組，wnt-c59治療組和對照組小鼠血液中尿素氮(bun)與肌酐(cr)的含量進行了測定，以此確切反應(yīng)腎功能的變化情況，反映出囊腫的嚴重程度。具體操作如下：

在小鼠三月齡時，將lgk974治療組，wnt-c59治療組和對照組小鼠乙醚麻醉，從下腔靜脈抽取小鼠血液，離心后獲取上清即為血清。對血清進行化驗即可測得肌酐 及尿素氮含量。

二、實驗結(jié)果

1、lgk974治療組，wnt-c59治療組和對照組小鼠的腎囊腫表型

肉眼觀察和he染色結(jié)果如圖3所示，從圖中可以看出，lgk-974治療組較對照組(安慰劑)具有更多的腎實質(zhì)，且腎囊腫表型明顯少于對照組，但wnt-c59治療后與對照組沒有顯著性差異。另外，lgk974治療組，wnt-c59治療組和對照組小鼠的腎臟體重比(g/g)測定結(jié)果如圖4所示，結(jié)果顯示lgk974治療組的腎臟體重比(g/g)顯著小于對照組(p＝0.000015)，具有統(tǒng)計學意義，但wnt-c59治療組的腎臟體重比(g/g)較對照組相比雖有下降，但沒有統(tǒng)計學意義(p＝0.11)。

2、lgk974治療組，wnt-c59治療組和對照組小鼠的腎臟囊腫指數(shù)

lgk974治療組，wnt-c59治療組和對照組小鼠的腎臟囊腫指數(shù)測定結(jié)果如圖5所示，lgk974治療組較對照組相比腎臟囊腫指數(shù)顯著降低(p＝0.000019)，具有統(tǒng)計學意義,但wnt-c59治療組的腎臟囊腫指數(shù)較對照組相比雖有下降，但沒有統(tǒng)計學意義(p＝0.09)。

3、lgk974治療組，wnt-c59治療組和對照組小鼠adpkd相關(guān)生化指標的測定

lgk974治療組，wnt-c59治療組和對照組小鼠的血液中尿素氮(bun)與肌酐(cr)的含量測定結(jié)果如圖6所示，結(jié)果顯示，lgk974治療組小鼠的血液中尿素氮(bun)與肌酐(cr)的含量較對照組相比，均有下降趨勢，lgk974治療組的血液中尿素氮和血肌酐顯著小于對照組(p＝0.00005，p＝0.00174)，具有統(tǒng)計學意義，但wnt-c59治療組的尿素氮和血肌酐較對照組相比雖有下降，但沒有統(tǒng)計學意義(p＝0.08，p＝0.012)。

綜合本實施例的實驗結(jié)果，可見lgk974在治療常染色體顯性遺傳性多囊腎(adpkd)中具有一定作用。