專利名稱：用鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ抑制劑治療結(jié)構(gòu)性心臟病中的心肌功能障礙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明要求2001年10月1日提交、序列號為60/326,576和2001年10月8日提交、序列號為60/328,010的美國臨時申請的優(yōu)先權(quán)。此處將60/326,576和60/328,010臨時申請全文引入作為參考。
本發(fā)明是在美國國家衛(wèi)生部的HL03727和HL62494經(jīng)費資助下，得到政府的支持完成的。政府享有本發(fā)明中的某些權(quán)利。
背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及鈣調(diào)蛋白激酶II(CaMKII)的抑制。更具體而言，CaMKII的抑制可以治療或預(yù)防結(jié)構(gòu)性心臟病，例如，心肌梗塞后出現(xiàn)的收縮功能障礙，或者擴張性心肌病。
背景技術(shù)：
心肌梗塞是美國及全世界其它許多國家中具有顯著性的殘疾和死亡的主要原因，并且也是約2/3心力衰竭病例的原因。7某些引起疾病的事件(如心肌梗塞、未經(jīng)治療的高血壓、收縮蛋白的先天性突變)可以導致包括心腔室擴張在內(nèi)的常見心臟病表型，并減弱收縮功能(即減少心臟收縮期間由每個心室的射血分數(shù))從而導致心力衰竭的臨床綜合征。7擴張性心肌病包括兩種獨特的疾病實體。此處所用的擴張性心肌病包括缺血性心肌病，該病是以左心室擴張與收縮功能減弱為特征的疾病實體。當心肌梗塞后存活的未梗塞心肌的正常代償性肥厚不足時，便可能出現(xiàn)該病癥。7“擴張性心肌病”也可以包括在沒有心肌梗塞的情況下，由于心肌蛋白的遺傳異常而導致的心肌重量增加，收縮功能減弱。7擴張性心肌病受試者是由于心室擴張而導致心臟收縮性降低的受試者。因此，與存活的未梗塞心肌肥厚以補償梗塞心肌的受試者相比，擴張性心肌病和收縮功能障礙受試者的功能障礙是不同且更為嚴重的。此外，擴張性心肌病和收縮功能障礙受試者所患疾病不同于包括異常松弛在內(nèi)的其它心臟病(即心臟舒張功能障礙和心律失常)。
可用于心力衰竭的療法不足，因而需要新的治療方法。心臟對梗塞的反應(yīng)是通過殘存心肌的肥厚以盡量維持正常收縮。然而，當肥厚不足以補償時，結(jié)果是擴張性心肌病和減弱的收縮功能將導致心力衰竭和死亡。19盡管醫(yī)學療法在防止心肌梗塞后的心臟功能障礙和心力衰竭方面已取得重大進展，15這些問題卻仍然是一個重要且未解決的公共衛(wèi)生難題。
沒有一種針對擴張性心肌病的藥理學療法是有效或令人滿意的，許多受試者死亡或者在特定病例中需要進行心臟移植。目前，用于緩解心力衰竭受試者的心臟功能障礙并降低其死亡率的可利用藥理學療法可以被分為三個主要種類血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑、β腎上腺素能受體(βAR)拮抗劑和醛固酮拮抗劑。盡管死亡率降低了，與無心力衰竭的同年齡對照受試者相比，經(jīng)過這些藥物治療的受試者所承受的死亡風險仍然是顯著增加了。ACE抑制劑、11βAR拮抗劑4和(至少一種類型的)醛固酮受體拮抗劑12均可以顯著降低心肌梗塞后心臟功能障礙和心力衰竭的發(fā)病率并減輕發(fā)病程度。其它可利用的藥理學療法包括硝酸甘油、利尿劑、正性變力劑(強心劑)，以及腦利尿鈉肽(BNP)。后幾種藥劑可以緩解癥狀，但與心力衰竭受試者死亡率的降低無關(guān)。
ACE抑制劑與10％受試者出現(xiàn)的咳嗽現(xiàn)象有關(guān)，并且可以在雙側(cè)腎動脈狹窄或其它嚴重腎病的穩(wěn)定期間導致腎衰竭。7βAR拮抗劑則與陽痿和抑郁癥有關(guān)，并且忌用于哮喘受試者；此外，在βAR拮抗劑的起始作用下，受試者可能進一步出現(xiàn)惡化的心力衰竭、低血壓、心動過緩、心傳導阻滯，以及疲勞。7醛固酮受體拮抗劑則會引發(fā)10％男性受試者顯著的高血鉀癥和令人痛苦的男性乳房發(fā)育癥。7、12未被證實有利于降低死亡率的藥劑也與諸多難題有關(guān)；最值得注意的是不斷發(fā)現(xiàn)許多強心劑雖然改善了癥狀，但實際上卻很可能通過引發(fā)致命的心律失常而提高了死亡率。7與之相比，目前已知的是，CaMKII抑制可以減少動物模型的心律失?，F(xiàn)象，20、21因而代表了一種可以增強心臟功能卻不加重心律失常的新方法。目前可利用的藥理學療法無效且受限于其顯著的有害副作用，因此具有改良功效且較少嚴重副作用的新療法的進展便成為一個重要的公共衛(wèi)生目標。
鈣調(diào)蛋白激酶II是存在于心臟中，當心臟細胞內(nèi)的Ca2+濃度提高時便被激活，并與結(jié)合了Ca2+的蛋白質(zhì)鈣調(diào)蛋白結(jié)合的一種酶。3CaMKII活性在嚴重心肌病受試者體內(nèi)可能提高，但CaMKII卻從未引起心力衰竭情況中的擴張性心肌病或收縮退化。
本發(fā)明提供了通過抑制CaMKII改善(提高)心肌收縮功能，以治療擴張性心肌病和心力衰竭的方法。本發(fā)明進一步提供了通過選擇性CaMKII抑制肽AC3-I的轉(zhuǎn)基因過表達，實現(xiàn)針對心臟的CaMKII抑制的小鼠模型。因此，該AC3-I轉(zhuǎn)基因小鼠是一種新的可以檢驗心臟疾病中慢性CaMKII抑制效果的重要工具。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種治療或預(yù)防受試者心肌梗塞后的心肌功能障礙的方法，該方法包括給予受試者有效量的鈣調(diào)蛋白激酶II(CaMKII)抑制劑，給予該抑制劑可以改善受試者心肌梗塞后的心肌收縮功能。
本發(fā)明提供了一種在被診斷患有擴張性心肌病或其它結(jié)構(gòu)性心臟病的受試者中，治療或預(yù)防出現(xiàn)在擴張性心肌病或其它結(jié)構(gòu)性心臟病(如末期心瓣膜疾病)中的心肌功能障礙的方法，該方法包括給予受試者有效量的CaMKII抑制劑，給予該抑制劑可以治療或預(yù)防受試者的擴張性心肌病或其它結(jié)構(gòu)性心臟病。
本發(fā)明提供了一種在被診斷患有擴張性心肌病的受試者中，治療或預(yù)防出現(xiàn)在擴張性心肌病中的心肌功能障礙的方法，該方法包括給予受試者有效量的CaMKII抑制劑，給予該抑制劑可以治療或預(yù)防受試者的擴張性心肌病或其它結(jié)構(gòu)性心臟病。
本發(fā)明提供了一種在被診斷患有擴張性心肌病的受試者中，提高其心肌收縮性的方法，該方法包括給予受試者有效量的CaMKII抑制劑，給予該抑制劑可以提高受試者的心肌收縮性。
本發(fā)明進一步提供了一種在被診斷患有心肌梗塞后的心功能障礙和/或收縮性降低的受試者中，提高其心肌收縮性的方法，該方法包括給予受試者有效量的CaMKII抑制劑，給予該抑制劑可以提高受試者的心肌收縮性。
本發(fā)明進一步提供了一種在被診斷患有心肌梗塞后的心肌收縮性降低的受試者中，提高其心肌收縮性的方法，該方法包括給予受試者有效量的CaMKII抑制劑，給予該抑制劑可以提高受試者的心肌收縮性。
本發(fā)明提供了鑒定可以治療結(jié)構(gòu)性心臟病的化合物的方法，該方法包括a)測定患有結(jié)構(gòu)性心臟病的動物的心臟收縮性；b)將該化合物給予步驟a)中的動物；c)測定步驟b)中動物的心臟收縮性；并檢測與步驟a)中動物的心臟收縮性相比，步驟b)中動物的心臟收縮性的增加，對心臟收縮性增加的檢測鑒定出可以治療結(jié)構(gòu)性心臟病的化合物。
本發(fā)明提供了一種治療受試者結(jié)構(gòu)性心臟病的方法，該方法包括給予受試者有效量的通過本發(fā)明方法鑒定的化合物。
本發(fā)明提供了一種表達編碼CaMKII抑制劑的核酸的轉(zhuǎn)基因動物。
本發(fā)明也提供了一種表達編碼一種肽的核酸的轉(zhuǎn)基因動物，該肽包括被稱為AC3-C的SEQ ID NO8的肽。
本發(fā)明進一步提供了一種雙重轉(zhuǎn)基因動物，該動物可以表達編碼CaMKII抑制劑的核酸，并表達編碼鈣調(diào)磷酸酶的核酸。
附圖簡述

圖1.CaMKI、II和IV，以及針對本研究工程化的AC3-I和AC3-C轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)表達的CaMKII抑制肽和對照肽的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)圖示。CaMKII和IV均具有一個由CaM-結(jié)合區(qū)和自抑制(AI)區(qū)構(gòu)成的調(diào)節(jié)域(陰影矩形)。CaMKII的CaM結(jié)合區(qū)(296-309，根據(jù)CaMKII編號，并由斜體字標記)與CaMKIV中的CaM結(jié)合區(qū)非常相似(相同的氨基酸下有劃線)，并且針對CaMKII中的CaM結(jié)合序列的抑制肽同樣地抑制CaMKIV的活化作用17。AC3-I是根據(jù)以Thr286(標有箭頭)為中心的CaMKII的AI區(qū)建立的，并且CaMKII和CaMKIV中的AI區(qū)是不同的。CaMKI的CaM結(jié)合區(qū)或AI區(qū)均不與CaMKII或IV同源，但是，與AI區(qū)形成對比的是，針對CaMKII或IV的CaM結(jié)合區(qū)的抑制肽仍然可以抑制CaMKI，因為CaM結(jié)合域通常共有一個螺旋結(jié)構(gòu)，卻往往缺乏一級序列同源性。13圖2.A-E.AC3-I小鼠具有正常心臟大小和收縮功能。A和B圖中，在AC3-I小鼠和野生型(WT)同窩出生小鼠對照之間，心臟舒張期(A)或收縮期(B)的超聲心動圖左心室尺寸無明顯差異。C和D圖中，在AC3-C小鼠和WT同窩出生小鼠對照之間，心臟舒張期(C)或收縮期(D)的室間隔厚度無差異。E圖中，AC3-I和基線的WT同窩出生小鼠對照之間，左心室的射血分數(shù)縮短無差異。所有圖示中，空白柱為WT，陰影柱為AC3-I轉(zhuǎn)基因(TG)。所有圖示中，各個種系編號(標注于圖E中)中對應(yīng)的研究小鼠數(shù)量(n)均相同。
圖3A-B.與野生型(WT)同窩出生小鼠對照相比，AC3-I小鼠具有顯著降低的心臟CaMKII活性(A)，以及在心肌梗塞外科手術(shù)后顯著較好的左心室射血分數(shù)縮短(B)。CaMKII活性測定獲得自完整心臟組織勻漿物。
圖4.通過GFP蛋白質(zhì)印跡法確定AC3-I和AC3-C小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)基因表達。括號中標示的種系編號表示蛋白質(zhì)印跡和相應(yīng)的定量磷光體成像結(jié)果中的特性(根據(jù)AC3-I5系標準化數(shù)據(jù))。所有轉(zhuǎn)基因小鼠的遺傳特性均通過DNA印跡分析而得以證實，但AC3-I種系3則不表達轉(zhuǎn)基因。
圖5A-C.AC3-C轉(zhuǎn)基因小鼠(來自種系1)出現(xiàn)了擴張性心肌病。心臟舒張期間，AC3-C(B)的左心室內(nèi)徑(LVID)明顯大于AC3-I小鼠(B，**P＜0.01，來自種系4)，表明了擴張的表型。心臟收縮期間，AC3-C(B)體內(nèi)的LVID縮短明顯少于AC3-I(A，***P＜0.001)小鼠，表明了降低的心室功能。與LVID相比，心臟舒張或收縮期間，AC3-I和AC3-C小鼠的室間隔(IVS)和左心室后壁(LVPW)均無顯著差異。C.與AC3-I小鼠(P＜0.001)相比，左心室射血分數(shù)縮短在AC3-C體內(nèi)有顯著降低。D.在AC3-I和AC3-C小鼠之間沒有心率上的差異。
圖6A-B.與AC3-C小鼠和野生型(WT)同窩出生小鼠相比，AC3-I來源的心室勻漿物的總CaMKII活性有顯著降低。A.總CaMKII活性。B.CaMKII活性中不依賴Ca2+的部分。
圖7A-D.CaMKII抑制作用改善了心肌梗塞外科手術(shù)后的心臟收縮功能。對心肌梗塞外科手術(shù)后3周未麻醉小鼠的超聲心動圖測量的結(jié)果表明CaMKII抑制作用顯著保護了小鼠的左心室功能。A.與野生型同窩出生小鼠對照(WT)或者經(jīng)由無活性KN-93同源物KN-92(30μmol/Kg體重)每日處理過的WT小鼠相比，經(jīng)由CaMKII抑制劑KN-93(以1和10μmol/Kg體重劑量)每日處理過的小鼠，和具有轉(zhuǎn)基因靶定CaMKII抑制作用的AC3-I小鼠的左心室(LV)射血分數(shù)縮短均有顯著增加。通過方差分析(ANOVA)的P＜0.001和星號表示采用Bonferroni-校正t檢驗與WT相比的顯著差異。B.心臟舒張期間的LV內(nèi)徑(LVID)是LV心室擴張的指標。心臟舒張期間的各組LVID無顯著差異。C.心臟舒張期間的LV后壁(LVPW)壁厚度是衡量未梗塞壁的LV肥厚的指標。心臟舒張期間的各組LVPW無顯著差異。D.具有轉(zhuǎn)基因靶定CaMKII抑制作用的AC3-I小鼠的心率顯著地慢于其它所有組的小鼠。
圖8.在擴張性心肌病情況中，CaMKII抑制作用緩解了左心室擴張，也改善了左心室收縮功能。與CAN+轉(zhuǎn)基因小鼠相比，雙重轉(zhuǎn)基因小鼠(AC3-I+/CAN+)的左心室(LV)擴張得到緩解，LV射血分數(shù)縮短也改善了。10對未麻醉的鈣調(diào)磷酸酶(CAN+)轉(zhuǎn)基因小鼠和雜種繁殖的雙重轉(zhuǎn)基因AC3-I+/CAN+小鼠進行超聲心動圖測量的結(jié)果顯示與CAN+小鼠相比，AC3-I+/CAN小鼠的心臟舒張期間，LV內(nèi)徑(LVID)顯著減小，室間隔(IVS)和LV后壁(LVPW)則增厚，這表明通過轉(zhuǎn)基因靶定的CaMKII抑制作用可以部分緩解擴張性心肌病的表型。前4幅圖中的測量參數(shù)一致左心室內(nèi)徑(LVID)，室間隔(IVS)，左心室后壁(LVPW)。與CAN+小鼠相比，雙重轉(zhuǎn)基因AC3-I+/CAN+小鼠的左心室收縮功能顯著提高了，表明通過轉(zhuǎn)基因靶定心臟的CaMKII抑制作用可以改善心臟的收縮功能。與之相比，AC3-I+/CAN+和CAN+轉(zhuǎn)基因動物的心率之間無顯著差異。所有小鼠均為4～8周齡。
圖9A-B.雜種繁殖AC3-I或AC3-C小鼠和鈣調(diào)磷酸酶(CAN)轉(zhuǎn)基因小鼠的方法。A.方框表示育種對。主要對照是在CAN陽性小鼠之間進行，也顯示了可選對照(提供的數(shù)據(jù)如圖8所示)。B.PCR結(jié)果表明AC3-I與CAN小鼠之間的雜種繁殖是成功的，并且雙重轉(zhuǎn)基因小鼠可以通過標準PCR方法得以鑒定。
發(fā)明詳述應(yīng)當指出，如果上下文沒有明確地另外指明，本說明書及所附權(quán)利要求中所用的單數(shù)形式“一種”、“一個”和“該”包括復數(shù)對象。因此，例如，提到的“一種抑制劑”包括該抑制劑的多重拷貝，也可以包括超過一個特定種類的抑制劑。
本發(fā)明提供了一種在被診斷患有心肌梗塞后心肌收縮功能障礙的受試者中，治療或預(yù)防心肌梗塞后心肌收縮功能障礙的方法，該方法包括給予受試者有效量的鈣調(diào)蛋白激酶II(CaMKII)抑制劑，給予該抑制劑可以治療或預(yù)防受試者心肌梗塞后的心肌收縮功能障礙。通常，抑制劑的“有效量”指獲得預(yù)期一種或多種理想結(jié)果所需要的量?！靶募」Ｈ币庵感呐K的局部缺血性損傷，其中心臟的部分心肌(心臟肌肉)壞死或凋亡，即細胞程序性死亡?！熬植咳毖該p傷”意指由于流向器官或組織的血液中斷，即局部缺血事件而導致對器官或組織的損害或潛在損害。貫穿全文所用的“受試者”意指個體。因此，“受試者”可以包括家養(yǎng)的動物，如貓、狗等，家畜(如牛、馬、豬、綿羊、山羊等)，實驗動物(如小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)以及鳥類。優(yōu)選的受試者為哺乳動物，如靈長類動物，更為優(yōu)選的是人類。
該受試者可以是被診斷為患有心肌梗塞的病人。該受試者可以是被診斷為患有梗塞后心臟功能障礙的病人。該受試者可以是被診斷為已患有心肌梗塞的病人，該病人因而具有出現(xiàn)梗塞后心臟功能障礙的高度危險性。此外，該受試者可以是被診斷為患有擴張性心肌病或者具有心力衰竭癥狀的病人，其中該心力衰竭癥狀由任何與心室腔擴張表型及心肌收縮功能降低相關(guān)導致。該受試者可以是被診斷為心肌收縮性降低的病人。診斷心肌梗塞、梗塞后心臟功能障礙、心肌收縮性降低和擴張性心肌病的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。區(qū)分患有梗塞后收縮功能障礙或擴張性心肌病受試者與患有心肌梗塞或心肌肥厚的受試者的方法也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。應(yīng)當認識到，被診斷患有心肌梗塞、心律失?；蛐募》屎竦氖茉囌卟⒉灰欢ɑ加袛U張性心肌病或心肌收縮性降低。
CaMKII的抑制劑可以是任何抑制CaMKII活性或表達(如數(shù)量或致病效果)的化合物、組合物或藥劑。該化合物可以是肽或非肽藥劑，包括例如，編碼了肽抑制劑的核酸。此外，該藥劑可以是抑制心臟中CaMKII表達的反義核酸(見GenBank，編號為L13407，Hoch et al.，Circ Res 1999，其說明書中圖9所示的異構(gòu)體δ3和δ2)5?！耙种啤币庵赶拗?、阻止或減低。因此，抑制劑是可以，例如減低酶活性和/或酶表達量的藥劑。抑制作用可以是可逆或不可逆的。受試者體內(nèi)的CaMKII活性或CaMKII總量可根據(jù)對其功能反應(yīng)的檢測或測量而容易地確定，例如，通過超聲心動圖或其它臨床參數(shù)進行確定。此文提供了測定非人類的動物模型體內(nèi)CaMKII活性的特定方法。因此，對抑制CaMKII的化合物的鑒定是常規(guī)實驗。
CaMKII抑制劑的一個實例是一種肽，包含SEQ ID NO2的肽，此文也稱其為AC3-I。本發(fā)明的該抑制劑可以由SEQ ID NO2的肽構(gòu)成。
CaMKII抑制劑的另一個實例是一種肽，包含SEQ ID NO4的肽，即CaM-KIIN。該抑制劑可以是全長CaM-KIIN(SEQ ID NO4)和/或該全長肽的一個片段；該片段被稱為CaM-KIINtide(SEQ ID NO6)。Chang et al.PNAS(USA)1998 9510890-10895中描述了CaMKIIN和CaM-KIINtide，此處將其完整引入作為參考。
由于這些肽均顯示可以抑制CaMKII，因此可以預(yù)期含有這些肽之外還包括非必需氨基酸的其它肽和多肽也將具有類似活性。非必需氨基酸是不影響該肽的功能或該肽完成其功能的途徑的氨基酸(如其二級結(jié)構(gòu)或該肽活性的最終結(jié)果)。本發(fā)明非必需氨基酸的實例包括但不僅限于含有GFP，即一種可標記并識別蛋白質(zhì)或肽以進行純化的肽標記的氨基酸。
本發(fā)明考慮到CaMKII有其它多種抑制劑，其中之一為KN-93。WO98/33491中描述了KN-93這種CaMKII的非肽抑制劑，此處將其完整引入以參考其關(guān)于KN-93和CaMKII抑制劑的學說。
本發(fā)明進一步提供了一種治療或預(yù)防受試者心肌梗塞后心臟功能障礙的方法，該方法包括給予受試者有效量的CaMKII抑制劑，給予該抑制劑可以治療或預(yù)防受試者的心臟功能障礙?！靶呐K功能障礙”意指血液泵壓室的收縮功能減低，該情況可導致心力衰竭的臨床狀況。診斷受試者心肌梗塞后心臟功能障礙的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
在治療或預(yù)防受試者心肌梗塞后心臟功能障礙的方法中，該CaMKII抑制劑可以是一種肽，例如該肽包含SEQ ID NO2的肽，或由SEQ ID NO2的肽組成。該CaMKII抑制劑可以是一種肽，它包含SEQ ID NO4的肽，或由SEQ ID NO4的肽所組成。此外，該抑制劑可以是一種肽，它包含SEQ ID NO6的肽，或由SEQ ID NO6的肽所組成。該抑制劑可以是非肽抑制劑，例如，含有KN-93活性區(qū)的抑制劑，或者其本身就是KN-93。
本發(fā)明也提供了一種治療或預(yù)防受試者的擴張性心肌病或任一原因?qū)е碌摹⒕哂行呐K腔室擴張表型的任何心臟疾病的方法，該方法包括給予受試者有效量的CaMKII抑制劑，給予該抑制劑可以治療受試者的擴張性心肌病或減少心室擴張。診斷擴張性心肌病受試者的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
在治療或預(yù)防擴張性心肌病的方法中，該CaMKII抑制劑可以是一種肽，例如它包含SEQ ID NO2的肽，或由SEQ ID NO2的肽所組成。該CaMKII抑制劑可以是一種肽，它包含SEQ ID NO4的肽，或由SEQ ID NO4的肽所組成。此外，該抑制劑可以是一種肽，它包含SEQ ID NO6的肽，或由SEQ ID NO6的肽所組成。該抑制劑可以是非肽抑制劑，例如，含有KN-93活性區(qū)的抑制劑，或者其本身就是KN-93。
本發(fā)明提供了一種在被診斷患有擴張性心肌病，或任一原因?qū)е碌摹⒕哂行呐K腔室擴張或收縮功能降低表型的任何心臟疾病受試者中，提高其心肌收縮性的方法，該方法包括給予受試者有效量的CaMKII抑制劑，給予該抑制劑可以改善受試者的心肌收縮性。測量心臟收縮性的技術(shù)，例如超聲心動圖、放射性核素血管造影術(shù)，以及磁共振成像均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。此處所用“心肌收縮性”指一個衡量心肌收縮，更具體而言，是衡量左心室收縮的尺度。如圖7所示，AC3-I和KN-93提高了心肌收縮性(正性肌力作用)而未引起心臟肥厚。
此外，本發(fā)明還提供了一種在被診斷患有心肌梗塞的受試者中提高其心肌收縮性的方法，該方法包括給予受試者有效量的CaMKII抑制劑，給予該抑制劑可以提高受試者的心肌收縮性。
本發(fā)明也提供了一種在被診斷患有心肌梗塞后心臟功能障礙的受試者中，提高其心肌收縮性的方法，該方法包括給予受試者有效量的CaMKII抑制劑，給予該抑制劑可以改善受試者的心肌收縮性。
在提高心肌收縮性的方法中，CaMKII抑制劑可以是一種肽，例如它包含SEQ ID NO2的肽，或者是由SEQ ID NO2的肽所組成。該CaMKII抑制劑可以是一種肽，它包含SEQ ID NO4的肽，或者是由SEQ ID NO4的肽所組成。此外，該抑制劑也可以是一種肽，它包含SEQ ID NO6的肽，或者是由SEQ ID NO6的肽所組成。該抑制劑可以是非肽抑制劑，例如，含有KN-93活性區(qū)的抑制劑，或者其本身就是KN-93。
CaMKII抑制劑可以被用于提高心肌的收縮性，而不引起心肌肥厚，因而可以治療被診斷患有心肌梗塞、心肌梗塞后的心臟功能障礙，和/或擴張性心肌病的受試者。
本發(fā)明提供了一種鑒定可治療結(jié)構(gòu)性心臟病的化合物的方法，該方法包括a)測定患有結(jié)構(gòu)性心臟病的動物的心臟收縮性；b)將該化合物給予步驟a)中的動物；c)測定步驟b)中動物的心臟收縮性；d)確定與步驟a)中動物的心臟收縮性相比，步驟b)中動物的心臟收縮性的增加，檢測該心臟收縮性的增加便可鑒定出可以治療結(jié)構(gòu)性心臟病的化合物。本發(fā)明的該方法中，患有結(jié)構(gòu)性心臟病的動物可以是表達AC3-C的轉(zhuǎn)基因動物。測定心臟收縮性的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，包括但不僅限于超聲心動圖。測定方法包括放射性核素血管造影術(shù)、磁共振成像，以及左心室血管造影術(shù)。
本發(fā)明提供了一種鑒定可治療結(jié)構(gòu)性心臟病的化合物的方法，該方法包括a)測定患有結(jié)構(gòu)性心臟病的動物的腦利尿鈉肽；b)將該化合物給予步驟a)中的動物；c)測定步驟b)中動物的腦利尿鈉肽；d)確定與步驟a)中動物的腦利尿鈉肽相比，步驟b)中動物的腦利尿鈉肽的增加，檢測該腦利尿鈉肽的增加便鑒定出該可以治療結(jié)構(gòu)性心臟病的化合物。本發(fā)明的該方法中，患有結(jié)構(gòu)性心臟病的動物可以是表達AC3-C的轉(zhuǎn)基因動物。
心力衰竭是一種臨床綜合征，包括由于心臟收縮和組織氧合的減低導致的運動耐受力降低，7因此通過腳踏車或自行車ergonometry進行的運動測試、降低的組織氧攝取、或升高的血漿腦利尿鈉肽水平均為心力衰竭嚴重程度的標志。指示心肌收縮極度和中度損傷、運動能力、最大耗氧量以及循環(huán)腦利尿鈉肽水平的數(shù)值均于治療心力衰竭領(lǐng)域內(nèi)有所描述并被技術(shù)人員所熟知。7結(jié)構(gòu)性心臟病的實例包括但不僅限于心肌梗塞、心肌梗塞后的心臟功能障礙、心肌收縮性降低，以及擴張性心肌病。
本發(fā)明提供了一種治療受試者心肌梗塞、心肌梗塞后心臟功能障礙和/或擴張性心肌病的方法，該方法包括給予受試者有效量的一種通過上述方法鑒定的化合物，該化合物的給予可以治療患有心肌梗塞后心臟功能障礙和/或擴張性心肌病的受試者，或者是具有心力衰竭、心臟腔室擴張及左心室收縮性降低等癥狀的病人。
本發(fā)明提供了表達編碼CaMKII抑制劑的核酸的轉(zhuǎn)基因動物?！稗D(zhuǎn)基因動物”指其身體的所有細胞均含有一種外源核酸的動物。本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物的一個實例中，該轉(zhuǎn)基因特異表達于心肌細胞中，并由心臟細胞特異啟動子啟動。該小鼠是采用心臟特異α肌球蛋白重鏈啟動子(GenBank編號U71441)進行設(shè)計的。制備轉(zhuǎn)基因動物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并于此文得以具體例證。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)表達的CaMKII抑制劑可以是一種肽，它包含SEQ ID NO2的肽。此外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物可以表達由SEQID NO2的肽所組成的肽。最近的報導發(fā)現(xiàn)在心臟中至少有4種不同的CaMKIIδ異構(gòu)體，5并且由于靶定的調(diào)節(jié)域的保守性，AC3-I(SEQ IDNO2)可以抑制所有的CaMKII異構(gòu)體。3CaMKII內(nèi)的AC3-I靶定的域與其它CaMK類型(即CaMKI和CaMKIV，圖1)中的類似功能域不同，并且實際上缺乏針對蛋白質(zhì)激酶A和C的活性。3本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)表達的CaMKII抑制劑可以是一種肽，它包含SEQ ID NO4的肽。此外，本發(fā)明的該轉(zhuǎn)基因動物可以表達由SEQ ID NO4的肽所組成的肽。
本發(fā)明進一步提供了于心肌細胞中表達編碼一種肽的核酸的轉(zhuǎn)基因動物，該肽包含SEQ ID NO8、也被稱為AC3-C的肽。如圖4和5所示，AC3-I和AC3-C小鼠具有相似的轉(zhuǎn)基因表達，但是AC3-C小鼠表現(xiàn)出心肌病，而具有CaMKII抑制作用的AC3-I小鼠則表現(xiàn)正常。如圖6所示，與患有心肌病的病人中所觀察到的結(jié)果一樣，AC3-C小鼠具有高的總CaMKII活性。因此，該轉(zhuǎn)基因動物可以被應(yīng)用于鑒定一種可以治療結(jié)構(gòu)性心臟病的化合物的本發(fā)明方法中。由于AC3-C被認為是無活性的，因此這些結(jié)果可能需要通過AC3-C-GFP轉(zhuǎn)基因的綠色熒光蛋白(GFP)部分的作用來解釋。6這種小鼠是遵照制備AC3-I轉(zhuǎn)基因小鼠的基礎(chǔ)方法獲得的。
本發(fā)明也提供了一種于心肌細胞中表達編碼AC3-I的核酸，和編碼鈣調(diào)磷酸酶的核酸的雙重轉(zhuǎn)基因動物(AC3-I+/CAN+)。該鈣調(diào)磷酸酶(CAN+)轉(zhuǎn)基因小鼠是公認患有嚴重擴張性心肌病的模型。10已知CAN拮抗劑可以‘挽救’多種小鼠模型中出現(xiàn)的心肌病表型，16但CaMKII抑制卻從未被預(yù)期可以改善這些或任何其它心肌病模型的心臟功能或結(jié)構(gòu)。如圖8所例證的，除CAN之外還表達CaMKII抑制劑的該雙重轉(zhuǎn)基因動物的左心室功能得到改善，并且與CAN+動物模型比較時，顯示出左心室擴張和肥厚的癥狀也得到緩解。因此，這種動物體內(nèi)的CaMKII抑制可以治療擴張性心肌病。
本發(fā)明的方法中，可以通過已知途徑給予CaMKII抑制劑。一個特定實例中，肽抑制劑被制成細胞膜滲透性的。細胞“膜滲透”意指可以通過膜上的開口或間隙16。該方法采用了被添加到抑制肽中的肽序列，但豆蔻酰基化是使肽通過細胞膜的另一種方法。
本發(fā)明的組合物也可以被包含在藥學可接受載體中被給予進體內(nèi)?！八帉W可接受”意指一種符合生物學或其它方面需要的材料，即該材料可連同組分被給予受試者，而不引起任何不希望發(fā)生的生物效應(yīng)，或者不會以有害的方式與包含其的藥物組合物的任何其它組分相互作用。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，該載體應(yīng)當可以使有效成分的任何降解程度最小化，并最小化受試者體內(nèi)有害副作用的發(fā)生。
盡管局部鼻內(nèi)給藥或通過吸入給藥是典型優(yōu)選的給藥方式，仍然可以通過口服、腸胃外(如靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、鞘內(nèi)注射、動脈內(nèi)注射和腹膜內(nèi)注射)、經(jīng)皮、體外、局部等方式給予該組合物。此處所用的“局部鼻內(nèi)給藥”意指經(jīng)由一個或兩個鼻孔將該組合物送遞至鼻孔和鼻道內(nèi)，可以包括通過噴霧器或滴液器，或者通過霧化治療劑實現(xiàn)的送遞。該組合物的送遞也可以是通過插管直接到下呼吸道的任意部位(如氣管、支氣管和肺)。根據(jù)受試者的人種、年齡、體重和全身狀態(tài)、所治療狀況的嚴重程度、所用的特定組合物、其給藥模式等，不同受試者所需組合物的準確量均不相同。因此，不可能指定每種組合物的準確量。不過，可以通過本領(lǐng)域一種普通技術(shù)，僅利用此處所提供方法的常規(guī)實驗便可確定合適量。
如果采用腸胃外給予該組合物，其給藥特征通常為注射?？梢詫⒖勺⑸湮镏苽涑沙Ｒ?guī)形式，如液體溶液或懸液，適用于注射前在液體中溶解成懸液的固體形式或乳劑。最近修訂的腸胃外給藥方法涉及緩釋或持續(xù)釋放體系的應(yīng)用，可以維持恒定劑量。見例如U.S.Patent No.3,610,795，此處引入了該文獻以作參考。
該物質(zhì)可以溶于溶液、懸液(例如被摻入微粒、脂質(zhì)體或細胞)中。借助于抗體、受體或受體配體可以將這些物質(zhì)靶定到特定細胞類型上。下述文獻是利用該技術(shù)將特定蛋白質(zhì)靶定到腫瘤組織上的實例(Senter，et al.，Bioconjugate Chem.，2447-451，(1991)；Bagshawe，K.D.，Br.J.Cancer，60275-281，(1989)；Bagshawe，et al.，Br.J.Cancer，58700-703，(1988)；Senter，et al.，Bioconjugate Chem.，43-9，(1993)；Battelli，et al.，CancerImmunol.Immunother.，35421-425，(1992)；Pietersz andMcKenzie，Immunolog.Reviews，12957-80，(1992)；and Roffler，et al.，Biochem.Pharmacol，422062-2065，(1991))。載體如“隱形”脂質(zhì)體及其它偶聯(lián)抗體的脂質(zhì)體(包括介導治療結(jié)腸癌藥物的脂質(zhì))，經(jīng)由細胞特異配體介導DNA靶定的受體，靶定腫瘤的淋巴細胞，及靶定鼠科動物體內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的高特異治療性逆轉(zhuǎn)錄病毒。下述文獻是利用該技術(shù)將特定蛋白質(zhì)靶定到腫瘤組織上的實例(Hughes et al.，Cancer Research，496214-6220，(1989)；andLitzinger and Huang，Biochimica et Biophysica Acta，1104179-187，(1992))。通常，受體被組成型或由配體誘導地包含在胞吞作用途徑。網(wǎng)格蛋白包被的小窩中的這些受體簇，借助于網(wǎng)格蛋白包被的小囊泡進入細胞中，經(jīng)過酸化的內(nèi)涵體，在該酸化內(nèi)體中受體被分類，繼而或者再循環(huán)至細胞表面，被儲存在細胞內(nèi)，或者在溶酶體中被降解。內(nèi)化途徑具有多種功能，如營養(yǎng)的攝取、活化蛋白質(zhì)的移除、大分子的清除、病毒及毒素的機會性入侵、配體的分離和降解，以及受體水平的調(diào)節(jié)。許多受體參與超過一個的細胞內(nèi)途徑，這取決于該細胞類型、受體濃度、配體類型、配體價及配體濃度。受體介導的胞吞作用的分子和細胞機理已有評述(Brown and Greene，DNA and Cell Biology106，399-409(1991))。
本發(fā)明的組合物可以包括編碼一種抑制劑的核酸，或者可以包括CaMKII反義核酸?？赏ㄟ^多種途徑將該公開組合物送遞至目標細胞。例如，可通過電穿孔、脂轉(zhuǎn)染，或者磷酸鈣沉淀方法送遞該組合物。所選擇的送遞機理部分地根據(jù)目標細胞的類型，以及該送遞是否發(fā)生，例如于體內(nèi)或體外。
因此，除了所公開的組合物或載體以外，該組合物還可以含有例如，諸如脂質(zhì)體，如陽離子脂質(zhì)體(如DOTMA、DOPE、DC-膽固醇)或陰離子脂質(zhì)體的脂類。如必要，脂質(zhì)體可以進一步含有蛋白質(zhì)，以利于靶定特定細胞。組合物的給藥包括將化合物和陽離子脂質(zhì)體給藥至血液中，以送遞至目標器官，或者將其吸入進呼吸道內(nèi)，以送遞至呼吸道的目標細胞。關(guān)于脂質(zhì)體，見例如Brigham et al.Am.J.Resp.Cell.Mol.Biol.195-100(1989)；Felgner et al Proc.Natl.Acad.Sci USA 847413-7417(1987)；U.S.Pat.No.4,897,355。此外，可以將該化合物作為一種微膠囊的組分給藥，該微膠囊可以被靶定到特定細胞類型上，如巨噬細胞，或者將該化合物從該微膠囊中的擴散或送遞設(shè)計成特定速率或劑量。
上述包括給予外源DNA并將其送遞至受試者細胞內(nèi)的方法(即基因轉(zhuǎn)導或轉(zhuǎn)染)中，可借助于多種機理將該組合物送遞至細胞。其中一個實例是借助于脂質(zhì)體送遞組合物，即采用商業(yè)可利用的脂質(zhì)體制劑，如LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE(GIBCO-BRL，Inc.，Gaithersburg，MD)、SUPERFECT(Qiagen，Inc.Hilden，Germany)和TRANSFECTAM(Promega Biotec，Inc.，Madison，WI)，以及其它根據(jù)本領(lǐng)域的操作標準研發(fā)的脂質(zhì)體。另外，通過電穿孔可以體內(nèi)送遞本發(fā)明的核酸或載體，可采用Genetronics，Inc.(San Diego，CA)的方法，并通過SONOPORATION機械途徑(ImaRx Pharmaceutical Corp.，Tucson，AZ)應(yīng)用該技術(shù)。
被送遞至細胞，并將被整合進宿主細胞基因組內(nèi)的核酸典型地含有整合序列。這些序列通常為病毒相關(guān)序列，尤其是當采用基于病毒的體系時。這些病毒整合體系也可以被整合進有待于采用非基于核酸，如脂質(zhì)體的送遞體系被送遞的核酸中，從而使得該送遞體系中包含的核酸可以被整合進宿主基因組中。此處所用“核酸”包括單鏈或雙鏈分子，即可能是由核苷酸堿基A、T、C、G組成的DNA，或者由堿基A、U(替代T)、C和G組成的RNA。該核酸可以代表編碼鏈或其互補鏈。該核酸的序列可能與自然存在的序列的一部分相同，或者可能包括可選密碼子，這些密碼子編碼了與自然存在序列中所發(fā)現(xiàn)氨基酸相同的氨基酸。此外，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，核酸可以包括代表氨基酸保守取代的密碼子。
用于整合進宿主基因組的其它通用技術(shù)包括，例如設(shè)計為可以促進與宿主基因組進行同源性重組的體系。這些體系典型地依賴待表達核酸的側(cè)翼序列，該序列與宿主細胞基因組內(nèi)的目標序列充分同源，發(fā)生了載體核酸與目標核酸的重組，并導致送遞的核酸被整合進宿主基因組內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知這些體系和方法對促進同源重組而言是必需的。
如上所述，可以借助于藥學可接受載體給予該組合物，并且通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的多種機理(如裸NDA的攝取、脂質(zhì)體融合、借助于基因槍的DNA肌肉內(nèi)注射、胞吞作用等)以體內(nèi)和/或體外方式將該組合物送遞至受試者細胞中。如果應(yīng)用的是體外方法，可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的標準操作方法將細胞或組織移出并維持在體外。借助于任何基因轉(zhuǎn)移機理，例如磷酸鈣介導的基因送遞、電穿孔、微注射或蛋白磷脂體法，均可以將該組合物導入細胞中。繼而可以根據(jù)細胞或組織類型經(jīng)由標準方法將該轉(zhuǎn)導細胞注入(如在藥學可接受載體中)或等位移植回受試者體內(nèi)。將多種細胞移植或注入受試者體內(nèi)的標準方法是已知的。
該抑制劑可以任意有效抑制CaMKII活性或量的劑量給藥。如上文所指出的，對CaMKII活性或量的減少的檢測在從業(yè)醫(yī)師的技能范圍內(nèi)。更具體而言，該抑制劑的給藥劑量為每公斤體重大約0.05mg到大約5.0mg。可選的，該抑制劑的給藥劑量為每公斤體重大約0.3mg到大約3.0mg。
下述實施例的描述是為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供了完整的公開內(nèi)容，以及如何制備并評定此處要求保護的組合物和/或方法的說明書，這些實施例僅為本發(fā)明的例證，并未對本發(fā)明者所認定的本發(fā)明范疇構(gòu)成限制。發(fā)明者已努力確保數(shù)字(如數(shù)量、溫度等)的準確性，但仍然存在某些誤差和偏差。下述實施例中更為具體地描述了本發(fā)明，由于其中出現(xiàn)的多處改動及變化對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易懂的，因此這些實施例僅具有說明性。
實施例AC3-I轉(zhuǎn)基因小鼠該AC3-I小鼠是以用于AC3-I的肽序列為基礎(chǔ)進行的小基因合成而得以制備的(圖1)。編碼AC3-I(KKALHRQEAVDCL)的‘小基因’、2CaMKII抑制肽均是采用這些互補寡核苷酸構(gòu)建的
(SEQ ID NO1)GATCAAAAAAGCCCTTCACCGCCAGGAGGCAGTTGACTGCCTTGCTTTTTTCGGGAAGTGGCGGTCCTCCGTCAACTGACGGAACGCTAG，同樣采用下列互補寡核苷酸構(gòu)建用于相關(guān)無活性對照肽AC3-C(KKALHAQERVDCL)的小基因(SEQ ID NO7)GATCAAAAAAGCCCTTCACGCACAGGAGCGCGTTGACTGCCTTGCTTTTTTCGGGAAGTGCGTGTCCTCGCGCAACTGACGGAACGCTAG將該小基因與EGFP框內(nèi)插入在pEGFP-C1(Clontech)的BspEI位點，使得EGFP位于該肽的N末端。該AC3-I小基因包括Kozak共有序列翻譯起始位點。繼而進行測序并在HEK293細胞中表達，顯示出綠色熒光。早前的研究指出AC3-I-GST-MTS融合肽保留了對合成CaMKII底物(AC3-I-GST-MTS IC50＝0.4μM；AC3-I IC500.5μM)的全部CaMKII抑制效力，表明AC3-I-GFP蛋白質(zhì)也保留了CaMKII抑制活性。繼而采用PCR擴增800bp AC3-I-GFP序列，對擴增產(chǎn)物進行純化并將其亞克隆進含有α-MHC啟動子載體(GenBank編號U71441)和人類生長激素(HGH)多聚腺苷酸尾部(由Dr.J.Robbins研發(fā))的pBluescript載體的SalI位點。通過測序及在鼠科動物心房腫瘤細胞系(HL1)中表達并顯示出綠色熒光便可驗證該構(gòu)建體。在Vanderbilt轉(zhuǎn)基因小鼠核心設(shè)施內(nèi)將鼠科動物胚胎干細胞連同線性化的DNA(2ng/ml)注射并移植進B6D2偽孕雌性小鼠體內(nèi)。
當于顯微鏡下檢視組織切片時，AC3-I與綠色熒光蛋白(GFP)相連可以顯示出遍及心臟的同源表達。這些AC3-I小鼠是存活的，并且具有正常的基礎(chǔ)心臟尺寸和功能(圖2)。不過，這些小鼠的心臟所具有的總心臟CaMKII活性顯著降低(圖3(A))了，并且與野生型同窩出生小鼠對照相比，在心肌梗塞實驗之后，這些小鼠的心臟功能損傷顯著地較少(圖3(B))。這些發(fā)現(xiàn)表明CaMKII活性是心肌梗塞后心臟功能障礙的一個新信號，并且也是我們要求保護的通過抑制CaMKII治療心肌梗塞受試者的方法的基礎(chǔ)。
AC3-I+/CAN+轉(zhuǎn)基因小鼠采用圖9所示方法步驟雜交繁殖雙重轉(zhuǎn)基因小鼠。為了對第一代進行基因分型，于小鼠3周齡時進行尾部活檢，并于55℃，在含有0.5Mg/ml蛋白酶K、50mM Tris(pH8.0)、100mM EDTA和0.5％SDS的溶液中培養(yǎng)過夜。在采用苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)進行兩次提取后，采用等體積的異丙醇沉淀基因組DNA。于50μl含有2.5μg RNA酶A的1/10TE(pH8.0)溶液中溶解DNA。采用EcoRI完全消化15μg的基因組DNA，并于1xTAE中，采用0.8％瓊脂糖凝膠分離已消化的DNA。電泳后，于0.25N HCl中溫育凝膠30分鐘，于0.5M NaOH-1.5M NaCl中進行15分鐘的中和反應(yīng)兩次，并于0.5M Tris-1.5M NaCl中平衡兩次各15分鐘。在MSI尼龍轉(zhuǎn)移膜(Micron separations Inc.Westborought，MA)上使凝膠印跡過夜，并對該濾膜進行紫外交聯(lián)。由隨機寡核苷酸所引發(fā)(Stratagene，La Jolla，CA)的32P標記的GFP-AC3I或GFP-AC3C DNA片段作為探針。在50％甲酰胺、5xSSPE、5xDenhardt溶液、0.1％SDS和100μg/ml變性、破碎的鮭魚精子DNA存在的條件下，于42℃進行雜交過夜。于65℃，在0.5xSSC-0.1％SDS中洗滌濾膜30分鐘，繼而于65℃，在0.1％SSC-0.1％SDS中洗滌20分鐘兩次。將該濾膜曝光到Kodak放射自顯影底片上并使其顯影。
對第一代之后的轉(zhuǎn)基因小鼠的常規(guī)篩選是通過PCR進行的(見圖9)。有兩個引物適用于擴增位于人類生長激素(hGH)基因3’末端的442-bp區(qū)。這兩個引物的序列為5’-Hgh(5’-(SEQ ID NO9)GTCTATTCGGGAACCAAGCT-3’)和3’-Hgh(5’-(SEQ ID NO10)ACAGGCATCTACTGAGTGGACC-3’)。將100ng的已純化基因組DNA與200pM的每種引物混合，并根據(jù)下述步驟進行擴增95℃下5分鐘，繼而進行30個包括95℃下45秒、50℃下45秒、72℃下1分鐘的循環(huán)，最后于72℃下進行最后7分鐘的延伸。在0.5μg/ml溴化乙錠存在條件下，將所有樣品上樣于1.5％瓊脂糖凝膠上進行電泳，并于紫外光照射下目測染色的DNA條帶。新的引物組是針對雜種繁殖的雙重轉(zhuǎn)基因小鼠(圖9)研發(fā)的，并且可用于區(qū)分雙重和單一轉(zhuǎn)基因動物。
超聲心動圖超聲心動圖是采用Hewlett Packard Sonos5500(完全針對鼠科動物的研究)以及特別研制的12MHz探針進行的。心臟尺寸獲得自2維導向的M模式圖像，并采用前沿方法，通過封閉、獨立讀數(shù)器取短軸和胸骨長軸面離線讀數(shù)。采用戊巴比妥(15mg/Kg，i.p.)便可容易地使動物鎮(zhèn)靜；不過也可以無需麻醉地進行測量，其中小鼠需要經(jīng)歷一個短暫的‘訓練’期以適應(yīng)整個過程?？梢詫⒋蠹s90％的小鼠訓練得可以承受超聲心動圖研究，而不產(chǎn)生麻醉的心臟抑制效應(yīng)。將來自LV后壁(LVPW)、室間隔(IVS)和LV內(nèi)徑(LVID)的3次連續(xù)搏動進行平均獲得測定值。射血分數(shù)縮短(FS)被用于評估心臟收縮功能，并且可以根據(jù)公式FS＝(LVID心臟舒張期-LVID心臟收縮期)/LVID舒張期x100計算出來。
心肌梗塞外科手術(shù)該外科手術(shù)是在Vanderbilt小鼠生理學核心實驗室中進行的，并且與其它已發(fā)表的報導基本一致18 8。14簡言之，麻醉小鼠(戊巴比妥33μg/g和氯胺酮33μg/g，i.p.)，將其置于嚙齒類動物呼吸器(潮氣容積0.5ml，速率120次呼吸/分鐘)上，采用左胸骨旁開胸術(shù)將其胸腔打開，并采用8-0縫合線將左前降枝動脈中部區(qū)域縫合。閉合胸腔(5-0縫合線)，并將該動物斷離呼吸器。通過增加的肺部濕干重可以確定野生型小鼠典型地出現(xiàn)心力衰竭。假手術(shù)省略結(jié)扎步驟。大約75％的存活動物通過外科手術(shù)成功地具有了梗塞的前壁。
CaMKII活性分析CaMKII活性是采用我們之前公開的方法1，在AC3-I小鼠和同窩出生小鼠對照中，采用具有對CaMKII比對CaMKIV超過約50倍選擇性的syntide 2這種合成底物，從完整心臟(心室)勻漿物中進行分析獲得的。
擴張性心肌病在通過抑制CaMKII對擴張性心肌病進行的預(yù)防中獲得了引人注目的數(shù)據(jù)。制備了表達與AC3-C(AC3-I的一種無活性同源物)相連的GFP的對照轉(zhuǎn)基因小鼠。該小鼠便出現(xiàn)了在AC3-I-GFP小鼠中不存在的相當嚴重的擴張性心肌病，并具有非常高水平的CaMKII活性(圖5)。
貫穿本申請，參考了多種出版物。為了更為完整地描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的狀況，此文將這些出版物的公開內(nèi)容完整引入該申請中，作為參考。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，應(yīng)當清楚的是本發(fā)明可以進行多種改動和變化，并不偏離本發(fā)明的范疇和實質(zhì)?？紤]到本發(fā)明此處所公開的說明書及實踐，本發(fā)明的其它實施方案對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言將是顯而易懂的。該說明書和實施例僅為例證，本發(fā)明的真實范疇及實質(zhì)由下述權(quán)利要求指明。
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序列表<110>范德比爾特大學M.安德森<120>用鈣調(diào)蛋白激酶II抑制劑治療結(jié)構(gòu)性心臟病中的心肌功能障礙<130>22000.0117P1<140>PCT/US02/31496<141>2002-10-01<150>60/328,010<151>2001-10-08<150>60/326,576<151>2001-10-01<160>10<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>90<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明；注釋＝合成構(gòu)建體<400>1gatcaaaaaa gcccttcacc gccaggaggc agttgactgc cttgcttttt tcgggaagtg60gcggtcctcc gtcaactgac ggaacgctag 90<210>2<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明；注釋＝合成構(gòu)建體<400>2Lys Lys Ala Leu His Arg Gln Glu Ala Val Asp Cys Leu
1 510<210>3<211>255<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明；注釋＝合成構(gòu)建體<400>3cggctcccct gctgagctag ggccggtccg gcagtcagcc tctgcccgtg ccccgccgca60gtccctagcc cgcccggtgc ccgccgcctg caggacacca actccttctt cgctggcaac120caggccaagc ggccccccaa gctgggccag atcggccgag ccaagagagt ggtgatcgag180gatgaccgga tagacgacgt gctgaagggg atgggggaga agcctccgtc cggagtgtag240acgcgccggc tctgg 255<210>4<211>79<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明；注釋＝合成構(gòu)建體<400>4Met Ser Glu Ile Leu Pro Tyr Gly Glu Asp Lys Met Gly Arg Phe Gly1 5 10 15Ala Asp Pro Glu Gly Ser Asp Leu Ser Phe Ser Cys Arg Leu Gln Asp20 25 30Thr Asn Ser Phe Phe Ala Gly Asn Gln Ala Lys Arg Pro Pro Lys Leu35 40 45Gly Gln Ile Gly Arg Ala Lys Arg Val Val Ile Glu Asp Asp Arg Ile50 55 60Asp Asp Val Leu Lys Gly Met Gly Glu Lys Pro Pro Ser Gly Val65 70 75<210>5<211>129<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明；注釋＝合成構(gòu)建體
<400>5aagcggcccc ccaagctggg ccagatcggc cgagccaaga gagtggtgat cgaggatgac60cggatagacg acgtgctgaa ggggatgggg gagaagcctc cgtccggagt gtagacgcgc120cggctctgg129<210>6<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明；注釋＝合成構(gòu)建體<400>6Lys Arg Pro Pro Lys Leu Gly Gln Ile Gly Arg Ala Lys Arg Val Val1 5 10 15Ile Glu Asp Asp Arg Ile Asp Asp Val Leu Lys20 25<210>7<211>90<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明；注釋＝合成構(gòu)建體<400>7gatcaaaaaa gcccttcacg cacaggagcg cgttgactgc cttgcttttt tcgggaagtg60cgtgtcctcg cgcaactgac ggaacgctag 90<210>8<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明；注釋＝合成構(gòu)建體<400>8Lys Lys Ala Leu His Ala Gln Glu Arg Val Asp Cys Leu1 5 10<210>9<211>20
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明；注釋＝合成構(gòu)建體<400>9gtctattcgg gaaccaagct20<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明；注釋＝合成構(gòu)建體<400>10acaggcatct actgagtgga cc 2權(quán)利要求
1.一種治療或預(yù)防受試者心肌梗塞后的心肌收縮功能障礙的方法，包括給予受試者有效量的鈣調(diào)蛋白激酶II(CaMKII)抑制劑，給予該抑制劑可以治療或預(yù)防受試者心肌梗塞后的心肌收縮功能障礙。
2.權(quán)利要求1的方法，其中該CaMKII抑制劑是一種肽，它包含SEQ ID NO2的肽。
3.權(quán)利要求2的方法，其中該抑制劑是SEQ ID NO2的肽。
4.權(quán)利要求1的方法，其中該CaMKII抑制劑是一種肽，它包含SEQ ID NO4的肽。
5.權(quán)利要求4的方法，其中該抑制劑是SEQ ID NO4的肽。
6.權(quán)利要求1的方法，其中該CaMKII抑制劑是一種肽，它包含SEQ ID NO6的肽。
7.權(quán)利要求6的方法，其中該抑制劑是SEQ ID NO6的肽。
8.權(quán)利要求1的方法，其中該抑制劑為KN-93。
9.權(quán)利要求1的方法，其中該抑制劑的給藥劑量為每公斤體重大約0.05mg到大約5.0mg。
10.權(quán)利要求1的方法，其中該抑制劑的給藥劑量為每公斤體重大約0.3mg到大約3.0mg。
11.一種在被診斷患有擴張性心肌病的受試者中，治療或預(yù)防擴張性心肌病的方法，包括給予受試者有效量的鈣調(diào)蛋白激酶II(CaMKII)抑制劑，給予使用該抑制劑可以治療或預(yù)防受試者的擴張性心肌病。
12.權(quán)利要求11的方法，其中該CaMKII抑制劑是一種肽，它包含SEQ ID NO2的肽。
13.權(quán)利要求12的方法，其中該抑制劑是SEQ ID NO2的肽。
14.權(quán)利要求11的方法，其中該CaMKII抑制劑是一種肽，它包含SEQ ID NO4的肽。
15.權(quán)利要求14的方法，其中該抑制劑是SEQ ID NO4的肽。
16.權(quán)利要求11的方法，其中該CaMKII抑制劑是一種肽，它包含SEQ ID NO6的肽。
17.權(quán)利要求16的方法，其中該抑制劑是SEQ ID NO6的肽。
18.權(quán)利要求11的方法，其中該抑制劑為KN-93。
19.權(quán)利要求11的方法，其中該抑制劑的給藥劑量為每公斤體重大約0.05mg到大約5.0mg。
20.權(quán)利要求11的方法，其中該抑制劑的給藥劑量為每公斤體重大約0.3mg到大約3.0mg。
21.一種在被診斷患有擴張性心肌病的受試者中，提高心肌收縮性的方法，包括給予受試者有效量的CaMKII抑制劑，給予該抑制劑可以提高受試者的心肌收縮性。
22.權(quán)利要求21的方法，其中該CaMKII抑制劑是一種肽，它包含SEQ ID NO2的肽。
23.權(quán)利要求22的方法，其中該抑制劑是SEQ ID NO2的肽。
24.權(quán)利要求21的方法，其中該CaMKII抑制劑是一種肽，它包含SEQ ID NO4的肽。
25.權(quán)利要求24的方法，其中該抑制劑是SEQ ID NO4的肽。
26.權(quán)利要求21的方法，其中該CaMKII抑制劑是一種肽，它包含SEQ ID NO6的肽。
27.權(quán)利要求26的方法，其中該抑制劑是SEQ ID NO6的肽。
28.權(quán)利要求21的方法，其中該抑制劑為KN-93。
29.權(quán)利要求21的方法，其中該抑制劑的給藥劑量為每公斤體重大約0.05mg到大約5.0mg。
30.權(quán)利要求21的方法，其中該抑制劑的給藥劑量為每公斤體重大約0.3mg到大約3.0mg。
31.一種在被診斷心肌收縮性降低的受試者中，提高其心肌收縮性的方法，包括給予受試者有效量的CaMKII抑制劑，給予該抑制劑可以提高受試者的心肌收縮性。
32.權(quán)利要求31的方法，其中該CaMKII抑制劑是一種肽，它包含SEQ ID NO2的肽。
33.權(quán)利要求32的方法，其中該抑制劑是SEQ ID NO2的肽。
34.權(quán)利要求31的方法，其中該CaMKII抑制劑是一種肽，它包含SEQ ID NO4的肽。
35.權(quán)利要求34的方法，其中該抑制劑是SEQ ID NO4的肽。
36.權(quán)利要求31的方法，其中該CaMKII抑制劑是一種肽，它包含SEQ ID NO6的肽。
37.權(quán)利要求36的方法，其中該抑制劑是SEQ ID NO6的肽。
38.權(quán)利要求31的方法，其中該抑制劑為KN-93。
39.權(quán)利要求31的方法，其中該抑制劑的給藥劑量為每公斤體重大約0.05mg到大約5.0mg。
40.權(quán)利要求31的方法，其中該抑制劑的給藥劑量為每公斤體重大約0.3mg到大約3.0mg。
41.一種在被診斷患有心肌梗塞后的心臟結(jié)構(gòu)性功能障礙的受試者中，提高其心肌收縮性的方法，包括給予受試者有效量的CaMKII抑制劑，給予該抑制劑可以提高受試者的心肌收縮性。
42.權(quán)利要求41的方法，其中該CaMKII抑制劑是一種肽，它包含SEQ ID NO2的肽。
43.權(quán)利要求42的方法，其中該抑制劑是SEQ ID NO2的肽。
44.權(quán)利要求41的方法，其中該CaMKII抑制劑是一種肽，它包含SEQ ID NO4的肽。
45.權(quán)利要求44的方法，其中該抑制劑是SEQ ID NO4的肽。
46.權(quán)利要求41的方法，其中該CaMKII抑制劑是一種肽，它包含SEQ ID NO6的肽。
47.權(quán)利要求46的方法，其中該抑制劑是SEQ ID NO6的肽。
48.權(quán)利要求41的方法，其中該抑制劑為KN-93。
49.權(quán)利要求41的方法，其中該抑制劑的給藥劑量為每公斤體重大約0.05mg到大約5.0mg。
50.權(quán)利要求41的方法，其中該抑制劑的給藥劑量為每公斤體重大約0.3mg到大約3.0mg。
51.一種表達編碼CaMKII抑制劑的核酸的轉(zhuǎn)基因動物。
52.權(quán)利要求51的轉(zhuǎn)基因動物，其中該CaMKII抑制劑是一種肽，它包含SEQ ID NO2的肽。
53.權(quán)利要求52的轉(zhuǎn)基因動物，其中該抑制劑是SEQ ID NO2的肽。
54.權(quán)利要求51的轉(zhuǎn)基固動物，其中該CaMKII抑制劑是一種肽，它包含SEQ ID NO4的肽。
55.權(quán)利要求54的轉(zhuǎn)基因動物，其中該抑制劑是SEQ ID NO4的肽。
56.權(quán)利要求51的轉(zhuǎn)基因動物，其中該CaMKII抑制劑是一種肽，它包含SEQ ID NO6的肽。
57.權(quán)利要求56的轉(zhuǎn)基因動物，其中該抑制劑是SEQ ID NO6的肽。
58.一種表達編碼CaMKII抑制劑的核酸，和編碼鈣調(diào)磷酸酶的核酸的雙重轉(zhuǎn)基因動物。
59.權(quán)利要求58的雙重轉(zhuǎn)基因動物，其中該CaMKII抑制劑是一種肽，它包含SEQ ID NO2的肽。
60.權(quán)利要求59的雙重轉(zhuǎn)基因動物，其中該抑制劑是SEQ ID NO2的肽。
61.權(quán)利要求58的雙重轉(zhuǎn)基因動物，其中該CaMKII抑制劑是一種肽，它包含SEQ ID NO4的肽。
62.權(quán)利要求61的雙重轉(zhuǎn)基因動物，其中該抑制劑是SEQ ID NO4的肽。
63.權(quán)利要求58的雙重轉(zhuǎn)基因動物，其中該CaMKII抑制劑是一種肽，它包含SEQ ID NO6的肽。
64.權(quán)利要求63的雙重轉(zhuǎn)基因動物，其中該抑制劑是SEQ ID NO6的肽。
65.一種表達編碼一種肽的核酸的轉(zhuǎn)基因動物，該肽包含SEQ IDNO8的肽。
66.權(quán)利要求65的轉(zhuǎn)基因動物，其中該轉(zhuǎn)基因動物表達編碼SEQ IDNO8的肽的核酸。
67.一種鑒定可以治療結(jié)構(gòu)性心臟病的化合物的方法，包括a)測量權(quán)利要求51的動物的心臟收縮性；b)給予權(quán)利要求51的動物該化合物；c)測量步驟b)中動物的心臟收縮性；并d)檢測與步驟a)中動物心臟收縮性相比，步驟b)中動物的心臟收縮性的增加，該心臟收縮性的增加的檢測鑒定出可以治療結(jié)構(gòu)性心臟病的化合物。
68.權(quán)利要求67的方法，其中該結(jié)構(gòu)性心臟病可以是擴張性心肌病或心肌收縮功能障礙中的至少一種。
69.一種鑒定可以治療結(jié)構(gòu)性心臟病的化合物的方法，包括a)測量權(quán)利要求58的動物的心臟收縮性；b)給予權(quán)利要求58的動物該化合物；c)測量步驟b)中動物的心臟收縮性；并d)檢測與步驟a)中動物心臟收縮性相比，步驟b)中動物的心臟收縮性的增加，該心臟收縮性的增加的檢測鑒定出可以治療結(jié)構(gòu)性心臟病的化合物。
70.權(quán)利要求69的方法，其中該結(jié)構(gòu)性心臟病可以是擴張性心肌病或心肌收縮功能障礙中的至少一種。
71.一種鑒定可以治療結(jié)構(gòu)性心臟病的化合物的方法，包括a)測量權(quán)利要求51的動物的腦利尿鈉肽；b)給予權(quán)利要求51的動物該化合物；c)測量步驟b)中動物的腦利尿鈉肽；并d)檢測與步驟a)中動物的腦利尿鈉肽相比，步驟b)中動物的腦利尿鈉肽的增加，該腦利尿鈉肽的增加的檢測鑒定出可以治療結(jié)構(gòu)性心臟病的化合物。
72.權(quán)利要求71的方法，其中該結(jié)構(gòu)性心臟病可以是擴張性心肌病或心肌收縮功能障礙中的至少一種。
73.一種鑒定可以治療結(jié)構(gòu)性心臟病的化合物的方法，包括a)測量權(quán)利要求58的動物的腦利尿鈉肽；b)給予權(quán)利要求58的動物該化合物；c)測量步驟b)中動物的腦利尿鈉肽；并d)檢測與步驟a)中動物的腦利尿鈉肽相比，步驟b)中動物的腦利尿鈉肽的增加，該腦利尿鈉肽的增加的檢測鑒定出可以治療結(jié)構(gòu)性心臟病的化合物。
74.權(quán)利要求73的方法，其中該結(jié)構(gòu)性心臟病可以是擴張性心肌病或心肌收縮功能障礙中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種治療受試者結(jié)構(gòu)性心臟病的方法，該方法包括給予受試者有效量的一種CaMKII抑制劑，通過該抑制劑的給藥可以治療受試者的結(jié)構(gòu)性心臟病。本發(fā)明也提供了用于治療結(jié)構(gòu)性心臟病的轉(zhuǎn)基因動物模型。本發(fā)明進一步提供了篩選可以治療結(jié)構(gòu)性心臟病的化合物的途徑。
文檔編號G01N33/68GK1599622SQ02824101
公開日2005年3月23日 申請日期2002年10月1日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月1日
發(fā)明者M·安德森 申請人:范德比爾特大學