本發(fā)明涉及生物化學(xué)和醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，涉及蛋白功能抑制劑dapt在制備治療內(nèi)分泌疾病的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：生長激素分泌過多，在骨骺閉合之前能引起巨人癥，而在骨骺閉合之后會導(dǎo)致肢端肥大癥。同一患者可兼有巨人-肢端肥大癥。可抑制垂體分泌gh的下丘腦激素藥物，有以下幾類：多巴胺能激動劑：多巴胺能激動劑促進(jìn)可正常人gh的分泌，但卻抑制gh瘤分泌gh。約20％肢端肥大癥患者的血gh及胰島素樣生長因子l(igf-1)可降至正常，同時分泌gh及催乳素(prl)的垂體瘤患者療效最好。雖70％肢端肥大癥患者長期用藥后臨床病情有所好轉(zhuǎn)，但血gh水平降至10及5μg/l以下者僅有20-50％，生長激素腺瘤略有縮小者僅10-15％。生長抑素類似物：生長抑素(ss)是含l4個氨基酸的環(huán)狀肽。目前已在國內(nèi)外上市的ss類藥物3種：(1)天然ss，其半衰期僅3分鐘，對胰島素的分泌也有強(qiáng)烈的抑制作用，停用后gh分泌有反彈，故不能作為慢性治療藥物。(2)八肽ss激動劑(瑞士sandoz公司研制的奧曲肽，octreotide)。奧曲肽更多地與sstr2結(jié)合，肢端肥大癥患者對奧曲肽的反應(yīng)決定于垂體gh瘤細(xì)胞上sstr2的數(shù)目。有10-30％的患者的瘤細(xì)胞sstr2的數(shù)目減少，對奧曲肽的反應(yīng)低，療效較差。(3)緩釋的生長抑素激動劑-蘭瑞肽，注射后93％患者血gh水平抑制至治療前的52％，6個月后85％患者gh分泌降至正常。癥狀改善率分別為盜汗75％，頭痛86％，手指和關(guān)節(jié)痛54％，脊柱痛50％。gh受體拮抗劑:如已上市的培維索孟是相對較新的一類藥物，可與天然gh競爭性結(jié)合gh受體，直接阻斷gh的作用，導(dǎo)致igf-1的合成減少。此藥在阻斷gh的作用和降低血清igf-1水平的作用上有效率高、起效快，缺點是gh不降低并有升高，部分患者腫瘤增大及肝酶增高，其臨床長期使用的安全性尚未得到全面證實。由于現(xiàn)有的治療手段存在上述缺陷，因此有必要開發(fā)能夠影響生長激素分泌的方法和藥品，從而為治療和緩解由生長激素過量分泌所引起內(nèi)分泌疾病提供有效途徑。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個目的是提供蛋白功能抑制劑dapt在制備治療內(nèi)分泌疾病的藥物中的用途。本發(fā)明的第二個目的是提供蛋白功能抑制劑dapt的功能片段、衍生物及其鹽或溶劑化物在制備治療內(nèi)分泌疾病的藥物中的用途。其中，dapt是指cas登錄號208255-80-5的化合物，中文名：(3,5-二氟苯乙?；?-l-丙氨?；?l-2-苯基甘氨酸叔丁酯；分子式：c23h26f2n2o4；是一種γ-分泌酶(γ-secretase)抑制劑，能夠間接抑制γ-分泌酶底物notch的活性，進(jìn)而影響細(xì)胞信號傳導(dǎo)和細(xì)胞分化過程。其中，所述dapt的衍生物為dapt的鹵代、磺化、硝化、羥化、烷氧化或酯化產(chǎn)物。dapt衍生物可成鹽或溶劑化物，其中所述的鹽包括鈉鹽、鉀鹽等，所述的溶劑化物是指水合物、乙醇化物等。所述衍生物可以用于至少部分的抑制生長技術(shù)的分泌。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)見，dapt的衍生物和功能化片段具備與dapt相同的核心結(jié)構(gòu)。因此，其功能片段、衍生物及其鹽或溶劑化物在制備治療內(nèi)分泌疾病的藥物中同樣具備理想的應(yīng)用效果。本發(fā)明中，所述內(nèi)分泌疾病包括由生長激素過量分泌所引起的內(nèi)分泌疾 病，包括肢端肥大癥和巨人癥。除活性成分外，本發(fā)明所述的藥物還包括藥學(xué)上可接受的至少一種賦形劑。所述的賦形劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，包括但并不局限于崩解劑、潤滑劑、分散劑等，本領(lǐng)域技術(shù)人員可依據(jù)制劑的實際需求加以選擇，本發(fā)明對此不作特別限定。本發(fā)明所述的藥物，可經(jīng)由常規(guī)方法制備成藥學(xué)上各種常見劑型，如片劑、膠囊劑、丸劑、散劑、顆粒劑、混懸劑、口服溶液、粉針或注射劑等。給藥方式可選口服、舌下、靜脈、皮下、透皮或局部給藥等，以單位給藥形式給予動物或人。本發(fā)明所述的藥物合適的單位給藥形式包括服劑型(例如片劑、膠囊、丸劑、散劑、顆粒劑、口服溶液或懸浮液)、舌下或口含給藥劑型、靜脈，皮下，透皮或肌內(nèi)給藥劑(例如注射液、粉針等)。此外，所述藥物可以是普通制劑、緩釋制劑、速釋制劑及控釋制劑。優(yōu)選的，本發(fā)明所述的藥物為口服劑型、靜脈給藥劑型或肌內(nèi)給藥劑型。本發(fā)明同時為含有dapt、dapt的功能片段、dapt衍生物及其鹽或溶劑化物的藥物制劑提供理想的實施方式，具體而言，當(dāng)制備片劑或膠囊形式的固體藥物組合物時，在活性成分中可加入的賦形劑，包括稀釋劑，如乳糖、糊精、淀粉、預(yù)膠化淀粉、蔗糖、甘露醇、微晶纖維素等；黏合劑，如聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、羥丙甲纖維素等；崩解劑，如羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)羧基甲基纖維素、低取代羥丙纖維素、羧甲基纖維素鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮等；潤滑劑，如二氧化硅、硬脂酸鎂、硬脂酸鹽、玉米淀粉、滑石粉等，矯味劑，如甘露醇、阿斯巴甜、糖精鈉和甜菊苷等，此外，還可加入表面活性劑，如十二烷基磺酸鈉、磺基丁二酸二辛酯鈉、蔗糖酯和泊洛沙姆等。當(dāng)制備丸劑形式的藥物組合物時，在活性成分中可加入的賦形劑，包括稀釋劑與吸收劑，如乳糖、葡萄糖、糊精、淀粉、蔗糖、可可脂等；黏合劑，如阿拉伯膠、黃芪膠、明膠、蜂蜜等；崩解劑， 如甲基纖維素、乙基纖維素、干燥淀粉、瓊脂粉、海藻酸鹽等。口服溶液或懸浮液可加入的賦形，包括甜味劑，如糖精鈉、蔗糖、甜蜜素、阿斯巴甜和甜菊苷等；助懸劑，如聚乙烯吡咯烷酮、微晶纖維素、蔗糖、羥丙基甲基纖維素等；防腐劑，如尼泊金類、苯甲酸鈉、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯等。顆粒劑可加入的賦形劑，包括填充劑、黏合劑、著色劑及矯味劑等。注射用制劑，如注射液、乳劑、凍干粉針劑等，可以使用本領(lǐng)域常用的各種稀釋劑，如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氧化異硬脂醇等，助溶劑，緩沖劑或ph調(diào)節(jié)劑等。另外，為了制備等滲注射液，可加入氯化鈉、葡萄糖或甘油等。本發(fā)明所述的片劑可以是純片劑，還可將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如薄膜衣、糖衣等。通過制備聚合物基質(zhì)或在膜包衣中使用特定的聚合物，可將片劑制成速釋、緩釋或控釋劑型。膠囊劑可以是軟膠囊或硬膠囊，不帶膜或帶膜，以便具有速釋、緩釋或控釋性能。在本發(fā)明的藥物組合物中，dapt通常以劑量單位配制。每劑量單位含有5至10毫克dapt，每日給予1次或多次。特定情況下也可以采用較高或較低劑量，每個患者的適用劑量由醫(yī)生根據(jù)給藥模式，該患者的年齡、體重和反應(yīng)來最終決定。所述藥物可以與已經(jīng)可用的治療手段(例如化學(xué)治療、外科手術(shù)治療或放療)聯(lián)用。除了在所概述的任意方法中使用藥物以外，本發(fā)明的藥物可用作其他療法的添加劑。應(yīng)該清楚本發(fā)明的治療可以與任何其他已知的治療方法聯(lián)用。通過上述技術(shù)方案，dapt能明顯抑制gh3細(xì)胞的生長。在gh3細(xì)胞中應(yīng)用不同劑量的dapt，能夠明顯抑制gh3細(xì)胞的增殖。特別是在5-20ng/ml的處理劑量下，能夠獲得最佳的抑制增殖效果，減少生長激素的分泌。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細(xì)說明。具體實施方式以下對本發(fā)明的具體實施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。以下實施例中dapt為geneoperation(us)的商品化產(chǎn)品，貨號為in01001-0005mg。實施例11.1細(xì)胞來源gh3細(xì)胞來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所。1.2主要試劑dapt，胰酶，dmem培養(yǎng)基，胎牛血清，二甲基亞砜，多聚賴氨酸均為市售產(chǎn)品。1.3細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)蘇gh3細(xì)胞，待細(xì)胞達(dá)到80％-90％融合時，用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，用dmem培養(yǎng)液重懸傳代。1.4觀測指標(biāo)：1.4.1形態(tài)學(xué)及細(xì)胞增殖速度觀察設(shè)置6個不同劑量的處理組，在dmem培養(yǎng)液中分別添加終濃度0.5、1、5、10、20和100ng/ml的dapt，對照組添加等體積的dmso，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下每天觀察一次培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)特點，記錄不同處理組下gh3細(xì)胞貼壁的時間及長滿單層的時間，結(jié)果如表1所示。表1處理組(ng/ml)0.51510201000細(xì)胞貼壁時間(小時)3466.56.581.5長滿單層時間(小時)5666748312617881.4.2流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡設(shè)置6個不同劑量的處理組，在dmem培養(yǎng)液中分別添加終濃度為0.5、1、5、10、20和100ng/ml的dapt，對照組添加等體積的dmso，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。取培養(yǎng)時間同為3周的gh3細(xì)胞傳代培養(yǎng)3d后將其收獲，并制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)1000r/m(r＝15cm)離心5min，棄上清，細(xì)胞直接懸浮于pi低滲液中，fcm對細(xì)胞dna進(jìn)行分析，pi-dna復(fù)合物發(fā)出的熒光經(jīng)fcm計量分析，細(xì)胞凋亡用小于2倍體峰的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)表示。結(jié)果如表2所示。表2處理組(ng/ml)0.51510201000細(xì)胞凋亡占總數(shù)的百分?jǐn)?shù)(％)4.26.711.917.221.728.62.41.4.3mts法檢測細(xì)胞增殖設(shè)置6個不同劑量的處理組，在dmem培養(yǎng)液中分別添加終濃度為0.5、1、5、10、20和100ng/ml的dapt，對照組添加等體積的dmso，培養(yǎng)gh3細(xì)胞到對數(shù)生長期，取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加dmem培養(yǎng)液(加10％小牛血清)在37℃5％co2的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。每孔加20μlmts/pms混合液，繼續(xù)培養(yǎng)3-4小時顯色。檢測前搖晃培養(yǎng)板10秒鐘，混勻顏色在酶聯(lián)檢測儀上，波長570nm處檢測各孔的光吸收值(od)。用樣品稀釋度對od值(od570)繪制曲線。統(tǒng)計細(xì)胞增殖情況如表3所示。表3處理組(ng/ml)0.51510201000細(xì)胞增殖百分?jǐn)?shù)(％)92.184.278.367.254.742.4100以上結(jié)果表明在gh3細(xì)胞中應(yīng)用不同劑量的dapt，能夠明顯抑制gh3細(xì)胞的增殖。特別是在5-20ng/ml的處理劑量下，能夠獲得最佳的抑制增殖效果。1.4.4檢測dapt對gh3細(xì)胞gh分泌的影響：將細(xì)胞種植于24孔板，使細(xì)胞密度約為3×105個/孔，37℃，濕度環(huán)境(含95％空氣5％二氧化碳)培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天。鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞貼壁良好，極少細(xì)胞懸浮。于藥物實驗前12小時，用無血清dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞過夜。1.4.4.1檢測不同濃度dapt對gh分泌的影響dapt工作濃度0.5、1、5、10、20和100ng/ml和空白對照，共設(shè)7個組(如表4所示,不同濃度dapt干預(yù)細(xì)胞分組)。37℃，濕度環(huán)境(含95％空氣5％二氧化碳)培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時后，收集細(xì)胞培養(yǎng)基，12000rpm離心5min，保留上清。采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(elisa)檢測gh水平，試劑盒購自millipore。根據(jù)試劑盒檢測450和590nm處吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算gh濃度(如表4所示)。表41.4.4.2檢測dapt在100ng/ml的工作濃度下不同作用時間對gh分泌的影響。設(shè)5個組(如表5所示)，空白對照，7℃，濕度環(huán)境(含95％空氣5％二氧化碳)培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在相應(yīng)時間收集細(xì)胞培養(yǎng)基，2000rpm離心5min，保留上清。采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(elisa)檢測gh水平，試劑盒購自millipore。根據(jù)試劑盒檢測450和590nm處吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算gh濃度(如表 5所示)。表5空白對照組第1組第2組第3組第4組第5組dapt-0.5h1h2h3h4hgh濃度(ng/ml)18.317.414.111.710.310.1以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本發(fā)明的各種不同的實施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。當(dāng)前第1頁12