本發(fā)明涉及兒茶素的制藥應(yīng)用，具體涉及一種兒茶素在制備治療皮膚乳頭狀瘤的藥物上的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

皮膚乳頭狀瘤是由于上皮組織增生后形成的表皮乳頭樣結(jié)構(gòu)。皮膚乳頭狀瘤的發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年增高及年輕化的趨勢(shì)，由于該病誘發(fā)因素較多，病因復(fù)雜，確切發(fā)病機(jī)理仍不清楚。在臨床治療上，皮膚乳頭狀瘤具有容易惡變成為皮膚癌、手術(shù)治療后容易復(fù)發(fā)、多發(fā)性和產(chǎn)生組織破壞等特點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于皮膚乳頭狀瘤治療方面的研究報(bào)道相對(duì)較少，如何有效控制該病的發(fā)生，提高治療效果，防止腫瘤的復(fù)發(fā)和惡變，具有非常重要的意義。

癌癥的發(fā)生和發(fā)展是多階段、多病因，受到多基因的相互作用，一般要經(jīng)歷三個(gè)階段，即始發(fā)階段、促癌階段和演進(jìn)階段[bertramjs,kolonelln,jrmf.rationaleandstrategiesforchemopreventionofcancerinhumans.[j].cancerresearch,1987,47(11):3012-3031.]。其中促癌階段是始發(fā)突變細(xì)胞克隆后連續(xù)過(guò)度增殖的過(guò)程，此階段需要較長(zhǎng)的時(shí)間并且具有可逆性，是藥物化學(xué)預(yù)防理想的作用時(shí)間點(diǎn)[葛化冰,付招娣,孫正,等.螺旋藻對(duì)dmba/巴豆油誘導(dǎo)小鼠皮膚腫瘤預(yù)防作用的研究[j].北京口腔醫(yī)學(xué),2004,12(3):135-137.]。小鼠皮膚乳頭狀瘤誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)一般利用二甲基苯并蒽(7,12-dimethylbenzanthraene,dmba)誘導(dǎo)dna發(fā)生多點(diǎn)突變后，在小鼠皮膚的局部涂抹三(2-吡啶甲基)胺(12-o-tetradecanoyl-phorbol13-acetate,tpa)，使皮膚的局部組織的氧化自由基含量升高，導(dǎo)致氧化壓力上升，并在局部形成持續(xù)發(fā)炎，造成細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)失衡，使腫瘤組織維持在發(fā)炎的微環(huán)境，促進(jìn)皮膚組織發(fā)生癌變，是研究皮膚組織癌癥發(fā)生機(jī)制最常用的經(jīng)典模型之一，現(xiàn)已成為評(píng)價(jià)化合物癌癥化學(xué)預(yù)防作用優(yōu)先選用的動(dòng)物致癌模型[berenblumi,shubikp.berenblumiandshubikp.thepersistenceoflatenttumorcellsinducedinthemouse'sskinbyasingleapplicationof9:10-dimethyl-1,2-benzanthracene.britishjournalofcancer,1949,3(3):384-386.]。在發(fā)炎過(guò)程中，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,inos)過(guò)度表達(dá)，在機(jī)體中合成過(guò)多的一氧化氮(nitricoxide,no)，no含量過(guò)高將導(dǎo)致dna損傷、降低損傷dna的修補(bǔ)能力，導(dǎo)致所表達(dá)的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上發(fā)生錯(cuò)誤，形成蛋白質(zhì)喪失原有的功能與活性；所以，inos的過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)腫瘤組織維持發(fā)炎的微環(huán)境。另外，no還具有促進(jìn)血管新生、白細(xì)胞的黏附、浸潤(rùn)與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。已有許多研究證實(shí)，在不同的慢性發(fā)炎疾病和惡性組織中，都存在inos過(guò)度表達(dá)現(xiàn)象[moncadas,palmerrm,higgsea.nitricoxide:physiology,pathophysiology,andpharmacology[j].pharmacologicalreviews,1991,43(2):109-142.]。在許多惡性組織中，都發(fā)現(xiàn)環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase-2,cox-2)基因的表達(dá)出現(xiàn)異常，其表達(dá)產(chǎn)物能夠促進(jìn)血管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移，間接造成腫瘤的生成與轉(zhuǎn)移等現(xiàn)象[tsujiim,kawanos,tsujis,sawaokah,horim,duboisrn.cyclooxygenaseregulatesangiogenesisinducedbycoloncancercells[j].cell.1998,93(5):705–716]。在炎癥組織中，環(huán)氧化酶-2的表達(dá)量會(huì)增加，會(huì)增加血管通透性，提升白血球與免疫細(xì)胞的趨化性，擴(kuò)大發(fā)炎反應(yīng)的范圍等生物學(xué)活性[tsujii,m.,kawano,s.,tsuji,s.,sawaoka,h.,hori,m.,anddubois,r.n.cyclooxygenaseregulatesangiogenesisinducedbycoloncancercells[j].cell,1998,93(5),705-716.]；cox-2的合成受到腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactoralpha,tnf-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,il-1β)及表皮生長(zhǎng)因子(epidermalgrowthfactor,egf)等的誘導(dǎo)[moncada,s.,palmer,r.m.,andhiggs,e.a.nitricoxide:physiology,pathophysiology,andpharmacology.pharmacolrev.1991,43(2):109-142.]。

近年來(lái)，眾多的研究結(jié)果證實(shí)，部分從植物中提取的天然物質(zhì)，具有較強(qiáng)的預(yù)防腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的活性。兒茶素屬于黃烷醇多酚類化合物，主要分為四種：表兒茶素(epicatechin,ec)、表沒(méi)食子兒茶素(egc)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(epicatechingallate,ecg)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechingallate,egcg)。研究表明，茶葉中兒茶素的含量一般占干物質(zhì)的12-24％，占茶葉中多酚類物質(zhì)含量的60-80％[張賤根,胡啟開(kāi).茶葉中兒茶素類物質(zhì)含量的影響因素[j].蠶桑茶葉通訊,2007(5):26-28.]，是茶葉的主要活性成分，也是兒茶等中藥材的活性成分。兒茶素類物質(zhì)具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、消除自由基、降低血糖血脂等生物活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)大多皮膚乳狀瘤具有易惡變?yōu)槠つw癌、術(shù)后易復(fù)發(fā)、多發(fā)性生長(zhǎng)并易產(chǎn)生組織破壞的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種兒茶素在制備治療皮膚乳頭狀瘤的藥物上的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兒茶素類化合物對(duì)治療皮膚乳頭狀瘤具有明顯的作用效果。因此，兒茶素具有制備治療皮膚乳頭狀瘤藥物的應(yīng)用。

所述的兒茶素包括表兒茶素(ec)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ecg)、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(egcg)，分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

所述的兒茶素在上述制藥應(yīng)用中的使用濃度優(yōu)選為2.5μmol/l-100μmol/l。

本發(fā)明具有的有益效果：兒茶素能夠從柑橘加工廢棄物橘皮中提取分離，屬于植物天然化合物，來(lái)源廣泛，也能夠直接從試劑公司購(gòu)買(mǎi)。以dmba和tpa誘導(dǎo)balb/c小鼠形成皮膚乳頭狀瘤，與誘導(dǎo)組相比，用5μmol/200μl濃度的ec、ecg或egcg處理后，小鼠皮膚腫瘤數(shù)量分別減少52.6％、54.4％與58.6％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兒茶素對(duì)皮膚乳頭狀瘤的治療效果顯著。本發(fā)明可指導(dǎo)開(kāi)發(fā)新的皮膚乳頭狀瘤治療方法，為今后開(kāi)發(fā)利用兒茶素類化合物提供了新的方向和策略。

附圖說(shuō)明

圖1是ec、ecg和egcg的分子結(jié)構(gòu)圖。

圖2是不同濃度兒茶素對(duì)lps誘導(dǎo)raw264.7細(xì)胞亞硝酸鹽含量的影響結(jié)果圖。

圖3是不同組balb/c小鼠背部皮膚中inos和cox-2的表達(dá)情況圖。

圖4是兒茶素對(duì)dmba/tpa誘導(dǎo)的balb/c小鼠皮膚腫瘤數(shù)量的影響結(jié)果圖。

圖5是不同組balb/c小鼠皮膚腫瘤誘導(dǎo)百分率結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

化學(xué)試劑的配制：

dmba溶液的配制：準(zhǔn)確稱取1.2815mgdmba，用200μl丙酮溶解后，配制成1μmol/ml的dmba溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

tpa溶液的配制：準(zhǔn)確稱取5mgtpa，用200μl丙酮溶解后配制成100nmol/200μl的tpa貯備液，使用前用丙酮稀釋成5nmol/200μl，現(xiàn)配現(xiàn)用。

ec、ecg和egcg溶液的配制：準(zhǔn)確稱取29.0mgec、44.2mgecg、45.8mgegcg，分別用200μl丙酮溶解后，配制成100μmol/200μl的儲(chǔ)備液，使用前用丙酮稀釋成2.5-100μmol/l，現(xiàn)配現(xiàn)用。

實(shí)施例1兒茶素對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞raw264.7亞硝酸鹽含量的影響

所培養(yǎng)的細(xì)胞為小鼠巨噬細(xì)胞raw264.7，培養(yǎng)基為dmem培養(yǎng)基(含有終濃度為100u/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素、體積比為10％的胎牛血清)，培養(yǎng)溫度為37℃，二氧化碳濃度為5％。

將小鼠巨噬細(xì)胞raw264.7培養(yǎng)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到8分滿后，分別在不同孔中加入終濃度為100ng/ml的脂多糖(lipopolysaccharides,lps)和終濃度為2.5μmol/l、5μmol/l、10μmol/l、20μmol/l、40μmol/l的ec、ecg、egcg(ec、ecg、egcg處理組，另設(shè)只加入終濃度為100ng/ml的脂多糖的lps處理組為誘導(dǎo)組)，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，分別取100μl上述各處理的培養(yǎng)基上清液至96孔板中，每孔加入100μl格里斯試劑(含有1％磺胺和0.1％鹽酸萘乙二胺的水溶液)混合均勻后，在波長(zhǎng)570nm下，用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光值，測(cè)定亞硝酸鹽含量。與誘導(dǎo)組相比，在濃度40μmol/l時(shí)，ec處理組培養(yǎng)基中的亞硝酸鹽含量減少20.93％，ecg處理組的亞硝酸鹽含量減少11.63％，egcg處理組的亞硝酸鹽減少量為41.86％(圖2)，圖2結(jié)果顯示兒茶素能夠抑制培養(yǎng)基中no的合成，且具有劑量依賴性。

no含量過(guò)高將導(dǎo)致dna損傷、降低損傷dna的修補(bǔ)能力，導(dǎo)致所表達(dá)的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上發(fā)生錯(cuò)誤，使所合成的蛋白質(zhì)喪失原有的功能與活性；另外，no還具有促進(jìn)血管新生、白細(xì)胞的黏附、浸潤(rùn)與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。上述結(jié)果表明兒茶素通過(guò)降低no水平，減輕組織中的炎癥程度，抑制腫瘤的形成與轉(zhuǎn)移。

實(shí)施例2兒茶素對(duì)dmba/tpa誘導(dǎo)bala/c小鼠基因表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)用balb/c小鼠購(gòu)自湖北省疾病預(yù)防控制中心(許可證號(hào)：sckx(鄂)2011-0012)，按6只/籠隨機(jī)分配至各個(gè)籠子，二籠為一組(即一組共有12只)，共分為空白對(duì)照組、tpa誘導(dǎo)組、5μmol/200μlec處理組、5μmol/200μlecg處理組和5μmol/200μlegcg處理組。飼養(yǎng)環(huán)境保持25℃恒溫，每天光照12小時(shí)/黑暗12小時(shí)，墊料及飲用水每周更換2次。適應(yīng)飼養(yǎng)一周后，用刀片將balb/c小鼠背部靠近尾巴處選一塊面積約為2cm²的部位剔除毛發(fā)。在剔除毛發(fā)部位涂抹200μl濃度為1μmol/ml的dmba，2天后再在相同部位涂抹200μl相同濃度的dmba。經(jīng)過(guò)dmba處理一周后，在剔除毛發(fā)部位，各組按如下處理方法連續(xù)處理20周：誘導(dǎo)組持續(xù)每星期用200μl濃度為5nmol/200μl的tpa涂抹2次；對(duì)照組持續(xù)每星期用200μl的丙酮涂抹2次；ec處理組持續(xù)每星期用200μl濃度為5μmol/200μl的ec涂抹2次，每次涂完ec30分鐘后，在相同部位涂抹200μl濃度為5nmol/200μl的tpa；ecg處理組持續(xù)每星期用200μl濃度為5μmol/200μl的ecg涂抹2次，每次涂完ecg30分鐘后，在相同部位涂抹200μl濃度為5nmol/200μl的tpa；egcg處理組持續(xù)每星期用200μl濃度為5μmol/200μl的egcg涂抹2次，每次涂完egcg30分鐘后，在相同部位涂抹200μl濃度為5nmol/200μl的tpa。實(shí)驗(yàn)全程使用普通市售嚙齒動(dòng)物專用飼料與單蒸水供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物食用。20周后，在最后一次tpa處理24小時(shí)后處死小鼠，收集處理部位的皮膚，把皮膚組織剪成細(xì)小的碎片后，按照每20mg皮膚組織加入150-250μl組織裂解液(含150mmol/l的nacl、1mmol/l的edta、1g/ml的亮抑酶肽、1g/ml的抑蛋白酶肽、1g/ml的胃蛋白酶抑制劑和1mmol/l的pmsf)的比例加入組織裂解液，用玻璃勻漿器勻漿至充分裂解后，10000rpm離心5分鐘，取上清。以2mg/mlbsa溶液為濃度標(biāo)準(zhǔn)液，用酶標(biāo)儀測(cè)定595nm處的吸光值，換算樣本內(nèi)蛋白濃度。提取液經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、結(jié)合一抗、二抗后，檢測(cè)目的蛋白inos和cox-2的表達(dá)水平，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

結(jié)果(圖3)顯示，單獨(dú)用tpa處理時(shí)，inos與cox-2蛋白質(zhì)的表達(dá)水平明顯增加；兒茶素處理組別中，ec、ecg和egcg均能降低皮膚組織中inos和cox-2的表達(dá)水平。

由于inos具有催化no的合成，而no能夠維持發(fā)炎的微環(huán)境和促進(jìn)血管新生、白細(xì)胞的黏附、浸潤(rùn)與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移等活性；cox-2具有促進(jìn)血管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移，間接造成腫瘤的生成與轉(zhuǎn)移的生物活性。由此推測(cè)，兒茶素通過(guò)降低inos和cox-2的表達(dá)，降低tpa所引發(fā)的小鼠皮膚發(fā)炎現(xiàn)象，抑制腫瘤的形成與轉(zhuǎn)移。

實(shí)施例3兒茶素對(duì)dmba/tpa誘導(dǎo)balb/c小鼠皮膚乳頭狀瘤生長(zhǎng)的影響

按實(shí)施例2的方法對(duì)小鼠進(jìn)行分組并處理小鼠，在處理過(guò)程中，每周記錄直徑大于1mm并持續(xù)存在2星期以上腫瘤的數(shù)量。20周后，在最后一次tpa處理24小時(shí)后處死小鼠，統(tǒng)計(jì)腫瘤數(shù)量、腫瘤誘導(dǎo)百分率。

結(jié)果如圖4、5所示，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，誘導(dǎo)組小鼠持續(xù)涂抹tpa至第7周后，即開(kāi)始有乳頭狀瘤的生成，到第20周后，每只小鼠腫瘤數(shù)量平均為21.5顆，腫瘤發(fā)生率達(dá)百分之百；對(duì)照組到實(shí)驗(yàn)20周結(jié)束都沒(méi)有形成乳頭狀瘤，表明該實(shí)驗(yàn)的腫瘤誘導(dǎo)模式是成立的。ec組每只小鼠腫瘤數(shù)量平均為10.2顆，腫瘤發(fā)生率為100％；ecg組每只小鼠腫瘤數(shù)量平均為9.8顆，腫瘤發(fā)生率為100％；egcg組每只小鼠腫瘤數(shù)量平均為8.9顆，腫瘤發(fā)生率為92％。各兒茶素處理組形成腫瘤的數(shù)量明顯減少，腫瘤發(fā)生時(shí)間有所推遲；與誘導(dǎo)組相比，用ec、ecg或egcg處理后，小鼠皮膚腫瘤數(shù)量分別減少52.6％、54.4％與58.6％。

實(shí)施例4兒茶素對(duì)dmba/tpa誘導(dǎo)bala/c小鼠炎癥因子含量的影響

按實(shí)施例2的方法處理小鼠，20周后，心臟采血法采集血液，室溫血液自然凝固30分鐘，1000rpm離心15分鐘，吸取血清，按武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司elisa檢測(cè)試劑盒(鼠單核細(xì)胞趨化蛋白1(mcp-1/ccl2/mcaf)elisa試劑盒、鼠白介素6(il-6)elisa試劑盒、鼠白介素1β(il-1β)elisa試劑盒、鼠腫瘤壞死因子α(tnf-α)elisa試劑盒)所提供的方法，檢測(cè)tnf-α、mcp-1、il-6、il-1β的含量。

tnf-α主要由巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞活化產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，可以促進(jìn)t細(xì)胞產(chǎn)生各種炎癥因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。mcp-1對(duì)單核細(xì)胞具有趨化活性，激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，使其胞漿內(nèi)ca²⁺濃度升高，超氧陰離子的產(chǎn)生和釋放，并釋放溶菌酶，上調(diào)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞粘附分子的表達(dá)和細(xì)胞因子il-1、il-6的產(chǎn)生，活化的巨噬細(xì)胞可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。il-6是由纖維母細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、t淋巴細(xì)胞、b淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、以及多種瘤細(xì)胞所產(chǎn)生，能夠刺激參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞增殖、分化并提高其功能。il-1β是指在白細(xì)胞或免疫細(xì)胞間相互作用的淋巴因子。白細(xì)胞介素在傳遞信息，激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，介導(dǎo)t、b細(xì)胞活化、增殖與分化及在炎癥反應(yīng)中起重要作用。血清中tnf-α、mcp-1、il-6、il-1β含量的高低，代表組織炎癥程度的嚴(yán)重性。

從檢測(cè)結(jié)果(表1)可知，兒茶素能夠降低tpa誘導(dǎo)所導(dǎo)致的血清中tnf-α、mcp-1、il-6、il-1β的升高，減輕tpa對(duì)小鼠引起的炎癥反應(yīng)，抑制皮膚乳頭狀瘤的形成。

表1兒茶素對(duì)balb/c小鼠血清中炎性指標(biāo)的影響(n＝12)(ng/l)

實(shí)施例5兒茶素對(duì)balb/c小鼠的生物毒性評(píng)價(jià)

按實(shí)施例2的方法處理小鼠，20周后處死小鼠，稱量各組小鼠的體重、肝、脾、腎重量，以心臟采血方式采集血液，室溫放置1h后，4℃、3000rpm離心10min，收集血清，儲(chǔ)存于-80℃冰箱中。以全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功能生化指數(shù)：天門(mén)冬酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(aspartateaminotransferase，ast)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanineaminotransferase，alt)、三酸甘油脂(triglyceride，tg)及總膽固醇(totalcholesterol，t-cho)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶是轉(zhuǎn)氨酶中比較重要的一種，它是醫(yī)學(xué)臨床上肝功能檢查的指標(biāo)，用來(lái)判斷肝臟是否受到損害。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶存在于肝臟、心臟和骨骼肌中，肝細(xì)胞或某些組織損傷或壞死，都會(huì)使血液中的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶升高，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶是反映肝細(xì)胞受損程度最靈敏的指標(biāo)，在肝功能檢查中最為常用。三酸甘油脂是指血中脂肪物質(zhì)如膽固醇、三酸甘油脂等，它能夠?qū)е卵鞍状x異常等疾病。總膽固醇是指血液中所有脂蛋白所含膽固醇之總和，人群總膽固醇水平主要取決于遺傳因素和生活方式，總膽固醇由肝臟合成，是合成腎上腺皮質(zhì)激素、性激素、膽汁酸及維生素d等生理活性物質(zhì)的重要原料，也是構(gòu)成細(xì)胞膜的主要成分，是脂肪在血液中存在的一種形式。

從檢測(cè)結(jié)果(表2)可以看出，ec、ecg、egcg處理后，不同處理間在臟器體重比、got和gpt的酶活、tg與t-cho含量等指標(biāo)上均沒(méi)有顯著性差異，表明ec、ecg、egcg對(duì)balb/c小鼠沒(méi)有生物毒性。

表2兒茶素對(duì)balb/c小鼠的生物毒性評(píng)價(jià)(n＝12)

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。