專利名稱：依賴細(xì)胞周期蛋白的激酶2和IKB－α的嘌呤抑制劑的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明是1996年8月2日提交的未決的美國專利申請08/692,012的部分繼續(xù)。
(1)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及2,6,9-三取代嘌呤，已發(fā)現(xiàn)它是細(xì)胞周期激酶(cell cyclekinase)的選擇性抑制劑并且該化合物也是細(xì)胞增殖的抑制劑。例如，2,6,9-三取代嘌呤可用于治療自身免疫性疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、狼瘡、Ⅰ型糧尿病、多發(fā)性硬化等；治療癌癥、心血管疾病如再狹窄、宿主-移植物疾病、痛風(fēng)、多囊性腎病和其它發(fā)病機(jī)理涉及異常性細(xì)胞增殖的增殖性疾病。
本發(fā)明也涉及2,6,9-三取代嘌呤，已發(fā)現(xiàn)它是有效的和特異性IκB-α激酶抑制劑，它抑制體內(nèi)和體外NF-κB激活和細(xì)胞因子(cytokines)合成。預(yù)期該抑制劑可抑制細(xì)胞因子和粘蛋白的合成，該合成在轉(zhuǎn)錄時受NF-κB的調(diào)節(jié)。促炎細(xì)胞因子(proinflammatory cytokines)如IL-1、IL-6、TNF和粘蛋白(例如ICAM、VCAM和選擇蛋白)屬于該類分子并且與炎性疾病的發(fā)病機(jī)理有關(guān)。因此，有效的IκB-α激酶抑制劑可用于臨床治療那些需要激活NF-κB來誘導(dǎo)的疾病。
(2)現(xiàn)有技術(shù)的描述在過去的幾年中，分子和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展已有助于我們理解細(xì)胞在有絲分裂進(jìn)展過程中發(fā)生的細(xì)胞增殖和特定活動的機(jī)理。例如，“Progressin Cell Cycle Research”第1卷，L.Meijer,S.Guidet和H.Y.L.Tung編；PlenumPress,New York,1995。這些研究表明，通過稱作依賴細(xì)胞周期蛋白激酶的一類絲氨酸/蘇氨酸激酶來控制細(xì)胞周期的漸進(jìn)。這些酶包含(a)催化蛋白，利用ATP作為底物的稱作依賴細(xì)胞周期蛋白激酶(CDK)；和(b)調(diào)節(jié)蛋白，稱為細(xì)胞周期蛋白(cyclin)。不同的cyclin-CDK的結(jié)合控制如生長、DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂的發(fā)生。CDK類酶的一個重要成員是CDK2。已表明CDK2活性是哺乳動物細(xì)胞周期漸進(jìn)在G1/S邊界上所必須的。注射微量直接抗CDK2抗體能阻斷人二倍體成纖維細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的S階段。人的骨肉瘤細(xì)胞中CDK2顯性失活突變的表達(dá)具有類似的作用?？傊@些研究表明抑制細(xì)胞CDK2活性將防止細(xì)胞通過有絲分裂周期的發(fā)展并誘導(dǎo)在S階段前生長的停止。與這種觀點相一致，用olomoucine(2-(羥基乙基氨基)-6-芐基氨基-9-甲基嘌呤)進(jìn)行的體外研究表明它是CDK2的一種特異性抑制劑，其IC50大約為2.1μg/ml,J.Vesely等人，Eur.J.Biochem 224,771-786(1994),L.Meijer“Chemical Inhibitors of Cyclin-Dependent Kinases”,351-356頁，在“Progress in Cell Cycle Reserch，第1卷，L.Meijer,S.Guidet和H.Y.L.Tung編；Plenum Press,New York,1995”中。在使用哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物的體內(nèi)研究中顯示olomoucine在大約50μg/ml濃度時抑制細(xì)胞增殖。
在本發(fā)明中，我們開發(fā)了一些生物活性明顯比olomoucine強(qiáng)的化合物。在使用哺乳動物細(xì)胞的體內(nèi)研究中顯示本發(fā)明公開的化合物以明顯低于olomoucine的濃度抑制細(xì)胞增殖。
近來，在研究刺激人的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中反映了IκB-α激酶的活性(Bennett等(1996),J.Biol.Chem 271,19680-19688)。確定本發(fā)明的某些化合物作為強(qiáng)的和特異的IκB-α激酶抑制劑防止體內(nèi)和體外誘導(dǎo)NF-κB激活和細(xì)胞因子的合成。雜二聚體轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活是一個復(fù)雜的過程。在未受刺激的細(xì)胞中，NF-κB(p50/p65)雜二聚體位于胞質(zhì)溶膠中，在那里與抑制劑亞單位IκB-α復(fù)合，IκB-α與NF-κB結(jié)合，屏蔽其核定位信號并防止向核易位。細(xì)胞受各種信號(如脂多糖)刺激時，IκB-α通過蛋白酶體快速磷?；我换?uniquitinated)和降解。降解的IκB-α允許NF-κB易位到核中，在那里它激活各種炎癥反應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄。
這些觀察結(jié)果表明IκB-α激酶是一種很吸引人的研究目標(biāo)，用于鑒定一些抑制劑是否可用于治療那些需要激活NF-κB來誘導(dǎo)的炎癥疾病。
發(fā)明概要本發(fā)明的目的是提供能抑制依賴于細(xì)胞周期蛋白激酶2的2,6,9-三取代嘌呤化合物。
本發(fā)明的另一目的是提供用于抑制細(xì)胞增殖的2,6,9-三取代嘌呤化合物。
本發(fā)明也提供一種包含2,6,9-三取代嘌呤化合物和可藥用載體的藥物組合物。
本發(fā)明還提供一種抑制細(xì)胞增殖的方法，它包括給予需要該化合物的哺乳動物有效量2,6,9-三取代嘌呤化合物。
在一個實施方案中，本發(fā)明是具有下式結(jié)構(gòu)的2,6,9-三取代嘌呤組合物
其中X為氨基、氧代、硫代、或砜部分；R1為鹵素或R1′-X其中X為氨基、氧代、硫代、或砜部分。優(yōu)選地X為氨基。
R1′為低級烷基、取代的低級烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)雜烷基、取代的環(huán)雜烷基、芳基、取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基、取代的雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、雜烷基、烷基鏈烯基、烷基鏈炔基、烷基環(huán)烷基、或烷基環(huán)雜烷基，每個取代基都具有1-20個碳原子；R2為氫、低級烷基、取代的低級烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基、取代的雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、雜烷基、烷基鏈烯基、烷基鏈炔基、烷基環(huán)烷基、或烷基環(huán)雜烷基；R3為鹵素、羥基、硫代、烷氧基、烷基硫代、低級烷基、-NR4R5或具有下式結(jié)構(gòu)的組成部分
其中m=1-3,n=1-3，并且o=1-3；Y=羰基、-NR4R5、羥基、硫羥、烷氧基、烷基硫代，并且其中R4和R5各(獨立地)選自氫、代級烷基、取代的低級烷基、烷氧基、氨基、酰氨基、羧基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)基、環(huán)雜烷基、取代的環(huán)雜烷基、酰基、芳基、取代的芳基、芳氧基、雜芳基、取代的雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、烷基鏈烯基、烷基鏈炔基、烷基環(huán)烷基、烷基環(huán)雜烷基或氰基；具有1-20個碳原子，并且優(yōu)選2-6個碳原子。此外，當(dāng)Y為羰基時，組合物中不存在R4′。R4″和R5″可以是單個氧原子并且R4和R5可以是單個氧原子。優(yōu)選地，R4和R5是具有2-6個碳原子相同或不同的取代低級烷基并且優(yōu)選CH2CH2OH、CH2HC(CH3)OH及其混合物。對于R1、R1′、R2、R3的范圍有某些限制，其中R3為2-羥基乙氨基并且R2為甲基，R1′-X不能是氨基、3-甲基-2-丁烯基氨基、芐氨基或3-羥基芐氨基。當(dāng)R3為2-羥基乙氨基并且R2為異丙基時，R1′-X不為芐氨基、3-羥基芐氨基或3-甲基丁氨基。當(dāng)R3為2-羥基乙氨基并且R2為2-羥乙基時，R1′-X不能為芐氨基。當(dāng)R3選自2-丙醇-2-甲氨基和2-二甲基氨基乙氨基并且R2為甲基時，R1′-X不能為芐氨基。
在另一實施方案中，本發(fā)明是一種抑制哺乳動物細(xì)胞增殖的方法，它包括給予哺乳動物治療有效量的權(quán)利要求1組合物。該方法用于治療細(xì)胞增殖快疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、狼瘡、Ⅰ型糖尿病、多發(fā)性硬化、癌癥、再狹窄宿主移植疾病和痛風(fēng)。
在另一實施方案中，本發(fā)明是藥物組合物，它包含上述和一種或多種可藥用賦形劑混合的組合物。
在另一實施方案中，本發(fā)明是用于治療人類、動物和植物真菌感染的組合物。
附圖的說明

圖1是用鹽水治療和用實施例2制備的化合物3治療的鼠頸動脈的平均新內(nèi)膜面積圖，其中，非陰影條形圖代表未進(jìn)行治療的頸動脈截面而陰影條形圖中代表經(jīng)治療的頸動脈截面。
本發(fā)明實施方案的說明本發(fā)明涉及具有下式結(jié)構(gòu)的2,6,9-三取代嘌呤化合物；
其中R1為鹵素或R1′-X其中X為氨基、氧代、硫代、或砜部分。優(yōu)選地X為氨基。
R1′為低級烷基、取代的低級烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)雜烷基、取代的環(huán)雜烷基、芳基、取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基、取代的雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、雜烷基、烷基鏈烯基、烷基鏈炔基、烷基環(huán)烷基、或烷基環(huán)雜烷基，每個取代基都具有1-20個碳原子；R1′優(yōu)選為CH2-芳基、CH2-取代的芳基、4-甲氧基芐基、4-氯芐基、4-硝基芐基、4-(2-吡啶基)芐基、芳基、取代的芳基、3-硫代甲氧基苯基或4-硫代甲氧基苯基。
R2可以為氫、低級烷基、取代的低級烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基、取代的雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、取代的雜芳烷基、雜烷基、烷基鏈烯基、烷基鏈炔基、烷基環(huán)烷基、或烷基環(huán)雜烷基，其中的碳?xì)浠衔锞哂?-20個碳原子。R2優(yōu)選為異丙基。
R3為氫、羥基、硫代、烷氧基、烷基硫代、低級烷基、-NR4R5或具有下式結(jié)構(gòu)的組成部分
其中m=1-3,n=1-3，o=1-3；Y=羰基、-NR4R5、羥基、硫羥、烷氧基、烷基硫代，并且其中R4和R5各自選自氫、低級烷基、取代的低級烷基、烷氧基、氨基、酰氨基、羧基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)基、環(huán)雜烷基、取代的環(huán)雜烷基、?；?、芳基、取代的芳基、芳氧基、雜芳基、取代的雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、烷基鏈烯基、烷基鏈炔基、烷基環(huán)烷基、烷基環(huán)雜烷基或氰基，它們具有1-20個碳原子，并且優(yōu)選2-6個碳原子。此外，當(dāng)Y為羰基時，組合物中不存在R′4。R4″和R5″可以是單個氧原子并且R4和R5可以是單個氧原子。優(yōu)選地，R4和R5是具有2-6個碳原子的相同或不同的取代低級烷基，包括-CH2CH2OH和-CH2HC(CH3)OH。
對于R1、R1′、R2和R3的范圍有某些限制。當(dāng)R3為2-羥基乙氨基并且R2為甲基，R1′-X不能是氨基、3-甲基-2-丁烯基氨基、芐氨基或間-羥基芐氨基。當(dāng)R3為2-羥基乙氨基并且R2為異丙基時，R1′-X不為芐氨基、間-羥基芐氨基、或3-甲基丁氨基。當(dāng)R3為2-羥基乙氨基并且R2為2-羥乙基時，R1′-X不能為芐氨基。當(dāng)R3為2-丙醇-2-甲氨基或2-二甲基氨基乙氨基并且R2為甲基時，R1′-X不能為芐氨基。
下面是本文所使用的某些術(shù)語的定義。
“鹵素”是指氟、溴、氯和碘原子。
“羥基”是指-OH基。
“硫羥”或“巰基”是指-SH基。
“低級烷基”是指環(huán)狀、直鏈或支鏈、1-10個碳原子的烷基。該術(shù)語可進(jìn)一步解釋為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基(或2-甲基丙基)、環(huán)丙基甲基、異戊基、正戊基、己基等。
“取代的低級烷基”是指剛剛描述的低級烷基，它包括一個或多個基團(tuán)如羥基、硫羥基、烷基硫羥基、鹵素、烷氧基、氨基、酰氨基、羧基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)基、環(huán)雜烷基、取代的環(huán)雜烷基、?；Ⅳ然?、芳基、取代的芳基、芳氧基、雜芳基、取代的雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、烷基鏈烯基、烷基鏈炔基、烷基環(huán)烷基、烷基環(huán)雜烷基、氰基。這些基團(tuán)可以連接到低級烷基部分的任何碳原子上。
“烷基鏈烯基”是指-R-CR′=CRR，其中R為低級烷基或取代的低級烷基、R′、R,R可獨立地為氫、鹵素、低級烷基、取代的低級烷基、?；⒎蓟?、取代的芳基、雜芳基或在此所述的取代的雜芳基。
“烷基鏈炔基”是指-RC≡CR′其中R為低級烷基或取代的低級烷基，R′為氫、低級烷基、取代的低級烷基、酰基、芳基、取代的芳基、雜芳基、或取代的在此所述的雜芳基。
“烷氧基”代表-OR，其中R為低級烷基、取代的低級烷基、酰基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、雜烷基、雜芳烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)雜烷基、或取代的環(huán)雜烷基。
“烷基硫代”代表-SR,-S(O)n=1-2-R，其中R為低級烷基、取代的低級烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基或取代的芳烷基。
“?；贝?C(O)R，其中R為氫、低級烷基、取代的低級烷基、芳基、取代的芳基等。
“芳氧基”代表-OAr，其中Ar為芳基、取代的芳基、雜芳基或在此所述的取代的雜芳基。
“氨基”代表NRR′，其中R和R′可獨立地為氫、低級烷基、取代的低級烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基或取代的雜芳基或?；?。
“酰氨基”代表-C(O)NRR′其中R和R′可獨立地為氫、低級烷基、取代的低級烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的在此所述的雜芳基。
“羧基”代表-C(O)OR，其中，R為氫，低級烷基、取代的低級烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基和在此所述的取代的雜芳基。
“芳基”是指至少具有一個芳環(huán)(例如苯基或二苯基)或多個稠合環(huán)，其中至少一個環(huán)為芳環(huán)(例如1,2,3,4-四氫萘基，萘基，蒽基或菲基)的芳族碳環(huán)基。
“取代的芳基”是指未取代或由一個或多個功能基取代的芳基，所述取代基如鹵素、低級烷基、低級烷氧基、烷基硫代、乙炔基、氨基、酰氨基、羧基、羥基、芳基、芳氧基、雜環(huán)基、雜芳基、取代的雜芳基、硝基、氰基、硫羥基、磺酰氨基等。
“雜環(huán)基”是指飽和的、不飽和的或芳族碳環(huán)基，具有一個環(huán)(例如嗎啉代、吡啶基或呋喃基)或多個稠合環(huán)(例如萘萘吡啶基、喹喔啉基、喹啉基、中氮茚基或苯并[b]噻吩基)并且在環(huán)內(nèi)至少具有一個雜原子如N、O或S，它可以是未取代的或取代的，取代基團(tuán)如鹵素、低級烷基、代級烷氧基、烷基硫代、乙炔基、氨基、酰氨基、羧基、羥基、芳基、芳氧基、雜環(huán)基、雜芳基、取代的雜芳基、硝基、氰基、硫羥基、磺酰氨基等。
“雜芳基”是指一個雜環(huán)，其中至少一個雜環(huán)是芳環(huán)。
“取代的雜芳基”是指由一個或多個功能基一取代或多取代的雜環(huán)，其中所述功能基如鹵素、低級烷基、低級烷氧基、烷基硫代、乙炔基、氨基、酰氨基、羧基、羥基、芳基、芳氧基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、雜芳基、取代的雜芳基、硝基、氰基、硫羥基、磺酰氨基等。
“芳烷基”是指-R-Ar，其中Ar為芳基并且R為低級烷基或取代的低級烷基。芳基可以是未取代的或由基團(tuán)取代的，取代基團(tuán)如鹵素、低級烷基、低級烷氧基、烷基硫代、乙炔基、氨基、酰氨基、羧基、羥基、芳基、芳氧基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、雜芳基、取代的雜芳基、硝基、氰基、硫羥基、磺酰氨基等。
“雜烷基”是指-R-Het，其中Het為雜環(huán)基并且R為低級烷基。雜烷基可以是未取代的或由基團(tuán)取代的，取代基團(tuán)如鹵素、低級烷基、低級烷氧基、烷基硫代、乙炔基、氨基、酰氨基、羧基、芳基、芳氧基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、雜芳基、取代的雜芳基、硝基、氰基、硫羥基、磺酰氨基等。
“雜芳烷基”是指-R-HetAr，其中HerAr為雜芳基并且R為低級烷基或取代的低級烷基。雜芳烷基可以是未取代的或由基團(tuán)取代的，取代基團(tuán)如鹵素、低級烷基、取代的低級烷基、烷氧基、烷基硫代、乙炔基、芳基、芳氧基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、雜芳基、取代的雜芳基、硝基、氰基、硫羥基、磺酰氨基等。
“環(huán)烷基”是指含3-15個碳原子的二價環(huán)或多環(huán)烷基。
“取代的環(huán)烷基”是指含一個或多個取代基的環(huán)烷基，所述取代基如鹵素、低級烷基、取代的低級烷基、烷氧基、烷基硫代、乙炔基、芳基、芳氧基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、雜芳基、取代的雜芳基、硝基、氰基、硫羥基、磺酰氨基等。
“環(huán)雜烷基”是指環(huán)烷基，其中一個或多個環(huán)上碳原子被雜原子(例如N、O、S或P)取代。
“取代的環(huán)雜烷基”是指含一個或多個取代基的環(huán)雜烷基，所述取代基如鹵素、低級烷基、低級烷氧基、烷基硫代，乙炔基、氨基、酰氨基、羧基、羥基、芳基、芳氧基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、雜芳基、取代的雜芳基、硝基、氰基、硫羥基、磺酰氨基等。
“烷基環(huán)烷基”代表-R-環(huán)烷基，其中環(huán)烷基為環(huán)烷基并且R為低級烷基或取代的低級烷基。環(huán)烷基可以是未取代的或由取代基取代的，所述取代基如鹵素、代級烷基、低級烷氧基、烷基硫代、乙炔基、氨基、酰氨基、羧基、羥基、芳基、芳氧基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、雜芳基、取代的雜芳基、硝基、氰基、硫羥基、磺酰氨基等。
“烷基環(huán)雜烷基”代表-R-環(huán)雜烷基，其中R為低級烷基或取代的低級烷基。環(huán)雜烷基可以是未取代的或由取代基取代的，所述取代基如鹵素、低級烷基、低級烷氧基、烷基硫代、氨基、酰氨基、羧基、乙炔基、羥基、芳基、芳氧基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、雜芳基、取代的雜芳基、硝基、氰基、硫羥基、磺酰氨基等。
如果本發(fā)明最終2,6,9-三取代嘌呤化合物含堿性基團(tuán)，那么，可制備該組合物的酸加成鹽。按照標(biāo)準(zhǔn)方法，在適宜的溶劑中，從母體化合物和過量的酸，如包括但不限制于鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、馬來酸、琥珀酸或甲磺酸制備本發(fā)明化合物所酸加成鹽。鹽酸鹽形式是特別有用的。
如果最終2,6,9-三取代嘌呤化合物含酸性基團(tuán)，那么，可制備該組合物的陽離子鹽。典型地，將酸性母體化合物用過量的堿性試劑處理，所述堿性試劑包括但不限制于含適宜的陽離子如包括但不限制于Na+,K+,Ca2+和NH4+的氫氧化物、碳酸鹽或醇鹽。某些化合物形成內(nèi)鹽或兩性離子，它們也是適宜的。
本發(fā)明化合物用于抑制哺乳動物包括人的細(xì)胞增殖。例如，2,6,9-三取代嘌呤用于治療自身免疫性疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、狼瘡、Ⅰ型糖尿病、多發(fā)性硬化等，治療癌癥、心血管疾病如再狹窄、宿主-移植物疾病、痛風(fēng)、多囊性腎病和其它發(fā)病機(jī)理涉及異常性細(xì)胞增殖的增殖性疾病。
治療方法包括通過非腸道或口服一種有效量的本發(fā)明所選擇的化合物，優(yōu)選分散在可藥用載體中。本發(fā)明組合物的治療有效量通常為大約0.01-大約100mg/kg，不過，本領(lǐng)域技術(shù)人員將依賴給藥途徑和病人的年齡和疾病狀況很容易地確定。對于急性和慢性疾病來說，可以將本發(fā)明組合物的治療有效量以每天1-10次或多次給予。當(dāng)按照本發(fā)明服用本發(fā)明化合物時，沒有不適宜的毒理學(xué)作用。
本發(fā)明化合物也用作抗炎劑和抗真菌劑。因此，本發(fā)明組合物用于治療人、動物和植物的炎癥和真菌感染。
包括本發(fā)明化合物，和/或其衍生物的藥物組合物可配制成用于非腸道給藥的溶液劑或凍干粉劑。粉劑可在使用前通過加入適宜的稀釋劑或其它可藥用載體再配制。如果以液體形式使用，優(yōu)選將本發(fā)明組合物配制成緩沖、等滲的水溶液。適宜的稀釋劑的實例為生理等滲鹽水溶液，標(biāo)準(zhǔn)5％葡萄糖水溶液和緩沖鈉或銨醋酸鹽溶液。該液體真菌適用于非腸道給藥，但也可以用于口服給藥。
可將賦形劑如聚乙烯吡咯烷酮、明膠、羥基纖維素、阿拉伯膠、聚乙二醇、甘露糖醇、氯化鈉、枸櫞酸鈉或其它任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的賦形劑加到含有本發(fā)明化合物的藥物組合物中?；蛘撸蓪⑺幬锝M合物包在膠囊中、壓片或制備成乳劑或糖漿劑用于口服給藥?？杉尤肟伤幱霉腆w或液體載體來增強(qiáng)或穩(wěn)定組合物，或者便于組合物的制備。液體載體包括但不限制于糖漿、花生油、橄欖油、甘油、鹽水、醇和水。固體載體包括但不限制于淀粉、乳糖、硫酸鈣二水合物、teffa alba、硬脂酸鎂或硬脂酸、滑石粉、果膠、阿拉伯膠、瓊脂或明膠。載體也可以包括緩釋物質(zhì)，如包括但不限制于單一的或與蠟混合的單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。固體載體的量可改變，但優(yōu)選每劑量單位大約20mg-大約1g。
用常規(guī)技術(shù)來確定藥物劑量，如對于片劑形式來說，所述技術(shù)包括但不限制于磨碾、混合、制粒和壓片(如果需要)；或者對于硬明膠膠囊形式來說，所述技術(shù)包括但不限制于磨碾、混合和填充。當(dāng)使用液體載體時，制劑將為糖漿、酏劑、乳劑或含水或不含水的懸乳液形式。該液體制劑可以直接給予或填充到軟明膠膠囊中。
下列實施例用于說明本發(fā)明。這些實施例不以任何形式限制本發(fā)明范圍，而用于顯示怎樣制備和使用本發(fā)明化合物。在實施例中，所有的溫度為攝氏度。RT代表室溫。
實施例1通過常規(guī)有機(jī)化學(xué)方法制備本發(fā)明化合物。在下列合成圖解中概括的反應(yīng)順序是用于合成本發(fā)明化合物的一般方法。將2,6-二氯嘌呤溶解在丁醇中并加入適宜的R1胺。加熱幾小時后，將反應(yīng)混合物冷卻，得到化合物1。向化合物1中加入氫化鈉，然后加入R2，并且分離得到化合物2。向化合物2中加入R3和N-甲基吡咯烷酮的溶液。將該混合物加熱適宜的時間，然后純化得到所需要的化合物。
按照上述方法制備以下化合物制備2-氯-6-(4-甲氧基芐氨基)嘌呤(1)將2,6-二氯嘌呤(4.06g,21.5mmol)懸浮在正丁醇(150ml)中并加入4-甲氧基芐胺(3.4ml,26mmol)。該溶液變澄清，幾分鐘后渾濁。將該溶液在120℃下加入2小時，然后冷卻。將正丁醇蒸發(fā)掉，然后將殘渣懸浮在水和乙醚的混合物中。加入2N NaOH(1.3ml,26mmol)溶液并將該溶液在過濾前攪拌10分鐘。將過濾出的沉淀用水和少量乙醚洗滌，然后真空干燥。將殘渣液體放置過夜，第二天收集得到更多的結(jié)晶并用乙醚洗滌。產(chǎn)率=71/％。制備2-氯-6-(4-甲氧基芐氨基)-9-異丙基嘌呤(2)將2-氯-6-(4-甲氧基芐氨基)嘌呤懸浮在無水DMF(5ml)中并用氫化鈉，60％懸浮液(82mg,2.06mmol)處理。將該懸浮液攪拌30分鐘，在該過程中，溶液變成澄清的黃/綠色。用5分鐘的時間加入2-吲哚丙烷(0.280ml,1.7當(dāng)量)并將得到的溶液攪拌2天。加入水并將溶液用乙酸乙酯提取。將有機(jī)層蒸發(fā)得到產(chǎn)品異丙基嘌呤(產(chǎn)量=508mg,89％)。制備2-二乙醇氨基-6-(4-甲氧基芐氨基)-9-異丙基嘌呤(3)將嘌呤(1.65g,4.98mmol)溶解在DMSO(12ml)和二乙醇胺(4ml)中，然后在140℃下加熱2-3天，然后在160℃下加熱1天。將該溶液冷卻并加入水飽和的丁醇(100ml)。然后在蒸發(fā)前，將該溶液用水(3×50ml)洗滌，得到棕色油狀物。將殘渣用硅膠色譜層析，用乙酸乙酰洗脫，然后用3％甲醇的乙酸乙酯液洗脫，得到產(chǎn)品(產(chǎn)量=730mg,37％)的淡黃色油狀物。產(chǎn)率=37％。1H-NMR(δCDCl3):7.29(brs,1H),7.25(d,2H),6.94(brs.1H),6.83(d.2H),5.43(brs.＜2H),4.63(brs.2H),4.53(m 1H),3.86(t.4H),3.76(m,7H),1.47(d6H).
表1鑒定按照本實施例所闡述的合成方法制備的本發(fā)明化合物。
表1通過實施例1方法制備的化合物
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<p>
實施例2該實施例描述了制備本發(fā)明化合物的方法。該實施例中所公開的合成方法僅僅是將實施例1中所公開的合成方法略加修改。
按照上述方法制備下列化合物。制備2,6-二氯-9-異丙基嘌呤(4)在室溫下,向0.67g 2,6-二氯嘌呤在5ml無水DMF的溶液中加入0.16g(1.1當(dāng)量)50％氫化鈉/油粉劑。當(dāng)停止放出氫氣時，將大量過量(2ml)的2-碘丙烷加到該陰離子溶液中。將該反應(yīng)溶液在室溫下攪拌3天。將反應(yīng)用30ml水驟冷并用乙酸乙酯(3×50ml)提取。將合并有機(jī)提取液并再用3×50ml水和20ml鹽水洗滌。將乙酸乙酯溶液用無水硫酸鎂干燥并蒸發(fā)。將該化合物在硅膠上，用己烷/乙酸乙酯混合物進(jìn)行各種梯度的閃式色譜層析并得到0.37g所需N-9產(chǎn)物(45)％和0.08gN-7異構(gòu)體(10％)。制備2-氯-6-苯胺基-9-異丙基嘌呤(5)將2,6-二氯-9-異丙基嘌呤(0.019g,0.081mmol)溶解在丁醇(0.5ml)中并加入苯胺(0.044ml,0.244mmol)。將反應(yīng)混合物加熱到120℃10小時，冷卻，用EtOAc稀釋并用水洗滌3次。將該混合物用MgSO4干燥并濃縮至灰白色固體。制備2-二乙醇氨基-6-(4-苯基苯胺基)-9-異丙基嘌呤(6)將67mg 2,6-二氯-N-9-異丙基嘌呤和100mg 4-苯基苯胺在1ml正辛醇中的溶液加熱至80℃24小時。真空除掉正辛醇并用1ml40％二乙醇胺的MDSO溶液代替。將該溶液在130℃下加熱48小時。將反應(yīng)物冷卻至室溫，然后用10ml水小時并接著用乙酸乙酯(3×30ml)提取。合并有機(jī)提取液并再用3×20ml水和10ml鹽水洗滌。將該乙酸乙酯溶液用無水硫酸鎂干燥并過濾，然后將溶劑蒸發(fā)。將65mg粗品從THF-乙醚溶液中結(jié)晶得到28mg純品(23％)。
下表2鑒定按照本實施例所闡述的合成方法制備的本發(fā)明化合物。
表2通過實施例2方法制備的化合物
實施例3該實施例描述了制備本發(fā)明化合物的方法。該實施例中所公開的合成方法僅僅是將實施例1中所公開的合成方法略加修改。
按照上述方法制備下列化合物制備2,6-二氫-9-異丙基嘌呤(4)在室溫下，將2,6-二氯嘌呤(5.00g,26.4mmol)懸浮在55ml無水DMF中并用氫化鈉處理，分次加入60％的分散液(1.27g,31.75mmol)。攪拌1小時后，加入2-碘丙烷(4.5ml,44.98mmol)，將反應(yīng)物攪拌2天。將反應(yīng)物傾入乙醚中并用飽和碳酸氫鈉洗滌1次，用水洗滌1次。將該混合物用無水硫酸鈉干燥并真空濃縮。將該濃縮液在硅膠上色譜層析，用10％丙酮的二氯甲烷溶液洗脫，得到所需N-9烷基化產(chǎn)物的白色固體，產(chǎn)率=47％。制備2-氯-6-(4-甲基巰基)苯胺基-9-異丙基嘌呤(5A)將2,6-二氯-9-異丙基嘌呤(0.15g,0.649mmol)溶解在正丁醇(4ml)中并加入4-(甲基巰基)苯胺(0.089ml,0.714mmol)和三乙胺(0.20ml,1.43mmol)。將反應(yīng)混合物在80℃下加熱過夜。將冷卻的反應(yīng)物用乙酸乙酯稀釋并在用無水硫酸鈉干燥前用1×1M HCl,1×飽和碳酸氫鈉，和1×鹽水洗滌并真空濃縮。將殘渣在硅膠上色譜層析并用2％甲醇的二氯甲烷液洗脫，得到所需產(chǎn)物的白色固體。產(chǎn)率=83％。制備2-二乙醇胺-6-(4-甲基巰基)苯胺-9-異丙基嘌呤(6A)將嘌呤(0.18g,539mmol)溶解在N-甲基吡咯烷酮(3ml)和二乙醇胺(1ml)中，然后在120℃下加熱過夜。將冷卻的反應(yīng)物傾入乙醚中并在用無水硫酸鈉干燥前用水洗滌3次并真空濃縮。將殘渣在硅膠上色譜層析，用5％甲醇的二氯甲烷液洗脫，得到所需產(chǎn)物的灰白色固體。產(chǎn)率=82％。
1H-NMR(δ,CDCl3):8.08(s,1H),7.58(d,2H),7.47(s,1H),7.18(d,2H),4.95(brs,＜2H),4.52(m,1H),3.94(m,4H),3.83(m,4H),2.43(s,3H),1.47(d,6H).制備4-(2-噻吩基)芐腈在與2,6-二氯-9-異丙基嘌呤反應(yīng)前，首先必須合成某些R1′基?？赏ㄟ^各種偶聯(lián)方法和有機(jī)合成領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它合成方法來合成這些基團(tuán)。
向耐壓管中加入4-溴芐腈(0.2g,1.10mmol)，四(三苯基膦)鈀(0)(0.127g,0.1當(dāng)量)和2-苯硫基硼酸(0.211g,1.65mmol)。將反應(yīng)物真空沖洗并用氮氣沖洗3次。沖洗后，將乙二醇二甲醚(5.5ml)和碳酸鈉水溶液(2.53ml,1M)加到該耐壓管中。然后，將該耐壓管密封并在80℃下加熱過夜。將冷卻的反應(yīng)物用乙醚稀釋并在用硫酸鈉干燥前用水洗滌2次，然后真空濃縮。將殘渣在硅膠上色譜層析，用10％乙酸乙酯/己烷洗脫得到所需產(chǎn)物的白色固體。產(chǎn)率=84％。制備4-(2-噻吩基)芐胺將4-(2-噻吩基)芐腈(0.086g,0.464mmol)溶解在無水四氫呋喃(1.6m)中，然后滴加氫化鋰鋁(0.46ml,0.464mmol,1M的THF液)。將反應(yīng)物在室溫下攪拌過夜。TCL(5％甲醇的二氯甲烷液)顯示仍然存在起始物質(zhì)。再加入1當(dāng)量LAH。1小時后，通過Fieser和Fieser方法通過將水(17.46μl),氫氧化鈉水溶液(17.46μl,15％的溶液)和水(52.37μl)按順序相繼加到反應(yīng)物中，將反應(yīng)物驟冷。然后將反應(yīng)物用乙醚和水稀釋并在用硫酸鈉干燥前用乙醚提取2次，然后真空濃縮。含粗品的殘渣不必進(jìn)一步純化。產(chǎn)率=89％。
下表3鑒定按照本實施例所闡述的合成方法制備的本發(fā)明化合物。
表3通過實施例3方法制備的化合物
實施例4該實施例描述了制備本發(fā)明化合物的方法。該實施例中所公開的合成方法僅僅是將實施例1中所公開的合成方法略加修改。
按照上述方法制備下列化合物。制備2-氫基-6-氯-9-甲基嘌呤(7)將2-氨基-6-氯嘌呤(1.08g,6.4mmol)懸浮在無水DMF(75ml)中并用氫化鈉的60％懸浮液(0.28g,7mmol)處理。在加入碘甲烷(0.44ml,7.06mmol)前，將該懸浮液攪拌15分鐘并將得到的黃色溶液攪拌1小時45分鐘。將固體過濾并在加入水之前，將濾液蒸發(fā)10分鐘。將得到的固體過濾并干燥過夜得到N-7和N-9烷基化產(chǎn)物的混合物。將殘留的母液放置過夜并在第二天收集得到更多的結(jié)晶并干燥。產(chǎn)率=77％。制備6-氯-2-(2-甲氧基乙酰氨基)-9-甲基嘌呤(8)將上述異構(gòu)體混合物溶解在二氯甲烷和吡啶(2當(dāng)量)中，然后用甲氧基乙酰氯(4當(dāng)量)處理。將反應(yīng)物在室溫下攪拌直至完全反應(yīng)。將反應(yīng)物蒸發(fā)并通過硅膠管過濾，用2％甲醇/二氯甲烷洗脫，然后用色譜純化，用2％甲醇/二氯甲烷洗脫，分離得到所需產(chǎn)物。產(chǎn)率=31％。
表4鑒定按照本實施例所闡述的合成方法制備的本發(fā)明化合物。
表4通過實施例4方法制備的化合物<
實施例5
該實施例描述了制備本發(fā)明化合物的方法。該實施例中所公開的合成方法僅僅是將實施例1中所公開的合成方法略加修改。
按照上述方法制備下列化合物。制備2-氯-6-(4-苯基芐基氨基)嘌呤(9)將2.6-二氯嘌呤(5.0g,26.45mmol)懸浮在正丁醇(50ml)中加入4-苯基芐胺(6.61g,29.1mmol)和三乙胺(4.1ml,29.1mmol)。將該溶液在120℃下加熱過夜然后冷卻。用過量的正丁醇將產(chǎn)物濾出并用100ml 1M HCl和200ml水洗滌沉淀。將該固體在70℃下真空干燥過夜，得到所需產(chǎn)物的淡黃色固體。產(chǎn)率=99％。制備2-二乙醇氨基-6-(4-苯基芐基氨基)嘌呤(10)將2-氯-6-(4-苯基芐基氨基)嘌呤(2.0g,5.96mmol)和二乙醇胺(11.4ml,119.2mmol)和N-甲基吡咯烷酮(10ml)一起加入并在120℃下加熱過夜。將冷卻的反應(yīng)物傾入二氯甲烷中并用水洗滌2次。將有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥并真空濃縮得到所需產(chǎn)物的淡綠色固體，將其在70℃烘箱中進(jìn)一步真空干燥2天。制備2-二乙醇氨基-6-(4-苯基芐基氨基)-9-(甲基嘌呤(11)將2-二乙醇氨基-6-(4-苯基芐基氨基)-9-甲基嘌呤(0.05g,0.124mmol)溶解在無水DMF中并用氫化鈉的60％懸浮液(5.5g,0.136mmol)處理1小時。加入碘甲烷90.009ml,0.148mmol)并將得到的溶液在室溫下攪拌過夜。將反應(yīng)物傾入乙醚中并在用無水硫酸鈉干燥前用飽和碳酸氫鈉洗滌2次并真空濃縮。將殘渣在硅膠上色譜層析，用5％甲醇的二氯甲烷液洗脫，得到產(chǎn)物的白色固體。產(chǎn)率=63％。
1H-NMR(δ,CDCl3):7.55(m,4H),7.41(m,4H),7.35(m,4H),6.4l(brs,＜1H),5.10(brs,＜2H),4.72(brs,2H),3.86(m,4H),3.74(m,4H),3.59(s,3H).
表5鑒定按照本實施例所闡述的合成方法制備的本發(fā)明化合物。
表5通過實施例5方法制備的混合物
實施例6在下列測試中評估本發(fā)明組合物。CDK2測定測定本發(fā)明組合物CKD2抑制活性。該測定系統(tǒng)(總體積50μl)包含50mMTris-Cl,pH 7.4,10mM MgCl2,5mM DTT,1μg組蛋白H1,30μMATP(1μCiγ32P標(biāo)記的ATP),10μgBSA和1ng純CDK2。在30℃下孵育30分鐘后，通過加入10μl10％TCA將反應(yīng)終止并將樣品在硝基纖維素濾紙上吸干。將這些濾紙在10％TCA中徹底洗滌并測定放射性。空白不含酶。為了確定本發(fā)明各種化合物的效力，將化合物以100-0.02μg/ml的濃度加到上述測定中。孵育30分鐘后，將測定管如上操作。在全部測定過程中，加入各種濃度的olomoucine并將其用作為一種標(biāo)準(zhǔn)的陽性對照。表6中所列出的IC50(酶)定義為50％抑制CDK2活性時所需要的化合物的濃度。細(xì)胞增殖測定將早期鼠主動脈平滑肌細(xì)胞(CV療法細(xì)胞庫)以每ml含5％加熱滅活牛血清的DME中含20,000個細(xì)胞的密度加到48孔盤(Falcon,ml/孔)中。將細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)孵化箱中孵化48小時。將培養(yǎng)基吸出并將各孔中再充滿新鮮的培養(yǎng)基。將本發(fā)明化合物以100-0.37μl/ml的濃度加入。孵化48小時后，將培養(yǎng)基吸出并將培養(yǎng)物用0.2ml鹽水和0.25μl含MTS(Cell Titer96含水的非放射活性的細(xì)胞增殖測定試劑盒，Catalog#G 5430,Promega,2800 Woods Hollow Road,Madison,WI 53711-5399)的phenozine甲磺酸鹽溶液。表6中所列出的IC50定義為50％抑制細(xì)胞增殖時所需要的化合物的濃度。加入各種濃度的olomoucine并將其作為標(biāo)準(zhǔn)的陽性對照。
表6本發(fā)明選擇性代表物的生物活性
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實施例7利用Murine Leukemia Model來評估本發(fā)明化合物的效力。MurineLeukemia Model是評估抗腫瘤劑中所使用的標(biāo)準(zhǔn)模型。經(jīng)CDF1鼠皮下注射L1210細(xì)胞(1×103個細(xì)胞/鼠)。24小時后，用各種劑量(ip)實施例1中化合物3的鹽水溶液處理這些鼠。在該研究中所使用的劑量方案列于下表7中。將化合物3每天或每隔一天給予鼠一次。對照鼠給予鹽水。7天后，停止給藥并監(jiān)測死亡率。
表7
<p>結(jié)果表明，給予化合物3的鼠比對照鼠存活時間長。
實施例8該實施例測定鼠頸動脈模型球囊血管成形術(shù)后，急性局部釋放實施例1中化合物3來減少新內(nèi)膜形成的作用。在該實施例中，利用Fogarty動脈栓子切除術(shù)導(dǎo)管，通過外科手術(shù)損傷成年雄性鼠(每個試驗組中n=10)左頸總動脈。損傷后立即用血管夾將該頸總動脈一分為二，由此建立未處理部分和處理部分。然后，將輸藥導(dǎo)管插入頸總動脈的遠(yuǎn)半端。輸藥后，將導(dǎo)管撤出并通過除掉血管夾和在關(guān)閉動脈前重新產(chǎn)生的血流來洗提少量的藥物。在采集頸總動脈前，讓動物恢復(fù)14天。將采集到的組織切開并將新內(nèi)膜區(qū)域數(shù)字化，用計算機(jī)求積系統(tǒng)測定。對于每個動物來說，未處理和處理部分各平均測定15次。
在圖1中可見該實施例的結(jié)果。按照圖1，將實施例1中化合物3用到受損的頸動脈中使得該頸動脈新內(nèi)膜區(qū)域減少大約88％，相比之下，單獨用鹽水處理的頸動脈新內(nèi)膜區(qū)域減少6％。
實施例9IκB-α激酶的測定測定本發(fā)明組合物IκB-α激酶的抑制活性。在這些試驗中所使用的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(HUVEC)購于Clonetics(SanDiego,CA)并在37℃組織培養(yǎng)孵化器中的內(nèi)皮細(xì)胞生長基質(zhì)中保存，所述基質(zhì)中補充了2％胎牛血清，10ng/ml人重組表皮生長因子，1μg/ml氫化可的松，50μg/ml慶大霉素，50ng/ml兩性霉素B和12μg/ml牛腦提取物。所有生長基質(zhì)和補充物購于Clonetics(San Diego,CA)。E.coli脂多糖(LPS)血清型0111:B4購于Sigma(Saint Louis,MI)。所有其它化學(xué)藥品為試劑純。細(xì)胞溶解產(chǎn)物的制備將單層(75cm2)HUVEC細(xì)胞用LPS(100ng/ml)處理5分鐘，然后快速除掉基質(zhì)并將該單層HUVEC細(xì)胞用冰冷PBS洗滌3次。將該細(xì)胞層刮到10mlPBS中并通過離心(3000rpm,5分鐘，4℃)使細(xì)胞成團(tuán)。通過在37℃渦流下，將細(xì)胞團(tuán)在0.2ml溶解緩沖劑(20mM HEPES,PH7.3,50mM NaCl,10mM MgCl2,1mM EDTA,1mM EGTA,1mM原釩酸鈉，10mMβ-甘油磷酸鹽，1mM苯甲基磺酰氟，1mM二硫蘇糖醇，0.5％NonidetP-40)中孵育15分鐘來制備細(xì)胞溶解產(chǎn)物。通過微量離心(10,000×g,15分鐘，4℃)從樣品中除掉細(xì)胞碎片并通過在溶解緩沖劑中加入100ml瓊脂糖4B的懸浮液，將上清液“預(yù)澄清”并在4℃下輕輕地混合1小時。通過微量離心將瓊脂糖4B顆粒除掉并將上清液等分和在80℃下貯存。固相IκB-α激酶的測定室溫下，在反應(yīng)緩沖劑(20mM HEPES，PH7.3，10mM MgCl2,15mMβ-甘油磷酸鹽，0.5mM原釩酸鈉，0.5mM EGTA)中，將1μg GST-IκB-α(與人器官的全長IκB-α相對應(yīng)(Santa CruzBiotechnology))和20μl50％谷胱甘肽S瓊脂糖4B(Pharmacia)一起孵育30分鐘。通過再懸浮和微量離心，將GST-IκB-顆粒配合物用0.5ml反應(yīng)緩沖劑洗滌3次。然后將在100μl反應(yīng)緩沖劑中的10μgHUVEC細(xì)胞溶解產(chǎn)物蛋白加到該GST-IκB-顆粒配合物中并將該混合物在4℃輕輕混合下孵育1小時。然后，將該顆粒配合物用含0.2MNaCl的反應(yīng)緩沖劑洗滌3次和用單一的反應(yīng)緩沖劑洗滌一次。最后，將該顆粒配合物懸浮在20μl含5μCi[y-32p]ATP(＞5000ci/mmol,New England Nuclear Corp.Boston,MA)的反應(yīng)緩沖劑中并在室溫下孵育15分鐘。通過加入10μlSDS-PAGE樣品緩沖劑并在用SDS-PAGE(10-20％梯度Readygel,BioRad)分離前煮沸3分鐘。在電泳后，將凝膠固定(50％甲醇10％乙酸)15分鐘，用蒸餾水洗滌3次，每次5分鐘并在干燥成膜用于放射性自顯影X-OMAT XAR-5 Kodak)之前，用5％甘油處理15分鐘。在凝膠中的激酶測定利用改良的先前所公開的方法(11,19,20)測定IκB-α同功酶的活性。簡而言之，按上文所述方法制備IκB-谷胱甘肽瓊脂糖4B顆粒配合物的復(fù)制樣品并通過在12％的15μg/mlGST-IκB-α存在下聚合的SDS-PAGE凝膠上電泳進(jìn)行分離。電泳之后，用50mM Tris-HClpH8.0、5mMB-氫硫基乙醇；20％異丙醇將凝膠輕輕洗滌兩次，每次30分鐘，以便除去SDS。然后通過在100ml 50mM Tris-HCl pH8.0、5mMβ-氫硫基乙醇；0.04％吐溫40中保溫45分鐘來使凝膠中的蛋白質(zhì)變性。之后，將凝膠切成兩半以獲得兩份相同的樣品。一半在10ml反應(yīng)緩沖液中培養(yǎng)而另一半在10ml含有10μg/ml的2-二乙醇氨基-6-(4-苯基苯氨基)-9-異丙基嘌呤(實施例2的化合物6)的10ml反應(yīng)緩沖液中在室溫下培養(yǎng)1小時，加入10μgCi[y-32P]ATP并且再在室溫下培養(yǎng)1小時。分別用100ml5％的三氯乙酸(其中含有1％的焦磷酸鈉)多次洗滌凝膠，每次15分鐘，直到1ml的洗滌溶液與本底放射活性接近。然后將凝膠干燥并進(jìn)行放射自顯影。制備2-二乙醇氨基-6-(4-苯基苯氨基)-9-異丙基嘌呤環(huán)氧化物活化的瓊脂糖6B親和性材料選擇冷凍干燥的環(huán)氧化物活化的瓊脂糖6B(PharmaciaLKB Piscataway,NJ)進(jìn)行偶合反應(yīng)，是由于其在含有羥基的配體和瓊脂糖上的環(huán)氧化物基團(tuán)之間具有形成醚鍵的能力，按制造商的說明書，將凝膠溶脹，將100mg的實施例2的化合物6溶解在1ml偶合溶液(1.2∶1v/v二甲基甲酰胺0.1N氫氧化鈉)中并在室溫和輕輕攪拌下與0.5ml膨脹的凝膠在pH10-11下混合72小時。在50℃溫度下，用1M乙醇胺將過量的反應(yīng)基團(tuán)阻滯4小時并將凝膠淤漿傾入1ml注射柱中。用三次交替的循環(huán)活化樹脂，即，各自為20柱體積的pH4.0(0.1M乙酸鹽、0.5M氯化鈉)和pH8.0(0.1M Tris-HCl、0.5M氯化鈉)緩沖液和20柱體積的反應(yīng)緩沖液(20mM HEPES,PH7.3,10mM MgCl2,15mMβ-甘油磷酸鹽，0.5mM原釩酸鈉，1mM EDTA,0.5mM EGTA)。在4℃下與含有0.5％疊氮化鈉的反應(yīng)緩沖液中儲存所得柱并在使用前按上文所述的低和高pH交替循環(huán)來再生。
活化的HUVEC細(xì)胞溶解產(chǎn)物(500μg蛋白質(zhì)在1ml反應(yīng)緩沖液中)連續(xù)5次通過CVT-1545瓊脂糖材料并儲存通過的液體(未結(jié)合的材料)。然后用1ml反應(yīng)緩沖液將材料洗滌3次(洗滌液1-3)，再用含有0.5M氯化鈉的反應(yīng)緩沖液洗滌3次(洗脫液1-3)。測定各樣品等分試樣(20μl到1ml)在GST-IκB-瓊脂糖顆粒配合物下的磷?；哪芰Σ⑼ㄟ^SDS-PAGE按上文所述方法來分析。富含IκB-α激酶親和性的測定由親和性材料獲得的大量0.5M氯化鈉洗脫液用作進(jìn)行IκB-α激酶濾過測定的酶原。每個反應(yīng)物在20μl反應(yīng)緩沖液中都含有富含IκB-α激酶(1μg蛋白質(zhì))、10ngGST-IκB-α激酶和0.5μCi[y-32p]ATP(＞5000Ci/mmol,New England Nuclear Corp,Boston,MA)的親和性。反應(yīng)物在室溫下培養(yǎng)15分鐘并通過加入20μl0.5M EDTA中止反應(yīng)。將反應(yīng)混合物點在磷酸纖維素盤(Gibco BRL Life Technologies,Gaithersburg,MD)并在輕輕振搖下用0.15M磷酸洗滌濾液三次15分鐘(用300ml0.15M磷酸洗滌多達(dá)10個濾液)。洗滌3次之后，將濾液空氣干燥，加到閃爍液中并通過液體閃爍光譜測定法測定。電泳流動性位移測定使用高鹽緩沖液提取方法制備核提取物。通過在37℃下用T4多核苷酸激酶培養(yǎng)1小時，用5μCi[y-32P]ATP(＞5000Ci/mmol,New England Nuclear Corp,Boston,MA)標(biāo)記10pmol雙股NF-κB共有基序的寡核苷酸(5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’,Promega)。未結(jié)合的核苷酸通過使反應(yīng)混合物經(jīng)過1ml交聯(lián)葡聚糖G-5-spin柱來除去。結(jié)合測定在室溫下進(jìn)行1小時，其組成為10μg核提取物、1μg鮭精子DNA、和5×104cpmd的在50倍未標(biāo)記的寡核苷酸存在和不存在下32p標(biāo)記的共有基序的寡低聚核苷酸。通過8％非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳解析DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，凝膠在濾紙上干燥并通過放射自顯影法顯色。
權(quán)利要求
1．具有下式結(jié)構(gòu)的2,6,9-三取代嘌呤組合物
R1為鹵素或R1’-X其中X為氨基、氧代、硫代、或砜部分。R1’為低級烷基、取代的低級烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)雜烷基、取代的環(huán)雜烷基、芳基、取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基、取代的雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、雜烷基、烷基鏈烯基、烷基鏈炔基、烷基環(huán)烷基、或烷基環(huán)雜烷基，每個取代基都具有1-20個碳原子；R2為氫或選自下列基團(tuán)的碳?xì)浠衔?，所述基團(tuán)包括低級烷基、取代的低級烷基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、雜環(huán)基、雜芳基、取代的雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、雜烷基、烷基鏈烯基、烷基鏈炔基、烷基環(huán)烷基、或烷基環(huán)雜烷基，其中，各碳?xì)浠衔锞哂?-20個碳原子；R3為鹵素、羥基、硫代、烷氧基、烷基硫代、低級烷基、-NR4R5或具有下式結(jié)構(gòu)的組成部分
其中m=1-3,n=1-3，并且o=1-3；Y=羰基、-NR4R5，羥基、硫羥、烷氧基、烷基硫代，并且其中R4和R5各自為氫、或選自下列基團(tuán)的烴，所述基團(tuán)包括低級烷基、取代的低級烷基、烷氧基、氨基、酰氨基、羧基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)基、環(huán)雜烷基、取代的環(huán)雜烷基、?；⒎蓟?、取代的芳基、芳氧基、雜芳基、取代的雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、烷基鏈烯基、烷基鏈炔基、烷基環(huán)烷基、烷基環(huán)雜烷基或氰基；其中各烴具有1-20個碳原子，其中當(dāng)Y為羰基時，組合物中不存在R’4,R4”和R5”可以是單個氧原子，R4和R5可以是單個氧原子，并且其中當(dāng)R3為2-羥基乙氨基和R2為甲基時，R1’-X不是氨基、3-甲基-2-丁烯基氨基、芐氨基或間-羥基芐氨基，當(dāng)R3為2-羥基乙氨基并且R2為異丙基時，R1’-X不為芐氨基、間-羥基芐氨基或3-甲基丁氨基，當(dāng)R3為2-羥基乙氨基并且R2為2-羥乙基時，R1’-X不為芐氨基并且當(dāng)R3選自2-丙醇-2-甲氨基和2-二甲基氨基乙氨基并且R2為甲基時，R1’-X不為芐氨基。
2．權(quán)利要求1的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中X為氨基。
3．權(quán)利要求1的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R3為具有下式結(jié)構(gòu)的組成部分
其中m=1-3、n=1-3、o=1-3、Y=羰基、-NR4R5、羥基、硫羥基、烷氧基、烷基硫代，并且其中R4和R5各自選自氫、低級烷基、取代的低級烷基、烷氧基、氨基、酰氨基、羧基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)基、環(huán)雜烷基、取代的環(huán)雜烷基、?；?、芳基、取代的芳基、芳氧基、雜芳基、取代的雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、烷基鏈烯基、烷基鏈炔基、烷基環(huán)烷基、烷基環(huán)雜烷基或氰基，其中，當(dāng)Y為羰基時，組合物中不存在R’4,R4”和R5”可以是單個氧原子并且R4和R5可以是單個氧原子。
4．權(quán)利要求3的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R1’選自芳烷基和雜芳烷基。
5．權(quán)利要求3的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R1’選自芳烷基、未取代的吡啶基烷基和取代的吡啶基烷基并且其中R2選自低級烷基、取代的低級烷基和烷基環(huán)烷基。
6．權(quán)利要求3的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R1’選自芳基、雜環(huán)基、雜芳基、取代的雜芳基和取代的芳基。
7．權(quán)利要求3的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R1’選自芳基、未取代的吡啶基、取代的吡啶基和取代的芳基，并且R2選自低級烷基、取代的低級烷基和烷基環(huán)烷基。
8．權(quán)利要求2的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R3是-NR4R5，其中R4和R5各自選自氫、低級烷基、取代的低級烷基、烷氧基、氨基、酰氨基、羧基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、雜環(huán)基、環(huán)雜烷基、取代的環(huán)雜烷基、?；?、芳基、取代的芳基、芳氧基、雜芳基、取代的雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、烷基鏈烯基、烷基鏈炔基、烷基環(huán)烷基、烷基環(huán)雜烷基或氰基。
9．權(quán)利要求8的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R1’選自芳烷基、取代的吡啶基烷基和未取代的吡啶基烷基，R2選自低級烷基、取代的低級烷基、環(huán)烷基和取代的環(huán)烷基，R4選自具有2-6個碳原子的低級烷基，并且R5選自氫、低級烷基、取代的低級烷基、芳基、取代的芳基、環(huán)烷基、芳基環(huán)烷基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、雜芳基、取代的雜芳基、雜烷基、雜芳烷基和取代的環(huán)烷基。
10．權(quán)利要求8的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R1’選自芳基、取代的芳基、吡啶基和取代的吡啶基，R2選自低級烷基、取代的低級烷基、環(huán)烷基、烷基環(huán)烷基和取代的環(huán)烷基，R4選自具有2-6個碳原子的低級烷基，并且R5選自氫、低級烷基、取代的低級烷基、芳基、取代的芳基、環(huán)烷基、芳基環(huán)烷基、雜環(huán)基、取代的雜環(huán)基、雜芳基、取代的雜芳基、雜烷基、雜芳烷基和取代的環(huán)烷基。
11．權(quán)利要求8的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R1’選自芳烷基、吡啶基烷基和取代的吡啶基烷基，R2選自低級烷基、取代的低級烷基和烷基環(huán)烷基并且R4和R5各自為取代的具有2-6個碳原子的低級烷基。
12．權(quán)利要求8的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R1’為CH2-芳基或CH2-取代的芳基，R2為低級烷基或取代的低級烷基，并且R4和R5各自為-CH2CH2OH,-CHR’CH2OH或-CH2CHR’OH，其中R’為氫或具有1-6個碳原子的烷基。
13．權(quán)利要求12的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R2為異丙基。
14．權(quán)利要求8的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R1’選自芳基、取代的芳基、吡啶基和取代的吡啶基，R2選自低級烷基、取代的低級烷基和烷基環(huán)烷基并且R4和R5各為取代的具有2-6個碳原子的低級烷基。
15．權(quán)利要求8的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R1’為芳基或取代的芳基，R2為低級烷基或取代的低級烷基，并且R4和R5各自為CH2CH2OH，-CHR’CH2OH或-CH2CHR’OH，其中R’為氫或具有1-6個碳原子的烷基。
16．權(quán)利要求15的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R2為異丙基。
17．權(quán)利要求8的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R1’為由鹵素、烷氧基、苯基、吡啶基或硝基取代的芐基，R2為異丙基，并且R4和R5各自為-CH2CH2OH。
18．權(quán)利要求8的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R1’為由鹵素、烷氧基、苯基、吡啶基或硝基取代的苯基，R2為異丙基，并且R4和R5各自為-CH2CH2OH。
19．權(quán)利要求8的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R1’為二苯基，R2為異丙基，并且R4和R5各自為-CH2CH2OH。
20．權(quán)利要求8的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R1’選自3-硫代甲氧基苯基、4-硫代甲氧基苯基、4-溴苯基、4-苯基芐基、4-甲氧基芐基、4-二苯基、3-甲氧基芐基、4-(2-噻吩基)芐基、4-(4-甲基)苯基芐基、4-(4-三氟甲基)苯基芐基、4-(4-次氮基)苯基芐基、4-(2-吡啶基)芐基、胡椒基、3-甲氧基芐基、4-氯芐基和4-硝基芐基，R2為異丙基，并且R4和R5都為CH2CH2OH。
21．權(quán)利要求20的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R1’為4-甲氧基芐基。
22．權(quán)利要求20的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R1’為4-苯基芐基。
23．權(quán)利要求20的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R1為4-甲氧基芐基。
24．權(quán)利要求20的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R1’為4-二苯基。
25．權(quán)利要求20的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R1’為3-甲氧基芐基。
26．權(quán)利要求20的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R1’為4-(2-噻吩基)芐基。
27．權(quán)利要求20的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R1’為4-(4-甲基)苯基芐基。
28．權(quán)利要求20的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R1’為4-(4-三氟甲基)苯基芐基。
29．權(quán)利要求20的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R1’為4-(4-次氮基)苯基芐基。
30．權(quán)利要求20的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R1’為4-(2-吡啶基)芐基。
31．權(quán)利要求20的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R1’為胡椒基。
32．權(quán)利要求20的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R1’為3-硫代甲氧基苯基。
33．權(quán)利要求20的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R1’為4-硫代甲氧基苯基。
34．權(quán)利要求20的2,6,9-三取代嘌呤組合物，其中R1’為4-溴苯基。
35．權(quán)利要求1組合物的陽離子鹽。
36．權(quán)利要求1組合物的酸加成鹽。
37．抑制哺乳動物細(xì)胞增殖的方法，它包括給所述哺乳動物以治療有效量的權(quán)利要求1組合物。
38．權(quán)利要求37的方法，其中治療有效量為大約0.001-大約100mg/kg哺乳動物。
39．權(quán)利要求37的方法，其中將組合物給患細(xì)胞增殖病的哺乳動物服用，所述細(xì)胞增殖病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、狼瘡、Ⅰ型糖尿病、多發(fā)性硬化、癌癥、再狹窄、宿主-移植物疾病和痛風(fēng)。
40．權(quán)利要求39的方法，其中細(xì)胞增殖病為再狹窄。
41．權(quán)利要求39的方法，其中細(xì)胞增殖病為癌癥。
42．權(quán)利要求39的方法，其中細(xì)胞增殖病為多囊性腎病。
43．權(quán)利要求39的方法，其中哺乳動物為人。
44．一種藥物組合物，含有權(quán)利要求1組合物和一種或多種藥用賦形劑。
45．權(quán)利要求43的藥物組合物，其中該藥物組合物為溶液劑形式。
46．權(quán)利要求43的藥物組合物，其中該藥物組合物為片劑形式。
47．用于治療人和哺乳動物真菌感染的抗真菌劑，它包含權(quán)利要求1的組合物。
全文摘要
用于抑制細(xì)胞增殖疾病和用作抗真菌劑的2,6,9－三取代嘌呤組合物。
文檔編號A61P25/00GK1231611SQ97198386
公開日1999年10月13日 申請日期1997年8月1日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月2日
發(fā)明者羅伯特·T·盧姆, 徹里·L·布盧姆, 理查德·麥克曼, 邁克爾·M·威克, 史蒂文·R·肖 申請人:Cv治療公司